CN113234864B

CN113234864B - 猪伪狂犬病毒lamp检测引物组及试剂盒

Info

Publication number: CN113234864B
Application number: CN202110726270.0A
Authority: CN
Inventors: 俞国华; 杨小燕; 戴爱玲; 范克伟; 刘建奎; 黄翠琴; 杨守深; 尹会方; 李晓华; 王鑫; 包银莉
Original assignee: Longyan University
Current assignee: Longyan University
Priority date: 2021-06-29
Filing date: 2021-06-29
Publication date: 2023-08-01
Anticipated expiration: 2041-06-29
Also published as: CN113234864A

Abstract

本发明公开了猪伪狂犬病毒LAMP检测引物组及试剂盒，猪伪狂犬病毒LAMP检测引物组包括6条引物，具体核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。猪伪狂犬病毒LAMP检测试剂盒包含上述引物组外，还包含Bst DNA聚合酶、dNTP、MgSO₄、Betaine、10Ｘ LAMP反应缓冲液、HNB、阳性对照质粒等成分。本试剂盒具有灵敏度高、特异性好、反应时间短、结果可视化、配套仪器简单等一系列优点，不仅适用于大型养殖单位和高端实验室，也适用于广大中小养殖单位和普通实验室。

Description

猪伪狂犬病毒LAMP检测引物组及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及猪伪狂犬病毒LAMP检测引物组及试剂盒。

背景技术

猪伪狂犬病(porcine pseudorabies)是由伪狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)引起的一种急性传染病。新生仔猪主要表现为神经症状，也可出现腹泻等消化系统症状。成年猪常为隐性感染，妊娠母猪感染后可引起流产、产死胎、木乃伊胎及呼吸系统症状。公猪表现为精液品质下降和呼吸系统症状。

伪狂犬病在1813年首次发生于美国的牛群中。因该病症状与狂犬病显示，故命名为伪狂犬病。该病是危害养猪业最重要的传染病之一，广泛分布于世界各地，造成了巨大的经济损失。

伪狂犬病毒(PRV)属于疱疹病毒科，病毒粒子呈球形或椭球形，有囊膜。PRV基因组为线性双股DNA，约150kb，编码70-100种蛋白质。

PRV的诊断方法有病毒分离鉴定、免疫荧光检测病毒抗原、血清中和试验、酶联免疫吸附实验(ELISA)、普通PCR和荧光定量PCR等，其中：病毒分离鉴定太过复杂繁琐，免疫荧光检测病毒抗原特异性相对较差，血清中和试验与ELISA检测只有在动物产生抗体后才能检测出来从而导致检测时间延后，普通PCR检测需要在扩增完成后通过电泳才能获得检测结果，而荧光定量PCR检测需要使用昂贵的荧光定量PCR仪从而限制了该方法的使用范围。

LAMP(Loop Mediated Isothermal Amplification，环介导等温基因扩增技术)是一种新型的核酸扩增技术，在2000年由日本科学家发明。该技术具有灵敏度高、特异性好、反应时间短、结果可视化、配套仪器简单等一系列优点。利用该技术开发的产品，具有以下两个优点：(1)配套仪器成本低：一个普通水浴锅即可完成检测反应；(2)结果可视化，产品使用范围大大扩展：不仅大型养殖单位和高端实验室可以使用，广大中小养殖单位和普通实验室也可以使用。

发明内容

为了克服传统PRV检测方法固有的缺点，本发明的目的在于提供猪伪狂犬病毒LAMP检测引物组及试剂盒。

本发明是通过如下技术方案实现的：

首先，选取PRV病毒基因组的保守序列，设计了针对PRV病毒的LAMP检测引物组，包括6条引物，具体核苷酸序列如下：

SEQ ID NO.1(PRV-F3):5′-gtacgtgctcgtgatgacc-3′

SEQ ID NO.2(PRV-B3):5′-gcgccagcacaaacagc-3′

SEQ ID NO.3(PRV-FIP):5′-cgtcagctccttgatgaccgtgttacctgggactacacgctc-3′

SEQ ID NO.4(PRV-BIP):5′-acgcgatctacgtggacggctttccggccgtacgggtt-3′

SEQ ID NO.5(PRV-LF):5′-acgtactcggccgcggtg-3′

SEQ ID NO.6(PRV-LB):5′-gcccgcgcgcccgtg-3′

其次，将以上6条PRV病毒的LAMP检测引物与以下试剂组合即构成可以检测PRV病毒的试剂盒，具体该试剂盒包括以下成分：

PRV病毒的LAMP检测引物组2μL(其中PRV-F3和PRV-B3各20μM，PRV-FIP和PRV-BIP各160μM，PRV-LF和PRV-LB各80μM)、8Units/μL Bst DNA聚合酶2.4μL、25mM dNTP 3μL、150mM MgSO₄ 2μL、5M Betaine 10μL、10X LAMP反应缓冲液6μL、3mM HNB(Hydroxynaphtholblue,羟基萘酚蓝)2.4μL、用去离子水补足到40μL。检测时，加入DNA样品20μL，反应总体积为60μL。

试剂盒中的HNB也可以用其它对反应结果起指示作用的指示剂或荧光染料代替，比如：钙黄绿素、SYTO-9、SYBR Green、Eva Green等。

每次实验需要同时设置阳性对照和阴性对照，阳性对照加入含PRV病毒DNA片段的质粒、阴性对照加入去离子水。

反应条件：61℃,90min。反应可以在普通PCR仪上进行，也可以在普通水浴锅内进行。

反应结果的判断：阳性对照的反应结果为深蓝色，阴性对照的反应结果为紫红色。如果待测样品反应管的颜色与阳性对照相同(呈深蓝色)，则说明待测样品PRV的检测结果为阳性。如果待测样品反应管的颜色与阴性对照相同(呈紫红色)，则说明待测样品PRV的检测结果为阴性。

含PRV病毒DNA片段的质粒的制备：我们合成了PRV病毒gE基因LAMP扩增对应的DNA片段并将其连接到质粒pGH上，该质粒命名为pGH-PRV，用作PRV病毒LAMP检测时的阳性对照，其具体序列如SEQ ID NO.7所示。

SEQ ID NO.7(PRV病毒DNA部分片段)：

5’-gggctgtacgtgctcgtgatgacccacaacggccacgtcgccacctgggactacacgctcgtcgccaccgcggccgagtacgtcac ggtcatcaaggagctgacggccccggcccgggccccgggcaccccgtggggccccggcggcggcgacgacgcgatctacgtggacggcg tcacgacgccggcgccgcccgcgcgcccgtggaacccgtacggccggacgacgcccgggcggctgtttgtgctggcgctgggc-3’

本发明利用LAMP恒温扩增技术，结合指示剂HNB(Hydroxynaphthol blue,羟基萘酚蓝)，开发出了一款可视化的PRV病毒LAMP检测试剂盒，本试剂盒具有灵敏度高、特异性好、反应时间短、结果可视化、配套仪器简单等一系列优点，不仅适用于大型养殖单位和高端实验室，也适用于广大中小养殖单位和普通实验室。

附图说明

图1为PRV病毒LAMP检测结果。结果显示：经61℃反应90min后，阳性对照反应管呈深蓝色(左侧2个反应管)，而阴性对照管呈紫红色(右侧1反应管)。

图2为PRV病毒LAMP检测试剂盒灵敏度测试结果。将pGH-PRV质粒做4倍系列稀释后，使用本试剂盒进行检测。测试结果显示：经61℃反应90min后，从4^(-1)-4^(-5)稀释度呈深蓝色，而4^(-6)-4^(-9)稀释度呈紫红色。该结果说明：本试剂盒的最高灵敏度可以达到4^(-5)稀释度，经计算该稀释度含有的pGH-PRV质粒拷贝数为422个拷贝。

图3为PRV病毒LAMP检测试剂盒对临床样品的检测结果，同时与普通PCR检测结果进行对比。结果显示：8个临床样品中，PRV病毒LAMP试剂盒检测出了3个阳性样品，其余5个为阴性样品，该检测结果与普通PCR检测结果100％相符。

具体实施方式

下面结合实施例，更具体的说明本发明的内容，但其内容不构成对本发明的限制。

实施例1

PRV病毒LAMP检测引物组的设计。

根据已公布的PRV病毒的核酸序列，设计了针对PRV病毒gE基因的LAMP检测引物组，具体核苷酸序列如下：

SEQ ID NO.1(PRV-F3):5′-gtacgtgctcgtgatgacc-3′

SEQ ID NO.2(PRV-B3):5′-gcgccagcacaaacagc-3′

SEQ ID NO.3(PRV-FIP):5′-cgtcagctccttgatgaccgtgttacctgggactacacgctc-3′

SEQ ID NO.4(PRV-BIP):5′-acgcgatctacgtggacggctttccggccgtacgggtt-3′

SEQ ID NO.5(PRV-LF):5′-acgtactcggccgcggtg-3′

SEQ ID NO.6(PRV-LB):5′-gcccgcgcgcccgtg-3′

PRV病毒gE基因LAMP检测时的阳性对照质粒的制备:我们合成了PRV病毒gE基因LAMP扩增对应的DNA片段并将其连接到质粒pGH上，该质粒命名为pGH-PRV，用作PRV病毒LAMP检测时的阳性对照，其具体序列如SEQ ID NO.7所示。

SEQ ID NO.7(PRV病毒DNA部分片段)：

5’-gggctgtacgtgctcgtgatgacccacaacggccacgtcgccacctgggactacacgctcgtcgccaccgcggccgagtacgtcacggtcatcaaggagctgacggccccggcccgggccccgggcaccccgtggggccccggcggcggcgacgacgcgatctacgtggacggcgtcacgacgccggcgccgcccgcgcgcccgtggaacccgtacggccggacgacgcccgggcggctgtttgtgctggcgctgggc-3’

PRV病毒LAMP检测的试剂盒组成如下：PRV病毒的LAMP检测引物组2μL(其中PRV-F3和PRV-B3各20μM，PRV-FIP和PRV-BIP各160μM，PRV-LF和PRV-LB各80μM)、8Units/μL BstDNA聚合酶2.4μL、25mM dNTP 3μL、150mM MgSO4 2μL、5M Betaine 10μL、10X LAMP反应缓冲液6μL、3mM HNB(Hydroxynaphthol blue,羟基萘酚蓝)2.4μL、用去离子水补足到40μL。检测时，加入DNA样品20μL，反应总体积为60μL。

每次实验需要同时设置阳性对照和阴性对照，阳性对照加入pGH-PRV的质粒、阴性对照加入去离子水。

反应结果的判断：阳性对照的反应结果为深蓝色，阴性对照的反应结果为紫红色。如果待测样品反应管的颜色与阳性对照相同(呈深蓝色)，则说明待测样品PRV病毒的检测结果为阳性。如果待测样品反应管的颜色与阴性对照相同(呈紫红色)，则说明待测样品PRV病毒的检测结果为阴性。

阳性对照为pGH-PRV质粒而阴性对照为去离子水的PRV病毒LAMP检测结果如图1所示。结果显示：经61℃反应90min后，阳性对照反应管呈深蓝色(左侧2个反应管)，而阴性对照管呈紫红色(右侧1反应管)。

该结果说明：所设计PRV病毒的LAMP检测引物组可以检测出含PRV病毒gE基因相应DNA片段的样品。

实施例2

PRV病毒LAMP检测试剂盒灵敏度测试。

将pGH-PRV质粒做4倍系列稀释，稀释度从4^(-1)-4^(-9)，然后使用本试剂盒对各稀释度进行检测。结果如图2所示。

测试结果显示：经61℃反应90min后，从4^(-1)-4^(-5)稀释度呈深蓝色，而4^(-6)-4^(-9)稀释度呈紫红色。

该结果说明：本试剂盒的最高灵敏度可以达到4^(-5)稀释度，经计算该稀释度含有的pGH-PRV质粒拷贝数为422个拷贝。

以上结果说明：本发明提供的PRV病毒LAMP检测试剂盒灵敏度良好，其最高检测灵敏度可达422个拷贝的目标分子。

实施例3

PRV病毒LAMP检测试剂盒对临床样品的检测。

我们利用本发明公布的PRV病毒LAMP检测试剂盒对8个临床样品进行检测，同时与普通PCR检测结果进行对比。结果如图3所示。

结果显示：8个临床样品中，PRV病毒LAMP试剂盒检测出了3个阳性样品，其余5个为阴性样品，该检测结果与普通PCR检测结果100％相符。

总之，本发明提供的PRV病毒LAMP检测试剂盒具有灵敏度高、特异性好、反应时间短、结果可视化、配套仪器简单等一系列优点。该试剂盒不仅适用于大型养殖单位和高端实验室，也适用于广大中小养殖单位和普通实验室。

序列表

<110> 龙岩学院

<120> 猪伪狂犬病毒LAMP检测引物组及试剂盒

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gtacgtgctc gtgatgacc 19

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gcgccagcac aaacagc 17

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

cgtcagctcc ttgatgaccg tgttacctgg gactacacgc tc 42

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

acgcgatcta cgtggacggc tttccggccg tacgggtt 38

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

acgtactcgg ccgcggtg 18

<210> 6

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

gcccgcgcgc ccgtg 15

<210> 7

<211> 258

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

gggctgtacg tgctcgtgat gacccacaac ggccacgtcg ccacctggga ctacacgctc 60

gtcgccaccg cggccgagta cgtcacggtc atcaaggagc tgacggcccc ggcccgggcc 120

ccgggcaccc cgtggggccc cggcggcggc gacgacgcga tctacgtgga cggcgtcacg 180

acgccggcgc cgcccgcgcg cccgtggaac ccgtacggcc ggacgacgcc cgggcggctg 240

tttgtgctgg cgctgggc 258

Claims

1.一种猪伪狂犬病毒LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含猪伪狂犬病毒LAMP检测引物组、Bst DNA聚合酶、dNTP、MgSO₄、Betaine、10Ｘ LAMP反应缓冲液、以及对反应结果起指示作用的HNB；

所述猪伪狂犬病毒LAMP检测引物组包括6条引物，6条引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNO. 1- SEQ ID NO.6所示，具体如下：

SEQ ID NO. 1（PRV-F3）: 5′ -gtacgtgctcgtgatgacc-3′

SEQ ID NO. 2（PRV -B3）: 5′ -gcgccagcacaaacagc-3′

SEQ ID NO. 3（PRV -FIP）: 5′ -cgtcagctccttgatgaccgtgttacctgggactacacgctc-3′

SEQ ID NO. 4（PRV -BIP）: 5′ -acgcgatctacgtggacggctttccggccgtacgggtt-3′

SEQ ID NO. 5（PRV -LF）: 5′ -acgtactcggccgcggtg-3′

SEQ ID NO. 6（PRV -LB）: 5′ -gcccgcgcgcccgtg-3′；

所述试剂盒的各组分及其含量如下：引物组 2 μL、8 Units /μL Bst DNA聚合酶 2.4μL、25 mM dNTP 3 μL、150 mM MgSO₄2 μL、5 M Betaine 10 μL、10Ｘ LAMP反应缓冲液 6 μL、3 mM HNB 2.4 μL、用去离子水补足到40 μL，检测时，加入DNA样品20 μL，反应总体积为60 μL；

所述引物组中，各引物的摩尔浓度如下：PRV-F3和PRV-B3的摩尔浓度均为20 μM，PRV-FIP和PRV-BIP的摩尔浓度均为160 μM，PRV-LF和PRV-LB的摩尔浓度均为80 μM。

2.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病毒LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含阳性对照质粒。

3.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病毒LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应条件为：61 ℃, 90 min。