CN111575410A - 一种猪伪狂犬病毒的lamp检测试剂盒 - Google Patents

一种猪伪狂犬病毒的lamp检测试剂盒 Download PDF

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CN111575410A CN202010491840.8A CN202010491840A CN111575410A CN 111575410 A CN111575410 A CN 111575410A CN 202010491840 A CN202010491840 A CN 202010491840A CN 111575410 A CN111575410 A CN 111575410A
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张志刚
石磊
苏永裕
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Abstract

本发明公开了一种猪伪狂犬病毒的LAMP检测试剂盒，具有一检测引物组和一内标引物组；该检测引物组包括一检测外引物对、一检测内引物对和一检测环引物对，该内标引物组包括一内标外引物对、一内标内引物对和一内标环引物对。本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、成本低、不需要昂贵仪器、适合现场检测等有益效果，更重要是该方法提高检测的准确性，及时发现检测中的假阴性结果，可有效防止因假阴性检测结果引起各种事故。

Description

一种猪伪狂犬病毒的LAMP检测试剂盒
技术领域
本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及一种猪伪狂犬病毒的LAMP检测试剂盒。
背景技术
猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的猪急性传染病，可导致妊娠母猪流产、死胎，公猪不育，以及新生仔猪大量死亡，育肥猪呼吸困难、生长停滞等，是危害养猪业的重大传染病之一。
伪狂犬病毒属于疱疹病毒科，猪疱疹病毒属，病毒粒子为圆形，直径150～180nm，核衣壳直径为105～110nm，病毒粒子的最外层为病毒囊膜，是由宿主细胞衍生而来的脂质双层结构。基因组为线性双链DNA，大小约150kb，有10个不同的糖蛋白(gB，gC，gD，gE，gH，gI，gK，gL，gM，gN)参与病毒复制和免疫过程。
目前PRV检测的传统方法主要有病毒分离和鉴定、免疫组化和酶联免疫吸附试验等方法，这些方法都存在着技术要求高、耗时耗力和灵敏度低等缺点，限制了它们在养殖业的实际应用。近年来，以分子生物学为基础的检测方法如PCR和实时荧光PCR因其灵敏度高、特异性强和方便快速而广泛应用于临床诊断。但是PCR方法操作复杂，需依赖跑胶设备，进行跑胶分析；实时荧光PCR需使用昂贵的仪器设备并依赖标准曲线进行定量检测。昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求，导致现有的检测技术不能很好得应用于广大基层单位，无法对猪伪狂犬病做到早期诊断，对养猪业造成了极大的经济损失。因此，亟需研究开发一种快速准确、经济简便而易于操作的分子检测方法，以便应用于广大基层单位，提升基层用户的诊断水平。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种猪伪狂犬病毒的LAMP检测试剂盒。
本发明的技术方案如下：
一种猪伪狂犬病毒的LAMP检测试剂盒，具有一检测引物组和一内标引物组；
该检测引物组包括一检测外引物对、一检测内引物对和一检测环引物对，该检测外引物对由如SEQ ID NO.01所示的正向检测外引物和如SEQ ID NO.02所示的反向检测外引物组成，该检测内引物对由如SEQ ID NO.03所示的正向检测内引物和如SEQ ID NO.04所示的反向检测内引物组成，该检测环引物对由如SEQ ID NO.05所示的正向检测环引物和如SEQ ID NO.06所示的反向检测环引物组成；
该内标引物组包括一内标外引物对、一内标内引物对和一内标环引物对，该内标外引物对由如SEQ ID NO.07所示的正向内标外引物和如SEQ ID NO.08所示的反向内标外引物组成，该内标内引物对由如SEQ ID NO.09所示的正向内标内引物和如SEQ ID NO.010所示的反向内标内引物组成，该内标环引物对由如SEQ ID NO.11所示的正向内标环引物和如SEQ ID NO.12所示的反向内标环引物组成。
在本发明的一个优选实施方案中，所述检测外引物对、检测内引物对和检测环引物对的摩尔比为1-2∶4-8∶2-4。
在本发明的一个优选实施方案中，所述内标外引物对、内标内引物对和内标环引物对的摩尔比为1-2∶4-8∶2-4。
在本发明的一个优选实施方案中，还包括DNA聚合酶、LAMP反应液、内标、阳性对照和阴性对照。
进一步优选的，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
进一步优选的，所述LAMP反应液中含有浓度为6mM的dNTPs溶液、10×ThermoPol反应缓冲液和浓度为160mM的MgSO4水溶液。
更进一步优选的，所述dNTPs溶液、10×Thermo Pol反应缓冲液和MgSO4水溶液的体积比为8∶4∶3。
进一步优选的，所述阳性对照为含有猪伪狂犬病毒gB基因片段的T载体克隆。
进一步优选的，所述阴性对照为超纯水。
进一步优选的，所述内标为含有猪伪狂犬病毒DBP基因片段的T载体克隆。
本发明的有益效果是：
1、本发明快速高效：整个扩增只用30-60min即可完成，扩增产量可达109-1010个拷贝。
2、本发明操作简便：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要一部恒定温度仪就能反应和检测，条件比较温和。
3、本发明特异性稿：本发明根据猪伪狂犬病毒gB基因设计了检测引物组，应用这特定的检测引物组，扩增靶序列的6个区域，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行。
4、本发明灵敏度高：最低检测极限可达到1fg/μL。
5、本发明鉴定简便：可通过观察扩增曲线判断扩增与否，无需电泳等其他任何分析步骤，适合现场检测。
6、本发明的准确性高：本发明的检测试剂盒内含内标，可根据检测内标引物组是否有扩增来判断是否有假阴性检测结果，有效预防因抑制等原因造成的检测结果为假阴性的情况发生，为目前无法判断检测结果是假阴性结果的情况提供一种新的LAMP检测方法，提高检测的准确性。
7、本发明的内标与实际样品的检测不在同一管中进行检测，该内标与样品检测管中的扩增靶标不同，内标的核酸浓度在该内标的检测线附近，可识别轻微的反应抑制；正常情况下因内标检测管在加入样品提取液的同时加入有低浓度的内标，所以内标检测管检测检测结果为阳性，如内标管检测结果为阴性，提示样品提取液中含有抑制因子或其他原因，导致内标检测管不能进行扩增反应，同样样品检测管也可能因抑制因子或其他原因导致不能进行正常扩增检测，造成样品检测管检测结果为假阴性，因此该方法可根据内标管的检测结果辅助判断样品检测结果可能为假阴性结果。
附图说明
图1为本发明实施例3的实验结果图之一，其显示猪伪狂犬病毒内标的最低检出限为1fg/μL。
图2为本发明实施例3的实验结果图之二，其为猪伪狂犬病毒内标的最低检出限为1fg/μL的复核。
图3为本发明实施例3的实验结果图之三，其中猪伪狂犬病毒gB基因最低检出限102copies/μL。
图4为本发明实施例4中的特异性实验结果图，其中，对猪胸膜炎放线杆菌(APP)、猪链球菌(SS)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、副猪嗜血杆菌(HPS)、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、猪多杀性巴氏杆菌、健康猪血清临床样本的DNA均无非特异性扩增。
图5为本发明实施例5的无抑制因子的实际样品检测结果图。
图6为本发明实施例5的有抑制因子的实际样品检测结果图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1猪伪狂犬病毒LAMP检测试剂盒的建立
猪伪狂犬病毒的LAMP-PCR检测试剂盒，包括检测引物组、内标引物组、LAMP反应液、Bst DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照和内标。
(1)检测引物组：以猪伪狂犬病毒gB基因为靶基因，进行LAMP引物的设计，所述检测引物组包括一检测外引物对、一检测内引物对和一检测环引物对，该检测外引物对由如SEQ ID NO.01所示的正向检测外引物和如SEQ ID NO.02所示的反向检测外引物组成，该检测内引物对由如SEQ ID NO.03所示的正向检测内引物和如SEQ ID NO.04所示的反向检测内引物组成，该检测环引物对由如SEQ ID NO.05所示的正向检测环引物和如SEQ ID NO.06所示的反向检测环引物组成，核苷酸序列分别如下所示：
gB-F3：5’-tcgccgtgctcttca-3’(SEQ ID NO.01)；
gB-B3：5’-gcgtagccgatgtgc-3’(SEQ ID NO.02)；
gB-FIP：5’-ggcggtcaccttgtggttgaaccgcttcacagacc-3’(SEQ ID NO.03)；
gB-BIP：5’-gcggctggcacaccagcctccacctcctcg-3’(SEQ ID NO.04)；
gB-LF：5’-cgtccgtgatctcctgc-3’(SEQ ID NO.05)；
gB-LB：5’-caacgacacctacaccaaga-3’(SEQ ID NO.06)；
(2)内标引物组：以猪伪狂犬病毒DBP基因为内标，进行LAMP引物的设计，所述内标引物组包括一内标外引物对、一内标内引物对和一内标环引物对，该内标外引物对由如SEQID NO.07所示的正向内标外引物和如SEQ ID NO.08所示的反向内标外引物组成，该内标内引物对由如SEQ ID NO.09所示的正向内标内引物和如SEQ ID NO.10所示的反向内标内引物组成，该内标环引物对由如SEQ ID NO.11所示的正向内标环引物和如SEQ ID NO.12所示的反向内标环引物组成，核苷酸序列分别如下所示：
DBP-F3：5’-cacggtgtccatcaacg-3’(SEQ ID NO.07)；
DBP-B3：5’-cctcggagagcacgg-3’(SEQ ID NO.08)；
DBP-FIP：5’-tccaggttccgcacgctccatcagcgaggagtt-3’(SEQ ID NO.09)；
DBP-BIP：5’-gcatggcgtccgtcatgggctcctcgtcgtaca-3’(SEQ ID NO.10)；
DBP-LoopF：5’-cagcaggcggcagag-3’(SEQ ID NO.11)；
DBP-LoopB：5’-cgctgtcgctggagg-3’(SEQ ID NO.12)。
(3)LAMP反应液：6mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、160mM MgSO4水溶液、三者的体积比是8∶4∶3。
(4)阳性对照为含有猪伪狂犬病毒gB基因部分片段的T载体克隆，其制备方法为：以分离鉴定的猪伪狂犬病毒为模板，利用检测外引物对(gB外引物，SEQ ID NO.01和SEQ IDNO.02)进行扩增，所得gB基因扩增片段序列如SEQ ID NO.13所示，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中，即为阳性对照。
(5)内标为含有DBP基因部分片段的T载体克隆，以分离鉴定的猪伪狂犬病毒为模板，利用内标外引物对(DBP外引物，SEQ ID NO.07和SEQ ID NO.08)进行扩增，所得DBP基因扩增片段序列如SEQ ID NO.14所示，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中，即为内标。
(6)阴性对照为超纯水。
实施例2猪伪狂犬病毒的LAMP检测方法
利用实施例1的猪伪狂犬病毒的LAMP检测试剂盒对样品进行检测，步骤如下：
(1)提取待检样品DNA。
(2)利用权利要求1的LAMP引物组合物对待检样品DNA进行LAMP恒温扩增：
LAMP恒温扩增的25μL反应体系含有：gB-F30.2μM，gB-B30.2μM，gB-FIP 1.4μM，gB-BIP 1.4μM，gB-LF 0.8μM，gB-LB 0.8μM，DBP-F30.2μM，DBP-B30.2μM，DBP-FIP1.2μM，DBP-BIP 1.2μM，DBP-LoopF 0.8μM，DBP-LoopB 0.8μM，LAMP反应液12.5μL，DNA聚合酶8U，10×SYBR Green I 0.5μL，待检样品2μL，内标2μL，用超纯水补齐到25μL；
LAMP恒温扩增的程序为：63-65℃反应30-60min，并在80℃持续2min。
(3)结果判断：将反应管中置于恒温荧光检测仪或荧光PCR仪中，实时读取荧光信号，根据gB基因检测结果和内标DBP检测结果进行判断：
gB基因检测结果为阳性内标检测结果全为阳性时，检测结果为阳性；
gB基因检测结果为阴性内标检测结果全为阳性时，检测结果为阴性；
gB基因检测结果为阳性内标检测结果全为阴性时，检测结果为阳性；
gB基因检测结果为阴性内标检测结果全为阴性时，检测结果可能为假阴性，建议重新提取DNA进行检测。
实施例3灵敏度实验
将构建的质粒进行灵敏度实验，将1pg/μL质粒以10倍梯度稀释为1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、0.1fg/μL五个梯度作为质控标准，用实施例2的方法进行检测，通过灵敏度实验确定内标的最低检出限1fg/μL(如图1所示)，并对最低检出限予以复核(图2)，将内标浓度定为最低检出限的浓度。
取已知浓度猪伪狂犬病毒液，进行10倍梯度稀释，对各梯度病毒液进行核酸提取，经测试本试剂盒的最低检出度为102copies/μL，检测结果见图3。
实施例4特异性实验
用实施例2的方法分别对猪胸膜炎放线杆菌(APP)、猪链球菌(SS)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、副猪嗜血杆菌(HPS)、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、猪多杀性巴氏杆菌、健康猪血清临床样本进行检测，如图4所示，结果显示阳性对照及内标扩增正常，猪胸膜炎放线杆菌(APP)、猪链球菌(SS)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、副猪嗜血杆菌(HPS)、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、猪多杀性巴氏杆菌、健康猪血清临床样本的DNA均无扩增。
实施例5实际样品检测
取不含抑制因子的样品及不含抑制因子的样品同时进行实验，并增加灵敏度实验予以辅助判断结果，检测方法及结果如下：
1、待检样品DNA的提取：
按照商品化DNA/RNA提取试剂盒说明书进行操作。
2、恒温基因扩增检测反应体系及条件：25μL反应体系含有：gB-F3 0.2μM，gB-B30.2μM，gB-FIP 1.4μM，gB-BIP 1.4μM，gB-LF 0.8μM，gB-LB 0.8μM，，LAMP反应液12.5μL，，DNA聚合酶8U，10×SYBR Green I 0.5μL，待检2μL g，用超纯水补齐到25μL；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，并于63-65℃反应30-45min，并在80℃持续2min；
(3)恒温基因扩增内标反应体系及条件：25μL反应体系含有：DBP-F3 0.2μM，DBP-B3 0.2μM，DBP-FIP 1.2μM，DBP-BIP 1.2μM，DBP-LoopF 0.8μM，DBP-LoopB 0.8μM，LAMP反应液12.5μL，DNA聚合酶8U，10×SYBR Green I 0.5μL，待检样品2μL，内标2μL，用超纯水补齐到25μL；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，并于63-65℃反应30-45min，并在80℃持续2min；
(4)结果判断：将上述反应管中置于恒温荧光检测仪或荧光PCR仪(如ABI 7500)中，根据仪器实时读取的荧光信号来判断扩增结果。根据gB基因检测结果和内标DBP检测结果进行判断。
检测结果见图5(为不含抑制因子的样品检测结果图)及图6(含抑制因子的样品检测结果及灵敏度对照图)，内标及样品检测结果为阳性，检测结果正常，且试剂盒各浓度梯度均能检出，出峰时间正常，但含抑制因子的内标及样品检测结果均为阴性，提示检测结果可能为假阴性检测结果，样品中可能含有抑制因子或其他原因引起检测结果异常，需重新实验并排查原因，做进一步的确认。通过上述实验证明该方法可有效的鉴别检测结果是否为假阴性。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<110> 厦门银祥集团有限公司
<120> 一种猪伪狂犬病毒的LAMP检测试剂盒
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcgccgtgct cttca 15
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcgtagccga tgtgc 15
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggcggtcacc ttgtggttga accgcttcac agacc 35
<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcggctggca caccagcctc cacctcctcg 30
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgtccgtgat ctcctgc 17
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caacgacacc tacaccaaga 20
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cacggtgtcc atcaacg 17
<210> 8
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cctcggagag cacgg 15
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
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<400> 9
tccaggttcc gcacgctcca tcagcgagga gtt 33
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcatggcgtc cgtcatgggc tcctcgtcgt aca 33
<210> 11
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<212> DNA
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<400> 11
cagcaggcgg cagag 15
<210> 12
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cgctgtcgct ggagg 15

Claims (10)

1.一种猪伪狂犬病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于：具有一检测引物组和一内标引物组；
该检测引物组包括一检测外引物对、一检测内引物对和一检测环引物对，该检测外引物对由如SEQ ID NO.01所示的正向检测外引物和如SEQ ID NO.02所示的反向检测外引物组成，该检测内引物对由如SEQ ID NO.03所示的正向检测内引物和如SEQ ID NO.04所示的反向检测内引物组成，该检测环引物对由如SEQ ID NO.05所示的正向检测环引物和如SEQID NO.06所示的反向检测环引物组成；
该内标引物组包括一内标外引物对、一内标内引物对和一内标环引物对，该内标外引物对由如SEQ ID NO.07所示的正向内标外引物和如SEQ ID NO.08所示的反向内标外引物组成，该内标内引物对由如SEQ ID NO.09所示的正向内标内引物和如SEQ ID NO.010所示的反向内标内引物组成，该内标环引物对由如SEQ ID NO.11所示的正向内标环引物和如SEQ ID NO.12所示的反向内标环引物组成。
2.如权利要求1所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述检测外引物对、检测内引物对和检测环引物对的摩尔比为1-2∶4-8∶2-4。
3.如权利要求1所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述内标外引物对、内标内引物对和内标环引物对的摩尔比为1-2∶4-8∶2-4。
4.如权利要求1至3中任一权利要求所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于：还包括DNA聚合酶、LAMP反应液、内标、阳性对照和阴性对照。
5.如权利要求4所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
6.如权利要求4所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述LAMP反应液中含有浓度为6mM的dNTPs溶液、10×ThermoPol反应缓冲液和浓度为160mM的MgSO4水溶液。
7.如权利要求6所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述dNTPs溶液、10×ThermoPol反应缓冲液和MgSO4水溶液的体积比为8∶4∶3。
8.如权利要求4所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为含有猪伪狂犬病毒gB基因片段的T载体克隆。
9.如权利要求4所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述阴性对照为超纯水。
10.如权利要求4所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述内标为含有猪伪狂犬病毒DBP基因片段的T载体克隆。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112176102A (zh) * 2020-09-08 2021-01-05 华南农业大学 一种离心式微流控芯片结合环介导等温扩增技术用于猪伪狂犬病毒检测的试剂盒
CN113234864A (zh) * 2021-06-29 2021-08-10 龙岩学院 猪伪狂犬病毒lamp检测引物组及试剂盒

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CN112176102A (zh) * 2020-09-08 2021-01-05 华南农业大学 一种离心式微流控芯片结合环介导等温扩增技术用于猪伪狂犬病毒检测的试剂盒
CN113234864A (zh) * 2021-06-29 2021-08-10 龙岩学院 猪伪狂犬病毒lamp检测引物组及试剂盒

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