CN116790772A - 一种检测猪呼吸道病原的多重pcr引物组及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多重PCR引物组，由用于扩增链球菌(SS)GDH基因、大肠杆菌(E.coli)ompA基因、胸膜肺炎放线杆菌(APP)APXⅣA基因、巴氏杆菌(Pm)KMT1基因、副猪嗜血杆菌(HPS)ompP2基因的特异性上游引物及下游引物组成，各引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑10所示，本发明还公开了该引物组在制备猪呼吸道病原检测试剂盒中的应用以及一种检测猪呼吸道病原的方法。本发明实现了对SS、E.coli、APP、Pm、HPS五种猪呼吸道病原的单管一次性PCR检测，具有准确性高、特异性强、灵敏性好等优点。

Description

一种检测猪呼吸道病原的多重PCR引物组及其应用
技术领域
本发明属于病原检测领域，具体涉及一种检测猪呼吸道病原的多重PCR引物组，本发明还涉及该引物组在制备猪呼吸道病原检测试剂盒中的应用，以及一种非诊断目的检测猪呼吸道病原的方法。
背景技术
猪呼吸道疾病一直是困扰我国养猪业的一大难题，猪患病后生长速度和饲料利用率降低、食欲减退，虽然总体死亡率不高，但可严重影响猪场的经济效益。猪呼吸道疾病病因复杂，临床上多是由于混合感染，链球菌(SS)，大肠杆菌(E.coli)、胸膜肺炎放线杆菌(APP)，巴氏杆菌(Pm)，副猪嗜血杆菌(HPS)是目前猪群中主要流行的导致猪呼吸道疾病的传染病原。目前临床上对这些病原的检测主要是细菌分离鉴定和分子生物学方法，细菌分离鉴定耗费时间过长，分子生物学方法检测周期短，准确性高，尤其是多重PCR能在同一个反应体系中实现对多个目的片段的扩增，可同时检测多种病原菌，大大节约了检测成本和周期。但是现有的PCR方法都是对其中的一个或几个病原菌进行检测，且目前很多检测是针对16SrDNA设计引物，虽然16SrDNA高度保守但是不同细菌的16SrDNA同源性较高，容易出现假阳性。
链球菌的毒力因子主要有CPS、MRP、EF、GDH等，其中GDH蛋白的编码基因在不同血清型的链球菌中高度保守，同源性约为96％～100％，并且GDH基因在链球菌中是高拷贝。大肠杆菌毒力因子众多有几十种，临床上分离出的大肠杆菌毒力因子差异巨大，猪中分离出的肠外大肠杆菌ompA检出率为100％。猪胸膜肺炎放线杆菌有四种APX毒素基因分别是APXⅠ、APXⅡ、APXⅢ以及APXⅣA，不同血清型的APXⅠ、APXⅡ、APXⅢ是不同的，这三种毒力基因并不存在于所有血清型，而APXⅣA则在不同血清型中高度保守，而且APXⅣA只特异性存在于猪胸膜肺炎放线杆菌，在其他放线杆菌中检测不到。巴氏杆菌有很多不同的血清型，不同血清型的毒力因子也有所不同，用KMT1基因克隆片段与巴氏杆菌PstⅠ酶切片段进行杂交，发现其抗原能与所有巴氏杆菌杂交，因此KMT1基因为巴氏杆菌的种特异性基因。副猪嗜血杆菌血清型众多，至少可分为15个血清型，目前对副猪嗜血杆菌的毒力因子还未有明确的定义，但对于多数细菌而言，荚膜、菌毛、外膜蛋白、脂多糖等被认为是重要的毒力因子，其中副猪嗜血杆菌的OMP是重要的毒力因子之一，分为生物型1型和生物型2型，健康猪分离到的副猪嗜血杆菌OMP多为1型，发病猪分离到的副猪嗜血杆菌OMP多为2型，ompP2是一种参与副猪嗜血杆菌致病过程的多功能蛋白，在副猪嗜血杆菌引起的疾病发病机制中发挥着重要作用，并且副猪嗜血杆菌ompP2的基因也高度保守。
经检索，目前针对猪呼吸道疾病上述五种病原同时进行检测的PCR方法尚未有报道，基于此，我们设计了一种多重PCR引物，能快速且准确的检测出SS、E.coli、APP、Pm、HPS五种病原菌，并选择链球菌的GDH基因，大肠杆菌的ompA基因，猪胸膜肺炎放线杆菌的APXⅣA基因，巴氏杆菌的KMT1基因和副猪嗜血杆菌的ompP2基因作为引物设计靶标，所设计的检测引物具有特异性高，灵敏度好等优点。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术存在的不足，在于提供一种可以同时检测SS、E.coli、APP、Pm、HPS五种猪呼吸道病原的多重PCR引物，解决临床检测过程中效率低耗费时间长等问题。
本发明是这样实现的：
申请人针对猪链球菌(SS)的GDH基因序列、大肠杆菌(E.coli)的ompA基因序列、猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)的APXⅣA基因序列、猪巴氏杆菌(Pm)的KMT1基因序列、副猪嗜血杆菌(HPS)的ompP2基因序列，根据多重PCR引物设计原则，设计了多组引物，以含有上述五个基因的重组质粒为模板，根据PCR扩增的准确性、特异性和灵敏性对所设计的多组引物进行筛选，最终得到一组多重PCR引物组合，其中：
序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2的引物为检测链球菌的上游、下游引物；
序列为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4的引物为检测大肠杆菌的上游、下游引物；
序列为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6的引物为检测胸膜肺炎放线杆菌的上游、下游引物；
序列为SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8的引物为检测巴氏杆菌的上游、下游引物；
序列为SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10的引物为检测副猪嗜血杆菌的上游、下游引物。本发明设计的引物组能在一个PCR反应体系(单管一次性)中实现对五种猪呼吸道病原的扩增，极大地提高了扩增效率，且扩增产物条带相互之间无干扰且亮度高，无非特异性条带，因此具有很高的准确性、特异性和灵敏性。该引物组可用于SS、E.coli、APP、Pm、HPS的检测及制备猪呼吸道病原检测试剂盒。
多重PCR不同于普通PCR，多重PCR的反应体系和反应条件影响二聚体、非特异性扩增以及扩增产物条带，因此相较引物，PCR的反应体系和条件对扩增效果的影响同样重要，基于此，我们继续对五重PCR的反应体系和条件进行了优化，最终得到反应体系和反应条件如下：
反应体系：模板5uL、多重PCR引物组10uL(每条引物各1uL)、Mix液25uL、ddH2O10uL，总计50uL。其中，所述Mix液含10U的Taq酶，1.5mM的Mg2+，0.35mM的dNTP。
反应条件：94℃5min、94℃30S、55℃30S、72℃90S、72℃10min、4℃2h，其中94℃30S、55℃30S、72℃90S各循环35次。
最终，本发明建立的PCR方法能特异性扩增SS、E.coli、APP、Pm、HPS产物，而对葡萄球菌，支原体，繁殖与呼吸综合征病毒，圆环2型病毒，圆环3型病毒，伪狂犬病毒，枯草芽孢杆菌等其它猪呼吸道病原无扩增产物，方法具有很高的特异性；同时，本发明建立的PCR方法产物条带清晰，对SS质粒的最低检测量为103拷贝，对E.coli质粒的最低检测量为104拷贝，对APP质粒的最低检测量为102拷贝，对Pm质粒的最低检测量为103拷贝，对HPS质粒的最低检测量为103拷贝；对SS、E.coli、APP、Pm、HPS核酸的检出限度为20pg/uL，方法也具有很高的敏感性。
本发明的有益效果是：
(1)本发明首次实现了对SS、E.coli、APP、Pm、HPS五种猪呼吸道病原的单管一次性PCR检测，有利于更好地诊断猪呼吸道疾病，有针对性地进行疾病防控，另外也更有利于开展这五种病原的实验室筛查鉴定。
(2)本发明提供了一种用于检测猪呼吸道病原的多重PCR引物组，丰富了引物种类，为临床检测提供了更多的选择。在本发明中，尽管引物所针对的靶基因都是已知的，但没有人将这些靶基因用于多重PCR，本发明针对这些靶基因进行引物筛选，最终实现了多重PCR检测目的。
(3)本发明提供的引物和检测方法具有准确性高、特异性强、灵敏性好等优点。
(4)本发明还具有方法简便、快捷等优点。
附图说明
图1是SS、E.coli、APP、Pm、HPS复合PCR最佳引物组合筛选试验，图中：M：DL2000DNA Marker；1-3:使用第一组引物扩增，模版浓度分别为107拷贝，106拷贝，105拷贝；4-6:使用第二组引物扩增，模版浓度为107拷贝，106拷贝，105拷贝；7-9:使用第三组引物扩增，模版浓度为107拷贝，106拷贝，105拷贝。
图2是SS、E.coli、APP、Pm、HPS复合PCR反应体系优化试验，图中：M：DL2000DNAMarker；1-16分别与表2四因素四水平正交试验表的1-16号对应。
图3是SS、E.coli、APP、Pm、HPS单重PCR退火温度范围确定，从左至右分别是SS、E.coli、APP、Pm、HPS的单重PCR，温度分别是36℃，42℃，48℃，54℃，60℃，66℃。
图4是SS、E.coli、APP、Pm、HPS复合PCR反应条件优化试验，图中：M：DL2000DNAMarker；1-9分别与表3三因素三水平正交试验表的1-9号对应。
图5是复合PCR对SS、E.coli、APP、Pm、HPS五种质粒的敏感性试验。图中：M：DL2000DNA Marker；1-11泳道：模版拷贝数为109拷贝-10-2拷贝。
图6是复合PCR的对SS、E.coli、APP、Pm、HPS五种菌液核酸的敏感性试验，M：DL2000DNAMarker；1-7：菌液核酸浓度为20ng/uL，2ng/uL，200pg/uL，20pg/uL，2pg/uL，0.2pg/uL，0.02pg/uL的模版。
图7是SS、E.coli、APP、Pm、HPS复合PCR特异性试验，图中：M：DL2000 DNA Marker；1:SS、E.coli、APP、Pm、HPS混合模版；2:SS；3:E.coli；4:APP；5:Pm；6:HPS；7：葡萄球菌；8：支原体；9：繁殖与呼吸综合征病毒；10：圆环2型病毒；11：圆环3型病毒；12：伪狂犬病毒；13：枯草芽孢杆菌；14：阴性对照。
图8是SS、E.coli、APP、Pm、HPS复合PCR重复性试验，图中：M：DL2000 DNA Marker；1-7：相同模版的7次扩增。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明的试验流程主要包括以下步骤：
1)SS、E.coli、APP、Pm、HPS复合PCR引物组合筛选：根据复合PCR引物设计原则设计多组复合PCR引物并进行比较，选择最终引物组合；
2)复合PCR反应体系的确定：针对rTaq酶、dNTPs、引物总体积和Mg2+的组合进行四因素水平正交试验；
3)复合PCR反应条件的确定：对复合PCR退火温度、循环数、延伸时间进行优化，确定最终的PCR反应条件；
4)对确定的检测方法进行验证，包括敏感性、特异性、重复性等。
实施例1：复合PCR引物组合筛选
1.引物设计
首先从NCBI检索链球菌完整GDH基因序列、大肠杆菌完整ompA基因序列、猪胸膜肺炎放线杆菌完整APXⅣA基因序列、巴氏杆菌KMT1完整基因序列、副猪嗜血杆菌完整ompP2序列，然后将所有序列下载后导入CLC Genomics Workbench后分别对所有序列进行比对，分析每个基因的保守序列，从保守度高的序列处设计引物，每条引物最多允许有一个碱基错配，根据多重PCR引物设计原则，共筛选出三组引物，见表1。
表1复合PCR引物
2.多重PCR引物筛选
(1)五个基因重组表达质粒的制备
在NCBI检索链球菌完整GDH基因序列、大肠杆菌完整ompA基因序列、猪胸膜肺炎放线杆菌完整APXⅣA基因序列、巴氏杆菌KMT1完整基因序列、副猪嗜血杆菌完整ompP2序列后下载并从每个序列的两端设计引物，扩增出完整的序列后将序列连接到pMD19-T载体上，并导入大肠杆菌，挑选阳性菌落扩大培养提取质粒。
(2)表达质粒的混合(不同浓度模版的配制)
将提取的质粒测定浓度后，计算每种质粒的拷贝数，将五种质粒分别稀释到1010拷贝后备用。将五种质粒与水按照1:1:1:1:1:5比例混合，配制成每种质粒为109拷贝的模版，再进行10倍稀释，最终配制成拷贝数为109—10-2的模版。
(3)PCR扩增
反应体系：2×PCR SuperMix(+dye)25uL，上游引物及下游引物各2uL(共20uL)，模版5uL，总体系50uL。
反应程序：94℃5min、94℃30S、56℃30S、72℃90S、72℃10min、4℃2h；其中94℃30S、56℃30S、72℃90S各循环35次。
3.试验结果
从图1可以看出，使用第一组引物能够扩增出GDH、ompA、APXⅣA、KMT1、ompP2五个基因；使用第二组引物无法扩增出APXⅣA基因，且ompA基因、KMT1基因、ompP2基因的扩增条带的亮度均不如第一组引物；使用第三组引物不仅ompA基因、KMT1基因、ompP2基因的扩增条带的亮度不如第一组引物，而且还在KMT1基因与ompP2基因之间存在非特异性扩增。因此从准确性、特异性和灵敏性综合比较，选择第一组引物为复合PCR最佳引物组合并在此基础上优化反应体系和条件。
实施例2复合PCR反应体系和条件的优化
多重PCR的反应体系和反应条件影响二聚体、非特异性扩增以及扩增产物条带，因此相较引物，PCR的反应体系和条件对扩增效果的影响同样重要，基于此，我们继续对五重PCR的反应体系和条件进行了优化。
1.SS、E.coli、APP、Pm、HPS复合PCR反应体系的优化
(1)四因素四水平正交试验表的设计，见表2。
表2四因素四水平正交试验表
(2)复合PCR扩增
反应体系：见上表。所用试剂Taq DNAPolymerase浓度为5U/uL，Mg2+浓度为1mM/uL，dNTP为0.2mM/uL。
反应程序：94℃5min、94℃30S、56℃30S、72℃90S、72℃10min、4℃2h；其中94℃30S、56℃30S、72℃90S各循环35次。
(3)实验结果和分析
结果如图2所示，第14号能够扩增出GDH、ompA、APXⅣA、KMT1、ompP2五个基因且条带亮度最高，因此确定14号为最佳组合体系。最佳试剂组合为：在25uL MIX中含有10U的Taq酶，1.5mM的Mg2+，dNTP 0.35mM，引物总体积10uL。
2.SS、E.coli、APP、Pm、HPS复合PCR条件的优化
再对复合PCR退火温度、循环数、延伸时间等进行优化，具体方法如下：
(1)首先确定最佳退火温度范围，使用单重PCR分别以36℃、42℃、48℃、54℃、60℃、66℃为退火温度，扩增SS、E.coli、APP、Pm、HPS的核酸，确定退火温度范围。
结果如图3所示，链球菌单重PCR最佳退火温度范围是36℃至66℃，大肠杆菌单重PCR最佳退火温度范围是36℃至60℃，猪胸膜肺炎放线杆菌单重PCR最佳退火温度范围是36℃至60℃，巴氏杆菌单重PCR最佳退火温度范围是36℃至66℃，副猪嗜血杆菌单重PCR最佳退火温度范围是54℃至66℃。根据菌单重PCR的退火温度范围确定SS、E.coli、APP、Pm、HPS复合PCR的最佳退火温度范围为54℃至60℃。
(2)采用三因素三水平正交试验确定SS、E.coli、APP、Pm、HPS复合PCR的最佳反应条件。
表3三因素三水平正交试验表
(3)试验结果和分析
结果如图4所示，第1，4，8，9号反应条件的组合扩增效果较好，根据复合PCR反应的敏感性以及反应程序的简便和通用性，最终确定最佳反应条件组合为9号，即PCR扩增条件为：94℃5min、94℃30S、55℃退火30S、72℃延伸90S、72℃10min、4℃2h；其中94℃30S、55℃30S、72℃90S各循环35次。
通过以上试验，最终确定以下PCR反应体系和条件，不仅能实现五种病原的检测，而且无非特异性扩增，特异性扩增条带亮度高，最终提高了检测的特异性和敏感性，而且还具有扩增效率高等优点。
表4复合PCR最佳反应体系
PCR扩增条件为：94℃5min、94℃30S、55℃30S、72℃90S、72℃10min、4℃2h；其中94℃30S、55℃30S、72℃90S各循环35次。
实施例3敏感性试验
使用复合PCR的最佳反应体系和条件，进行敏感性试验的扩增，具体方法如下：
1.对质粒的检测敏感性
首先制备不同拷贝数的质粒模版，将提取的质粒测定浓度后，计算每种质粒的拷贝数，首先将五种质粒分别稀释到1010拷贝后再将五种质粒与水按照1:1:1:1:1:5比例混合，配制成每种质粒为109拷贝的模版，再进行10倍稀释，最终配制成拷贝数为109—10-2的模版。使用最佳反应体系和最佳扩增条件，扩增制备好的不同拷贝数的质粒模版。
结果见图5，可以看出：链球菌最低检测量为103拷贝，大肠杆菌最低检测量为104拷贝，胸膜肺炎放线杆菌最低检测量为102拷贝，巴氏杆菌最低检测量为103拷贝，副猪嗜血杆菌最低检测量为103拷贝。
2.对菌液的检测敏感性
首先制备不同浓度菌液核酸模版，将培养的五种细菌分别提取核酸，并测定每种细菌的核酸浓度。将五种细菌的核酸浓度均稀释为100ng/uL，然后将五种细菌的核酸按照1:1:1:1:1比例混合，得到每种细菌核酸浓度为20ng/uL的模版。再对制备此模版进行10倍梯度稀释，最终得到浓度为20ng/uL，2ng/uL，200pg/uL，20pg/uL，2pg/uL，0.2pg/uL，0.02pg/uL的混合模版。使用最佳反应体系和反应条件，扩增制备好的不同浓度的菌液核酸模版。
结果见图6，从中可以看出：多重PCR对SS、E.coli、APP、Pm、HPS五种核酸的检出限度为20pg/uL。
实施例4特异性试验
使用复合PCR的最佳反应体系和条件，进行特异性试验研究。使用复合PCR最佳反应体系和条件分别以SS、E.coli、APP、Pm、HPS五种核酸混合，SS核酸，E.coli核酸，APP核酸，Pm核酸，HPS核酸，葡萄球菌核酸，支原体核酸，繁殖与呼吸综合征病毒核酸，圆环2型病毒核酸，圆环3型病毒核酸，伪狂犬病毒核酸，枯草芽孢杆菌核酸，双蒸水为模版进行扩增，验证复合PCR的特异性。
结果见图7，葡萄球菌核酸，支原体核酸，繁殖与呼吸综合征病毒核酸，圆环2型病毒核酸，圆环3型病毒核酸，伪狂犬病毒核酸，枯草芽孢杆菌核酸，双蒸水均未出现非特异性扩增，特异性良好。
实施例5重复性试验
将培养的不同批次的五种细菌分别提取核酸后混合，使用复合PCR最佳反应体系和条件，以混合后的SS、E.coli、APP、Pm、HPS五种核酸为模版进行7次重复性试验。
结果见图8，对SS、E.coli、APP、Pm、HPS进行7次重复试验，7次扩增结果一致，说明重复性良好。
所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种多重PCR引物组，其特征在于：由用于扩增链球菌(SS)GDH基因、大肠杆菌(E.coli)ompA基因、胸膜肺炎放线杆菌(APP)APXⅣA基因、巴氏杆菌(Pm)KMT1基因、副猪嗜血杆菌(HPS)ompP2基因的特异性上游引物及下游引物组成，各引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.1-10所示。
2.权利要求1所述的多重PCR引物组在制备猪呼吸道病原检测试剂盒中的应用，所述猪呼吸道病原包括SS、E.coli、APP、Pm、HPS。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述检测试剂盒是检测猪呼吸道病原的单管一次性多重PCR试剂盒。
4.一种检测猪呼吸道病原的单管一次性多重PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的多重PCR引物组。
5.如权利要求4所述的单管一次性多重PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括含有Taq酶，Mg2+，dNTP的Mix液。
6.权利要求4或5所述的试剂盒在非诊断目的检测猪呼吸道病原中的应用。
7.一种非诊断目的检测猪呼吸道病原的方法，其特征在于包括以下步骤：提取待测样品的核酸，以提取的核酸为模板，加入权利要求1所述的多重PCR引物组、Mix液，配制反应体系并进行PCR扩增，根据扩增条带对猪呼吸道病原进行检测。
8.如权利要求7所述检测猪呼吸道病原的方法，其特征在于：所述PCR扩增条件为94℃5min、94℃30S、55℃30S、72℃90S、72℃10min、4℃2h，其中94℃30S、55℃30S、72℃90S各循环35次。
9.如权利要求7所述检测猪呼吸道病原的方法，其特征在于，所述反应体系如下：模板5uL、多重PCR引物组10uL、Mix液25uL、ddH2O 10uL，总计50uL。
10.如权利要求9所述检测猪呼吸道病原的方法，其特征在于：所述Mix液含10U的Taq酶，1.5mM的Mg2+，0.35mM的dNTP。
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