CN112501329B

CN112501329B - 用于滑液支原体鉴定的特有功能基因、核酸染料qPCR引物、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN112501329B
Application number: CN202011570899.2A
Authority: CN
Inventors: 徐彬; 张小飞; 卢凤英; 孙华伟; 刘传敏; 张敬峰; 潘群兴; 吴凤瑶
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-12-26
Filing date: 2020-12-26
Publication date: 2023-04-11
Anticipated expiration: 2040-12-26
Also published as: CN112501329A

Abstract

本发明公开了用于滑液支原体鉴定的特有功能基因、核酸染料qPCR引物、试剂盒及其应用，基于核酸染料qPCR鉴定滑液支原体的引物为正向引物VY2250F、反向引物VY2250R组成的引物对和/或正向引物VY2300F、反向引物VY2300R组成的引物对，通过核酸染料qPCR检测滑液支原体的特有功能基因VY93_RS02250基因和/或VY93_RS02300基因以鉴定滑液支原体，当检测样品检测不到C_T值时，则判定滑液支原体核酸阴性；当检测样品的C_T值≤35，出现典型的S型扩增曲线，判定滑液支原体核酸阳性；当检测样品的C_T值>35，或虽然C_T值≤35但扩增曲线不显著，则建议对样品进行复检。本发明鉴定方法简单，引物检测准确度高、特异性高、敏感性高、重复性强，且成本低，对滑液支原体的临床确诊和推广应用具有重要意义。

Description

用于滑液支原体鉴定的特有功能基因、核酸染料qPCR引物、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及用于滑液支原体鉴定的特有功能基因、核酸染料qPCR引物、试剂盒及其应用。

背景技术

滑液支原体(Mycoplasma synoviae)是一种重要的禽病病原，其能造成鸡、火鸡等家禽的慢性呼吸道症状、生长迟缓、关节肿胀、产蛋量下降等症状，导致饲料转化率降低、屠体废弃率升高、生产效率降低，给家禽养殖业造成严重的经济损失。滑液支原体传播迅速，各年龄段的鸡均可被感染和发病。滑液支原体的感染也增加其他病原对鸡只的致病性，鸡只一旦感染，终身带菌，难以用药物去除，这给针对该病原的治疗和净化带来严重考验。

现阶段针对滑液支原体的核酸染料qPCR检测方法仅有国外Jarquin等人创立的以滑液支原体16S rRNA的DNA序列为靶标的方法(参考文献：Jarquin R,Schultz J,HanningI,Ricke SC(2009)Development of a real-time polymerase chain reaction assayfor the simultaneous detection of Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasmasynoviae under industry conditions.Avian Dis 53(1)：73-77.doi：10.1637/8445-080808-Reg.1)。16S rRNA属于所有物种的共有基因，现已研究表明在很多近似物种中，针对16S rRNA的检测方法会出现对其他病原的交叉反应；比如，Mekkes等人建立的针对鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum)的16S rRNA检测方法就发现能非特异的检测出模仿支原体(Mycoplasma imitans)(参考文献：Mekkes DR,Feberwee A(2005)Real-timepolymerase chain reaction for the qualitative and quantitative detection ofMycoplasma gallisepticum.Avian Pathol 34(4)：348-354.doi：10.1080/03079450500179954)。多项研究也表明，针对单一基因位点多病原检测，会出现由于病原基因引物区突变、近似物种病原基因非特异性扩增等诸多情况导致结果不可靠(参考文献：Diene SM,Bertelli C,Pillonel T,Jacquier N,Croxatto A,Jaton K,Greub G(2016)Comparative genomics of Neisseria meningitidis strains：new targets formolecular diagnostics.Clin Microbiol Infect 22(6)：568e561-567.doi：10.1016/j.cmi.2016.03.022；Hu F,Rishishwar L,Sivadas A,Mitchell GJ,Jordan IK,MurphyTF,Gilsdorf JR,Mayer LW,Wang X(2016)Comparative Genomic Analysis ofHaemophilus haemolyticus and Nontypeable Haemophilus influenzae and a NewTesting Scheme for Their Discrimination.J Clin Microbiol 54(12)：3010-3017.doi：10.1128/jcm.01511-16)。为了临床上更准确的病原鉴定，针对滑液支原体的多个不同基因特别是特有编码基因的核酸染料qPCR检测方法需要建立。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供了用于鉴定滑液支原体鉴定的特有功能基因VY93_RS02250和/或VY93_RS02300，并基于两个滑液支原体特有功能基因设计了高特异性、高准确度、高敏感性、且可重复性高的基于核酸染料qPCR鉴定滑液支原体的引物、试剂盒及其应用。

为实现上述技术目的，本发明采取的技术方案为：

本发明提供了用于滑液支原体鉴定的特有功能基因，特有功能基因为VY93_RS02250和/或VY93_RS02300，VY93_RS02250的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，VY93_RS02300的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种基于核酸染料qPCR鉴定滑液支原体的引物，引物为检测滑液支原体VY93_RS02250基因的qPCR引物，VY93_RS02250基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，检测VY93_RS02250基因的qPCR引物为SEQ ID NO.3所示的正向引物VY2250F和SEQ IDNO.4所示的反向引物VY2250R。

本发明还提供了一种基于核酸染料qPCR鉴定滑液支原体的引物，引物为检测滑液支原体VY93_RS02300基因的qPCR引物，VY93_RS02300基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，检测VY93_RS02300基因的qPCR引物为SEQ ID NO.5所示的正向引物VY2300F和SEQ IDNO.6所示的反向引物VY2300R。

本发明还提供了一种基于核酸染料qPCR鉴定滑液支原体的引物组合，包括检测VY93_RS02250基因的qPCR引物和检测VY93_RS02300基因的qPCR引物，VY93_RS02250的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，VY93_RS02300的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，检测VY93_RS02250基因的qPCR引物为SEQ ID NO.3所示的正向引物VY2250F和SEQ ID NO.4所示的反向引物VY2250R，检测VY93_RS02300基因的qPCR引物为SEQ ID NO.5所示的正向引物VY2300F和SEQ ID NO.6所示的反向引物VY2300R。

本发明还提供了一种基于核酸染料qPCR的滑液支原体鉴定试剂盒，包括检测VY93_RS02250基因的qPCR引物对VY2250F和VY2250R，通过核酸染料qPCR检测VY93_RS02250基因以鉴定滑液支原体，当检测样品检测不到C_T值，则判定滑液支原体核酸阴性；当检测样品的C_T值≤35，出现典型的S型扩增曲线，判定滑液支原体核酸阳性；当检测样品的C_T值>35，或虽然C_T值≤35但扩增曲线不显著，则建议对样品进行复检。

本发明还提供了一种基于核酸染料qPCR的滑液支原体鉴定试剂盒，包括检测VY93_RS02300基因的qPCR引物对VY2300F和VY2300R，通过核酸染料qPCR检测VY93_RS02300基因以鉴定滑液支原体，当检测样品检测不到C_T值，则判定滑液支原体核酸阴性；当检测样品的C_T值≤35，出现典型的S型扩增曲线，判定滑液支原体核酸阳性；当检测样品的C_T值>35，或虽然C_T值≤35但扩增曲线不显著，则建议对样品进行复检。

本发明还提供了一种基于核酸染料qPCR的滑液支原体鉴定试剂盒，包括引物组合VY2250F和VY2250R、VY2300F和VY2300R，通过对同一样品的平行样采用核酸染料qPCR分别检测VY93_RS02250基因和VY93_RS02300基因以鉴定滑液支原体，当两个检测体系的检测结果一致时，则检测标准为：当检测样品检测不到C_T值，则判定滑液支原体核酸阴性；当检测样品的C_T值≤35，出现典型的S型扩增曲线，判定滑液支原体核酸阳性；当检测样品的C_T值>35，或虽然C_T值≤35但扩增曲线不显著，则建议对样品进行复检；当两个检测体系的检测结果不一致时，则建议对样品进行复检。

进一步地，滑液支原体鉴定试剂盒，其特征在于：还包括TB Green Premix Ex TaqII(Tli RNaseH Plus)(2X)、ROX Reference Dye(50X)、灭菌双蒸水、阳性重组质粒和/或滑液支原体标准株ATCC25204基因组DNA。

进一步地，所述阳性重组质粒为VY2250-pMD-18T重组质粒和/或VY2300-pMD-18T重组质粒。

本发明还提供了引物SEQ ID NO.3所示的正向引物VY2250F和SEQ ID NO.4所示的反向引物VY2250R或SEQ ID NO.5所示的正向引物VY2300F和SEQ ID NO.6所示的反向引物VY2300R或引物组合VY2250F和VY2250R、VY2300F和VY2300R或上述滑液支原体鉴定试剂盒在制备鉴定滑液支原体的产品中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明所建立的核酸染料qPCR方法特异性高，BLASTN验证引物VY2250F和VY2250R作为引物对、VY2300F和VY2300R作为引物对均不能匹配除滑液支原体外其他物种；实验验证不存在与鸡的正常组织及已知重要禽细菌/支原体性病原，如大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、鸡毒支原体发生交叉反应；

(2)本发明所建立的核酸染料qPCR方法准确性高，针对滑液支原体两个特有的保守功能基因VY93_RS02250和VY93_RS02300分别进行检测，确保阳性结果为滑液支原体；

(3)本发明所建立的核酸染料qPCR方法可重复性强，将阳性重组质粒标准品进行倍比稀释，DNA拷贝数与C_T值做标准曲线，引物对VY2250F和VY2250R、VY2300F和VY2300R标准曲线的R²均大于0.99；用同一拷贝数阳性重组质粒样品做10次独立重复试验，引物对VY2250F和VY2250R、VY2300F和VY2300R所测定的C_T值的标准差均不高于0.52；

(4)本发明所建立的核酸染料qPCR方法敏感性高，10次独立重复试验，引物对VY2250F和VY2250R对每个反应中不低于10个拷贝的阳性重组质粒DNA得出100％阳性检测，引物对VY2300F和VY2300R对每个反应中不低于5个拷贝的阳性重组质粒DNA得出100％阳性检测；

(5)相对于探针qPCR检测方法，核酸染料qPCR检测方法在经济上更实惠，对滑液支原体的临床确诊和推广应用具有重要意义。

附图说明

图1是本发明的VY93_RS02250和VY93_RS02300基因位置图；

图2是本发明实施例2的不同拷贝数阳性重组质粒与灭菌双蒸水的扩增曲线；

图3是本发明实施例2的重复性检测结果；

图4是本发明实施例2的敏感性检测结果；

图5是本发明实施例2的20株滑液支原体临床分离株的核酸染料qPCR检测结果；

图6是本发明实施例2中其中1株滑液支原体临床分离株、其他6种病原各一株及其阴、阳性对照的核酸染料qPCR检测结果；

图7是本发明实施例3中8份滑液支原体阳性感染病料样品、2份阴性健康鸡样品、阳性对照滑液支原体标准株ATCC25204、阴性对照灭菌双蒸水的核酸染料qPCR检测结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本技术领域常规试剂、方法和设备。

下述实施例中所用的20株滑液支原体临床分离株、3株鸡毒支原体、6株金黄色葡萄球菌、4株禽致病性大肠杆菌、2株鸡白痢沙门氏菌、3株鸡伤寒沙门氏菌、3株鼠伤寒沙门氏菌，均可从江苏省农业科学院兽医研究所获得。

实施例1：用于核酸染料qPCR鉴定滑液支原体的引物设计

1.1、核酸染料qPCR靶标基因的确定

VY93_RS02250和VY93_RS02300均编码未知功能的假定蛋白(Hypotheticalprotein)，因此用其在标准株ATCC25204(GenBank编号：NZ_CP011096)中的基因编号代表其基因名。经过BLASTP同源性比对，确定VY93_RS02250和VY93_RS02300的氨基酸序列在GenBank中已公布全基因组序列的六株滑液支原体(ATCC 25204、NCTC10124、HN01、MS-H、53、86079/7NS)中的同源性分别不低于99.39％和98.67％，且不能匹配GenBank数据库中除滑液支原体外其他任何蛋白氨基酸序列，说明这两个基因是滑液支原体的特有功能基因。

经过BLASTN同源性分析，确定VY93_RS02250和VY93_RS02300核苷酸序列在GenBank中已公布全基因组序列的六株滑液支原体中的同源性分别不低于99.43％和99.08％，且匹配的GenBank数据库中除滑液支原体外其他任何基因核苷酸序列，均不能达到序列覆盖率>40％且E值<10^-3的阈值，说明这两个基因在核苷酸水平上也是特有基因。这两个基因位于两个管家基因EF-Ts和EF-P之间，上下游基因排序在六株已公布全基因组序列的滑液支原体中高度一致，且EF-Ts和EF-P基因之间没有转座元件(图1)。因此，本申请的VY93_RS02250和VY93_RS02300不具有序列丢失情况，是滑液支原体的保守基因，可以作为核酸染料qPCR检测的理想靶标。

同时，提取江苏省农业科学院兽医研究所保存的20株滑液支原体临床分离株的基因组DNA，经核酸染料qPCR检测，发现VY93_RS02250和VY93_RS02300基因均存在于20株滑液支原体中(实施例2)。这也进一步说明VY93_RS02250和VY93_RS02300是滑液支原体的保守基因。

滑液支原体特有功能基因VY93_RS02250和VY93_RS02300的核苷酸序列如下：

VY93_RS02250基因：

VY93_RS02300基因：

1.2、引物对VY2250F和VY2250R、VY2300F和VY2300R的设计

本发明所用两个引物对VY2250F和VY2250R、VY2300F和VY2300R是利用CD-HIT快速聚类分析、BLAST同源性比对等方法对滑液支原体相对其他物种特有功能基因查找和确定，并针对滑液支原体特有基因VY93_RS02250和VY93_RS02300为靶标设计的，并由南京擎科生物科技有限公司合成。两个引物对的序列信息如下：

VY93_RS02250基因：

正向引物VY2250F：5′-ATTGCTTGTGCTAGCGTTTATCC-3′(SEQ ID NO.3)；

反向引物VY2250R：5′-ATTTGGTGGCGCTAAATTAACC-3′(SEQ ID NO.4)；

VY93_RS02300基因：

正向引物VY2300F：5′-GCTGGCCCAAGATGTATTAGAC-3′(SEQ ID NO.5)；

反向引物VY2300R：5′-CCTTTTCATAGTTTGATTCAGGATT-3′(SEQ ID NO.6)。

实施例2：引物在滑液支原体鉴定中的应用

2.1、滑液支原体培养基的制备

滑液支原体培养基(改良Fery式培养基)：基础液100mL，25％酵母浸出液10％，辅酶I(NAD)0.01％，酚红0.002％，猪血清15％，盐酸半胱氨酸0.01％，青霉素10万单位，醋酸铊0.01％，用NaOH溶液调pH至7.7～7.8；

其中，基础液的配置为：NaCl 2.5g，Na₂HPO₄·12H₂O 0.8g，KCl 0.2g，MgSO₄·7H₂O0.1g，KH₂PO₄ 0.05g，葡萄糖5.0g，去离子水500mL，乳蛋白水解物2.5g，115℃经高压灭菌20min。

2.2、阳性重组质粒的构建和提取

2.2.1、PCR扩增VY93_RS02250和VY93_RS02300基因片段

以提取的滑液支原体标准株ATCC25204(购自中国兽用微生物菌种保藏中心(CVCC)，菌种保藏编号：CVCC385)基因组DNA为模板，以引物对VY2250F和VY2250R，或者VY2300F和VY2300R分别进行普通PCR扩增，以获得VY93_RS02250和VY93_RS02300的基因片段；

普通PCR扩增反应体系(20μL)为：2×Taq Plus Master MixⅡ(Dye Plus)(购自诺唯赞公司，产品目录号：P213-01)10μL，DNA模板1μL，正反向引物(VY2250F和VY2250R，或者VY2300F和VY2300R)各1μL，其余用灭菌双蒸水补齐；

普通PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min，95℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 10s，30个循环，72℃延伸10min。

2.2.2、构建VY2250-pMD-18T重组质粒和VY2300-pMD-18T重组质粒

采用pMD18-T Vector Cloning Kit(TaKaRa公司，产品目录号：6011)，将上述VY93_RS02250和VY93_RS02300基因片段分别连接至pMD-18T载体上以构建VY2250-pMD-18T重组质粒和VY2300-pMD-18T重组质粒；将重组质粒分别转化到大肠杆菌DH5α中，并将菌液送南京擎科生物科技有限公司测序，经公司测序鉴定确为含有滑液支原体相应DNA片段的阳性重组质粒；含有阳性重组质粒的DH5α阳性菌株置于-80℃冰箱保存备用。

2.2.3、阳性重组质粒的提取

采用

Plasmid Mini Kit I(购自OMEGA公司，产品目录号：D6943-02)按着用户手册从阳性菌株中提取阳性重组质粒。

2.3、基因组DNA提取

2.3.1、基因组DNA提取前样品处理

情况一、当检测样品为疑似滑液支原体病原培养液时，检测组及其阳性对照组、阴性对照组的样品处理

检测组：取待检疑似滑液支原体病原培养液，以1：100转接至步骤2.1所述滑液支原体培养基中并于37℃温箱中静置培养；待培养基颜色由红色变为黄色后，将培养基以10000g离心10min收集菌体沉淀；或者直接将待检疑似滑液支原体病原培养液以10000g离心10min离心收集菌体沉淀；然后将菌体沉淀用PBS缓冲液(pH7.4)重悬制成菌悬液后用于基因组DNA的提取；

阳性对照组：选用步骤2.2构建的阳性重组质粒(VY2250-pMD-18T重组质粒和/或VY2300-pMD-18T重组质粒)或选用与检测组相同方法处理获得的滑液支原体标准株ATCC25204菌悬液；

阴性对照组：选用灭菌双蒸水。

情况二、当检测样品为疑似感染滑液支原体的发病鸡只病变组织时，检测组及其阳性对照组、阴性对照组的样品处理

检测组：采集疑似感染滑液支原体的发病鸡只病变跗关节，取跗关节关节囊连带其上方肌腱和腱鞘及周围组织一起，于-20至-80℃冷冻保存或立即送检；也可采集发病鸡只病变的爪垫、气管或输卵管组织做相同处理；然后将待检组织反复冻融2～3次，剪碎，按质量体积比1∶3与PBS缓冲液(pH7.4)混合并置于均质仪(如北京格瑞德曼的GT200组织细胞样品均质仪)中充分均质；均质后样品置于离心机中，以6000g离心5min，取上清液用于基因组DNA的提取；

阳性对照组：选用步骤2.2构建的阳性重组质粒(VY2250-pMD-18T重组质粒和/或VY2300-pMD-18T重组质粒)或选用与情况一检测组相同方法处理的滑液支原体标准株ATCC25204菌悬液；

阴性对照组：选用如上检测组相同方法处理的健康鸡对应部位组织或灭菌双蒸水。

情况三、当检测样品为从疑似感染滑液支原体的发病鸡只病变组织或炎性渗出液分离的疑似滑液支原体病原时，检测组及其阳性对照组、阴性对照组的样品处理

检测组：无菌采集疑似感染滑液支原体的发病鸡只病变跗关节，取跗关节关节囊连带其上方肌腱和腱鞘及周围组织一起，或采集发病鸡只病变的爪垫、气管或输卵管组织，或者用无菌棉签沾取部分病变组织的炎性渗出物；将采集的病料组织剪碎，将剪碎的组织或者沾有炎性渗出物的棉签置于步骤2.1配制的滑液支原体培养基中，于37℃温箱中静置培养；待培养基的颜色由红色变为黄色，将培养基以1：100转接新的滑液支原体培养基在相同培养条件下培养；待第二轮培养的滑液支原体培养基颜色由红色变为黄色后，将培养基以10000g离心10min收集菌体沉淀；将菌体沉淀用PBS缓冲液(pH7.4)重悬后获得菌悬液用于基因组DNA的提取；

阴性对照组：选用灭菌双蒸水。

2.3.2、基因组DNA提取

针对上述步骤2.3.1处理后的检测组、阳性对照组(当阳性对照组选择VY2250-pMD-18T重组质粒和/或VY2300-pMD-18T重组质粒无需进行基因组DNA提取)、阴性对照组(当阴性对照组选择灭菌双蒸水无需进行基因组DNA提取)样品采用如下任一种方法提取基因组DNA：

法1：利用Mycoplasma gDNA Miniprep Kit(BIOMIGA公司，GD3211-01)，并按照试剂盒说明书提取各组样品中的基因组DNA；

法2：人工提取法，包括以下步骤：

a)取步骤2.3.1获得的组织样品上清液或者菌悬液465μL，加入25μL 10％十二烷基硫酸钠和10μL的20mg/mL蛋白酶K，42℃水浴箱上放置1h；

b)加入等量的饱和酚溶液(pH7.9)500μL，振荡混匀20s，4℃冰浴10min，12000g离心5min，取上清液；

c)向步骤b)的上清液中加入等量的酚：氯仿：异戊醇混合液(酚：氯仿：异戊醇的体积比25：24：1)，振荡混匀20s，12000g离心10min后取上层液；

d)向步骤c)的上层液中加入两倍体积的无水乙醇及1/10体积3mol/L乙酸钠，上下颠倒混匀，-20℃沉淀1h；12000g离心10min，弃上清，室温干燥后，加入30μL双蒸水溶解沉淀，即得DNA模板，-20℃保存备用。

随后利用微量分光光度仪，如德国Eppendorf公司的BioPhotometer D30测定样品DNA的浓度。

2.4、核酸染料qPCR反应体系及反应程序

核酸染料qPCR反应体系(20μL)为：TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseHPlus)(2X)(TaKaRa，Code No.：RR820A)10μL，ROX Reference Dye(50X)(TaKaRa，Code No.：RR391A)0.4μL，检测组或阳性对照组或阴性对照组DNA模板(当模板为动物组织样品中直接提取的基因组DNA,模板浓度为＜100ng/μL；当模板为疑似滑液支原体菌株或者滑液支原体标准菌株ATCC25204中提取的基因组DNA或者为VY2250-pMD-18T重组质粒和/或VY2300-pMD-18T重组质粒时，模板浓度为1ng/μL；当阴性对照为灭菌双蒸水时，不加此模板)1μL，正反向引物(VY2250F和VY2250R，或者VY2300F和VY2300R)各1μL，其余用灭菌双蒸水补齐。

核酸染料qPCR反应程序：根据TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(TaKaRa，产品目录号：RR820A)用户手册，将上述核酸染料qPCR反应体系在不同的qPCR仪设置对应的反应标准程序。

2.5、重复性和敏感性检测

采用质粒提取试剂盒(OMEGA公司，产品目录号：D6943-02)从步骤2.2的阳性菌株中重提VY2250-pMD-18T和VY2300-pMD-18T重组质粒，并利用微量分光光度仪测定质粒DNA的浓度；将阳性重组质粒(VY2250-pMD-18T重组质粒和/或VY2300-pMD-18T重组质粒)按每反应体系1×10¹⁰拷贝→10拷贝分别进行qPCR反应；将阳性重组质粒DNA拷贝数的lg值作为横坐标，对应qPCR结果的C_T值作为纵坐标做标准曲线。

结果显示，VY2250F和VY2250R引物检测VY2250-pMD-18T重组质粒的标准曲线为y＝-3.3393x+38.267，R²＝0.9997；VY2300F和VY2300R引物检测VY2300-pMD-18T重组质粒的标准曲线为y＝-3.3269x+38.074，R²＝0.9989。

如图2所示，两对引物在检测不同拷贝数的阳性重组质粒样品时，均出现典型的S型扩增曲线，模板浓度越高，C_T值越小；阴性对照组(灭菌双蒸水为样品，附图标记为H₂O)为一条平滑的直线。

以上结果表明，两个qPCR方法的扩增效果均很好；扩增C_T值能真实反映对应的阳性重组质粒中的基因拷贝数。

用不同拷贝数的阳性重组质粒DNA做10次独立重复试验，评估两个qPCR方法的可重复性；

如图3A和3B所示，当阳性重组质粒DNA拷贝数分别为1000、100和10时，两对引物检测到VY93_RS02250和VY93_RS02300基因片段的C_T值分别为28.41±0.38和28.62±0.42(阳性重组质粒DNA拷贝数为1000)，31.78±0.41和31.58±0.32(阳性重组质粒DNA拷贝数为100)，34.75±0.51和34.57±0.52(阳性重组质粒DNA拷贝数为10)。

以上结果表明，这两个qPCR检测方法均具有较高的可重复性。

用不同拷贝数的阳性重组质粒DNA做10次独立重复试验，对两个qPCR方法的敏感性进行评估；

如图4A和4B所示，引物对VY2250F和VY2250R对每个反应中不低于10个拷贝的阳性重组质粒DNA得出100％阳性检测，引物对VY2300F和VY2300R对每个反应中不低于5个拷贝的阳性重组质粒DNA得出100％阳性检测。

2.6、特异性检测

按照步骤2.4所建立的滑液支原体核酸染料qPCR反应体系及反应程序，同时对20株滑液支原体临床分离株、3株鸡毒支原体、6株金黄色葡萄球菌、4株禽致病性大肠杆菌、2株鸡白痢沙门氏菌、3株鸡伤寒沙门氏菌、3株鼠伤寒沙门氏菌及阳性对照滑液支原体标准株ATCC25204的基因组DNA进行核酸染料qPCR检测，验证核酸染料qPCR方法的特异性；阴性对照组为灭菌双蒸水。

参照步骤2.3对各待检支原体样品及阳性对照样品的基因组DNA进行提取；细菌基因组DNA选用MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0(TaKaRa公司，产品目录号：9763)并按照试剂盒说明书提取；提取的样品基因组DNA作为模板。

按照上述步骤2.4中的核酸染料qPCR反应体系和程序进行核酸染料qPCR反应；共分为三组，三组的区别在于：

VY2250F和VY2250R引物组：核酸染料qPCR反应体系中的正反向引物选择VY2250F和VY2250R；

VY2300F和VY2300R引物组：核酸染料qPCR反应体系中的正反向引物选择VY2300F和VY2300R；

VY2250F和VY2250R+VY2300F和VY2300R引物组：样品进行引物对VY2250F和VY2250R和引物对VY2300F和VY2300R平行检测，综合两对引物的检测结果判断样品是否是滑液支原体/含有滑液支原体核酸。

结果显示，当核酸染料qPCR反应体系使用引物对VY2250F和VY2250R和引物对VY2300F和VY2300R检测20株滑液支原体临床分离株的基因组DNA的C_T值分别为19.28±0.95和19.60±0.98，均具有典型的S型扩增曲线(图5)；检测阳性对照滑液支原体标准株ATCC25204基因组DNA的C_T值也在上述检测20株滑液支原体临床分离株的基因组DNA的C_T值的变化区间，且均具有典型的S型扩增曲线(图6)；检测阴性对照灭菌双蒸水、其他病原的基因组DNA均检测不到C_T值；

如图6A所示，以VY2250F和VY2250R作为引物，参照步骤2.4中的核酸染料qPCR反应体系和程序进行核酸染料qPCR反应，滑液支原体临床分离株基因组DNA(为清楚观察滑液支原体临床分离株基因组DNA样品的扩增曲线情况，仅显示其中一株与阳性对照C_T值区别较大的)、阳性对照滑液支原体标准株ATCC25204基因组DNA均出现典型的S型扩增曲线，其他6种病原基因组DNA、阴性对照灭菌双蒸水(附图标记为H₂O)均为一条平滑的直线；

如图6B所示，以VVY2300F和VY2300R作为引物，参照步骤2.4中的核酸染料qPCR反应体系和程序进行核酸染料qPCR反应，滑液支原体临床分离株基因组DNA(为清楚观察滑液支原体临床分离株基因组DNA样品的扩增曲线情况，仅显示其中一株与阳性对照C_T值区别较大的)、阳性对照滑液支原体标准株ATCC25204基因组DNA均出现典型的S型扩增曲线，其他6种病原基因组DNA、阴性对照灭菌双蒸水(附图标记为H₂O)均为一条平滑的直线。

核酸染料qPCR反应结果判定如下：

当阳性对照滑液支原体标准株ATCC25204基因组DNA出现典型的S型扩增曲线，且C_T值≤35，阴性对照检测不到C_T值时实验成立。

若检测样品检测不到C_T值，则判定滑液支原体核酸阴性；

若检测样品的C_T值≤35，出现典型的S型扩增曲线，判定滑液支原体核酸阳性；

若检测样品的C_T值>35，或虽然C_T值≤35但扩增曲线不显著，则建议对样品进行复检；

对于VY2250F和VY2250R+VY2300F和VY2300R引物组，当同一样品的两个平行检测体系(引物分别为VY2250F和VY2250R、VY2300F和VY2300R)结果不统一时，建议对样品进行复检。

实施例3、临床样品的检测

病料组：参阅步骤2.3，将江苏省农业科学院保存的48份滑液支原体感染的鸡跗关节病料，分别经组织匀浆、基因组DNA提取；共分为6批次，任选8份滑液支原体感染的鸡跗关节病料组织基因组DNA作为一批次；

阳性对照组：参照步骤2.3对滑液支原体标准株ATCC25204进行培养和基因组DNA提取；

阴性健康料组：参照步骤2.3，将10份健康鸡跗关节组织，分别经组织匀浆、基因组DNA提取；共分为5批次，任选2份健康鸡跗关节组织基因组DNA作为一批次；

阴性对照组：灭菌双蒸水。

将从上述病料组、阳性对照组和阴性健康料组样品中提取的基因组DNA分别调整浓度到1ng/μL作为模板，参照实施例2的三种反应体系和程序(VY2250F和VY2250R引物组、VY2300F和VY2300R引物组、VY2250F和VY2250R+VY2300F和VY2300R引物组)进行核酸染料qPCR反应；根据病料组划分的6批次，共分6轮进行核酸染料qPCR反应；其中5批次各含有2份健康鸡跗关节组织基因组DNA；

结果显示，两对引物检测阳性对照滑液支原体标准株ATCC25204基因组DNA、滑液支原体感染阳性组织样品DNA(病料组)的C_T值均不大于32.247，且出现典型的S型扩增曲线；阴性对照灭菌双蒸水、健康鸡组织样品DNA(阴性健康料组)用两对引物均检测不到C_T值；

如图7A所示为其中一批次的核酸染料qPCR检测，以VY2250F和VY2250R作为引物，参照步骤2.4中的核酸染料qPCR反应体系和程序进行核酸染料qPCR反应，8份滑液支原体感染的鸡跗关节病料样品DNA和阳性对照滑液支原体标准株ATCC25204基因组DNA均出现典型的S型扩增曲线，阴性对照灭菌双蒸水(附图标记为H₂O)、健康鸡跗关节组织基因组DNA均为一条平滑的直线；

如图7B所示为其中一批次的核酸染料qPCR检测，以VY2300F和VY2300R作为引物，参照步骤2.4中的核酸染料qPCR反应体系和程序进行核酸染料qPCR反应，8份滑液支原体感染的鸡跗关节病料样品DNA和阳性对照滑液支原体标准株ATCC25204基因组DNA均出现典型的S型扩增曲线，阴性对照灭菌双蒸水(附图标记为H₂O)、健康鸡跗关节组织基因组DNA均为一条平滑的直线。

以上结果与参照实施例2的鉴定标准的鉴定结果一致，说明本发明的方法正确。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 用于滑液支原体鉴定的特有功能基因、核酸染料qPCR引物、试剂盒及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2475

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaataaaa aagccaaaat cttacttact agtttcagcg ctcttggcgc aattgcttgt 60

gctagcgttt atccgatata taaaataata tcagatatta aattttcaaa atttaattca 120

gattcgcagc tggttaattt agcgccacca aattacaatt taatttcaag tgaaaaccaa 180

agtaaaatta aaaatttatt aagcgcttca actaactttg atgatttaga aaataaacta 240

agcgctaata tagaactttt aaatgaaaat gttaaaaagc ttaataacga aaataattta 300

aaaaaattat ttttactttt atatactaga atttcatcgt cactaaatca agtagaactt 360

ttcgatgaat tttatgaaaa taaatattta aaatttacaa ataaaatttt gcaagttaaa 420

gaaattaaca atttaaaatt tgatgaaata aataaagaat tattagagct taaagctcaa 480

ataaaggctt ttatcgatat atttatatat aacgcaaatg ctagcattga tgcaattaat 540

gaatttgatt tacaaaaaag tcaaactaaa gatattttaa aattaaatct agacaatgct 600

aatggatttt tagcttattt aaatcaattt aaaaataaac ttgattcatt tgcatttagt 660

tcgcaaaatt ttaaaactag ccttgcactt ttaaatgaat atgtagctaa atttaaaact 720

aatcttcaaa actataattt atacttttca ttttcagaaa ctttttatca aaattactcg 780

ctgaatttaa ataaaagcga tgaaataaat ttagaaaatt taagcgctaa aaaagagcta 840

gataaactgg ctaaaaattt taatgattta tatcttcaag aaaaaacttt tttaagtagt 900

tctttaattg aaaaaaataa tattgaaaga aaaattgcag aagtctcttt aagatttaat 960

tatttaatta atttttattt tgaagtattt aatgtttatt caaatgaaga aagtgcttta 1020

aaaataaata atcttttaaa agatgccaaa aaatatgttg aagacaattt taaatatgtt 1080

tttaatgtta attcaaataa atttttaatt agtggttcat atgtaaattt aataaataaa 1140

tattcatctt ttattcagga tattaattta gagttaaatt catttttact ttctaaattt 1200

tcatctatta caaaaaatag cagtgaaatt ttaaatttaa taaataaaga aaattcttta 1260

tatttagaat taaatacaaa aaatttaaga ctaaataatt taaatttaac tttaatttca 1320

ctaaataata atccagaaaa taattcagtt agcgatgaat ttatcgattc aattgaagat 1380

gtaaatattc aaaatattta caaagaaatt aatgctataa atattttaaa aacaagcatt 1440

aaaaatcaaa tttctaaaaa taaaactcat ttagataaag ccttagaaaa tctttattta 1500

aattcactaa agctagaatt tatcaataaa acattaactg ataaaaattt tgactacatt 1560

gctaaaagta aaattttaga aaagctttta gataaaaatt tatctgatag tgaaattgaa 1620

aattatttta ttcaagctca aattttggct aataattttt ctgcagataa cgatttaatt 1680

tattcatatt tagatgaaat aaaaaggctg agtttaaata atttacaaga tcaaagtcaa 1740

cttgaaagtt taagatttga acttaatact aataagttaa ataaaaactt tgactctagc 1800

aatttagaaa aattaatttt agaaaaagaa aaagcaatta ttaaaaacaa agaagaaatt 1860

aataatttaa attctttgat agactcgata aataatcaac ttcagaaaaa aataaatgaa 1920

ataaaacttc ttaaaattga aaattcaaat ttcaaaaata caataaatca aaataattta 1980

aatttaaata atttaagatc gcagcttaat caaaataata gtaacattgc ttattgagag 2040

aggcaaaatc aagagctgca aaatcagctt aatgaaaaaa caaatctaat aagaaatgca 2100

actgaaaaat ataatctagc caaaagtgaa ttagataatt tcaaaaaaca aaatgcactt 2160

ttatctaatc aatattctgc tttaagaaat gctgcaattt caattaaaaa taaacttagt 2220

aaatttaaaa aatgaattga tgaaattaat gatgccatcg atttagcagc tgaacctata 2280

aaaacagatc ctattagaca attaattaac acttatagat tcaactcgcc actgcattta 2340

gaatctgaaa attatcaaac taaagcaggc agaatcaata aagctgcttt taccattaaa 2400

aataatacaa aatgaattct agatgaaact agtgaaataa taaatgtaat tctagctaga 2460

gtattaaaaa attaa 2475

<210> 2

<211> 1581

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgactattg gagctgtttt tactaccggg atagctttaa ttcaaaccaa taaaacttta 60

acccaaaaaa gaatagaact cgcccaagaa gccacaaaag accttaaaaa aaataatgtt 120

gaatttcaag ccgttttaaa agaaagcatt aacgaattta aaaattcata tcaacagttt 180

ctagaaaagc tttccaaatt tataaagcaa aaagtaaagc ctgaagttca agctaccgtt 240

ttaaaagttt attctggcaa agtttatatt ccaaaagaaa actttacttt tttaaattat 300

tttgtaagcg atgaaaccat taacgcatat ttaaatgtgc taatggaaca aatccaaaaa 360

tattcaagtt tattttcaaa taacaatagc attaaattaa ttaatacttg aataaaatta 420

attacaaact ttttttctaa tacgctaatt actattgtta gatacgttcc agagctggcc 480

caagatgtat tagactttaa caccaaaagc tttagcgctt tgggaagtaa tttttcattt 540

acatgatata aagttcacta tcaaaacttt ataaatgatt ccaagcttgt tttaaaaact 600

ttttcagaaa gcgataagca aaatcctgaa tcaaactatg aaaaggtttt agactttaaa 660

aacaaatcac aaagttattt aagtgaactt gaaactaaat ataattcctt aattaatctt 720

ccaaaaacaa tagctaacaa taaacttctt gatgatttat ttgatgaaaa ttcagcgcaa 780

cttaaggctc tgcttccact atatgaacaa tatgttttat ctcaagctgc agagcaaatg 840

caaagccttt attcaacacc aaaacaattt ataaattact ttgttaataa cggcgaaatt 900

ttatcgaaag cgcaagcggc aagcaaagca actagtgacg ctgaagaatt taaaaacaaa 960

cttaattctt tatcagaaaa tggttttaaa tttttatcta atgattttac caacgattta 1020

actccaacaa aagaagttaa agctagcgct aattatttaa atgaaaatga agagctaact 1080

gtttcatttt ataaagcaaa tgaaaatgga atttttcaag tagaaaattc aactgaaaca 1140

aatctgctta gctctaaatt aaaaaatgct aagcctaatt cttacgttgt taaattttcg 1200

tttttattaa atgaatcatt tccggaaagc atatttacca atagcttaaa tagctatctg 1260

caagaagata aaaatgattt atttgtaaaa aataattttg aaatttattc ggttctgcct 1320

tttgtaattt cgagaatcaa tatacaaaat agcagtgtta atttaaattt taattttaat 1380

tatttagatt cacaatttat attaaatgaa tttcaatcta attatggaaa ttcaaaaaat 1440

ttatttttag tcgatcctaa taataaagaa aaatctcaag ctaaagttga tatttatctt 1500

tatttagata acactaaaat aattgaaaaa ttagacaaat taattcaaaa cgataaaatt 1560

aatataaatg ttaaatttta a 1581

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

attgcttgtg ctagcgttta tcc 23

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atttggtggc gctaaattaa cc 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctggcccaa gatgtattag ac 22

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccttttcata gtttgattca ggatt 25

Claims

1.功能基因VY93_RS02250和/或VY93_RS02300在核酸染料qPCR法鉴定滑液支原体中的应用，所述VY93_RS02250的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述VY93_RS02300的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种核酸染料qPCR所用引物在滑液支原体鉴定中的应用，所述引物为检测滑液支原体VY93_RS02250基因的qPCR引物，所述VY93_RS02250基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述检测VY93_RS02250基因的qPCR引物为SEQ ID NO.3所示的正向引物VY2250F和SEQID NO.4所示的反向引物VY2250R。

3.一种核酸染料qPCR所用引物在滑液支原体鉴定中的应用，所述引物为检测滑液支原体VY93_RS02300基因的qPCR引物，所述VY93_RS02300基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述检测VY93_RS02300基因的qPCR引物为SEQ ID NO.5所示的正向引物VY2300F和SEQID NO.6所示的反向引物VY2300R。

4.一种核酸染料qPCR所用引物组合在滑液支原体鉴定中的应用，所述引物组合包括检测VY93_RS02250基因的qPCR引物和检测VY93_RS02300基因的qPCR引物，所述VY93_RS02250的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述VY93_RS02300的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述检测VY93_RS02250基因的qPCR引物为SEQ ID NO.3所示的正向引物VY2250F和SEQ IDNO.4所示的反向引物VY2250R，所述检测VY93_RS02300基因的qPCR引物为SEQ ID NO.5所示的正向引物VY2300F和SEQ ID NO.6所示的反向引物VY2300R。

5.一种基于核酸染料qPCR的滑液支原体鉴定试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的检测VY93_RS02250基因的qPCR引物对VY2250F和VY2250R，通过核酸染料qPCR检测VY93_RS02250基因以鉴定滑液支原体，当检测样品检测不到C_T值，则判定滑液支原体核酸阴性；当检测样品的C_T值≤35，出现典型的S型扩增曲线，判定滑液支原体核酸阳性；当检测样品的C_T值>35，或虽然C_T值≤ 35但扩增曲线不显著，则建议对样品进行复检。

6.一种基于核酸染料qPCR的滑液支原体鉴定试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述的检测VY93_RS02300基因的qPCR引物对VY2300F和VY2300R，通过核酸染料qPCR检测VY93_RS02300基因以鉴定滑液支原体，当检测样品检测不到C_T值，则判定滑液支原体核酸阴性；当检测样品的C_T值≤35，出现典型的S型扩增曲线，判定滑液支原体核酸阳性；当检测样品的C_T值>35，或虽然C_T值≤ 35但扩增曲线不显著，则建议对样品进行复检。

7.一种基于核酸染料qPCR的滑液支原体鉴定试剂盒，其特征在于，包括权利要求4所述的引物组合VY2250F和VY2250R、VY2300F和VY2300R，通过对同一样品的平行样采用核酸染料qPCR分别检测VY93_RS02250基因和VY93_RS02300基因以鉴定滑液支原体，当两个检测体系的检测结果一致时，则检测标准为：当检测样品检测不到C_T值，则判定滑液支原体核酸阴性；当检测样品的C_T值≤35，出现典型的S型扩增曲线，判定滑液支原体核酸阳性；当检测样品的C_T值>35，或虽然C_T值≤ 35但扩增曲线不显著，则建议对样品进行复检；当两个检测体系的检测结果不一致时，则建议对样品进行复检。

8.根据权利要求5～7任一项所述的滑液支原体鉴定试剂盒，其特征在于：还包括TBGreen Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2X）、ROX Reference Dye（50X）、灭菌双蒸水、阳性重组质粒和/或滑液支原体标准株ATCC25204基因组DNA。

9.根据权利要求8所述的滑液支原体鉴定试剂盒，其特征在于：所述阳性重组质粒为VY2250-pMD-18T阳性重组质粒和/或VY2300-pMD-18T阳性重组质粒。

10.权利要求5～9任一项所述的滑液支原体鉴定试剂盒在制备鉴定滑液支原体的产品中的应用。