JP2798499B2 - 感染症診断用プローブ - Google Patents
感染症診断用プローブInfo
- Publication number
- JP2798499B2 JP2798499B2 JP6503175A JP50317594A JP2798499B2 JP 2798499 B2 JP2798499 B2 JP 2798499B2 JP 6503175 A JP6503175 A JP 6503175A JP 50317594 A JP50317594 A JP 50317594A JP 2798499 B2 JP2798499 B2 JP 2798499B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- bacteria
- probe
- infectious disease
- sequence type
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 49
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 title claims abstract description 33
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title claims description 28
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 claims abstract description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 52
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 claims description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 7
- 241001478240 Coccus Species 0.000 claims 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 65
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 23
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 23
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 description 22
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 13
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 7
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 7
- 241000588697 Enterobacter cloacae Species 0.000 description 6
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 6
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 6
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 6
- 229940032049 enterococcus faecalis Drugs 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 5
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 5
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 4
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 229940037645 staphylococcus epidermidis Drugs 0.000 description 4
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 3
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 2',3'-Dideoxyadenosine-5-triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1CC[C@@H](CO[P@@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical group C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000005956 Cosmos caudatus Nutrition 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000194033 Enterococcus Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- 108010053229 Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- HDRRAMINWIWTNU-NTSWFWBYSA-N [[(2s,5r)-5-(2-amino-6-oxo-3h-purin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1CC[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HDRRAMINWIWTNU-NTSWFWBYSA-N 0.000 description 1
- ARLKCWCREKRROD-POYBYMJQSA-N [[(2s,5r)-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)CC1 ARLKCWCREKRROD-POYBYMJQSA-N 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009640 blood culture Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- URGJWIFLBWJRMF-JGVFFNPUSA-N ddTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)CC1 URGJWIFLBWJRMF-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000000624 ear auricle Anatomy 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Measuring And Recording Apparatus For Diagnosis (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Ultra Sonic Daignosis Equipment (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
〔技術分野〕
本発明は、感染症患者の原因菌の検出および同定に有
用な感染症起因菌由来のプローブに関する。
用な感染症起因菌由来のプローブに関する。
病理学的に、感染とは病原性の微生物（以下、「菌」
と称する）が生体内に侵入し、増殖の足がかりを確立す
ることを指し、生体内での菌の増殖に起因する発症は、
宿主の抵抗力と菌の毒力との相互関係に依存するもので
ある。
と称する）が生体内に侵入し、増殖の足がかりを確立す
ることを指し、生体内での菌の増殖に起因する発症は、
宿主の抵抗力と菌の毒力との相互関係に依存するもので
ある。
感染症の中でも、菌血症の治療方法の改善は急務とさ
れている。すなわち、菌血症は、特定の菌によるもので
はなく、種々の菌が血液中に出現、棲息することに端を
発するものであり、臨床的には40度近い高熱が２日以上
続くとその発病を疑われ、また、小児患者の場合は数
日、生体の抵抗力が弱まっている癌の末期患者の場合で
は一日ないし二日間放置すれば死に至る、という重症か
つ緊急な病気であるため、菌血症の治療方法の改善は急
務とされている。
れている。すなわち、菌血症は、特定の菌によるもので
はなく、種々の菌が血液中に出現、棲息することに端を
発するものであり、臨床的には40度近い高熱が２日以上
続くとその発病を疑われ、また、小児患者の場合は数
日、生体の抵抗力が弱まっている癌の末期患者の場合で
は一日ないし二日間放置すれば死に至る、という重症か
つ緊急な病気であるため、菌血症の治療方法の改善は急
務とされている。
感染症において、生体組織内では第一義的には好中
球、単球及びマクロファージ系の食細胞がその防御に働
いている。菌血症での血液中への菌の出現とは、優勢に
なった菌が食細胞組織から血液中に浸出したものと考え
られる。
球、単球及びマクロファージ系の食細胞がその防御に働
いている。菌血症での血液中への菌の出現とは、優勢に
なった菌が食細胞組織から血液中に浸出したものと考え
られる。
菌血症は菌が血液中に浸出した状態であり、治療にお
いては、起因菌に感受性のある抗生物質を大量に投与す
る。ところが、抗生物質は一般に肝臓など臓器の機能を
低下させるため、有効でない抗生物質を危険な状態にあ
る患者に投与することは極力避けなければならない。
いては、起因菌に感受性のある抗生物質を大量に投与す
る。ところが、抗生物質は一般に肝臓など臓器の機能を
低下させるため、有効でない抗生物質を危険な状態にあ
る患者に投与することは極力避けなければならない。
一般に、細胞の食菌力が菌の毒力に及ばず、菌が全身
の血流中に拡がる場合を菌血症（bactermia）と定義す
れば、菌の産生する毒素の働きで、重い症状を示す菌血
症を敗血症（sepsis）と称する。そして、sepsisの証
明、すなわち診断の確立には、（１）臨床症状、（２）
検体の培養、（３）検体に含まれる菌のグラム染色、お
よび（４）ショック状態の確認が必須であり、これらの
項目が確認されて初めて治療方針が決定される。したが
って、臨床現場においては、迅速かつ確実な菌の同定が
望まれているのである。
の血流中に拡がる場合を菌血症（bactermia）と定義す
れば、菌の産生する毒素の働きで、重い症状を示す菌血
症を敗血症（sepsis）と称する。そして、sepsisの証
明、すなわち診断の確立には、（１）臨床症状、（２）
検体の培養、（３）検体に含まれる菌のグラム染色、お
よび（４）ショック状態の確認が必須であり、これらの
項目が確認されて初めて治療方針が決定される。したが
って、臨床現場においては、迅速かつ確実な菌の同定が
望まれているのである。
一般的には、検査室では菌血症を疑われた検体の菌の
検出・同定方法としては、カルチャー・ボトル法で陽性
の検体に限って、選択培地を用いて同定が行われてい
る。しかしながら、実際にはこれら血液検体からの菌の
培養の成功率は極めて低く、しかも、菌血症を疑われた
時点で、大量に抗生物質を投与されている場合には、た
とえば血液中に菌が含まれていても、増菌・増殖できな
い場合が多く、それ故、カルチャー・ボトル法で陽性に
なる割合は極めて少ない。
検出・同定方法としては、カルチャー・ボトル法で陽性
の検体に限って、選択培地を用いて同定が行われてい
る。しかしながら、実際にはこれら血液検体からの菌の
培養の成功率は極めて低く、しかも、菌血症を疑われた
時点で、大量に抗生物質を投与されている場合には、た
とえば血液中に菌が含まれていても、増菌・増殖できな
い場合が多く、それ故、カルチャー・ボトル法で陽性に
なる割合は極めて少ない。
さらに、サブルーチンとしての方法に、菌体成分や菌
の代謝産物の機器分析法（辨野義己、「ガスクロマトグ
ラフィーによる細菌同定の迅速化」、臨床検査、vol.2
9,No.12,1985年11月、医学書院参照）、特異抗体を利用
した方法（特開昭60−224068号参照）、さらには、DNA
の特異性を利用したハイブリダイゼーションによる方法
（特表昭61−502376号）等があるが、いずれも、菌の分
離及び増菌培養を必須とされている。一方、感染症にお
ける食細胞の機能に着目したものとして、血液試料中の
白血球成分が集中しているバフィーコート（Buffy coa
t）の塗抹染色標本を検鏡する方法がある。一般に、バ
フィーコート標本で菌が検出される頻度は、成人菌血症
では耳朶血の頻度と同様に30％程度にとどまるが、新生
児の場合、10例中７例（70％）で菌を検出している報告
もあり、塗抹標本の検鏡により末梢血中菌の有無に関す
る情報は治療における大きな指針となっている。
の代謝産物の機器分析法（辨野義己、「ガスクロマトグ
ラフィーによる細菌同定の迅速化」、臨床検査、vol.2
9,No.12,1985年11月、医学書院参照）、特異抗体を利用
した方法（特開昭60−224068号参照）、さらには、DNA
の特異性を利用したハイブリダイゼーションによる方法
（特表昭61−502376号）等があるが、いずれも、菌の分
離及び増菌培養を必須とされている。一方、感染症にお
ける食細胞の機能に着目したものとして、血液試料中の
白血球成分が集中しているバフィーコート（Buffy coa
t）の塗抹染色標本を検鏡する方法がある。一般に、バ
フィーコート標本で菌が検出される頻度は、成人菌血症
では耳朶血の頻度と同様に30％程度にとどまるが、新生
児の場合、10例中７例（70％）で菌を検出している報告
もあり、塗抹標本の検鏡により末梢血中菌の有無に関す
る情報は治療における大きな指針となっている。
上記従来技術においては、その前処理操作として、少
なくとも検体からの菌の選択的分離に１〜２日、増菌に
１日、固定操作に１日以上、合計で３〜４日は十分かか
り、現実にはこの培養を菌が発育するまで続けることに
なるので、カルチャー・ボトル法で陽性になった場合で
すら、前処理操作に一週間以上要する場合が多く、これ
がカルチャー・ボトル法で陽性を示した患者の死亡率を
押し上げる要因になっている。例えば、「感染症学雑
誌」,vol.58,No.2,pp.122,1984には、血液培養陽性率が
28.6％（163/569件）でも、その内死亡率が84.6％（138
/163件）にまで到っている旨が報告されている。
なくとも検体からの菌の選択的分離に１〜２日、増菌に
１日、固定操作に１日以上、合計で３〜４日は十分かか
り、現実にはこの培養を菌が発育するまで続けることに
なるので、カルチャー・ボトル法で陽性になった場合で
すら、前処理操作に一週間以上要する場合が多く、これ
がカルチャー・ボトル法で陽性を示した患者の死亡率を
押し上げる要因になっている。例えば、「感染症学雑
誌」,vol.58,No.2,pp.122,1984には、血液培養陽性率が
28.6％（163/569件）でも、その内死亡率が84.6％（138
/163件）にまで到っている旨が報告されている。
さらに、菌の培養時に患者の原因菌以外の菌が混入し
ても区別できない場合もある。例えば、菌血症の起因菌
の一つの表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidi
s）は、正常人の皮膚にも存在する菌であり、注射針を
皮膚に刺す時にこの菌を取り込んで検体中に混入するお
それもある。
ても区別できない場合もある。例えば、菌血症の起因菌
の一つの表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidi
s）は、正常人の皮膚にも存在する菌であり、注射針を
皮膚に刺す時にこの菌を取り込んで検体中に混入するお
それもある。
そして重要なことは、前述した事情から、培養すべき
検体中の多くの菌は食細胞に取り込まれ、抗生物質投与
のため死んでいるか静止状態にあるため、培養条件下で
も増殖できる菌の数は少なく、臨床検体を用いた培養に
よる実際の菌の検出率は10％前後と、非常に低い。換言
すれば、臨床的に菌血症が疑われた患者の血液をさらに
一昼夜以上培養して検査しても結局、その90％は菌の存
在すら判明しないのが現状である。
検体中の多くの菌は食細胞に取り込まれ、抗生物質投与
のため死んでいるか静止状態にあるため、培養条件下で
も増殖できる菌の数は少なく、臨床検体を用いた培養に
よる実際の菌の検出率は10％前後と、非常に低い。換言
すれば、臨床的に菌血症が疑われた患者の血液をさらに
一昼夜以上培養して検査しても結局、その90％は菌の存
在すら判明しないのが現状である。
このような状況から、現在は臨床的に敗血症を疑った
段階で、検出結果が出るのを待たずに治療、すなわち、
最も広範囲な種類の菌に有効な抗生物質を投与し、１、
２日間様子を見て、効果が現れないと別の抗生物質に切
換えるという試行錯誤的な方法に頼っているのである。
段階で、検出結果が出るのを待たずに治療、すなわち、
最も広範囲な種類の菌に有効な抗生物質を投与し、１、
２日間様子を見て、効果が現れないと別の抗生物質に切
換えるという試行錯誤的な方法に頼っているのである。
また、検体中の菌を染色により検出する方法では、生
体成分も菌と同様に染色されるため、検鏡して認められ
る形態によってのみ迅速に菌を判別するのは、熟練が必
要であり、判定が困難な場合もある。
体成分も菌と同様に染色されるため、検鏡して認められ
る形態によってのみ迅速に菌を判別するのは、熟練が必
要であり、判定が困難な場合もある。
このように、迅速・確実な診断が求められる疾患であ
るにもかかわらず、従来の診断法では十分対応できてい
なかったのが実情である。
るにもかかわらず、従来の診断法では十分対応できてい
なかったのが実情である。
本発明は上記当該技術分野が抱えている課題に鑑みて
完成されたものであり、その要旨とするところは、主要
な感染症原因菌が保有するDNAまたはRNAと特異的な反応
性を有するプローブであり、さらに、そのプローブが有
するDNAの塩基配列を解明し、遺伝子情報を提供するこ
とにある。
完成されたものであり、その要旨とするところは、主要
な感染症原因菌が保有するDNAまたはRNAと特異的な反応
性を有するプローブであり、さらに、そのプローブが有
するDNAの塩基配列を解明し、遺伝子情報を提供するこ
とにある。
すなわち、本発明のプローブにより、例えば、食細胞
に取り込まれて破壊されつつある菌においてなお維持さ
れている感染症原因菌のDNAを検出することにより、菌
を培養・増殖せずに、感染症疾患の原因菌が迅速かつ確
実に検出できる。また、これらのプローブの塩基配列情
報を参照してプライマーをデザインすれば、ハイブリダ
イゼーションを行わなくとも、PCR法によりDNAの増幅に
より、感染症原因菌を同定することができる。
に取り込まれて破壊されつつある菌においてなお維持さ
れている感染症原因菌のDNAを検出することにより、菌
を培養・増殖せずに、感染症疾患の原因菌が迅速かつ確
実に検出できる。また、これらのプローブの塩基配列情
報を参照してプライマーをデザインすれば、ハイブリダ
イゼーションを行わなくとも、PCR法によりDNAの増幅に
より、感染症原因菌を同定することができる。
また、ハイブリダイゼーションに用いるプローブを非
放射性のもの、例えば、ビオチン化したプローブを用い
れば、放射性同位元素使用施設のない一般検査室でも光
学顕微鏡を用いて検出でき、検出作業が迅速、簡便に行
える。
放射性のもの、例えば、ビオチン化したプローブを用い
れば、放射性同位元素使用施設のない一般検査室でも光
学顕微鏡を用いて検出でき、検出作業が迅速、簡便に行
える。
第１図は、Staphylococcus aureus（黄色ブドウ球
菌）検出用プローブのHind III断片の制限酵素地図であ
る。
菌）検出用プローブのHind III断片の制限酵素地図であ
る。
第２図は、Staphylococcus epidermidis（表皮ブドウ
球菌）検出用プローブのHind III断片の制限酵素地図で
ある。
球菌）検出用プローブのHind III断片の制限酵素地図で
ある。
第３図は、Enterococcus faecalis検出用プローブのH
ind III断片の制限酵素地図である。
ind III断片の制限酵素地図である。
第４図は、Pseudomonas aeruginosa（緑膿菌）検出用
プローブのHind III断片の制限酵素地図である。
プローブのHind III断片の制限酵素地図である。
第５図は、Escherichia coli（大腸菌）検出用プロー
ブのHind III断片の制限酵素地図である。
ブのHind III断片の制限酵素地図である。
第６図は、Enterobacter cloacae（エンテロバクター
クロアカエ）検出用プローブ、およびKlebsiella pne
umonia（肺炎桿菌）のHind III断片の制限酵素地図であ
る。
クロアカエ）検出用プローブ、およびKlebsiella pne
umonia（肺炎桿菌）のHind III断片の制限酵素地図であ
る。
以下に、比較的発症頻度の高い感染症疾患起因菌、特
に敗血症起因菌として挙げられる、Staphylococcus aur
eus、Staphylococcus epidermidis、Enterococcus faec
alis、Pseudomonas aeruginosa、Escherichia coli、Kl
ebsiella pneumoniae、およびEnterobacter cloacae
（J.Infection,vol.26,pp.159−170（1993）,J.Clin.Mi
crobiol.,vol.31.,pp.552−557（1993））の各起因菌に
由来するプローブの実施例を示す。
に敗血症起因菌として挙げられる、Staphylococcus aur
eus、Staphylococcus epidermidis、Enterococcus faec
alis、Pseudomonas aeruginosa、Escherichia coli、Kl
ebsiella pneumoniae、およびEnterobacter cloacae
（J.Infection,vol.26,pp.159−170（1993）,J.Clin.Mi
crobiol.,vol.31.,pp.552−557（1993））の各起因菌に
由来するプローブの実施例を示す。
実施例1:感染症疾患起因菌由来DNAプローブの調製
（１）感染症疾患起因菌の分離
まず、目的とする疾病に罹患した感染患者から採取し
た血液を、血液培養法（BBCシステム：血液培養システ
ム・キット；ロシュ社製）および市販の同定用キット
（アピ20、アピスタフ、アピストレップ20;いずれもバ
イオ・メリュー社製）に適用し、当該各キットの使用説
明書に従って、各感染症疾患起因菌を分離、同定した。
た血液を、血液培養法（BBCシステム：血液培養システ
ム・キット；ロシュ社製）および市販の同定用キット
（アピ20、アピスタフ、アピストレップ20;いずれもバ
イオ・メリュー社製）に適用し、当該各キットの使用説
明書に従って、各感染症疾患起因菌を分離、同定した。
（２）分離菌株が保有するGenomic DNAの抽出および精
製 上記（１）にて分離された菌株をBHI（Brain Heart I
nfusion）培地で一晩培養し、培養菌体を集菌して、リ
ゾチームの代わりにアクロモペプチダーゼを加えた上
で、Saito−Miura法（“Preparation of Transforming
Deoxyribonucleic Acid by Phenol Treatment",Bioche
m.Biophys.Acta.vol.72,pp.619−629）に従って、Genom
ic DNAを抽出し、この抽出して得られたDNAを制限酵素H
ind IIIで完全消化し、ベクターpBR322にランダムクロ
ーニングした。
製 上記（１）にて分離された菌株をBHI（Brain Heart I
nfusion）培地で一晩培養し、培養菌体を集菌して、リ
ゾチームの代わりにアクロモペプチダーゼを加えた上
で、Saito−Miura法（“Preparation of Transforming
Deoxyribonucleic Acid by Phenol Treatment",Bioche
m.Biophys.Acta.vol.72,pp.619−629）に従って、Genom
ic DNAを抽出し、この抽出して得られたDNAを制限酵素H
ind IIIで完全消化し、ベクターpBR322にランダムクロ
ーニングした。
（３）起源細菌種特異的プローブの選抜
次に、マニアティスのマニュアル（T.Maniatis,et a
l.,“Molecular Cloning（A Laboratory Manual）",Col
d Spring Harbour Laboratory（1982））に従い、得ら
れた各クローンを含むE.coilをsmall scale cultureで
培養して、それぞれのクローンを含むプラスミドを得
た。
l.,“Molecular Cloning（A Laboratory Manual）",Col
d Spring Harbour Laboratory（1982））に従い、得ら
れた各クローンを含むE.coilをsmall scale cultureで
培養して、それぞれのクローンを含むプラスミドを得
た。
これらプラスミドを、制限酵素Hind IIIで消化し、１
％アガロースゲル電気泳動（ミューピッド：コスモバイ
オ社製）で挿入体とプラスミドを完全に分離した後、サ
ザーントランスファー法により、ナイロンメンブラン
（ポールバイオダインA:ポール社製）に転写し、前述の
各菌種のクロモゾームDNAを32P−dCTP（アマシャム社
製）でニックトランスレーションラベルしたプローブと
クロスハイブリダイゼーションを行った。
％アガロースゲル電気泳動（ミューピッド：コスモバイ
オ社製）で挿入体とプラスミドを完全に分離した後、サ
ザーントランスファー法により、ナイロンメンブラン
（ポールバイオダインA:ポール社製）に転写し、前述の
各菌種のクロモゾームDNAを32P−dCTP（アマシャム社
製）でニックトランスレーションラベルしたプローブと
クロスハイブリダイゼーションを行った。
このハイブリダイゼーションにて、各挿入体と交差せ
ず、起源種細菌由来のプローブとのみ交差するものを、
各感染症起因菌に特異的なDNA断片を含むプローブとし
て選択した。
ず、起源種細菌由来のプローブとのみ交差するものを、
各感染症起因菌に特異的なDNA断片を含むプローブとし
て選択した。
なお、Escherichia coli、Klebsiella pneumoniaeお
よびEnterobacter cloacaeから調製されたプローブに関
しては、これらの菌が、敗血症の起因菌として同グルー
プ（腸内細菌、グラム陰性通気性杆菌）に属することか
ら（前出のJ.Infection,vol.26,pp.159−170（1993）,
J.Clin.Microbiol.,vol.31.,pp.552−557（1993）を参
照）、上記した一連の特異性検定においても、上記三つ
の菌種相互間に交差反応が認められたことから、上記三
種の菌の一つの菌から調製した各プローブを、これらの
菌を縁類菌として一括検出するためのプローブとして位
置付けた。
よびEnterobacter cloacaeから調製されたプローブに関
しては、これらの菌が、敗血症の起因菌として同グルー
プ（腸内細菌、グラム陰性通気性杆菌）に属することか
ら（前出のJ.Infection,vol.26,pp.159−170（1993）,
J.Clin.Microbiol.,vol.31.,pp.552−557（1993）を参
照）、上記した一連の特異性検定においても、上記三つ
の菌種相互間に交差反応が認められたことから、上記三
種の菌の一つの菌から調製した各プローブを、これらの
菌を縁類菌として一括検出するためのプローブとして位
置付けた。
そして、下記第１表に、以上の方法によって選抜され
た各菌種別のプローブ（プローブ信号）を列挙した。
た各菌種別のプローブ（プローブ信号）を列挙した。
同時に、上記各プローブの制限酵素地図を、第１図か
ら第６図にそれぞれ示した。
ら第６図にそれぞれ示した。
実施例2:各DNAプローブの種特異性の検定
各プローブと各種感染症原因菌株のDNAとの搬送性
を、以下の方法により検討した。
を、以下の方法により検討した。
まず、検討対象菌株として、Staphylococcus aureu
s、Staphylococcus epidermidis、Enterococcus faecal
is、Pseudomonas aeruginosa、Escherichia coli、Kleb
siella pneumoniae、およびEnterobacter cloacaeの臨
床菌株を実施例１（１）に記載の方法に従って改めて分
離した。
s、Staphylococcus epidermidis、Enterococcus faecal
is、Pseudomonas aeruginosa、Escherichia coli、Kleb
siella pneumoniae、およびEnterobacter cloacaeの臨
床菌株を実施例１（１）に記載の方法に従って改めて分
離した。
次に、各臨床菌株を実施例１（２）に記載の方法に従
って、各菌株のDNAを抽出し、この抽出したDNAの一定量
（例えば、５μｌ）をナイロンフィルタにスポットし、
アルカリ変性したものをドット・ブロット・ハイブリダ
イゼーションの試料とした。そして、ビチオン（Bio−d
UTP,BRL社製）でラベルした各対象菌株由来のDNAプロー
ブを、前出のマニアティスのマニュアルに従い、45％ホ
ルムアミド、５×SSC、42℃の条件下で、終夜ハイブリ
ダイゼーションを実施した。
って、各菌株のDNAを抽出し、この抽出したDNAの一定量
（例えば、５μｌ）をナイロンフィルタにスポットし、
アルカリ変性したものをドット・ブロット・ハイブリダ
イゼーションの試料とした。そして、ビチオン（Bio−d
UTP,BRL社製）でラベルした各対象菌株由来のDNAプロー
ブを、前出のマニアティスのマニュアルに従い、45％ホ
ルムアミド、５×SSC、42℃の条件下で、終夜ハイブリ
ダイゼーションを実施した。
終夜ハイブリダイゼーションを終えた試料を、55℃に
て0.1×SSC、0.1％SDSによる20分間の洗浄を２回行った
後に、Streptavidin−ALP conjugates（BRL社製）で検
出・発色させ、ハイブリダイゼーションの状況を確認し
た。
て0.1×SSC、0.1％SDSによる20分間の洗浄を２回行った
後に、Streptavidin−ALP conjugates（BRL社製）で検
出・発色させ、ハイブリダイゼーションの状況を確認し
た。
各プローブと各臨床菌株のDNAとの反応性に関する実
験結果を、下記第２表（ｉ）〜（vi）に示した。なお、
表中において、＋の符号はハイブリダイズのシグナルが
検出されたことを、また、−の符号はハイブリダイズの
シグナルが検出されなかったことを示す。
験結果を、下記第２表（ｉ）〜（vi）に示した。なお、
表中において、＋の符号はハイブリダイズのシグナルが
検出されたことを、また、−の符号はハイブリダイズの
シグナルが検出されなかったことを示す。
上記表２から明らかなように、各プローブはいずれも
起源とする菌株（あるいはその類縁菌）が保有するDNA
に対してのみ反応性を示し、起源菌以外の菌株から得た
DNAには全く反応（ハイブリダイズ）を示さず、その種
特異性が確認された。
起源とする菌株（あるいはその類縁菌）が保有するDNA
に対してのみ反応性を示し、起源菌以外の菌株から得た
DNAには全く反応（ハイブリダイズ）を示さず、その種
特異性が確認された。
実施例3:塩基配列の解析
実施例１および２にて種特異性が確認された本発明の
DNAプローブ（計23本）の塩基配列を下記の方法に従っ
て決定した。
DNAプローブ（計23本）の塩基配列を下記の方法に従っ
て決定した。
（１）プラスミドDNAの調製
サブクローンされた（塩基配列を決定すべき）挿入断
片をpGem−3Z（Promega）に含んだEscherichia coli K
−12,JM109形質転換体を、5mlのLuria−Bactani Medium
（bacto−tryptone,10g/1L;bacto−yeast extract,5g/1
L;NaCl,10g/1L;5N NaOHでpH7.0に調整）に植菌し、一晩
培養した。
片をpGem−3Z（Promega）に含んだEscherichia coli K
−12,JM109形質転換体を、5mlのLuria−Bactani Medium
（bacto−tryptone,10g/1L;bacto−yeast extract,5g/1
L;NaCl,10g/1L;5N NaOHでpH7.0に調整）に植菌し、一晩
培養した。
培養液を遠心分離（5,000rpm,5min.）して集菌した。
沈澱物に2.5mg/mlの濃度でリゾチーム（Sigma）を含む5
0mMグルコース/50mM Tris−HCl（pH8.0）/10mM EDTA溶
液を100μｌ加え、室温で５分間放置した。得られた懸
濁液に１％の濃度でドデシル硫酸ナトリウム（Sigma）
を含む0.2M水酸化ナトリウム水溶液を加えて混合した。
5M酢酸カリウム水溶液（pH4.8）150μｌをさらに加えて
混合し、15分間水冷した。
沈澱物に2.5mg/mlの濃度でリゾチーム（Sigma）を含む5
0mMグルコース/50mM Tris−HCl（pH8.0）/10mM EDTA溶
液を100μｌ加え、室温で５分間放置した。得られた懸
濁液に１％の濃度でドデシル硫酸ナトリウム（Sigma）
を含む0.2M水酸化ナトリウム水溶液を加えて混合した。
5M酢酸カリウム水溶液（pH4.8）150μｌをさらに加えて
混合し、15分間水冷した。
そして、遠心分離（15,000rpm,15min.）して得た上清
を、フェノール/CHCl3処理し、上清に２倍量のエタノー
ルを加え、さらに遠心分離（12,000rpm,5min.）して沈
澱を得た。この沈澱物を、10mM Tris−HCl（pH7.5）/0.
1mM EDTA溶液100μｌに溶解し、10mg/ml RNaseA（Sigm
a）溶液を加え、室温で15分間放置した。
を、フェノール/CHCl3処理し、上清に２倍量のエタノー
ルを加え、さらに遠心分離（12,000rpm,5min.）して沈
澱を得た。この沈澱物を、10mM Tris−HCl（pH7.5）/0.
1mM EDTA溶液100μｌに溶解し、10mg/ml RNaseA（Sigm
a）溶液を加え、室温で15分間放置した。
この調製物に0.1M酢酸ナトリウム水溶液（pH4.8）を3
00μｌ加え、フェノール/CHCl3処理し、上清にエタノー
ルを加えて沈澱を得た。この沈澱物を乾燥し、10μｌの
蒸留水に溶解したものをDNA試料とした。
00μｌ加え、フェノール/CHCl3処理し、上清にエタノー
ルを加えて沈澱を得た。この沈澱物を乾燥し、10μｌの
蒸留水に溶解したものをDNA試料とした。
（２）塩基配列決定の前処理
塩基配列決定の前処理をAutoRead（登録商標）Sequen
cing Kit（Pharmasia）を用いて行った。
cing Kit（Pharmasia）を用いて行った。
すなわち、鋳型となるDNAが32μｌ溶液中に５〜10μ
ｇの濃度になるように調整した。1.5mlのミニチューブ
（エッペンドルフ）に、鋳型DNA32μｌを移し、2M水酸
化ナトリウム水溶液を８μｌ加えて穏やかに混合した。
そして、軽く遠心した後、室温で10分間放置した。
ｇの濃度になるように調整した。1.5mlのミニチューブ
（エッペンドルフ）に、鋳型DNA32μｌを移し、2M水酸
化ナトリウム水溶液を８μｌ加えて穏やかに混合した。
そして、軽く遠心した後、室温で10分間放置した。
3M酢酸ナトリウム（pH4.8）７μｌと蒸留水４μｌを
加え、さらにエタノールを120μｌ加えて混合し、ドラ
イアイス上で15分間放置した。そして、15分間遠心分離
して沈澱したDNAを集め、注意しながら上清を除去し
た。得られた沈澱物を70％エタノールで洗浄し、10分間
遠心分離した。そして、注意しながら再度上清を除去
し、減圧条件下で沈澱物を乾燥した。
加え、さらにエタノールを120μｌ加えて混合し、ドラ
イアイス上で15分間放置した。そして、15分間遠心分離
して沈澱したDNAを集め、注意しながら上清を除去し
た。得られた沈澱物を70％エタノールで洗浄し、10分間
遠心分離した。そして、注意しながら再度上清を除去
し、減圧条件下で沈澱物を乾燥した。
沈澱物を蒸留水10μｌに溶解し、螢光性のプライマー
〔Fluorescent Primer,M13 Universal Primer;5′−Flu
orescein−ｄ［CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT］−３′（1.
6pmol/μl;0.42A260 unit/ml）;M13 Reverse Primer,
5′−Fluorescein−ｄ［CAGGAAACAG CTATGAC］−３′
（2.1pmol/μl;0.42A260 unit/ml）〕２μｌ（0.42A260
unit/ml,4〜6pmol）とアニーリング用緩衝液２μｌを
加え、穏やかに混合した。
〔Fluorescent Primer,M13 Universal Primer;5′−Flu
orescein−ｄ［CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT］−３′（1.
6pmol/μl;0.42A260 unit/ml）;M13 Reverse Primer,
5′−Fluorescein−ｄ［CAGGAAACAG CTATGAC］−３′
（2.1pmol/μl;0.42A260 unit/ml）〕２μｌ（0.42A260
unit/ml,4〜6pmol）とアニーリング用緩衝液２μｌを
加え、穏やかに混合した。
そして、軽く遠心した後、65℃で５分間熱処理を行
い、素早く37℃条件下に置き、そこで10分間保温した。
保温後10分以上室温で放置し、軽く遠心した。そして、
延長用緩衝液１μｌとジメチルスルホキシド３μｌを加
えたものを試料とした。
い、素早く37℃条件下に置き、そこで10分間保温した。
保温後10分以上室温で放置し、軽く遠心した。そして、
延長用緩衝液１μｌとジメチルスルホキシド３μｌを加
えたものを試料とした。
４本のミニチューブにＡ、Ｃ、ＧおよびＴと記入し、
それぞれのチューブにA Mix（ddATPをdATP、dCTP、c7dG
TPおよびdTTPと共に溶解したもの）、C Mix（ddCTPをdA
TP、dCTP、c7dGTPおよびdTTPと共に溶解したもの）、G
Mix（ddGTPをdATP、dCTP、c7dGTPおよびdTTPと共に溶解
したもの）およびT Mix（ddTTPをdATP、dCTP、c7dGTPお
よびdTTPと共に溶解したもの）を2.5μｌずつ分注し
た。なお、それぞれの溶液は使用時までは氷中で保存
し、使用時には37℃で１分間以上保温してから使用し
た。
それぞれのチューブにA Mix（ddATPをdATP、dCTP、c7dG
TPおよびdTTPと共に溶解したもの）、C Mix（ddCTPをdA
TP、dCTP、c7dGTPおよびdTTPと共に溶解したもの）、G
Mix（ddGTPをdATP、dCTP、c7dGTPおよびdTTPと共に溶解
したもの）およびT Mix（ddTTPをdATP、dCTP、c7dGTPお
よびdTTPと共に溶解したもの）を2.5μｌずつ分注し
た。なお、それぞれの溶液は使用時までは氷中で保存
し、使用時には37℃で１分間以上保温してから使用し
た。
希釈したT7DNAポリメラーゼ（Pharmacia;6〜8units/2
μｌ）２μｌをDNA試料に加え、ピペッティングもしく
は穏やかな混合により、完全に混合した。
μｌ）２μｌをDNA試料に加え、ピペッティングもしく
は穏やかな混合により、完全に混合した。
混合後すぐに、この混合液を4.5μｌずつ保温してお
いた４種の溶液に分注した。なお、分注に際しては新し
いチップを用いた。
いた４種の溶液に分注した。なお、分注に際しては新し
いチップを用いた。
37℃で５分間保温し、停止溶液を５μｌずつそれぞれ
の反応液に加えた。
の反応液に加えた。
この分注においても、新しいチップを用いた。90℃で
２〜３分間保温し、すぐに氷中で冷却した。電気泳動に
は１レーンあたり４〜６μｌを泳動した。
２〜３分間保温し、すぐに氷中で冷却した。電気泳動に
は１レーンあたり４〜６μｌを泳動した。
（３）塩基配列の決定
実施例１および２に開示した、Staphylococcus aureu
sあるいはStaphylococcus epidermidisに対して特異性
を有するプローブそれぞれの塩基配列の決定を、泳動温
度45℃、泳動時間６時間として、A.L.F.DNA Sequencer
システム（Pharmacia）を用いて行った。
sあるいはStaphylococcus epidermidisに対して特異性
を有するプローブそれぞれの塩基配列の決定を、泳動温
度45℃、泳動時間６時間として、A.L.F.DNA Sequencer
システム（Pharmacia）を用いて行った。
そして、各感染症患者起因菌から調製された下記第３
表に列挙したプローブ（配列番号）の塩基配列を、添付
の配列表に示した。
表に列挙したプローブ（配列番号）の塩基配列を、添付
の配列表に示した。
これにより、各感染症疾患起因菌（あるいはその類縁
菌）に特異的な部位を含む遺伝子情報が明らかとなった
のである。
菌）に特異的な部位を含む遺伝子情報が明らかとなった
のである。
本発明のプローブを用いれば、例えば、食細胞に取り
込まれた感染症原因菌を増殖することなく直接検出し、
かつ菌を迅速にしかも正確に同定できる。すなわち、本
発明のプローブを用いた診断では、１回分の検体で菌の
同定まで行え、診断に要する時間を従来法の３〜４日
（検出される率は低い）から、約１〜２日と飛躍的に短
縮でき、しかもその検出率は格段と高い。それ故、菌血
症の治療に対して画期的な指針を与えるばかりでなく、
感染症患者に早期の内に有効な治療が実施でき、ひいて
は死亡率の低減も期待される。
込まれた感染症原因菌を増殖することなく直接検出し、
かつ菌を迅速にしかも正確に同定できる。すなわち、本
発明のプローブを用いた診断では、１回分の検体で菌の
同定まで行え、診断に要する時間を従来法の３〜４日
（検出される率は低い）から、約１〜２日と飛躍的に短
縮でき、しかもその検出率は格段と高い。それ故、菌血
症の治療に対して画期的な指針を与えるばかりでなく、
感染症患者に早期の内に有効な治療が実施でき、ひいて
は死亡率の低減も期待される。
また、感染症疾患起因菌の主要な菌に特異的に反応す
るプローブの塩基配列を明らかにしたことにより、これ
らプローブを人工的に調製することを可能とした。さら
に、解析した塩基配列の情報の一部を利用して作製した
プライマーを用いて、臨床検体に含まれる感染症原因菌
のDNAを、PCR法によって増幅して、原因菌の迅速な診断
に役立てることができる。
るプローブの塩基配列を明らかにしたことにより、これ
らプローブを人工的に調製することを可能とした。さら
に、解析した塩基配列の情報の一部を利用して作製した
プライマーを用いて、臨床検体に含まれる感染症原因菌
のDNAを、PCR法によって増幅して、原因菌の迅速な診断
に役立てることができる。
さらに、臨床検体に含まれるGenomic DNAの塩基配列
と本発明によって解析された塩基配列とを比較参照する
ことにより、感染症原因菌種の迅速な同定が行える。
と本発明によって解析された塩基配列とを比較参照する
ことにより、感染症原因菌種の迅速な同定が行える。
上記したように、本発明は、所期の目的であった感染
症診断用プローブを提供するのみならず、PCR用プライ
マー作製の指針として、また臨床検体に含まれるGenomi
c DNAとの比較参照用に適した標準配列として優れた有
用性が期待され、さらには感染症疾患起因菌に特異的に
反応するプローブの今後の探究・開発における貴重な手
がかりをもたらすなどの優れた効果を奏するものであ
る。
症診断用プローブを提供するのみならず、PCR用プライ
マー作製の指針として、また臨床検体に含まれるGenomi
c DNAとの比較参照用に適した標準配列として優れた有
用性が期待され、さらには感染症疾患起因菌に特異的に
反応するプローブの今後の探究・開発における貴重な手
がかりをもたらすなどの優れた効果を奏するものであ
る。
また、本願出願にて開示した塩基配列は、臨床分離株
のGenomic DNAをランダムにクローニングして得られた
ものであり、それ故、本発明の塩基配列の有用性はその
相補鎖にまで及ぶものである。
のGenomic DNAをランダムにクローニングして得られた
ものであり、それ故、本発明の塩基配列の有用性はその
相補鎖にまで及ぶものである。
さらに、野性株が保有するDNAに変異部分が存在する
ことは当然考えられるが、上記実施例の開示から明らか
なように、当該DNA変異部分が、感染症診断のためのハ
イブリダイゼーションへ利用する際の本発明プローブの
特異性、あるいは本願出願にて開示した塩基配列情報を
感染症の迅速診断を目的としたPCR法のプライマーをデ
ザインするために利用できる等の、本発明が奏する有用
性には何ら影響を与えるものではない。
ことは当然考えられるが、上記実施例の開示から明らか
なように、当該DNA変異部分が、感染症診断のためのハ
イブリダイゼーションへ利用する際の本発明プローブの
特異性、あるいは本願出願にて開示した塩基配列情報を
感染症の迅速診断を目的としたPCR法のプライマーをデ
ザインするために利用できる等の、本発明が奏する有用
性には何ら影響を与えるものではない。
配列表
配列番号:1
配列の長さ:8959
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
起源
生物名：スタヒロコッカス アウレウス（Staphyloco
ccus aureus） 株名：臨床分離株 SA−７ 配列番号:2 配列の長さ:10207 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：スタヒロコッカス アウレウス（Staphyloco
ccus aureus） 株名：臨床分離株 SA−24 配列番号:3 配列の長さ:2082 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：スタヒロコッカス アウレウス（Staphyloco
ccus aureus） 株名：臨床分離株 SA−36 配列番号:4 配列の長さ:2885 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：スタヒロコッカス アウレウス（Staphyloco
ccus aureus） 株名：臨床分離株 SA−77 配列番号:5 配列の長さ:2362 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：スタヒロコッカス エピデルミディス（Stap
hylococcus epidermidis） 株名：臨床分離株 SE−３ 配列番号:6 配列の長さ:8654 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：スタヒロコッカス エピデルミディス（Stap
hylococcus epidermidis） 株名：臨床分離株 SE−22 配列番号:7 配列の長さ:5024 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：スタヒロコッカス エピデルミディス（Stap
hylococcus epidermidis） 株名：臨床分離株 SE−32 配列番号:8 配列の長さ:3287 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：スタヒロコッカス エピデルミディス（Stap
hylococcus epidermidis） 株名：臨床分離株 SE−37 配列番号:9 配列の長さ:2291 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：エンテロコッカス フェカーリス（Enteroco
ccus faecalis） 株名：臨床分離株 S2−１ 配列番号:10 配列の長さ:3719 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：エンテロコッカス フェカーリス（Enteroco
ccus faecalis） 株名：臨床分離株 S2−３ 配列番号:11 配列の長さ:3480 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：エンテロコッカス フェカーリス（Enteroco
ccus faecalis） 株名：臨床分離株 S2−７ 配列番号:12 配列の長さ:2441 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：エンテロコッカス フェカーリス（Enteroco
ccus faecalis） 株名：臨床分離株 S2−27 配列番号:13 配列の長さ:9515 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：シュードモナス アエルギノーザ（Pseudomo
nas aeruginosa） 株名：臨床分離株 P2−２ 配列番号:14 配列の長さ:2471 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：シュードモナス アエルギノーザ（Pseudomo
nas aeruginosa） 株名：臨床分離株 P2−７ 配列番号:15 配列の長さ:5247 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：シュードモナス アエルギノーザ（Pseudomo
nas aeruginosa） 株名：臨床分離株 P2−17 配列番号:16 配列の長さ:2812 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：シュードモナス アエルギノーザ（Pseudomo
nas aeruginosa） 株名：臨床分離株 P4−５ 配列番号:17 配列の長さ:3615 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：エシェリキア コリ（Escherichia coli） 株名：臨床分離株 EC−24 配列番号:18 配列の長さ:4954 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：エシェリキア コリ（Escherichia coli） 株名：臨床分離株 EC−34 配列番号:19 配列の長さ:3796 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：エシェリキア コリ（Escherichia coli） 株名：臨床分離株 EC−39 配列番号:20 配列の長さ:5541 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：エシェリキア コリ（Escherichia coli） 株名：臨床分離株 EC−625 配列番号:21 配列の長さ:6317 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：エンテロバクター クロアカエ（Enterobact
er cloacae） 株名：臨床分離株 ET−12 配列番号:22 配列の長さ:6914 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：エンテロバクター クロアカエ（Enterobact
er cloacae） 株名：臨床分離株 ET−49 配列番号:23 配列の長さ:5975 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：クレブシエラ ニューモニエ（Klebsiella p
neumoniae） 株名：臨床分離株 KI−50
ccus aureus） 株名：臨床分離株 SA−７ 配列番号:2 配列の長さ:10207 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：スタヒロコッカス アウレウス（Staphyloco
ccus aureus） 株名：臨床分離株 SA−24 配列番号:3 配列の長さ:2082 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：スタヒロコッカス アウレウス（Staphyloco
ccus aureus） 株名：臨床分離株 SA−36 配列番号:4 配列の長さ:2885 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：スタヒロコッカス アウレウス（Staphyloco
ccus aureus） 株名：臨床分離株 SA−77 配列番号:5 配列の長さ:2362 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：スタヒロコッカス エピデルミディス（Stap
hylococcus epidermidis） 株名：臨床分離株 SE−３ 配列番号:6 配列の長さ:8654 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：スタヒロコッカス エピデルミディス（Stap
hylococcus epidermidis） 株名：臨床分離株 SE−22 配列番号:7 配列の長さ:5024 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：スタヒロコッカス エピデルミディス（Stap
hylococcus epidermidis） 株名：臨床分離株 SE−32 配列番号:8 配列の長さ:3287 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：スタヒロコッカス エピデルミディス（Stap
hylococcus epidermidis） 株名：臨床分離株 SE−37 配列番号:9 配列の長さ:2291 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：エンテロコッカス フェカーリス（Enteroco
ccus faecalis） 株名：臨床分離株 S2−１ 配列番号:10 配列の長さ:3719 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：エンテロコッカス フェカーリス（Enteroco
ccus faecalis） 株名：臨床分離株 S2−３ 配列番号:11 配列の長さ:3480 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：エンテロコッカス フェカーリス（Enteroco
ccus faecalis） 株名：臨床分離株 S2−７ 配列番号:12 配列の長さ:2441 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：エンテロコッカス フェカーリス（Enteroco
ccus faecalis） 株名：臨床分離株 S2−27 配列番号:13 配列の長さ:9515 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：シュードモナス アエルギノーザ（Pseudomo
nas aeruginosa） 株名：臨床分離株 P2−２ 配列番号:14 配列の長さ:2471 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：シュードモナス アエルギノーザ（Pseudomo
nas aeruginosa） 株名：臨床分離株 P2−７ 配列番号:15 配列の長さ:5247 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：シュードモナス アエルギノーザ（Pseudomo
nas aeruginosa） 株名：臨床分離株 P2−17 配列番号:16 配列の長さ:2812 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：シュードモナス アエルギノーザ（Pseudomo
nas aeruginosa） 株名：臨床分離株 P4−５ 配列番号:17 配列の長さ:3615 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：エシェリキア コリ（Escherichia coli） 株名：臨床分離株 EC−24 配列番号:18 配列の長さ:4954 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：エシェリキア コリ（Escherichia coli） 株名：臨床分離株 EC−34 配列番号:19 配列の長さ:3796 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：エシェリキア コリ（Escherichia coli） 株名：臨床分離株 EC−39 配列番号:20 配列の長さ:5541 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：エシェリキア コリ（Escherichia coli） 株名：臨床分離株 EC−625 配列番号:21 配列の長さ:6317 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：エンテロバクター クロアカエ（Enterobact
er cloacae） 株名：臨床分離株 ET−12 配列番号:22 配列の長さ:6914 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：エンテロバクター クロアカエ（Enterobact
er cloacae） 株名：臨床分離株 ET−49 配列番号:23 配列の長さ:5975 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：クレブシエラ ニューモニエ（Klebsiella p
neumoniae） 株名：臨床分離株 KI−50
フロントページの続き
(72)発明者 上原 啓嗣
兵庫県神戸市東灘区深江本町１丁目13―
20―310
(72)発明者 江田 宗司
大阪府東大阪市日下町３丁目１―５―
305
(58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名)
C12Q 1/68
C12N 15/00 - 15/90
G01N 33/53 - 33/535
G01N 33/566
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ
ＥＮＥＴＹＸ)
Claims (2)
- 【請求項１】Staphylococcus aureus（スタヒロコッカ
ス アウレウス）菌による感染症を診断するための感染
症診断用プローブであって、前記プローブが、Staphylo
coccus aureus菌が保有するDNAと特異的に反応し、か
つ、Staphylococcus aureus菌のゲノミックDNAに含まれ
る以下の塩基配列〜の少なくとも一つの塩基配列、
すなわち、 の少なくとも一つの塩基配列からなる、ことを特徴とす
る感染症診断用プローブ。 - 【請求項２】Staphylococcus epidermidis（スタヒロコ
ッカス エピデルミディス）菌による感染症を診断する
ための感染症診断用プローブであって、前記プローブ
が、Staphylococcus epidermidis菌が保有するDNAと特
異的に反応し、かつ、Staphylococcus epidermidis菌の
ゲノミックDNAに含まれる以下の塩基配列〜の少な
くとも一つの塩基配列、すなわち、 の少なくとも一つの塩基配列からなる、ことを特徴とす
る感染症診断用プローブ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6503175A JP2798499B2 (ja) | 1992-07-07 | 1993-07-07 | 感染症診断用プローブ |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17971992 | 1992-07-07 | ||
| JP4-179719 | 1992-07-07 | ||
| JP6503175A JP2798499B2 (ja) | 1992-07-07 | 1993-07-07 | 感染症診断用プローブ |
Related Child Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10065836A Division JP2965544B2 (ja) | 1992-07-07 | 1998-03-16 | 感染症診断用プローブ |
| JP10065820A Division JP2965543B2 (ja) | 1992-07-07 | 1998-03-16 | 感染症診断用プローブ |
| JP10065850A Division JP3026789B2 (ja) | 1992-07-07 | 1998-03-16 | 感染症診断用プローブ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2798499B2 true JP2798499B2 (ja) | 1998-09-17 |
Family
ID=16070679
Family Applications (4)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6503175A Expired - Fee Related JP2798499B2 (ja) | 1992-07-07 | 1993-07-07 | 感染症診断用プローブ |
| JP10065836A Expired - Lifetime JP2965544B2 (ja) | 1992-07-07 | 1998-03-16 | 感染症診断用プローブ |
| JP10065820A Expired - Lifetime JP2965543B2 (ja) | 1992-07-07 | 1998-03-16 | 感染症診断用プローブ |
| JP10065850A Expired - Lifetime JP3026789B2 (ja) | 1992-07-07 | 1998-03-16 | 感染症診断用プローブ |
Family Applications After (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10065836A Expired - Lifetime JP2965544B2 (ja) | 1992-07-07 | 1998-03-16 | 感染症診断用プローブ |
| JP10065820A Expired - Lifetime JP2965543B2 (ja) | 1992-07-07 | 1998-03-16 | 感染症診断用プローブ |
| JP10065850A Expired - Lifetime JP3026789B2 (ja) | 1992-07-07 | 1998-03-16 | 感染症診断用プローブ |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US5807673A (ja) |
| EP (10) | EP0652291B1 (ja) |
| JP (4) | JP2798499B2 (ja) |
| KR (1) | KR0159071B1 (ja) |
| AT (10) | ATE328118T1 (ja) |
| AU (1) | AU684250B2 (ja) |
| CA (1) | CA2139847C (ja) |
| DE (10) | DE69333887T2 (ja) |
| DK (8) | DK1498495T3 (ja) |
| TW (1) | TW256881B (ja) |
| WO (1) | WO1994001583A1 (ja) |
Families Citing this family (34)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20020055101A1 (en) | 1995-09-11 | 2002-05-09 | Michel G. Bergeron | Specific and universal probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
| US6001564A (en) * | 1994-09-12 | 1999-12-14 | Infectio Diagnostic, Inc. | Species specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
| JP3571378B2 (ja) * | 1994-09-30 | 2004-09-29 | 扶桑薬品工業株式会社 | 感染症診断用プローブ |
| US6905670B2 (en) * | 1995-03-28 | 2005-06-14 | The General Hospital Corporation | Methods of screening compounds useful for prevention of infection or pathogenicity |
| AUPN350795A0 (en) * | 1995-06-13 | 1995-07-06 | Australian National University, The | Nucleic acid molecule and its uses in determining pathogenicity of Staphylococcus |
| US5994066A (en) * | 1995-09-11 | 1999-11-30 | Infectio Diagnostic, Inc. | Species-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
| US6107071A (en) * | 1996-09-24 | 2000-08-22 | Smithkline Beecham Corporation | Histidinol dehydrogenase |
| US6255072B1 (en) | 1996-09-30 | 2001-07-03 | Smithkline Beecham Corporation | spsA polynucleotides |
| US20030049636A1 (en) | 1999-05-03 | 2003-03-13 | Bergeron Michel G. | Species-specific, genus-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial and fungal pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for diagnosis in microbiology laboratories |
| US20100267012A1 (en) | 1997-11-04 | 2010-10-21 | Bergeron Michel G | Highly conserved genes and their use to generate probes and primers for detection of microorganisms |
| JP3520172B2 (ja) * | 1997-03-25 | 2004-04-19 | 扶桑薬品工業株式会社 | クレブシェラ・ニューモニエ菌に起因する感染症の診断用プローブ |
| JP2002516571A (ja) * | 1997-05-06 | 2002-06-04 | ヒューマン ジノーム サイエンシーズ，インコーポレイテッド | Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓポリヌクレオチドおよびポリペプチド |
| US7060458B1 (en) * | 1997-08-14 | 2006-06-13 | Wyeth | Nucleic acid and amino acid sequences relating to Staphylococcus epidermidis for diagnostics and therapeutics |
| US6914131B1 (en) * | 1998-10-09 | 2005-07-05 | Chiron S.R.L. | Neisserial antigens |
| US6610836B1 (en) | 1999-01-29 | 2003-08-26 | Genome Therapeutics Corporation | Nucleic acid amino acid sequences relating to Klebsiella pneumoniae for diagnostics and therapeutics |
| GB9911683D0 (en) * | 1999-05-19 | 1999-07-21 | Chiron Spa | Antigenic peptides |
| BR0014370A (pt) | 1999-09-28 | 2002-11-05 | Infectio Diagnostic Inc | Genes altamente conservados e seu uso para gerar sondas de ácido nucléico e preparadores de amplificação especìficos em espécie, especìfico em gênero, especìficos em famìlia, especìficos em grupo e universais para rapidamente detectar e identificar microorganismos algais, amebianos, bacterianos, fúngicos e parasitas de espécimes clìnicos para diagnose |
| KR100353506B1 (ko) * | 1999-10-04 | 2002-09-19 | 제일제당주식회사 | 녹농균 동정 및 감염 진단용 프라이머 |
| US6703492B1 (en) | 1999-11-09 | 2004-03-09 | Smithkline Beecham Corporation | Staphylococcus epidermidis nucleic acids and proteins |
| AU1478301A (en) * | 1999-11-09 | 2001-06-06 | Glaxo Group Limited | Staphylococcus epidermidis nucleic acids and proteins |
| JP2003523754A (ja) * | 2000-02-25 | 2003-08-12 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレーション | グラム陽性エンテロコッカスビルレンス因子のスクリーニング法 |
| MXPA02008314A (es) * | 2000-02-28 | 2002-12-09 | Chiron Spa | Expresion heterologa de proteinas de neisseria. |
| US7078584B2 (en) * | 2000-03-17 | 2006-07-18 | The General Hospital Corporation | Salmonella typhimurium-infected Caenorhabditis elegans for identifying inhibitors of infection |
| WO2001073038A2 (de) * | 2000-03-31 | 2001-10-04 | Lonza Ag | Verfahren zur biotechnologischen herstellung von l-alaninol |
| US7112716B2 (en) * | 2000-04-06 | 2006-09-26 | The General Hospital Corporation | Methods for screening and identifying host pathogen defense genes |
| WO2002099133A1 (fr) * | 2001-05-31 | 2002-12-12 | Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. | Procede ameliore de detection et d'identification de micro-organismes causes d'infections |
| EP1818402A3 (en) * | 2001-05-31 | 2008-04-02 | Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. | Method of evaluating the function of phagocyte and utilization thereof |
| US20040161741A1 (en) | 2001-06-30 | 2004-08-19 | Elazar Rabani | Novel compositions and processes for analyte detection, quantification and amplification |
| US6696254B2 (en) * | 2001-11-21 | 2004-02-24 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Detection and identification of enteric bacteria |
| JP2004089046A (ja) * | 2002-08-30 | 2004-03-25 | Fuso Pharmaceutical Industries Ltd | カンジダアルビカンス菌の検出用プローブおよびそれを用いた方法 |
| JP2004313181A (ja) | 2003-04-02 | 2004-11-11 | Canon Inc | 感染症起炎菌検出用プローブ及びプローブセット、ならびに担体及び遺伝子検査方法 |
| US20090035767A1 (en) * | 2006-11-28 | 2009-02-05 | Canon Kabushiki Kaisha | Primer for bacterium genome amplification reaction |
| EP2503008B1 (en) | 2007-04-19 | 2015-04-01 | Molecular Detection Inc. | Methods, compositions and kits for detection and analysis of antibiotic-resistant bacteria |
| WO2009152298A1 (en) * | 2008-06-13 | 2009-12-17 | Zeus Scientific, Inc. | Methods, compositions and and diagnostic kits for the detection and treatment for staphylococcal nasal decolonization using achromopeptidase |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4652517A (en) * | 1984-06-11 | 1987-03-24 | Diagnostic Research Limited Partnership | Methods for the in vitro detection and identification of unknown pathogens or genetic entities |
| US5047334A (en) * | 1987-06-30 | 1991-09-10 | Repligen Corporation | Novel prokaryotic expression and secretion system |
| US5004682A (en) * | 1987-11-02 | 1991-04-02 | Olin Corporation | Method and kit for detecting live microorganisms in chlorine- or bromine-treated water |
| AU623889B2 (en) * | 1988-04-20 | 1992-05-28 | Fuso Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha | Method for diagnosis of infectious diseases and method of detecting and identifying microorganisms |
| EP0377711A1 (en) * | 1988-06-20 | 1990-07-18 | Luminis Pty. Limited | Serotyping dna probes |
| NL8900670A (nl) * | 1989-03-17 | 1990-10-16 | Stichting Tech Wetenschapp | Polynucleotide-probe, werkwijze en kit voor het identificeren en opsporen van gram-negatieve bacterien. |
| DE69022167T2 (de) * | 1989-05-23 | 1996-02-15 | Amoco Corp | Nukleinsäuresonden zum nachweis von staphylococcus aureus. |
| NL9002157A (nl) * | 1989-11-27 | 1991-06-17 | U Gene Research Bv | Dna fragmenten en daarop gebaseerde dna-probes en primers. |
| ES2056261T3 (es) * | 1990-02-10 | 1994-10-01 | Nestle Sa | Un ensayo del dna para el lactobacilius helveticus. |
| WO1992005281A1 (en) * | 1990-09-14 | 1992-04-02 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method of detecting mesitylene-cephem-resistant staphylococcus aureus |
-
1993
- 1993-07-07 EP EP93914968A patent/EP0652291B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-07 DK DK04077305T patent/DK1498495T3/da active
- 1993-07-07 AT AT04077305T patent/ATE328118T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-07-07 DE DE69333887T patent/DE69333887T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-07 DE DE69334080T patent/DE69334080T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-07 AT AT03075759T patent/ATE346956T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-07-07 DE DE69333958T patent/DE69333958T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-07 US US08/362,577 patent/US5807673A/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-07 EP EP01203326A patent/EP1160334B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-07 DE DE69333872T patent/DE69333872T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-07 DK DK03075759T patent/DK1329520T3/da active
- 1993-07-07 EP EP03075759A patent/EP1329520B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-07 EP EP01203321A patent/EP1167542B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-07 AT AT03075758T patent/ATE314467T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-07-07 AU AU45135/93A patent/AU684250B2/en not_active Ceased
- 1993-07-07 AT AT93914968T patent/ATE241702T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-07-07 AT AT01203324T patent/ATE304609T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-07-07 AT AT01203321T patent/ATE344333T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-07-07 DK DK01203326T patent/DK1160334T3/da active
- 1993-07-07 AT AT01203326T patent/ATE338141T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-07-07 DE DE69333008T patent/DE69333008T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-07 AT AT04077306T patent/ATE326551T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-07-07 EP EP04077305A patent/EP1498495B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-07 EP EP03075757A patent/EP1329518B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-07 DK DK03075757T patent/DK1329518T3/da active
- 1993-07-07 DK DK01203321T patent/DK1167542T3/da active
- 1993-07-07 DK DK03075758T patent/DK1329519T3/da active
- 1993-07-07 DE DE69334028T patent/DE69334028T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-07 CA CA002139847A patent/CA2139847C/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-07-07 WO PCT/JP1993/000936 patent/WO1994001583A1/ja active IP Right Grant
- 1993-07-07 DE DE69334018T patent/DE69334018T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-07 DK DK93914968T patent/DK0652291T3/da active
- 1993-07-07 EP EP01203323A patent/EP1167543B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-07 TW TW082105424A patent/TW256881B/zh active
- 1993-07-07 DE DE69334094T patent/DE69334094T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-07 JP JP6503175A patent/JP2798499B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1993-07-07 EP EP01203324A patent/EP1167544B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-07 DE DE69334060T patent/DE69334060T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-07 EP EP04077306A patent/EP1498496B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-07 DK DK04077306T patent/DK1498496T3/da active
- 1993-07-07 AT AT03075757T patent/ATE346167T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-07-07 AT AT01203323T patent/ATE307200T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-07-07 EP EP03075758A patent/EP1329519B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-07 KR KR1019950700098A patent/KR0159071B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1993-07-07 DE DE69334090T patent/DE69334090T2/de not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-08-29 US US08/921,177 patent/US5798211A/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-08-29 US US08/920,827 patent/US5770375A/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-08-29 US US08/920,828 patent/US5853998A/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-08-29 US US08/920,812 patent/US5763188A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-03-16 JP JP10065836A patent/JP2965544B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-16 JP JP10065820A patent/JP2965543B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-16 JP JP10065850A patent/JP3026789B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2798499B2 (ja) | 感染症診断用プローブ | |
| EP0670373B1 (en) | Probe for diagnosing candida-infections | |
| JP3571378B2 (ja) | 感染症診断用プローブ | |
| CA2284555C (en) | Probes for the diagnosis of infections caused by streptococcus pyogenes | |
| JP3520172B2 (ja) | クレブシェラ・ニューモニエ菌に起因する感染症の診断用プローブ | |
| US6265568B1 (en) | Probes for the diagnosis of infections caused by bacteroides fragilis | |
| JP3914916B2 (ja) | ストレプトコッカス・ピオゲネス菌に起因する感染症の診断用プローブ | |
| JP3914915B2 (ja) | ストレプトコッカス・ピオゲネス菌に起因する感染症の診断用プローブ | |
| JP3914914B2 (ja) | ストレプトコッカス・ピオゲネス菌に起因する感染症の診断用プローブ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090703 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090703 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100703 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100703 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110703 Year of fee payment: 13 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120703 Year of fee payment: 14 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130703 Year of fee payment: 15 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |