DE69022167T2

DE69022167T2 - Nukleinsäuresonden zum nachweis von staphylococcus aureus.

Info

Publication number: DE69022167T2
Application number: DE69022167T
Authority: DE
Inventors: David Lane; Raymond Nietupski; Jyotsna Shah
Original assignee: BP Corp North America Inc
Current assignee: BP Corp North America Inc
Priority date: 1989-05-23
Filing date: 1990-05-22
Publication date: 1996-02-15
Anticipated expiration: 2010-05-23
Also published as: CA2031498A1; EP0426837A1; JPH04500310A; JP3105241B2; EP0426837B1; ATE127529T1; US5582974A; AU5810490A; DE69022167D1; WO1990014444A1

Description

Diese Erfindung betrifft den Nachweis von Bakterien, die zur Art Staphylococcus aureus gehören, und insbesondere die Bereitstellung von Nucleinsäuresonden und Zusammensetzungen zusammen mit Verfahren für ihre Anwendung zum spezifischen Nachweis von Staphylococcus aureus.
Der hier verwendete Begriff "Staphylococcus aureus" verweist auf Bakterien, die als solche in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Sneath P.H.A., Hrsg., 1986, Seiten 1015-1019, Williams & Wilkins) klassifiziert wurden. Der Nachweis von Staphylococcus aureus ist in verschiedenen medizinischen Zusammenhängen und Zusammenhängen der öffentlichen Gesundheit wichtig. Insbesondere kann Staphylococcus aureus eine schwere Lebensmittelvergiftung verursachen. In den Vereinigten Staaten werden jedes Jahr tausende von Fällen von Lebensmittelvergiftung gemeldet. Man vermutet viel mehr nicht gemeldete Fälle. Lebensmittel werden auf das Vorhandensein von S. aureus und/oder seiner Enterotoxine untersucht, um zu bestätigen, daß S. aureus der Erreger einer nahrungsmittelbedingten Erkrankung ist, sowie um festzustellen. ob ein Lebensmittel eine potentielle Quelle der "Staph"-Lebensmittelvergiftung ist und um eine Kontaminierung nach der Verarbeitung nachzuweisen, die im allgemeinen auf menschlichen Kontakt oder kontaminierte Lebensmittelkontaktoberflächen zurückzuführen ist.
Verfahren zum Nachweis und zur Spezifizierung von Staphylococcus aureus hängen gewissermaßen von den Anlässen für die Untersuchung des Lebensmittels und der vorangangenen Geschichte des Testmaterials selbst ab. Die Analyseverfahren für S. aureus, die besonders häufig angewendet werden (und welche die von der Food and Drug Administration (FDA) benötigte Information liefern), werden in den Kapiteln 14 und 15 des FDA/BAM- Bacteriological Analytical Manual's angegeben (sechste Auflage, 1984, Association of Official Analytical Chemists). Im allgemeinen umfassen solche Verfahren die Isolierung von Staphylococcus aureus aus einer geeignet präparierten Probe in einem mikrobiologischen Medium unter Bedingungen, die für das Wachstum dieser Bakterien günstig sind. Die resultierenden Kolonien werden dann typischerweise auf morphologische und biochemische Eigenschaften untersucht, ein Verfahren, das im allgemeinen 48 Stunden nach Erhalt der Probe begonnen wird und ungünstigerweise zwischen vier und sechs Tage in Anspruch nimmt, bis es abgeschlossen ist. Deshalb ist ein Gesichtspunkt dieser Erfindung die Bereitstellung von Nucleinsäuresonden, die spezifisch sind für Staphylococcus aureus und die nicht mit anderen Bakterien oder Pilzen reagieren, die in den ausgewählten Materialien vorliegen können. Solche Sonden können in einer Vielzahl von Testsystemen verwendet werden, die viele der Nachteile vermeiden, die mit den traditionellen mehrtägigen Züchtungstechniken verbunden sind.
Ein anderer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt ist die Bereitstellung von Sonden, die mit Zielbereichen hybridisieren, die unter normalen Testbedingungen den Sonden zugänglich gemacht werden können.
Während Kohne et al. (Biophysical Journal 8 (1968), 1104-1118) ein Verfahren zur Herstellung von Sonden für rRNA-Sequenzen diskutieren, stellen sie nicht die für die Herstellung von Staphylococcus aureus-spezifischen Sonden notwendige Lehre bereit.
Pace and Campbell (Journal of Bacteriology 107 (1971), 543-547) diskutieren die Homologie der ribosomalen Ribonucleinsäuren aus verschiedenen Bakterienarten und ein Hybridisierungsverfahren zur Quantifizierung solcher Homolgiegrade. In ähnlicher Weise diskutieren Sogin, Sogin und Woese (Journal of Molecular Evolution 1 (1972), 173-184) die theoretischen und praktischen Gesichtspunkte der Anwendung der primären strukturellen Eigenschaft von unterschiedlichen ribosomalen RNA-Molekülen zur Bewertung von phylogenetischen Verwandtschaften. Fox, Pechman und Woese (International Journal of Systematic Bacteriology 27 (1977), 44-57) diskutieren die vergleichende Katalogisierung der ribosomalen 16S-RNAs als ein Mittel zu prokaryontischen Systematiken. Diese Dokumente ersetzen jedoch nicht die in Hinsicht auf Staphylococcus aureus fehlende Lehre von Kohne und stellen insbesondere keine Staphylococcus aureus-spezifische Sonden bereit, die bei Tests zum Nachweis von Staphylococcus aureus in Lebensmittel und anderen Proben nützlich sind.
EP-A-0272009 (Hogan et al.) beschreibt eine Anzahl von Sonden, für die beansprucht wird, daß sie mit vielen Vertretern von Eubakterien und Pilzen hybridisieren. Es wird ein allgemein anwendbares Verfahren zur Herstellung einer Sonde offenbart, die in einem qualitativen oder quantitativen Hybridisierungstest zum spezifischen Nachweis eines bestimmten nicht-viraien Organismus verwendet wird. Jedoch offenbart EP-A-0272009 (Hogan et al.) nicht die erfindungsgemäßen Sonden.
Ribosomen sind für alle Organismen von größter Wichtigkeit, da sie als das einzig bekannte Mittel zur Translation von genetischer Information in zelluläre Proteine dienen, die strukturellen und kataiytischen Hauptelemente des Lebens. Eine deutliche Manifestierung dieser Wichtigkeit ist die Beobachtung, daß alle Zellen Ribosomen aufweisen.
Ribosomen enthalten drei verschiedene RNA-Moleküle, die zumindest in E. coli als 5S-, 16S- und 23S-rRNAs bezeichnet werden. Diese Bezeichnungen beziehen sich historisch auf die Größe der rRNA-Moleküle, die durch ihre Sedimentationsrate bestimmt wurde. In Wirklichkeit jedoch variieren die ribosomalen RNA-Moleküle zwischen Organismen wesentlich in der Größe. Dennoch wird 5S-, 16S- und 23S-rRNA üblicherweise als allgemeine Bezeichnung für die homologen RNA-Moleküle in allen Bakterien verwendet und diese Konvention wird hier beibehalten.
Wie hier verwendet, verweist Sonde(n) auf synthetisch oder biologisch hergestellte Nucleinsäuren (DNA oder RNA), die durch Konstruktion oder Selektion spezifische Nucleotidsequenzen enthalten, die es ihnen ermöglichen, unter definierten, vorherbestimmten Stringenzen zu hybridisieren, besonders (d.h. vorzugsweise, vgl. nachstehend: Hybridisierung) mit Zielnucleinsäuresequenzen. Zusätzlich zu ihren Hybridisierungseigenschaften können die Sonden auch bestimmte Komponenten enthalten, die ihre richtige oder optimale Funktion unter bestimmten Testbedingungen betreffen. Beispielsweise können Sonden modifiziert werden, so daß sie Nachweisliganden (z.B. Fluorescein, 32-P, Biotin, etc.) tragen oder um ihr Einfangen auf einem festen Träger zu erleichtern (z.B. Polydesoxyadenosin-"Schwänze"). Solche Modifikationen sind Entwicklungen der grundlegenden Sondenfunktion, das heißt ihrer Fähigkeit, in nützlicher Weise zwischen Ziel- und Nicht-Zielorganismen in einem Hybrisierungstest zu unterscheiden.
Hybridisierung wird traditionell als der Vorgang verstanden, bei dem man unter vorherbestimmten Reaktionsbedingungen zwei partiell oder vollständig komplementäre Nucleinsäurestränge in einer antiparallelen Weise miteinander in Kontakt kommen läßt, wobei eine doppelsträngige Nucleinsäure mit spezifischen und stabilen Wasserstoffbrücken gebildet wird.
Die Stringenz einer bestimmten Reihe von Hybridisierungsbedingungen wird durch die Basenzusammensetzung des Sonden/Ziel-Duplexes definiert sowie durch die Menge und die Geometrie der Falschpaarung zwischen den zwei Nucleinsäuren.
Die Stringenz kann auch durch solche Reaktionsparameter bestimmt werden, wie Konzentration und Typ der in der Hybridisierungslösung vorliegenden Ionenarten, Arten und Konzentrationen der vorhandenen Denaturierungsmittel und/oder Temperatur der Hybridisierung. Allgemein werden, wenn die Hybridisierungsbedingungen stringenter werden, längere Sonden bevorzugt, falls stabile Hybride gebildet werden sollen. Als Folgeerscheinung wird die Stringenz der Bedingungen, unter denen eine Hybridisierung erfolgen soll (z.B. bezogen auf die Art des durchzuführenden Tests), bestimmte Eigenschaften der bevorzugten Sonden, die eingesetzt werden sollen, diktieren. Solche Verhältnisse sind gut verstanden und können durch den Fachmann leicht manipuliert werden.
Allgemein verstehen solche Personen, abhängig von der Sondenlänge, unter stringenten Bedingungen etwa 35ºC-65ºC in einer Salzlösung von etwa 0,9 Mol/l.
Gemäß der verschiedenen Prinzipien und Gesichtspunkte der vorliegenden Erfindung werden Nucleinsäuresonden und Sondensätze bereitgestellt, umfassend DNA- oder RNA-Sequenzen, die unter spezifischen Bedingungen mit den ribosomalen RNA-Molekülen (rRNA) oder rRNA-Genen (rDNA) von Staphylococcus aureus hybridisieren, die aber unter den gleichen Bedingungen nicht mit der rRNA oder rDNA von anderen verwandten Bakterien hybridisieren, die in den Testproben vorliegen können. Deshalb schafft die erfindungsgemäße Sonde(n) die Grundlage für die EntwicMung eines nützlichen Nucleinsäure-Hybridisierungstests für den spezifischen Nachweis von S. aureus in Lebensmittel, klinischen Proben oder Umweltproben.
Nach unserer Kenntnissen wurde festgestellt, daß derartige auf Nucleinsäurehybridisierung bezogene Tests zu einer verstärkten Leistungsfähigkeit in Hinsicht auf die meisten derzeit verfügbaren mikrobiologischen Verfahren zum Nachweis von Bakterien in Testproben führt, allgemein umfassend:
a) einer verstärkte Empfindlichkeit; d.h. die Fähigkeit, die Bakterien in einer bestimmten Probe häufiger nachzuweisen;
b) potentiell bedeutende Verringerung der Testkosten aufgrund der Verwendung von billigen Reagenzien und einem verringerten Arbeitsaufwand;
c) genaue Identifizierung von selbst biochemisch unüblichen Stämmen der Zielbakterien;
d) schnellere Ergebnisse, da solche Tests keine Isolierung des Zielbakteriums aus der Probe vor der Untersuchung erfordern.
Es wurde entdeckt, daß andere Vorteile, die sich daraus ergeben, daß die erfindungsgemäßen Sonden gegen rRNA gerichtet werden, die Tatsache einschließen, daß die nachgewiesenen rRNAS eine bedeutende Komponente der zellulären Masse darstellen. Obwohl Schätzungen des zellulären Ribosomengehalts variieren, können aktiv wachsende Staphylococcus aureus-Bakterien mehr als 50 000 Ribosomen pro Zelle enthalten und deshalb 50 000 Kopien jeder rRNA (sie liegen in Ribosomen in einer Stöchiometrie von 1:1:1 vor). Im Gegensatz dazu sind andere potentielle zelluläre Zielmoleküle, wie Gene oder RNA- Transkripte davon, weniger geeignet, da sie in einer viel geringeren Häufigkeit vorliegen.
Ein weiterer unerwarteter Vorteil ist, daß die rRNAS (und die sie spezifizierenden Gene) nicht der lateralen Übertragung zwischen gleichzeitig vorliegenden Organismen ausgesetzt sind. Folglich stellt die primäre rRNA-Struktur eher ein Organismus-spezifisches, molekulares Ziel bereit als ein Gen-spezifisches Ziel, wie es wahrscheinlich beispielsweise bei einem Plasmid-abhängigen Gen oder einem Produkt davon der Fall sein würde, das einer lateralen Übertragung zwischen gleichzeitig vorliegenden Organismen ausgesetzt sein kann.
Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung Sonden gegen rRNA-Zielsequenzen von Staphylococcus aureus bereit, die bei allen getesteten Staphylococcus aureus-Stämmen ausreichend ähnlich sind, so daß sie mit dem Zielbereich aller zu Staphylococcus aureus gehörenden Bakterien hybridisieren können. Vorteilhafterweise sind diese gleichen rRNA-Zielsequenzen in den meisten rRNAs von Bakterien, die nicht zur Gattung Staphylococcus aureus gehören, ausreichend verschieden, so daß sie unter Bedingungen, bei denen eine der Sonden, Sonde 1337, mit rRNAS von S, aureus hybridisiert, nicht mit den meisten rRNAS von Bakterien die nicht zur Gattung S. aureus gehören, hybridisieren. Diese Sondeneigenschaften werden jeweils als Inklusivität und Exklusivität definiert.
Die andere bevorzugte erfindungsgemäße Sonde Sonde 1336, ist wie Sonde 1337 für die S. aureus-Stämme völlig inklusiv und zusätzlich hybridisiert Sonde 1336 auch mit einigen wenigen nahen Verwandten von S. aureus.
Die Entdeckung, daß Sonden mit den außerordentlichen Inklusivitäts- und Exklusivitätseigenschaften der erfindungsgemäßen Sonden in Hinsicht auf S, aureus erzeugt werden können, war nicht vorhersagbar und unerwartet.
Die verschiedenen erfindungsgemäßen Gesichtspunkte, für die ein Schutz beansprucht wird, sind in den beigefügten Patentansprüchen aufgeführt.
Die erfindungsgemäßen Prinzipien und Gesichtspunkte werden mit Bezug auf die Tabellen verständlicher, wobei:
Tabelle 1 eine Abgleichung der Nucleotidsequenzen der bevorzugten erfindungsgemäßen Sonden mit den Zielnucleotidsequenzen einer Anzahl von Staphylococcus-Stämmen darstellt. Die entsprechenden Teile der 23S-rRNAs einer Anzahl von nahe verwandten Bakterien, die nicht zur Gattung Staphylococcus aureus gehören, sind zum Vergleich ebenfalls aufgeführt. RNA(Ziel)-Sequenzen werden von 5' nach 3' geschrieben, Sondensequenzen entsprechen DNA und werden von 3' nach 5' geschrieben. Die Sonden sind zusammen mit dem "Kern"-Bereich der Variation dargestellt, auf dem ihr Inklusivitäts- und Exklusivitätsverhalten beruht. Der untere Fall C (c) in Sonde 1336 zeigt einen modifizierten Cytosinrest an, der abhängig von der verwendeten Testanordnung mit einer Markergruppe verknüpft werden kann oder nicht.
Tabelle 2 veranschaulicht das Inklusivitäts- und Exklusivitätsverhalten der bevorzugten Sonden gegenüber einer repräsentativen Probe von Staphylococcus aureus-Stämmen und Stämmen, die nicht zur Gattung Staphylococcus aureus gehören, in einem Dot-Blot- Hybridisierungstest

Sondenentwicklungsstrategie

Der erste Schritt bei der Entwicklung der erfindungsgemäßen Sonden, umfaßte die Identifizierung der Bereiche der 16S- und 23S-rRNA, die potentiell als Zielstellen für Staphylococcus aureus-spezifische Nucleinsäuresonden dienen könnten. Praktisch ist es schwierig a priori vorherzusagen welche Organismen, die nicht zur Gattung Staphylococcus aureus gehören, in einer beliebigen Testprobe vorliegen könnten.
Aufgrund der großen Anzahl solcher potentiellen Bakterien, die nicht zur Gattung Staphylococcus aureus gehören, ist es nicht nur nicht vorhersagbar, sondern auch extrem schwierig und mühsam, die Exklusivität für jede angegebene Sondensequenz nachzuweisen. Ein rigoroseres Kriterium wurde gewählt, damit sich die Notwendigkeit erübrigt, zu wissen welche Bakterien, die nicht zur Gattung Staphylococcus aureus gehören, in allen Testproben vorliegen könnten, die unter Verwendung der Sonden letztendlich abgesucht werden.
Dies erforderte die Kenntnis der phylogenetischen Beziehungen von Staphylococus aureus untereinander und zwischen Staphylococcus aureus und anderen Bakteriengruppen.
Insbesondere wurde eine vorher nicht bewiesene Arbeitshypothese gewählt, daß das Exklusivitätskriterium durch den Nachweis erfüllt sein könnte, daß, wenn ein bestimmter Zielbereich in der rRNA von Staphylococcus aureus identifiziert werden könnte, der vom homologen Bereich in der rRNA der repräsentativen, jedoch nahe evolutionär Verwandten von Staphylococcus aureus ausreichend verschieden ist, dann eine Sonde zu einer solchen Sequenz dazu verwendet werden könnte, um zwischen Staphylococcus aureus und den Verwandten durch einen Hybridisierungstest zu unterscheiden. Basierend auf den phylogenetischen Beobachtungen wurde dann extrapoliert, daß rRNA-Sequenzen von entfernter verwandten Organismen, selbst wenn ihre aktuelle Identität nicht notwendigerweise bekannt ist, in dem vorstehend erwähnten Ziel bereich der Sequenz vorhersagbar unterschiedlicher sein sollten als der vorstehend erwähnte nahe evolutionär Verwandte von Staphylococcus aureus. Es kann jedoch nicht a priori vorhergesagt werden, ob solche Bereiche existieren oder wenn sie existieren, wo innerhalb der rRNA solche Bereiche lokalisiert sind.
Als erster Schritt bei der Identifizierung von Bereichen der rRNA von Staphylococcus aureus, die potentiell als nützliche Zielstellen für Nucleinsäurehybridisierungssonden dienen könnten, wurden die beinahe vollständigen Nucleotidsequenzen der 16S- und 23S- rRNAS von einer Anzahl von Stämmen von Staphylococcus aureus bestimmt.
Die Nucleotidsequenzen wurden mit Standardlaborprotokollen entweder durch Clonieren (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982), Cold Spring Harbor Laboratory New York, Seite 545) und Sequenzieren (Maxam und Gilbert. Proceedings of the National Academy of Science USA 74 (1977), 560-564; Sanger et al., Proceedings of the National Academy of Science USA 24 (1977), 5463-5467) der Gene bestimmt. welche die rRNAs spezifizieren, und/oder durch direkte Sequenzierung der rRNAs selbst unter Verwendung einer reversen Transkriptase (Lane et al., Proceedings of the National Academy of Science USA 82 (1985), 6955-6959).
Die bestimmten rRNA-Nucleotidsequenzen von Staphylococcus aureus wurden mit anderen verfügbaren rRNA-Nucleotidsequenzen verglichen, insbesondere mit solchen von nahe verwandten Bakterien, wie andere Arten von Staphylococcus aureus, Enterococcus, Listeria und Bacillus etc., die ebenfalls als Teil dieser Arbeit bestimmt wurden.
Der Vergleich der Sequenzen von Staphylococcus aureus und seines sehr nahe Verwandten Staphylococcus epidermidis erwies sich als besonders nützlich. Ein Bereich der Sequenz wurde identifiziert, der bei den zwei Arten von Staphylococcus und zwischen Staphylococcus aureus und Bakterien, die nicht zur Gattung Staphylococcus gehören, unterschiedlich zu sein schien. Tabelle 1 zeigt einen ausführlichen Vergleich dieses Bereichs in einer Vielzahl von Staphylococcus-Bakterien und Bakterien, die nicht zur Gattung Staphylococcus gehören. Schließlich wurde die Nützlichkeit der Sonden im Bezug auf die beobachteten Nucleotidsequenzunterschiede anschließend durch umfassende Hybridisierungsversuche bestätigt und in Tabelle 2 dargestellt.

Physikalische Beschreibung der Sonden

Die vorstehende Sondenauswahlstrategie führte zu einer Anzahl von Sonden, die zur Identifizierung von Staphylococcus aureus-Bakterien in Proben nützlich sind. Die folgenden bevorzugten Oligonucleotidsonden sind hier offenbart:
SEQ.-ID-NR. 1
Sonde 1336: 5'-cGATTATTACCTTCTTTGATTCATCTTTCCAGAcT-3'
SEQ.-ID-NR. 2
Sonde 1337: 5'-ATTCGTCTAATGTCGTCCTTTGTAACTC-3'
Die Sonden 1336 und 1337 sind auf benachbarte Bereiche der 23S-rRNA gerichtet (Tabelle 1). Sonde 1336 ist auf den Bereich der 23S-rRNA von Staphylococcus aureus gerichtet, der etwa den Nucleotidpositionen 304 bis 335 entspricht (Anwendung des E. coli- Numerierungssyswms) und Sonde 1337 ist auf die Positionen ca. 274 bis 301 gerichtet (Tabelle 1).
Wie in Tabelle 1 angegeben, ist die Sonde 1337 um die Positionen der Kernvariation "gebaut" die besonders nützlich sind zur Unterscheidung zwischen Staphylococcus aureus und seinem sehr nahen Verwandten Staphylococcus epidermidis. Die Kernsequenz GGACGACA in der 23S-rRNA von Staphylococcus aureus enthält in Hinsicht auf den homologen Bereich von Staphylococcus epidermidis 5 Sequenzunterschiede (angezeigt durch die Buchstaben in der oberen Reihe in der in Tabelle 1 dargestellten Kernsequenz).
Die Sonde 1336 unterscheidet nicht zwischen Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis aufgrund der nachgewiesenen Identität der Zielsequenzen für diese Sonde in diesen zwei bakteriellen 23 S-rRNAs (Tabelle I). Deshalb wäre die Sonde 1336 allein als Staphylococcus aureus-spezifische Sonde nicht nützlich, da die Unterscheidung zwischen diesen zwei Bakterienarten für die meisten potentiellen Anwendungen eines Tests, der solche Sonden einsetzen würde, allgemein als wichtig angesehen wird. Jedoch weist die Sonde 1336 wichtige und neue Spezifitätseigenschaften auf. Der für die Sonde 1336 definierte Kernbereich der Variation ist eine Konzentration der Sequenzunterschiede zwischen Staphylococcus aureus (und S. epidermidis) und Staphylococcus carnosis. Aus diesen Sequenzdaten kann die Sonde 1336 deshalb eine taxonomisch größere Gruppe von Staphylococcus aureus-Verwandten bestimmen als die Sonde 1337. Dies wurde durch die in Tabelle 2 aufgeführten Hybridisierungsdaten bestätigt.
Das spezifische Verhalten der Sonden 1336 und 1337 hängt in einem erheblichen Umfang von der Testanordnung ab, in der sie verwendet werden. Umgekehrt legt die Testanordnung bestimmte Merkmale der optimalen Konstruktionsmerkmale von bestimmten Sonden fest. Der "Kern" der erfindungsgemäßen Sonden sollte nicht so konstruiert werden, daß er auf die spezifische Nucleotidkette in den als 1336 und 1337 bezeichneten Sonden beschränkt ist. Beispielsweise wurde die Länge dieser bestimmten Oligonucleotide für die Anwendung im Dot-Blot-Test (und bestimmten anderen angenommenen Testen) optimiert, wie nachstehen beschrieben. Dem Fachmann ist gut bekannt daß die optimale Sondenlänge eine Funktion der Stringenz der gewählten Hybridisierungbedingungen ist und deshalb kann die Länge der gegenwärtigen Sonden entsprechend dazu verändert werden. In Anbetracht von Sätzen, die mehr als eine Sonde umfassen, ist es auch wünschenswert, daß sich alle Sonden in allen bestimmten Anordnungen, in denen sie beide verwendet werden, in einer kompatiblen Weise verhalten. Folglich weist die genaue Länge einer bestimmten Sonde in einem gewissen Umfang auf ihre spezifische beabsichtigte Anwendung hin.
Der hier beschriebene "Kern" der Sonden beruht auf der Entdeckung und Nutzung der vorstehend beschriebenen und in Tabelle 1 angegebenen (Kernvariation) Staphylcoccus aureus-spezifischen Sequenzen.

Hybridisierungsanalyse des Sondenverhaltens

Die Sequenzdaten in Tabelle 1 führen zu der Annahme, daß die Sonden 1336 und 1337 mit einer bedeutenden Anzahl von Staphylococcus aureus-Stämmen hybridisiert. Die 23S-rRNAS der Staphylococcus aureus-Stämme und Cistrons, deren Sequenzen alle überprüft wurden, sind innerhalb des in Tabelle 1 dargestellten Zielbereichs identisch. Jedoch ist das verglichen mit der Anzahl bekannter Isolate eine kleine Auswahl von Staphylococcus aureus- Stämmen. Potentiell könnte in anderen Staphylococcus aureus-Stämmen eine viel größere Sequenzvariation vorliegen, die durch eine Sequenzanalyse nicht überprüft wurden. Eine solche Variation könnte die Hybridisierung verringern oder möglicherweise verhindern. Deshalb wird eine sorgfältige Dokumentation des Hybridisierungsverhaltens gegenüber von Staphylococcus aureus-Isolaten bevorzugt, um das Vertrauen hinsichtlich der Sondenspezifität aufrechtzuerhalten.
Genauso wichtig wie das Inklusivitätsverhalten der Sonden ist ihr Exklusivitätsverhalten d.h. ihre Reaktivität gegenüber von Bakterien, die nicht zur Gattung Staphylococcus aureus gehören. Die Anzahl und Arten der Stämme, die nicht zur Gattung Staphylococcus aureus gehören, die in einer potentiell Staphylococcus aureus-enthaltenden Testprobe vorhanden sein könnten, ist äußerst groß. Die in Tabelle 1 dargestellten ausgewählten Sequenzen sind alle nahe Verwandte von Staphylococcus aureus, insbesondere von S. epidermidis und S. carnosis, und man kann erwarten, daß sie im Vergleich zu rRNA-Sequenzen von Staphylococcus aureus sehr ähnliche rRNA-Sequenzen aufweisen. Tatsächlich deckte eine umfassende und sorgfältige Überprüfung der 165-rRNAS dieser und anderer Bakterien keine Bereiche auf, die zur Unterscheidung zwischen Staphylococcus aureus und anderen Staphylococcus- Arten nützlich sind. Die Entdeckung eines kleinen Bereichs einer konservierten Sequenzvariation zwischen den 23S-rRNAS von Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis (in Tabelle 1 als Kernbereich der Variation angegeben) war deshalb nicht vorhersehbar und unerwartet. Jedoch wie vorstehend diskutiert, könnten diese Muster des Sequenzunterschieds nicht für jeden Stamm von Staphylococcus epidermidis oder andere Staphylococcus-Stämme aufrechterhalten werden.
Deshalb wurde das Verhalten der Sonden gegenüber repräsentativen Staphylococcus aureus-Bakterien und Bakterien, die nicht zur Gattung Staphylococcus aureus gehören, durch eine Hybridisierungsanalyse unter Anwendung eines Dot-Blot-Verfahrens bestimmt.

Beispiel 1: Dot-Blot-Analyse des Sondenhybridisierungsverhaltens

Die Dot-Blot-Analyse gemäß gut bekannter Verfahren umfaßt die Immobilisierung einer Nucleinsäure oder einer Population von Nucleinsäuren auf einem Filter, wie Nitrocellulose, Nylon oder andere derivatisierte Membranen, die, besonders für diesen Zweck, ohne weiteres im Handel erhältlich sind. DNA oder RNA können auf einem solchen Filter leicht immobilisiert und anschließend für die Hybridisierung unter einer beliebigen Vielzahl von Bedingungen (d.h. Stringenzen) mit Nucleotidsequenzen oder Sonden von Interesse untersucht oder getestet werden. Unter stringenten Bedingungen zeigen Sonden, deren Nucleotidsequenzen eine größere Komplementarität zur Zielsequenz aufweisen, eine größere Hybridisierungsgrate als Sonden, die eine geringere Komplementarität aufweisen. Für die hier beschriebenen Oligonucleotidsonden wäre eine Hybridisierung mit den rRNA-Zielen bei 60ºC für 14 bis 16 Stunden (in einer Hybridisierungslösung, die 0,9 M NaCl, 0,12 M Tris- HCl, pH 7,8, 6 mM EDTA, 0,1 M KP0&sub4;, 0,1% SDS, 0,1% Pyrophosphat, 0,002% Ficoll, 0,02% BSA und 0.002% Polyvinylpyrrolidin), gefolgt von drei Waschsclrritten nach der Hybridisierung von 15 Minuten bei 60ºC (in 0,03 M NaCl 0,004 M Tris-HCl, pH 7,8, 0,2 mM EDTA und 0,1 % SDS), wobei nicht gebundene Sonden entfernt werden, ausreichend stringent, um die in Tabelle aufgeführten Spezifitätsraten zu erzielen.
Es stehen auch Techniken zur Verfügung, bei denen DNA oder RNA, die in rohen (ungereinigten) Zellysaten vorliegt, immobilisiert werden kann, ohne daß die fragliche Nucleinsäure zuerst gereinigt werden muß (z.B. Maniatis T., Fritsch E.F. und Sambrook J., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982)). Es wurde festgestellt, daß dieses letztere Verfahren den für das Screening der bestimmten Nucleotidsequenzen, die in den Nucleinsäuren jedes bestimmten Organismus vorliegen können. erforderlichen Arbeitsaufwand erheblich verringert und außerdem ermöglicht es vorteilhafterweise das Massen-Screening einer großen Anzahl von Organismen.
Die meisten in Tabelle 2 gezeigten Daten wurden durch Hybridisierung der angegebenen Sonden mit gereinigten RNA-Präparationen aus den angegebenen Staphylococcus- Bakterien und Bakterien, die nicht zur Gattung Staphylococcus gehören, erhalten. Zusätzlich wurden rohe Bakterienlysate von 72 klinischen und 11 tierärztlichen Isolaten von Staphylococcus aureus (wie in Tabelle 2 angegeben) ebenfalls getestet. Beide Verfahren ergaben im wesentlichen äquivalente Ergebnisse. In beiden Fällen wurden die Sonden unter Anwendung von Standardverfahren an den Enden mit radioaktivem Phosphor 32 markiert. Nach Hybridisieren und Waschen, wie vorstehend beschrieben, wurden die Hybridisierungsfilter einem Röntgenfilm ausgesetzt und die Intensität des Signals wurde in Hinsicht auf Kontrollflecke einer bekannten Menge des Zielmaterials (Zellen oder RNA) visuell "beurteilt".
Wie in Tabelle 2 angegeben, wurden 92 Stämme/Isolate von Staphylococcus aureus getestet. Eine kleine, aber repräsentative Auswahl von 9 Stämmen, die aus unterschiedlichen klinischen Quellen isoliert wurden, wurde von der Arnerican Type Culture Collection (ATCC) erhalten, Die restlichen Stämme (72) waren Zufallsisolate aus den Kultursammlungen und Patientenpopulationen größerer Krankenhäuser und den diagnostischen Laboratorien im Bereich von Massachusetts, einschließlich: Massachusetts State Laboratory, Framingham Union Hospital, Brigham and Women's Hospital und Tufts Veterinary Diagnostic Laboratory.
Alle S. aureus-Stämme hybridisieren stark mit den beiden Sonden 1336 und 1337 (ein ++++-Signal gibt ein Hybridisierungssignal an, das dem Signal des "Kontroll"- Staphylococcus aureus entspricht, für den eine ideale Paarung zwischen Sonde und Zielsequenzen durch Sequenzanalyse ausführlich bestimmt wurde). Deshalb kann vorausgesagt werden, daß das Inklusivitätsverhalten der Sonden sehr gut ist.
In Hinsicht auf Exklusivität (d.h. Hybridisierung mit Bakterien, die nicht zur Gattung Staphylococcus aureus gehören) verhalten sich die zwei Sonden unterschiedlich. Es wurden 87 Stämme getestet, die nicht zur Gattung Staphylococcus gehören und 15 Arten repräsentieren, und 41 Bakterien, die nicht zur Gattung Staphylococcus gehören und 34 Arten der 14 Gattungen repräsentieren (Tabelle 2). Die Sonde 1337 scheint eine perfekte Exklusivität aufzuweisen. Das bedeutet, daß nur eine gerade noch nachweisbare Hybridisierung mit nur wenigen Bakterien, die nicht zur Gattung Staphylococcus aureus gehören, beobachtet wird (ein +-Signal gibt ein Hybridisierungssignal an, das sogar nach einer verlängerten Exposition des Autoradiogramms über Nacht gerade noch nachweisbar ist). Deshalb ist die Sonde 1337 sowohl sehr inklusiv als auch sehr spezifisch für Staphylococcus aureus-Bakterien. In Einzeltestanordnungen wäre die Sonde 1337 die bevorzugte Sonde.
Die Sonde 1336 besitzt eine etwas breitere Inklusivität als Sonde 1337. Zusätzlich zur Hybridisierung mit allen getesteten Staphylococcus aureus-Stämmen, hybridisiert sie mit Stämmen einer Anzahl von anderen Staphylococcus-Arten. Insbesondere hybridisiert die Sonde 1336 stark mit Staphylococcus capitis und Staphylococcus xylosus, mit den meisten Stämmen von Staphylococcus epidermidis und Staphylococcus saprophyticus sowie mit einigen Stämmen von Staphylococcus hominis. Sie hybridisiert auch schwach (++-Signal, definiert als sehr schwach verglichen mit den Kontrollmengen, aber auch nach vierstündigen Expositionen des Autoradiogramms deutlich) mit einigen Stämmen von Staphylococcus haemolyticus und Staphylococcus warneri. Diese vertreten die Staphylococcus-Arten, die besonders eng mit Staphylococcus aureus verwandt sind was durch DNA/DNA-Hybridisierung nachgewiesen wurde (Kloos W.E. und Schleifer K.H. in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Bd. 2. 1986, 1013-1035). Jedoch hybridisiert die Sonde 1336 nicht mit allen Staphylococcus-Arten (S. auricularis, S. caseolyticus, S. cohnii, S. intermedius. S. lentus, S. sciuri und S. simulans werden nicht nachgewiesen), noch hybridisiert sie mit irgendwelchen der in Tabelle 2 aufgeführten Bakterien, die nicht zur Gattung Staphylococcus gehören. Deshalb weist die Sonde 1336 für sich allein die nützliche Eigenschaft auf, eine "higher-level"- Staphylococcus-Sonde zu sein von noch unbestimmter Bedeutung. Ihr Hybridisierungsverhalten zeigt deutlich die Art der Nucleotidsequenz in den (Ziel) Bereichen der 23 S-rRNA dieser Staphylococcus-Stämme und gibt deshalb auch ihre taxonomische (systematische) Gruppierung auf dem Niveau der Untergattung an. Dieses taxonomische Muster wurde vorher nicht beobachtet.
Wie vorstehend diskutiert, besitzt die Sonde 1336 auch einen bedeutenden Wert als Begleitsonde für Sonde 1337 bei der Anwendung einer beliebigen Vielzahl von Doppelsonden in Sandwich-ähnlichen Hybridisierungstestanordnungen (z.B. die homopolymere Einfang-Doppelsonde in einer Flüssig-Hybridisierungsanordnung), die im US-Patent Nr. 5147778, in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 89302637.7 oder in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 89308413.7 beschrieben wurden. In einer solchen Anwendung wurde die Sonde 1337 oder ein Derivat an ihrem 3'-Ende so modifiziert, daß sie einen Bereich von Desoxyadenosin(da)-Resten mit einer Länge von ca. 20 bis 200 Resten enthält. Dieser würde zum "Einfangen" der Ziel-rRNA (nach einer Flüssig-Hybridisierung) aus der Testprobe an einen festen Träger (z.B. Kügelchen, Plastikoberfläche, Filter, etc.) verwendet werden, der für diesen Zweck mit Polydesoxythymidin (dt) geeignet derivatisiert worden war. Die Sonde 1336 würde als Nachweissonde verwendet werden und durch einige nachweisbare Liganden (z.B. ³²P, Fluorescein, Biotin, etc.) derivatisiert werden. Die in Tabelle 1 angegebenen modifizierten Cytosinreste sind als einfaches Mittel zur Verknüpfung mit einem solchen Liganden nützlich. Der Nachweis, daß die Zielnucleinsäure in einer Testprobe vorliegt, wird dann durch das Einfangen des Nachweisligands auf der Trägeroberfläche durch eine Reihe von Hybridisierungswechselwirkungen angezeigt. Fester Träger ZEILNUCLEINSÄURE (Einfangsonde) (Nachweissonde) Ligand
Dies erfolgt nur, wenn die Zielnucleinsäure in der Testprobe vorliegt.
Die physikalischen Eigenschaften, welche die Sonden 1336 und 1337 als Sondensatz nützlich machen, sind: 1) Ihre kombinierten Hybridisierungseigenschaften und 2) ihre physikalische Verwandtschaft zueinander. Diese letztere Eigenschaft verringert die Wahrscheinlichkeit auf ein Minimum, daß die in einigen Testproben vorliegende Ribonuclease das Testergebnis negativ beeinflußt indem sie das zwischen den Zielstellen der Einfang- und Nachweissonde gebundene Ziel-rRNA-Molekül abtrennt, also eine unnatürliche (und falsche) Trennung der Bindung, die das vorstehend beschriebene molekulare Sandwich zusammenhält.
Die nützlich kombinierten Hybridisierungseigenschaften umfassen die folgenden Beobachtungen:
1) Die Sonde 1336 hybridisiert mit allen getesteten Staphylococcus aureus-Bakterien und würde als Nachweissonde alle S. aureus-Zielnucleinsäuren nachweisen, die durch ihre Begleitsonde, Sonde 1337, "eingefangen" wurden (d.h. die Sondenpaare würden für S. aureus eine völlige Inklusivität aufweisen).
2) Obwohl die Sonde 1336 mit einer bedeutenden Anzahl von Bakterien hybridisiert, die nicht zur Gattung Staphylococcus aureus gehören, würden diese nicht durch die Sondenpaare nachgewiesen, da die Sonde 1337 solche Ziele nicht einfangen würde. In diesem Sinne könnte eine Nachweissonde im Prinzip mit allen Bakterien hybridisieren solange sie mit allen Bakterien der Gattung Staphylococcus aureus hybridisiert; sie wäre einfach ein "Gattungs"-Markierungsreagenz. Die Tatsache, daß die Sonde 1336 nur mit wenigen anderen Staphylococcus-Arten als S. aureus hybridisiert und überhaupt nicht mit Bakterien, die nicht zur Gattung Staphylococcus gehören, verleiht den Sondenpaaren überhaupt einen weiteren praktischen Nutzen da beide Sonden des Paares bis auf die wenigen Arten, die nicht zur Gattung Staphylococcus aureus gehören, mit denen die Sonde 1336 hybridisiert, völlig spezifisch für Staphylococcus aureus sind. Deshalb sind zwei spezifische Hybridisierungsereignisse statt einem erforderlich, um ein positives Testsignal nachzuweisen.
Andere bevorzugte erfindungsgemäße Sonden umfassen die Sonden 1336 und 1337, die modifiziert wurden, indem ihre Enden mit einer Schutzgruppe versehen wurden ("end capping"), wobei ihre Resistenz gegen Abbau verbessert wird.
Die Herstellung der blockierten Sonden kann durch die Modifizierung der veröffentlichten Verfahren erreicht werden die für die Synthese von Oligonucleotiden angewendet werden (Beaucage S.L. und Caruthers M.H., Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1862; Agrawal S., Christodoulous C. und Gait M., Nucleic Acids Research 14 (1986), 6227-6245; Coull J.M., Weith H.L. und Bischoff R., Tetrahedron Letters 27 (1986), 3991-3994). Diese Modifikationen umfassen idealerweise eine beliebige Vielzahl der Nicht-Nucleosidphosphoramidite, die vorteilhafterweise mit den 3'- und/oder 5'-Hydroxylgruppen der synthetischen DNA-Ketten verknüpft werden können. Da diese Reagenzien eine oder beide der terminalen Hydroxylgruppen wirksam blockieren ist das resultierende synthetische Oligonucleotid gegen eine Exonuclease-Spaltung resistent.
Beispiele der Reagenzien, die bei dieser Anwendung verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht darauf begrenzt, 5'-Amino-modifizierende Stoffe, die von Glen Research Corporation (Herndon, Virginia) und Clontech (Palo Alto, Kalifornien) erhältlich sind. Die Blockierung der Oligonucleotide erfolgt durch Hinzufügen der Nicht-Nucleosidphosphoramidite an das entsprechende Ende oder Enden des synthetischen Oligonucleotids. Im allgemeinen wird der Amino-modifizierende Stoff in wasserfreiem Acetonitril oder Dichlormethan bis zu einer Endkonzentration von 0,1 M gelöst. Die erhaltene Lösung wird dann in eine geeignete Öffnung eines automatischen DNA-Synthetisierers gefüllt. Alle notwendigen Syntheseschritte, wie Kuppeln, Oxidieren und Ablösen der Blockierungsreagenzien, werden dann ausgeführt, wie in den Gerätebedienungshandbüchern beschrieben, so wie in jenen, die durch Applied Biosystems (Foster City, Kalifornien) oder Biosearch (San Rafel, Kalifornien) geliefert werden. Tabelle 1: Abgleichung der Sonden- und Zielsequenzen Position Escherichia coli Sonde Staphylococcus aureus Kernvariation epidermidis Bacillus subtilis stearothermophilus Listeria monocytogenes Heliobacillus chlorum Micrococcus luteus * Staphylococcus aureus 1 = ATCC 27660 (direkte rRNA-Sequenz) ; 2, 3, 4 = ATCC12600 (rRNA - Gensequenzen von 3 unterschiedlichen Cistrons ); 5 = ATCC12600 (direkte rRNA-Sequenz). A = Adenosin, C = Cytosin, G = Guanidin, T = Thymidin, U = Uracil, W = A oder U, K = G oder U, - = an dieser Position liegt kein Nucleotid vor. Tabelle 2: Dot-Blot-Hybridisierung Stamm Gattungsart Sonde Isolate (93 insgesamt, bgl. Text) Klinische Andere Staphylococcus aureus auricularis capitis caseolyticus cohnii epidermidis Tabelle 2: Dot-Blot-Hybridisierung (Fortsetzung) Stamm Gattungsart Sonde Staphylococcus epidermidis haemolyticus hominis intermedius lentus saprophyticus sciuri simulans Tabelle 2: Dot-Blot-Hybridisierung (Fortsetzung) Stamm Gattungsart Sonde Staphylococcus simulans warneri xylosus Bacillus brevis cereus coagulans subtilis citrobacter freundii diversus Enterobacter agglomerans cloacae Klebsiella oxytoca Kurthia zopfii Lactobacillus acidophilus Listeria monocytogenes Micrococcus conglomeratus luteus roseus sp. Planococcus citreus halophilus Salmonella typhirurium typhi arizonae Shigella sonnei dysenteriae boydii C13 Sporosarcina ureae Streptococcus agalactiae bovis faecalis faecium mutans pneumoniae salivarius sanguis

SEQUENZPROTOKOLL

SEQ.-ID-NR.:1
SEQUENZLÄNGE: 35 Basen
SEQUENZART: Nucleotid
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: Linear
MOLEKÜLART: DNA-Sonde für Staphylococcus
HYPOTHETISCH: Nein
MERKMALE: Die Basen 1 und 34 sind modifizierte Cytosinreste, die abhängig von der verwendeten Testanordnung mit einer Markergruppe verknüpft sein können oder nicht.
SEQUENZ:
NGATTATTAC CTTCTTTGAT TCATCTTTCC AGANT 35
SEQ.-ID-NR.: 2
SEQUENZLÄNGE: 28 Basen
SEQUENZART: Nucleotid
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: Linear
MOLEKÜLART: DNA-Sonde für Staphylococcus aureus
HYPOTHETISCH: Nein
SEQUENZ:
ATTCGTCTAA TGTCGTCCTT TGTAACTC 28

Claims

1. Nucleinsäurefragment, das bevorzugt mit rRNA oder rDNA von Staphylococcus aureus, verglichen mit rRNA oder rDNA von Bakterien, die nicht zur Gattung Staphylococcus gehören, hybridisiert, wobei das Fragment komplementär zu oder homolog mit mindestens 90 % einer Sequenz ist, die beliebige 0 bis 62 aufeinanderfolgende Nucleotide innerhalb des Bereiches 274 bis 335 der 235-ribosomalen RNA von Staphylococcus aureus mit der folgenden Sequenz umfaßt:

GAGUUACAAAGGACGACAUUAGACGAAUCAUCUGGAAAGAUGAAUCAAAGAAGGUAAUWAUCC

in der:

A Adenosin bedeutet,

C Cytosin bedeutet,

T Thymidin bedeutet,

G Guanidin bedeutet,

U Uracil bedeutet, und

W A oder U ist.

2. Nucleinsäurefragment nach Anspruch 1, wobei das Fragment bevorzugt mit rRNA oder rDNA von Staphylococcus aureus hybridisierz, verglichen mit rRNA oder rDNA von Staphylococcus auricularis, Staphylococcus capitis, Staphylococcus caseolyticus, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus epicermis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus lenus, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus simulans, Staphylococcus warneri, Staphylococcus xylosus, Bacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus coagulans, Bacillus subtilis, Citrobacter freundii, Citrobacter diversus, Enterobacter agglomerans, Enterobacter cloacae, Klebsiella oxytoca, Kurthia zopfii, Lactobacillus acidophilus, Listeria monocytogenes, Micrococcus conglomeratus, Micrococcus luteus, Micrococcus roseus, Planococcus citreus, Planococcus halophilus, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Salmonella arizonae, Shigella sonnei, Shigella dysenteriae, Shigella boydii C13, Sporosarcina ureae, Streptococcus agalactiae, Streptococcus bovis, Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium, Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguis.

3. Nucleinsäurefragment nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Fragment komplementär zu oder homolog mit mindestens 90 % einer Sequenz ist, die beliebige zehn aufeinanderfolgende Nucleotide innerhalb des Bereiches 274-301 der 23S-rRNA-Sequenz von Staphylococcus aureus mit der folgenden Sequenz umfaßt:

GAGUUACAAAGGACGACAUUAGACGAAU.

4. Nucleinsäurefragment nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend die folgende Nucleotidsequenz von Sonde 1337 oder die komplementäre Sequenz dazu:

5'-ATTCGTCTAATGTCGTCCTTTGTAACTC-3'.

5. Nucleinsäurefragment nach Anspruch 1, das bevorzugt mit rRNA oder rDNA von Staphylococcus aureus, Staphylococcus capitis, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hominis, Staphylococcus saprophyticus, und Staphylococcus xylosus hybridisiert und nicht mit rRNA oder rDNA von Staphylococcus auricularis, Staphylococcus caseolyticus, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus lentus, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus simulans, Bacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus coagulans, Bacillus subtilis, Citrobacter freundii, Citrobacter diversus, Enterobacter agglomerans, Enterobacter cloacae, Klebsiella oxytoca, Kurthia zopfii, Lactobacillus acidophilus, Listeria monocytogenes, Micrococcus conglomeratus, Micrococcus luteus, Micrococcus roseus, Planococcus citreus, Planococcus halophilus, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Salmonella arizonae, Shigella sonnei, Shigella dysenteriae, Shigella boydii C13, Sporosaricina ureae, Streptococcus agalactiae, Streptococcus bovis, Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium, Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguis.

6. Nucleinsäurefragment nach Anspruch 2 oder 5, wobei das Fragment komplementär zu oder homolog mit mindestens 90 % einer Sequenz ist, die beliebige zehn aufeinanderfolgende Nucleotide innerhalb des Bereiches 301 bis 335 der 23S-rRNA-Sequenz von Staphylococcus aureus mit der folgenden Sequenz umfaßt:

UCAUCUGGAAAGAUGAAUCAAAGAAGGUAAUWAUCC;

in der:

A Adenosin bedeutet,

C Cytosin bedeutet,

G Guanidin bedeutet,

T Thymidin bedeutet,

U Uracil bedeutet, und

W A oder U ist.

7. Nucleinsäurefragment nach einem der Ansprüche 1, 5 oder 6, umfassend die folgende Nucleotidsequenz von Sonde 1336:

5'-cGATTATTACCTTCTTTGATTCATCTTTCCAGAcT-3'

in der c an den Positionen 1 und 34 ein modifizierter Cytosinrest ist, der mit einem nachweisbaren Liganden verknüpft werden kann, oder die komplementäre Sequenz dazu.

8. Sondensatz, umfassend mindestens zwei Nucleinsäurefragmente, von denen eines ein Nucleinsäurefragment nach einem der Ansprüche 1 bis 4 umfaßt, und das andere ein Fragment nach einem der Ansprüche 1, 5, 6 oder 7 umfaßt.

9. Verfahren zum Nachweis der Gegenwart von Staphylococcus aureus in einer Probe, umfassend:

a) Inkontaktbringen der Probe mit Nucleinsäurefragmenten nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder einem Sondensatz nach Anspruch 8 unter Bedingungen, die den Fragmenten oder Sonden die Hybridisierung mit rRNA oder rDNA von Staphylococcus aureus erlaubt, falls diese in der Probe vorliegen, wobei Hybridnucleinsäurekomplexe gebildet werden; und

b) Nachweis der Mybridnucleinsäurekomplexe als Hinweis auf die Gegenwart von Staphylococcus in der Probe.