DE60038015T2

DE60038015T2 - Verfahren, basierend auf einer polynukleotidmatrix, zur identifizierung von mikroorganismen

Info

Publication number: DE60038015T2
Application number: DE60038015T
Authority: DE
Inventors: James J. Coronado Hogan
Original assignee: Gen Probe Inc
Current assignee: Gen Probe Inc
Priority date: 1999-05-03
Filing date: 2000-05-03
Publication date: 2009-02-12
Anticipated expiration: 2020-05-04
Also published as: AU778230B2; EP1177318A2; WO2000066789A3; DE60038015D1; JP2002542808A; WO2000066789A2; AU2005200846B2; DE60042623D1; ATE386139T1; CA2370255C; AU4705600A; EP1177318B1; AU2005200846A1; ATE437242T1; CA2370255A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren, Zusammensetzungen und Vorrichtungen zum Identifizieren von Mikroorganismen. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung einer Matrix von Polynukleotidsonden, die Spezifität für ribosomale Nukleinsäuren (rRNA und rDNA) besitzen, die basierend auf der molekularen Phylogenese Arten oder Gruppen von Organismen voneinander unterscheiden.
Hintergrund der Erfindung
Die Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung von infektiösen Organismen sind einige der kritischsten Aufgaben, die in einem klinischen Labor durchgeführt werden. Während die Labordiagnosen von infektiösen Krankheiten früher von erfahrenen Technikern durch visuelle Inspektion von gefärbtem klinischen Material durchgeführt wurden, sind unter Verwendung von modernen Techniken schnellere und objektivere Ergebnisse erhältlich. Immunassays, einschließlich Radioimmunassays, enzym-verbundene Immunassays und Latexagglutination und Immunblotassays haben sich zu leistungsfähigen diagnostischen Werkzeugen entwickelt, deren Nützlichkeit durch die Verfügbarkeit von monoklonalen Antikörpern verstärkt wird. Kürzliche Fortschritte bei der Signal- und Zielamplifikation haben die Ära der auf der Verwendung von Polynukleotidsonden basierenden molekularen Diagnostik eingeläutet.
In der Tat benutzen klinische Mikrobiologen nun eine umfangreiche Anzahl von Techniken für die Identifizierung von infektiösen Organismen (siehe Manual of Clinical Microbiology, Murray et al., Herausgeber, sechste Auflage, ASM Press (1995)). Automatisierte träger-verwendende Systeme verlassen sich typischerweise auf enzymatische Reaktionen, die chromogene oder fluorogene Verbindungen freisetzen, Tetrazol-basierende Indikatoren der metabolischen Aktivität in Anwesenheit von verschiedenen Kohlenstoffquellen oder den Nachweis von sauren Stoffwechselprodukten. Die Muster an positiven und negativen Reaktionen mit diesen Substraten liefern ein biochemisches Profil, das verwendet werden kann, um Mikroorganismen, die aus klinischen Proben isoliert wurden, zu identifizieren. Das chromatographische Profil von den mehr als 300 Fettsäuren, die an der Bildung von Lipiden in Bakterien und Hefen beteiligt sind, wurde ebenfalls verwendet, um Mikroorganismen zu phänotypisieren. Trotz der Verfügbarkeit dieser sehr leistungsfähigen Techniken, gewinnen Assays, die auf Polynukleotiden basieren, in der klinischen Laborpraxis schnell an Popularität.
Die Spezifität von Polynukleotid-Hybridisierungsreaktionen zusammen mit der außergewöhnlichen Sensitivität, die durch Nukleinsäure-Amplifizierungstechniken ermöglicht wird, hat die molekulare Diagnostik für den Nachweis und für die Identifizierung von Mikroben, die nur in sehr kleinen Mengen verfügbar sind, zum Verfahren der Wahl gemacht. Üblicherweise verwendete DNA-Sonden-Hybridisierungsformate schließen ein: Festphasen-Hybridisierung, Flüssigphasen-Hybridisierung und in situ Hybridisierung. In Festphasen-Hybridisierungsverfahren, wird eine Probe, die mikrobielle Polynukleotide enthält, auf einem festen Träger immobilisiert, denaturiert und dann mit einer Polynukleotidsonde in Kontakt gebracht, die einen nachweisbaren Marker trägt. Nicht hybridisierte Sonde wird aus dem System entfernt und die spezifisch hybridisierte Sonde nachgewiesen, zum Beispiel durch Autoradiographie oder direkte visuelle Auswertung. In Flüssigphasen-Hybridisierungsverfahren sind das Zielpolynukleotid und die markierte Sonde frei, um in einem wässerigen Hybridisierungspuffer miteinander wechselzuwirken. Die spezifisch hybridisierte Sonde wird dann als ein Indikator des Vorhandenseins des Zielpolynukleotids in der Mischung nachgewiesen. In situ Hybridisierung, die Formalin-fixierte Gewebsschnitte verwendet, wird zum Erhalt von Informationen über die physikalische Verteilung und Häufigkeit von Mikroorganismen verwendet. Üblicherweise werden molekulare Diagnostikassays durchgeführt, um zu bestimmen, ob eine bestimmte Art oder Gruppe von Organismen in einer biologischen Probe, die dem Test unterzogen wird, vorhanden sind.
Bakterämie und Fungämie sind Erkrankungen, die sich durch das Vorhandensein von bakteriellen Organismen und Pilzorganismen im Blutkreislauf auszeichnen. Sepsis bezieht sich auf eine schwere bakterielle Infektion, die sich über das Blut im ganzen Körper ausbreitet. Bei einer Blutvergiftung zeigt das Vorhandensein von Mikroorganismen im Blut an, dass es das Immunsystem des Wirts versäumt hat, eine Infektion zu lokalisieren. Organismen, die für diese Erkrankungen verantwortlich sind, werden typischerweise nach dem Beimpfen einer „Blutkulturflasche" mit einer Patientenblutprobe und dann dem Typisieren aller Mikroorganismen, die sich vermehrt haben, identifiziert. Die Mortalität bei Infektionen des Blutkreislaufs bewegt sich im Bereich von geschätzten 20% bis 50% (siehe Clinics in Laboratory Medicine 14: 9 (1994)). In den Vereinigten Staaten sind jährlich geschätzte 50.000 Todesfälle auf Sepsis zurückzuführen (Vanderbilt Univ. Med. Center Reporter 1991 1. März; 2(8): 1,3). Somit wurde der Diagnose und der Behandlung dieses Syndroms beträchtliche Aufmerksamkeit gewidmet.
Unglücklicherweise haben die Blutkulturverfahren, die den „Goldenen Standard" für die Diagnose von Blutvergiftung darstellen, signifikante Beschränkungen (Weinstein, Clin Infect Dis 23: 40 (1996)). In der Tat ist kein einzelnes Medium für die Vermehrung aller potentiellen Organismen im Blut ideal, einige relevante Mikroorganismen wachsen in üblichen Medien und Systemen nur sehr schwach und positive Ergebnisse erfordern Stunden bis Tage der Inkubation. Jedes dieser Gebiete verlangt nach Verbesserungen, wenn die Diagnose einer Blutvergiftung schneller und genauer werden soll.
Molekulare Diagnostikverfahren, die Sammlungen von artspezifischen DNA-Sonden verwenden, wurden verwendet, um Mikroorganismen in Blutkulturen zu identifizieren. Gemäß einem Verfahren wurden Mikroorganismen, die in wachstumspositiven Kulturflaschen vorhanden waren, zuerst isoliert und dann gramgefärbt und auf ihre Morphologie hin analysiert (Davis et al., J. Clin Microbiol. 29: 2193 (1991)). Das Auftreten der gefärbten Organismen bestimmte, welche von mehreren verschiedenen Polynukleotidsonden in einem folgenden Testschritt verwendet wurden. Fälle, in denen positive Hybridisierungsergebnisse erhalten wurden, ergaben vorläufige Identifikationen. Die Identifikation von Bakterien, die negative Hybridisierungsergebnisse ergaben, waren auf Beobachtungen beschränkt, die nach Gram-färbung und mikroskopischer Analyse gemacht wurden. Diese Untersuchungen bestätigten, dass DNA-Sonden für die schnelle Identifizierung von Bakterien, die direkt aus Blutkulturflaschen entnommen wurden, verwendet werden können, erforderten aber immer noch die Bewertung von gram-gefärbten Mikroorganismen durch einen erfahrenen Mikrobiologen. Bedeutsamerweise konnten polymikrobielle Baketerämien in dem Verfahren aufgrund des Fehlens von verfügbaren Sonden nicht analysiert werden.
In einer Studie mit mehreren hundert positiven Blutkulturen, die von Patienten mit einer Blutvergiftung erhalten wurden, schlussfolgerten Weinstein et al. in Clin Infect Dis 24: 584 (1997), dass die fünf häufigsten Pathogene Staphylococcus aureus, Escherichia coli, koagulase-negative Staphylokokken, Klebsiella pneumoniae und Enterococcus-Arten sind. Hefen waren ebenfalls häufige Isolate aus Blutkulturflaschen und stellten eine tatsächliche Fungämie dar, wenn sie ungefähr 92% der Zeit nachgewiesen wurden. Candida albicans war unter den Top 10 Mikroorganismen, die eine Blutvergiftung verursachen. Interessanterweise waren ungefähr 91% der Fälle von Bakterämie und Fungämie unimikrobiell, während die verbleibenden Fälle mit zwei oder mehr Organismen assoziiert waren. Die niedrigste damit verbundene Mortalität unter den Patienten, die positive Blutkulturen besaßen, war mit koagulasenegativen Staphylokokken (5,5%) und die höchste mit Hefen und Pilzen (35,8%) verbunden. Am Wichtigsten war, dass gezeigt wurde, dass die mit einer Blutvergiftung verbundene Mortalität im Verhältnis zu der Dauer einer unangemessenen antimikrobiellen Therapie ansteigt. Dieses Ergebnis betont die Wichtigkeit einer frühen und richtigen klinischen Diagnose.
WO 98/28444 offenbart ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Identifizieren eines Bakteriums in einer Probe, wobei besagte Vorrichtung Sonden einer höheren, einer mittleren und einer niederen Ordnung besitzt.
Die unten im Detail beschriebene Erfindung liefert ein schnelles Mittel zum Identifizieren von Mikroorganismen unter Verwendung von Techniken, die für die automatisierte Analyse geeignet sind. Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen und Verfahren können sogar verwendet werden, um die Identität von Mikroorganismen, die in einer gemischten Population von Mikroorganismen enthalten sind, zu bestimmen.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung zum Hybridisieren von Nukleinsäuren. Die erfindungsgemäße Vorrichtung schließt einen festen Träger und eine Vielzahl von Adressen, die auf dem festen Träger aufgebracht sind, ein. Jede der Adressen schließt mindestens eine Sonde, die ribosomale Nukleinsäuren von mindestens einer Mikrobenart unter Hybridisierungsbedingungen hoher Stringenz hybridisiert, ein. Die Vielzahl von Adressen schließt eine Adresse höherer Ordnung, eine Adresse mittlerer Ordnung und eine Adresse niederer Ordnung ein. Die Adresse niederer Ordnung hybridisiert ribosomale Nukleinsäuren einer Untergruppe von Organismen, die ribosomale Nukleinsäuren besitzen, die an die Adresse mittlerer Ordnung hybridisieren. Die Adresse mittlerer Ordnung hybridisiert ribosomale Nukleinsäuren von einer Untergruppe von Organismen, die ribosomale Nukleinsäuren besitzen, die an die Adresse höherer Ordnung hybridisieren. Die Adresse niederer Ordnung umfasst ferner mindestens eine Sonde, die unter Hybridisierungsbedingungen hoher Stringenz an ribosomale Nukleinsäuren einer mikrobiellen Art, die keine ribosomalen Nukleinsäuren besitzt, die an eine oder beide einer Adresse höherer Ordnung und einer Adresse mittlerer Ordnung hybridisieren. In bestimmten Ausführungsformen ist der feste Träger der Vorrichtung entweder eine Multiwellplatte oder eine Vielzahl von einzelnen Röhrchen, die in einer Konfiguration mit Abstand zueinander gehalten werden. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist die Adresse höherer Ordnung eine pan-bakterielle Adresse, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren einer Vielzahl von Arten von Gram⁽⁺⁾ Bakterien, eine Vielzahl von Arten von Bakterien der Familie Enterobacteriaceae, einer Vielzahl von Arten von Bakterien der Gattung Enterococcus, eine Vielzahl von Arten von Bakterien der Gattung Staphylococcus und eine Vielzahl von Arten von Bakterien der Gattung Campylobacter hybridisiert. In alternativen Ausführungsformen ist die Adresse höherer Ordnung eine pan-Pilz Adresse, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren von einer Vielzahl von Pilzarten hybridisiert. Bestimmte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung schließen sowohl eine pan-bakterielle Adresse als die Adresse höherer Ordnung als auch eine pan-Pilz Adresse ein. Die Adresse höherer Ordnung kann ebenfalls eine Gram⁽⁺⁾ Adresse sein, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren von einer Vielzahl von Gram⁽⁺⁾ Bakterienarten hybridisiert. Wenn die Adresse höherer Ordnung eine pan-bakterielle Adresse ist, und unabhängig davon, ob eine Adresse zum Nachweis von pan-Pilz Organismen eingeschlossen ist oder nicht, kann die Adresse mittlerer Ordnung eine Gram⁽⁺⁾ Adresse, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren einer Vielzahl von Gram⁽⁺⁾ Bakterien hybridisiert, eine Adresse für die Familie Enterobacteriaceae, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren einer Vielzahl von Bakterien in der Familie Enterobacteriaceae, eine Adresse für die Gattung Staphylococcus, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren von einer Vielzahl von Arten in der Gattung Staphylococcus hybridisiert, eine Adresse für die Gattung Enterococcus, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren von einer Vielzahl von Arten in der Gattung Enterococcus hybridisiert, oder eine Campylobacter Adresse, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren von einer Vielzahl von Campylobacter-Arten hybridisiert, sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Adresse mittlerer Ordnung die Gram⁽⁺⁾ Adresse und die Adresse niederer Ordnung ist eine Actinomyceten Adresse, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren einer Vielzahl von Bakterien, die zu der Hoch (G + C) Untergruppe von Gram⁽⁺⁾ Bakterien gehören, hybridisiert. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Adresse mittlerer Ordnung eine Gram⁽⁺⁾ Adresse und die Adresse niederer Ordnung ist eine Adresse, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren von einer Vielzahl von Mycobacterium Arten hybridisiert. Z. B. kann die Vielzahl von Mycobacterium-Arten Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium bovis BCG und Mycobacterium africanum einschließen. In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform, in der die Adresse höherer Ordnung eine pan-bakterielle Adresse ist, und unabhängig davon, ob eine Adresse zum Nachweis von pan-Pilz Organismen vorhanden ist oder nicht, ist die Adresse mittlerer Ordnung die Gram⁽⁺⁾ Adresse und die Adresse niederer Ordnung ist eine Adresse, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren von Streptococcus pneumoniae hybridisiert. In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform, in der die Adresse höherer Ordnung eine pan-bakterielle Adresse ist, und unabhängig davon, ob eine Adresse zum Nachweis von pan-Pilz Organismen eingeschlossen ist oder nicht, ist die Adresse mittlerer Ordnung die Gram⁽⁺⁾ Adresse und die Adresse niederer Ordnung ist eine Adresse, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren von Listeria monocytogenes hybridisiert. In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, in der die Adresse höherer Ordnung eine pan-bakterielle Adresse ist, und unabhängig davon, ob eine Adresse zum Nachweis von pan-Pilz Organismen eingeschlossen ist oder nicht, ist die Adresse mittlerer Ordnung die Gram⁽⁺⁾ Adresse und die Adresse niederer Ordnung ist eine Adresse, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren von Staphylococcus aureus hybridisiert. Eine andere Vorrichtung gemäß der Erfindung schließt eine panbakterielle Adresse als die Adresse höherer Ordnung ein und unabhängig davon, ob eine Adresse zum Nachweis von pan-Pilz Organismen eingeschlossen ist oder nicht, ist die Adresse mittlerer Ordnung eine Adresse für die Familie der Enterobacteriaceae und die Adresse niederer Ordnung ist eine E. coli Adresse, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren von E. coli hybridisiert. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform, in der die Adresse höherer Ordnung eine pan-bakterielle Adresse ist, und unabhängig davon, ob eine Adresse zum Nachweis von pan-Pilz Organismen eingeschlossen ist oder nicht, ist die Adressen niederer Ordnung eine Staphylococcus aureus Adresse, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren von Staphylococcus aureus hybridisiert. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform, in der die Adresse höherer Ordnung eine pan-bakterielle Adresse ist, und unabhängig davon, ob eine Adresse zum Nachweis von pan-Pilz Organismen eingeschlossen ist oder nicht, ist die Adresse mittlerer Ordnung eine Adresse für die Gattung Enterococcus. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform, in der die Adresse höherer Ordnung eine pan-bakterielle Adresse ist, und unabhängig davon, ob eine Adresse zum Nachweis von pan-Pilz Organismen eingeschlossen ist oder nicht, ist die Adresse mittlerer Ordnung eine Campylobacter Adresse. In anderen bevorzugten Vorrichtungen ist die Adresse höherer Ordnung die Gram⁽⁺⁾ Adresse und die Adresse niederer Ordnung ist eine Adresse, die ribosomale Nukleinsäuren von Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium bovis BCG und Mycobacterium africanum nachweist. In noch anderen Vorrichtungen ist die Adresse höherer Ordnung eine pan-Pilz Adresse, die Adresse mittlerer Ordnung hybridisiert spezifisch ribosomale Nukleinsäuren von einer Vielzahl von Candida Arten, einschließlich Candida albicans, Candida tropicalis, Candida dubliniensis, Candida viswanathii und Candida parapsilosis, und die Adresse niederer Ordnung hybridisiert spezifisch ribosomale Nukleinsäuren von Candida albicans und Candida dubliniensis, aber nicht von Candida tropicalis, Candida viswanathii oder Candida parapsilosis. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform, in der die Adresse höherer Ordnung eine pan-bakterielle Adresse ist, ist eine pan-Pilz Adresse eingeschlossen, die ribosomale Nukleinsäuren von einer Vielzahl von Pilzarten hybridisiert. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform schließt die Vorrichtung eine pan-Pilz Adresse, eine panbakterielle Adresse, eine Gram⁽⁺⁾ Adresse und eine Actinomyceten Adresse ein. Eine noch bevorzugtere Vorrichtung schließt eine pan-Pilz Adresse, eine panbakterielle Adresse, eine Gram⁽⁺ ⁾ Adresse, eine Actinomyceten Adresse und eine Adresse, die ribosomale Nukleinsäuren von Bakterien in der Familie Enterobacteriaceae hybridisiert, ein. Eine alternativ besonders bevorzugte Vorrichtung schließt eine pan-Pilz Adresse, eine pan-bakterielle Adresse, eine Gram⁽⁺⁾ Adresse, eine Actinomyceten Adresse und Adressen, die ribosomale Nukleinsäuren von Enterococcus Bakterien hybridisieren, ein. In Vorrichtungen, die eine pan-Pilz Adresse, eine panbakterielle Adresse, eine Gram⁽⁺⁾ Adresse, eine Actinomyceten Adresse und eine Adresse, die ribosomale Nukleinsäuren von Bakterien der Familie Enterobacteriaceae hybridisiert, besitzen, kann ferner eine Adresse eingeschlossen sein, die ribosomale Nukleinsäuren von Enterococcus Bakterien hybridisiert. Noch eine andere besonders bevorzugte Vorrichtung schließt eine pan-Pilz Adresse, eine pan-bakterielle Adresse, eine Gram⁽⁺ ⁾ Adresse, eine Actinomyceten Adresse und eine Einzeladresse, die ribosomale Nukleinsäuren von Enterococcus Bakterien und ribosomale Nukleinsäuren von Bakterien in der Familie Enterobacteriaceae hybridisiert, ein. Noch eine besonders bevorzugte Vorrichtung schließt eine pan-Pilz Adresse, eine pan-bakterielle Adresse, eine Gram⁽⁺⁾ Adresse, eine Actinomyceten Adresse und eine Adresse, die ribosomale Nukleinsäuren von Bakterien in der Gattung Staphylococcus hybridisiert, ein. Noch eine andere besonders bevorzugte Vorrichtung schließt eine pan-Pilz Adresse, eine pan-bakterielle Adresse, eine Gram⁽⁺⁾ Adresse, eine Actinomyceten Adresse und eine Adresse, die ribosomale Nukleinsäuren von einer Vielzahl von Bakterien in der Gattung Campylobacter hybridisiert, ein. Noch eine andere besonders bevorzugte Vorrichtung schließt eine pan-Pilz Adresse, eine pan-bakterielle Adresse, eine Gram⁽⁺⁾ Adresse, eine Actinomyceten Adresse, eine Adresse, die ribosomale Nukleinsäuren von Bakterien in der Gattung Staphylococcus hybridisiert, und eine Adresse, die ribosomale Nukleinsäuren von einer Vielzahl von Bakterien in der Gattung Campylobacter hybridisiert, ein. Noch eine andere besonders bevorzugte Vorrichtung schließt eine pan-Pilz Adresse, eine pan-bakterielle Adresse, eine Gram⁽⁺⁾ Adresse, eine Actinomyceten Adresse, eine Adresse, die ribosomale Nukleinsäuren von Bakterien in der Familie Enterobacteriaceae hybridisiert, eine Adresse, die ribosomale Nukleinsäuren von Enterococcus Bakterien hybridisiert, und ferner eine Adresse, die ribosomale Nukleinsäuren von Bakterien in der Gattung Staphylococcus hybridisiert und eine Adresse, die ribosomale Nukleinsäuren von einer Vielzahl von Bakterien in der Gattung Campylobacter hybridisiert, ein. Noch eine andere besonders bevorzugte Vorrichtung schließt eine pan-Pilz Adresse, eine pan-bakterielle Adresse, eine Gram⁽⁺⁾ Adresse, eine Actinomyceten Adresse und eine Einzeladresse, die ribosomale Nukleinsäuren von Enterococcus Bakterien und ribosomale Nukleinsäuren von Bakterien der Familie Enterobacteriaceae hybridisiert, sowie eine Einzeladresse, die ribosomale Nukleinsäuren von Bakterien in der Gattung Staphylococcus und ribosomale Nukleinsäuren von einer Vielzahl von Bakterien in der Gattung Campylobacter hybridisiert, ein. Noch eine andere besonders bevorzugte Vorrichtung schließt eine pan-Pilz Adresse, eine pan-bakterielle Adresse, eine Gram⁽⁺⁾ eine Actinomyceten Adresse, eine Adresse, die ribosomale Nukleinsäuren von Bakterien in der Familie Enterobacteriaceae hybridisiert, eine Adresse, die ribosomale Nukleinsäuren von Enterococcus Bakterien hybridisiert, und ferner eine Adresse, die ribosomale Nukleinsäuren von Bakterien der Gattung Staphylococcus hybridisiert, und eine Adresse, die ribosomale Nukleinsäuren von einer Vielzahl von Bakterien in der Gattung Campylobacter hybridisiert, und ferner mindestens eine Adresse, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren von einer einzelnen Mikroorganismenart hybridisiert, ein. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die einzelne Mikroorganismenart aus der Gruppe, die aus Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans und Staphylococcus aureus besteht, ausgewählt. Noch eine andere besonders bevorzugte Vorrichtung schließt eine pan-Pilz Adresse, eine panbakterielle Adresse, eine Gram⁽⁺⁾ Adresse, eine Actinomyceten Adresse und eine Einzeladresse, die ribosomale Nukleinsäuren von Enterococcus Bakterien und ribosomale Nukleinsäuren von Bakterien der Familie Enterobacteriaceae hybridisiert, sowie eine Einzeladresse, die ribosomale Nukleinsäuren von Bakterien in der Gattung Staphylococcus und ribosomale Nukleinsäuren von einer Vielzahl von Bakterien in der Gattung Campylobacter hybridisiert, sowie eine Vielzahl von Adressen, die einzeln ribosomale Nukleinsäuren von einer Vielzahl von Mikroorganismenarten hybridisieren, ein. Noch eine andere besonders bevorzugte Vorrichtung schließt eine pan-Pilz Adresse, eine pan-bakterielle Adresse, eine Gram⁽⁺⁾ Adresse und eine Actinomyceten Adresse ein, wobei die pan-bakterielle Adresse eine Polynukleotidsonde, die eine Sequenz besitzt, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 58 ausgewählt wird, einschließt. Noch eine andere besonders bevorzugte Vorrichtung schließt eine pan-Pilz Adresse, eine pan-bakterielle Adresse, eine Gram⁽⁺⁾ Adresse und eine Actinomyceten Adresse ein, wobei die pan-Pilz Adresse eine Polynukleotidsonde umfasst, die die Sequenz von SEQ ID NO: 4 besitzt. Noch eine andere besonders bevorzugte Vorrichtung schließt eine pan-Pilz Adresse, eine pan-bakterielle Adresse, eine Gram⁽⁺⁾ Adresse und eine Actinomyceten Adresse ein, wobei die Gram⁽⁺⁾ Adresse eine Polynukleotidsonde einschließt, die die Sequenz von SEQ ID NO: 7 besitzt. Noch eine andere besonders bevorzugte Vorrichtung schließt eine pan-Pilz Adresse, eine pan-bakterielle Adresse, eine Gram⁽⁺⁾ Adresse und eine Actinomyceten Adresse ein, wobei die Actinomyceten Adresse eine Polynukleotidsonde einschließt, die die Sequenz von SEQ ID NO: 10 besitzt. Noch eine andere besonders bevorzugte Vorrichtung schließt eine pan-Pilz Adresse, eine panbakterielle Adresse, eine Gram⁽⁺⁾ Adresse und eine Actinomyceten Adresse ein, wobei die pan-bakterielle Adresse eine Polynukleotidsonde einschließt, die die Sequenz besitzt, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 58 ausgewählt wird, wobei die pan-Pilz Adresse eine Polynukleotidsonde einschließt, die die Sequenz von SEQ ID NO: 4 besitzt, wobei die Gram⁽⁺⁾ Adresse eine Polynukleotidsonde einschließt, die die Sequenz von SEQ ID NO: 7 besitzt, und wobei die Actinomyceten Adresse eine Polynukleotidsonde einschließt, die die Sequenz von SEQ ID NO: 10 besitzt. In noch einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist jede der Sonde mit einem Acridiniumester markiert.
Ein anderer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Analysieren einer biologischen Probe, von der vermutet wird, dass sie Mikroorganismen enthält. Das Verfahren beginnt mit einem Schritt zum Erhalt der biologischen Probe. Danach gibt es einen Schritt zur Kultivierung der biologischen Probe für einen Zeitraum, der ausreichend ist, die Anzahl von allen Mikroorganismen, die in der Probe enthalten sind, zu erhöhen. Als Nächstes gibt es einen Schritt zum Freisetzen der Polynukleotide aus allen Mikroorganismen in der kultivierten biologischen Probe und dann das Hybridisieren der freigesetzten Polynukleotide mit einer Sondenmatrix. Gemäß einigen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens wurden die freigesetzten Polynukleotide nicht in einem in vitro Polynukleotid-Amplifizierungsverfahren amplifiziert. Andere Ausführungsformen sehen die Amplifizierung von Polynukleotiden, z. B. durch in vitro Amplifikation, vor dem Hybridisierungsschritt vor. Die Polynukleotid-Sondenmatrix schließt eine Vielzahl von Adressen ein, wobei jede Adresse mindestens eine Sonde einschließt, die ribosomale Nukleinsäuren von einer oder mehreren mikrobiellen Arten unter Bedingungen hoher Stringenz hybridisiert. Die Vielzahl von Adressen schließt ein: eine Adresse höherer Ordnung, eine Adresse mittlerer Ordnung und eine Adresse niederer Ordnung. Die Adresse niederer Ordnung hybridisiert ribosomale Nukleinsäuren von einer Untergruppe von Organismen, die ribosomale Nukleinsäuren besitzen, die an die Adresse mittlerer Ordnung hybridisieren. Die Adresse mittlerer Ordnung hybridisiert ribosomale Nukleinsäuren von einer Untergruppe von Organismen, die ribosomale Nukleinsäuren besitzen, die an die Adresse höherer Ordnung hybridisieren. Die Adresse niederer Ordnung umfasst ferner mindestens eine Sonde, die unter Hybridisierungsbedingungen hoher Stringenz an ribosomale Nukleinsäuren von mikrobiellen Arten hybridisiert, die keine ribosomalen Nukleinsäuren besitzen, die an eine oder beide der Adresse höherer Ordnung und der Adresse mittlerer Ordnung hybridisieren. Zusätzliche Schritte in dem erfindungsgemäßen Verfahren schließen den Nachweis von positiven und negativen Hybridisierungsergebnissen für jede von besagter Vielzahl von Adressen ein, um ein Hybridisierungsprofil zu erstellen; und dann den Vergleich des Hybridisierungsprofils mit einer Vergleichstabelle, die die Identitäten von Mikroorganismen mit Hybridisierungsergebnissen an jeder der Adressen korreliert. Diese Vorgehensweise liefert Information über die Identität von Mikroorganismen, die in der biologischen Probe enthalten sind. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Salzkonzentration in der Hybridisierungsreaktion im Bereich von 0,6–0,9 M, wenn die Hybridisierungstemperatur im Bereich von 55–65°C liegt. Unabhängig von der Auswahl der Bedingungen hoher Stringenz, die ausgewählt wurden, kann die Adresse höherer Ordnung in dem Hybridisierungsschritt eine pan-bakterielle Adresse, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren von einer Vielzahl von Arten von Gram(+)-Bakterien, eine Vielzahl von Arten von Bakterien in der Familie Enterobacteriaceae, eine Vielzahl von Arten von Bakterien in der Gattung Enterococcus, eine Vielzahl von Arten von Bakterien in der Gattung Staphylococcus und eine Vielzahl von Arten von Bakterien in der Gattung Campylobacter hybridisiert, und die Vielzahl von Adressen in dem Hybridisierungsschritt kann eine pan-Pilz Adresse einschließen, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren von einer Vielzahl von Pilzarten hybridisiert. Wenn dies der Fall ist, und in einer bevorzugten Ausführungsform, kann die Adresse mittlerer Ordnung in dem Hybridisierungsschritt eine Gram⁽⁺⁾ Adresse sein, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren von einer Vielzahl von Arten von Gram(+)-Bakterien hybridisiert und die Adresse niederer Ordnung in dem Hybridisierungsschritt kann eine Actinomyceten Adresse sein, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren von einer Vielzahl von Bakterien, die zu der Hoch (G + C) Untergruppe von Gram⁽⁺⁾ Bakterien gehören, hybridisiert. Gegebenenfalls kann die biologische Probe in dem Gewinnungsschritt eine Blutprobe sein, die von einem Individuum, das auf eine medizinische Erkrankung, die aus der Gruppe, die aus Bakterämie, Blutvergiftung und Fungämie besteht, ausgewählt wird, getestet wird, entnommen wird, und der Kultivierungsschritt kann ein Schritt zum Beimpfen einer Blutflasche mit einem Aliquot der Blutprobe und danach das Inkubieren der beimpften Blutflasche einschließen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform schließt der Nachweisschritt den Nachweis über Luminometrie ein.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Analysieren einer Probe, die ribosomale Nukleinsäuren enthält. Dieses Verfahren beginnt mit einem Schritt zum Hybridisieren der Probe mit einer Sondenmatrix unter Bedingungen hoher Stringenz, um zu einer hybridisierten Probe zu führen. Die Sondenmatrix besitzt eine Vielzahl von Adressen, einschließlich einer Adresse höherer Ordnung, einer Adresse mittlerer Ordnung und einer Adresse niederer Ordnung. Die Adresse niederer Ordnung hybridisiert ribosomale Nukleinsäuren von einer Untergruppe von Organismen, die ribosomale Nukleinsäuren besitzen, die an die Adresse mittlerer Ordnung hybridisieren. Die Adresse mittlerer Ordnung hybridisiert ribosomale Nukleinsäuren von einer Untergruppe von Organismen, die ribosomale Nukleinsäuren besitzen, die an die Adresse höherer Ordnung hybridisieren. Die Adresse niederer Ordnung umfasst ferner mindestens eine Sonde, die unter Hybridisierungsbedingungen hoher Stringenz an ribosomale Nukleinsäuren einer Mikrobenart hybridisieren, die keine ribosomalen Nukleinsäuren besitzt, die an eine oder beide einer Adresse höherer Ordnung und einer Adresse mittlerer Ordnung hybridisieren. Ein weiterer Schritt in dem erfindungsgemäßen Verfahren schließt das Analysieren der hybridisierten Sonde ein, um eine erste Auswahl von Adressen zu identifizieren, die mindestens eine Sonde besitzen, die zu ribosomalen Nukleinsäuren, die in der Probe vorhanden sind, komplementär ist, und um eine zweite Auswahl von Adressen zu identifizieren, die nicht mindestens eine Sonde besitzen, die zu ribosomalen Nukleinsäuren, die in besagter Probe vorhanden sind, komplementär ist. Danach gibt es einen Schritt um aus der ersten und zweiten Auswahl von Adressen, die in dem Analyseschritt identifiziert wurden, nachzuweisen, welche einer Sammlung von Mikroorganismen ribosomale Nukleinsäuren besitzen, die ein entsprechendes Profil von ribosomalen Nukleinsäuresequenzen besitzen, und dadurch die mikrobielle Herkunft der RNA-enthaltenden Probe zu bestimmen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Adresse höherer Ordnung in dem Hybridisierungsschritt eine pan-bakterielle Adresse, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren von einer Vielzahl von Arten von Gram⁽⁺⁾ Bakterien, eine Vielzahl von Arten von Bakterien in der Familie Enterobacteriaceae, einer Vielzahl von Arten von Bakterien in der Gattung Enterococcus, einer Vielzahl von Arten von Bakterien in der Gattung Staphylococcus und eine Vielzahl von Arten von Bakterien in der Gattung Campylobacter hybridisiert, und die Vielzahl von Adressen in dem Hybridisierungsschritt schließt ferner eine pan-Pilz Adresse ein, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren von einer Vielzahl von Pilzarten hybridisiert. Wenn das der Fall ist, kann die Adresse mittlerer Ordnung in dem Hybridisierungsschritt eine Gram⁽⁺⁾ Adresse sein, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren von einer Vielzahl von Arten von Gram⁽⁺⁾ Bakterien hybridisiert, und die Adresse niederer Ordnung in dem Hybridisierungsschritt kann eine Actinomycetes Adresse sein, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren von einer Vielzahl von Bakterien, die zu der Hoch (G + C) Untergruppe von Gram⁽⁺⁾ Bakterien gehören, hybridisiert. Der Analyseschritt in dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Analyse mittels Luminometrie einschließen. Gegebenenfalls wird der Hybridisierungsschritt zwischen 55°C und 65°C durchgeführt.
Ferner wird eine Vorrichtung offenbart, die zur Analyse der Ergebnisse von einem Sondenmatrix-Hybridisierungsverfahren verwendet wird. Diese analytische Vorrichtung schließt eine Speichervorrichtung ein, in der eine Vergleichstabelle gespeichert ist. Diese Vergleichstabelle korreliert die Identität einer Vielzahl von Mikroorganismen mit positiven und negativen Hybridisierungsergebnissen an einer Vielzahl von Adressen in einer Sondenmatrix. Die Vielzahl von Adressen schließt mindestens eine Adresse höherer Ordnung, eine Adresse mittlerer Ordnung und eine Adresse niederer Ordnung ein. Die Adresse niederer Ordnung hybridisiert ribosomale Nukleinsäuren von einer Untergruppe von Organismen, die ribosomale Nukleinsäuren besitzen, die an die Adresse mittlerer Ordnung hybridisieren. Die Adresse mittlerer Ordnung hybridisiert ribosomale Nukleinsäuren von einer Untergruppe von Organismen, die ribosomale Nukleinsäuren besitzen, die an die Adresse höherer Ordnung hybridisieren. Die Vorrichtung schließt ebenfalls einen Prozessor ein, der mit der Speichereinheit verbunden ist, wobei der Prozessor so konfiguriert ist, dass er einen Vergleich zwischen den Ergebnissen, die in den Prozessor eingegeben werden, und einer Vergleichstabelle durchführt. Diese Ergebnisse zeigen positive und negative Hybridisierung an einer Vielzahl von Adressen in der Sondenmatrix für Polynukleotide, die aus den Mikroorganismen freigesetzt wurden, an. Die Vorrichtung schließt ferner eine Anwenderschnittstelle, die mit dem Prozessor verbunden ist, zum Starten des Vergleichs und eine Ausgabeeinheit, die an den Prozessor angeschlossen ist, um die Ergebnisse von besagtem Vergleich darzustellen, ein. In einer bevorzugten Ausführungsform schließt die Speichereinheit magnetische Speichermedien ein. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform schließt die Anwenderschnittstelle eine Tastatur zur Eingabe der positiven und negativen Hybridisierungsergebnisse in den Prozessor ein. In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform schließt die analytische Vorrichtung ferner einen Sondenhybridisierungsdetektor, der über ein Interface zur Eingabe von besagten positiven und negativen Hybridisierungsergebnissen in den Prozessor mit dem Prozessor verbunden ist, ein. Wenn das der Fall ist, kann der Detektor ein Luminometer einschließen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Ausgabeeinheit ein Bildschirm oder ein Drucker.
Ferner ist ein Verfahren zum Bestimmen, ob eine Probe von Bakterien eine Staphylokokkenart neben Staphylococcus aureus einschließt, offenbart. Dieses Verfahren beginnt mit einem Schritt zur Freisetzung von Polynukleotiden aus der Bakterienprobe, um zu einer Sammlung von freigesetzten Polynukleotiden zu führen. Danach gibt es einen Schritt zum Hybridisieren der Sammlung von freigesetzten Polynukleotiden mit einer ersten Sonde, die Spezifität für ribosomale Nukleinsäuren von Bakterien der Gattung Staphylococcus besitzt und mit einer zweiten Sonde, die Spezifität für ribosomale Nukleinsäuren von Staphylococcus aureus besitzt. Danach gibt es einen Schritt zum Nachweis von jeder der ersten oder zweiten Sonde, die die Auswahl von freigesetzten Polynukleotiden hybridisiert hat. Schließlich gibt es einen Schritt zum Nachweis, dass die Bakterienprobe eine Staphylokokkenart neben Staphylococcus aureus enthält, wenn die erste Sonde hybridisierte und die zweite Sonde nicht hybridisierte.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein schematisches Diagramm, das eine phylogenetische Hierarchie zeigt. Die Enterobacteriaceae sind als Untergruppe von den Gram⁽⁺⁾ Bakterien gezeigt, während die Klasse von Gram⁽⁺⁾ Bakterien in Niedrig (G + C) und Hoch (G + C) Untergruppen unterteilt ist. Eine pan-Pilz Sonde identifiziert Organismen, für die gezeigt wird, dass sie mit den Organismen, die durch eine pan-bakterielle Sonde identifiziert werden, nicht verwandt sind. Pfeile zeigen phylogenetische Verwandtschaften an.
2 ist ein schematisches Diagramm, das die phylogenetische Hierarchie unter den Gram⁽⁺⁾ Bakterien zeigt. Es ist gezeigt, dass die Hoch (G + C) Untergruppe von Gram⁽⁺⁾ Bakterien die Mycobakterien einschließt, wohingegen die Niedrig (G + C) Untergruppe von Gram⁽⁺⁾ Bakterien Staphylococcus, Streptococcus und Enterococcus einschließt. Pfeile zeigen phylogenetische Verwandtschaften an.
3 ist ein schematisches Diagramm, das die phylogenetische Hierarchie unter den Gram^(–) Bakterien zeigt. Es ist gezeigt, dass mehrere Arten der Gram^(–) Bakterien mit den enterischen (Enterobacteriaceae) Bakterien verwandt sind. Pfeile zeigen phylogenetische Verwandtschaften an.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Polynukleotid-basierte Verfahren, Zusammensetzungen und Vorrichtungen, die verwendet werden können, um Mikroorganismen in einer biologischen Probe zu identifizieren. Der hierin dargestellte Ansatz basiert auf der Verwendung einer „Matrix" von Polynukleotid-Hybridisierungssonden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind diese Hybridisierungssonden spezifisch für die ribosomalen Nukleinsäuren (rRNA und rDNA) von verschiedenen Arten oder taxonomisch verwandten Gruppen von Organismen. Unter Verwendung dieses Ansatzes ist es möglich, die Art eines Organismus aus einer Sammlung von Daten, die sonst, wenn die Hybridisierungsergebnisse isoliert voneinander betrachtet werden würden, eine nicht eindeutige Identifizierung ergeben würden, zu bestimmen. Tatsächlich können sogar Identifizierungen auf dem Level der Art und des Stamms gemacht werden, wenn die Ergebnisse von einem Sondenmatrix-Hybridisierungsverfahren als Elemente in einem Satz von voneinander abhängigen Ergebnissen analysiert werden. Das unten beschriebene Verfahren ist insbesondere für die Verwendung im Zusammenhang mit automatisierten Systemen zur Identifizierung von Mikroben geeignet.
Einführung und Hintergrund
Hierin wird ein Matrix-basiertes Verfahren zur Identifikation von Mikroben beschrieben, das Kombinationen von Polynukleotidsonden, die ribosomale Nukleinsäuren von Mikroorganismen hybridisieren, verwendet. Sonden in der Matrix unterscheiden zwischen Organismen, die voneinander durch bekannte phylogenetische Verwandtschaften differieren. Z. B. können Sonden ausgewählt werden, um, basierend auf dem Vorhandensein oder dem Fehlen von rRNA Sequenzen, die zwischen diesen beiden Arten von Mikroorganismen unterscheiden, Organismen als Bakterien oder Pilze zu klassifizieren. In einem anderen Beispiel kann eine Sondenmatrix eine oder mehrere Sonden verwenden, um grampositive (Gram⁽⁺⁾) Bakterien zu identifizieren und um diese Klasse von den phylogenetisch unterschiedlichen gramnegativen (Gram^(–)) Bakterien zu unterscheiden.
Ein anderer Aspekt des matrixbasierten Verfahrens zur Identifikation von Mikroben bezieht sich auf die Verwendung von Kombinationen von Sonden, die für ribosomale Nukleinsäuren spezifisch sind, in einer einzigen Hybridisierungsreaktion. Wie ausführlicher unten beschrieben, können selbst Kombinationen von Sonden, die zweideutige Ergebnisse liefern, die Identifikation auf dem Level der Art ermöglichen, wenn Hybridisierungsergebnisse von diesen Sondenkombinationen im Lichte von anderen Ergebnissen von derselben Matrix interpretiert werden. Z. B. kann eine Einzeladresse in einer Sondenmatrix ein positives Hybridisierungssignal ergeben, wenn ein Organismus einer einer Reihe von unterschiedlichen Arten ist. Insbesondere kann ein positives Hybridisierungssignal an einer Adresse in einer Matrix anzeigen, dass ein bakterielles Isolat entweder S. aureus oder E. coli ist, ohne anzuzeigen, welche dieser Möglichkeiten korrekt ist. Wenn jedoch in dem Kontext des zusätzlichen Ergebnisses, dass die rRNA von dem Testorganismus an eine Sonde hybridisiert, die spezifisch für enterische Bakterien ist, betrachtet, wird klar, dass der Organismus E. coli sein muss, da nur E. coli und nicht S. aureus als enterisches Bakterium klassifiziert wird. Es sollte verstanden werden, dass „enterische" Bakterien Mitglieder der Familie Enterobacteriaceae sind. Auf diesem Weg kann die Information von matrixbasierten Polynukleotid-Hybridisierungsverfahren unzweideutig bis hinunter zum Level der Artidentifikation interpretiert werden.
Selbst negative Ergebnisse in einem Sondenmatrix-Hybridisierungsverfahren können bedeutsam sein, wenn sie in Zusammenhang mit den anderen Ergebnissen der Matrix betrachtet werden. Wenn z. B. von einer Matrix mit zwei Loci bestimmt wird, dass eine Probe Polynukleotide enthält, die ein positives Hybridisierungssignal einer ersten Adresse ergibt, die pan-bakterielle Organismen identifiziert, und negative Ergebnisse an einer zweiten Adresse, die sowohl pan-Pilz Organismen sowie eine bestimmte Art von Bakterium identifiziert, dann zeigt die Kombination der Ergebnisse an, dass die Polynukleotide von einer Bakterienart stammen müssen, die sich von der Bakterienart, die an der zweiten Adresse in der Matrix ein positives Hybridisierungssignal erzeugt hätte, unterscheidet. Dieses einfache Beispiel illustriert, wie der Multiplexaspekt der Sondenmatrix in einem Hybridisierungsverfahren klinisch relevante Informationen aus einer sehr begrenzten Anzahl von Loci liefern kann.
Definitionen
Wie hierin verwendet, haben die folgenden Ausdrücke die folgenden Bedeutungen, sofern nicht ausdrücklich anders angegeben.
„Ribosomale Nukleinsäuren" sind rRNA und die rDNA, die die rRNA kodiert.
Ein „Locus" ist ein Platz, an dem sich etwas befindet. Ein Locus kann eine einzelne Vertiefung, um lösliche Polynukleotide in einer Multiwellplatte zu enthalten; eine einzelne Stelle von immobilisierten Polynukleotiden auf einem Stück Nitrocellulosemembran oder einem Teststäbchen oder eine einzelne Stelle von immobilisierten Polynukleotiden auf einem „DNA Chip" sein. Sondenmoleküle, die sich an einem Locus in einer Testvorrichtung befinden, mischen sich nicht mit Sondenmolekülen, die sich an einem anderen Locus in der Vorrichtung befinden.
Eine „Adresse" bezieht sich auf eine oder mehrere Polynukleotidsonden an einem einzelnen Locus in einer Testvorrichtung, wobei ein Hybridisierungsergebnis an einer Adresse bestimmte Informationen über das Vorhandensein oder das Fehlen von komplementären Nukleotidsequenzen in einer Sammlung von Polynukleotiden, die dem Test unterzogen werden, liefert. Z. B. kann eine Adresse Information über das Vorhandensein von rRNA, die bakteriellen Ursprungs ist, liefern. Solche Informationen können von einer einzelnen Sonde oder einem Cocktail von Sonden, die an einem einzelnen Locus auf einer Testvorrichtung aufgebracht sind, abgeleitet werden. Eine Adresse kann ebenfalls Informationen über das Vorhandensein von rRNA von einer oder mehreren Arten von Mikroorganismen, wie z. B. jeder von E. coli, S. aureus, C. albicans, P. aeruginosa und S. pneumoniae, liefern. Aus Gründen der Einfachheit wird auf eine Adresse, die Nukleinsäuren eines bestimmten Organismus oder Art von Organismus nachweist, über den Namen oder die Art des Organismus Bezug genommen. Somit zeigt ein positives Hybridisierungssignal an einer „pan-bakteriellen Adresse" die Gegenwart von ribosomalen Nukleinsäuren bakteriellen Ursprungs an.
Eine Sonden „Matrix" ist eine Sammlung von Adressen, die zum Identifizieren eines unbekannten Mikroorganismus oder zum Einengen des Bereichs von möglichen Identitäten eines unbekannten Organismus nützlich ist. Die Sonden einer Matrix sind gewöhnlich an einer Vielzahl von physikalischen Orten auf einer Testvorrichtung aufgebracht (entweder indem sie lösliche Sonden enthalten oder durch physikalische Immobilisierung), wobei jeder Locus spezifisch Nukleinsäuren von einer oder einer Vielzahl von Mikroorganismenarten hybridisiert. Mindestens ein Locus der Matrix trägt eine Sonde niederer Ordnung, die Nukleinsäuren von einer Untergruppe von Mikroorganismen, die Nukleinsäuren besitzen, die von einer Sonde höherer Ordnung, die sich an einem anderen Ort in der Matrix befindet, hybridisiert werden, hybridisiert. Beispiele von Sonden, die gegenüber artspezifischen Sonden (als ein Beispiel phylogenetischer Klassifizierung) als „Sonden höherer Ordnung" betrachtet werden, schließen Sonden ein, die Spezifität für eine taxonomische Gattung, eine taxonomische Familie oder eine taxonomische Ordnung besitzen.
Die Ausdrücke „Adresse niederer Ordnung" und „Adresse höherer Ordnung" sind funktional relativ zueinander definiert. Eine Adresse niederer Ordnung weist ribosomale Nukleinsäuren von einer Untergruppe von Organismen nach, die ribosomale Nukleinsäuren besitzen, die an einer Adresse höherer Ordnung nachgewiesen werden. Z. B. würde eine Adresse, die eine einzelne Art von Bakterien nachweist, in Beziehung auf eine andere Adresse, die pan-bakterielle Organismen nachweist, als „Adresse niederer Ordnung" betrachtet.
Eine „Adresse mittlerer Ordnung" ist funktional als eine Adresse definiert, die ribosomale Nukleinsäuren von einer Untergruppe von Organismen nachweist, die ribosomale Nukleinsäuren besitzen, die an einer entsprechenden Adresse höherer Ordnung nachweisbar sind. Die Adresse mittlerer Ordnung weist ribosomale Nukleinsäuren von einer größeren Anzahl oder einem größeren Bereich von Organismen als die Untergruppe von Organismen, die durch eine entsprechende Adresse niederer Ordnung nachweisbar sind, nach. Z. B. würde mit Bezug auf zwei Adressen, die unabhängig pan-bakterielle Organismen und die Bakterienart E. coli nachweisen, eine Adresse zum Nachweis von Bakterien der Familie Enterobacteriaceae eine Adresse mittlerer Ordnung sein. Das ist so, da die Enterobacteriaceae Adresse ribosomale Nukleinsäuren von einer Untergruppe von Organismen, die ribosomale Nukleinsäuren besitzen, die an der pan-bakteriellen Adresse nachgewiesen werden können, nachweist, und weil der Bereich von bakteriellen Organismen, die an der Enterobacteriaceae Adresse nachgewiesen werden können, E. coli zusätzlich zu anderen Bakterienarten umfasst.
Eine „Sonde" ist ein einzelsträngiges Polynukleotid, das sich mit einem komplementären einzelsträngigen Zielpolynukleotid verbindet, um ein doppelsträngiges Hybrid zu bilden. Eine Sonde kann ein Oligonukleotid oder ein Nukleotidpolymer sein und kann einen nachweisbaren Rest enthalten, der an das Ende/die Enden der Sonde angeheftet sein oder sich im Inneren der Sonde befinden kann. Die Nukleotide, die sich mit dem Zielpolynukleotid zusammenlagern, müssen nicht strikt aufeinanderfolgend sein, wie es z. B. der Fall mit einem nachweisbaren Rest, der sich im Inneren der Sequenz der Sonde befindet, sein kann.
Ein „nachweisbarer Rest" ist ein Molekül, das an eine Polynukleotidsonde angeheftet oder als ein Teil davon synthetisiert wird. Dieses Molekül sollte eindeutig nachweisbar sein und erlaubt es als Ergebnis, die Sonde nachzuweisen. Diese nachweisbaren Reste sind oft Radioisotope, chemolumineszente Moleküle, Enzyme, Haptene, redoxaktive Elektronentransferreste, wie z. B. Übergangsmetallkomplexe, Metallmarker, wie z. B.
Silber- oder Goldpartikel, oder sogar einzigartige Oligonukleotidsequenzen.
Ein „Hybrid" ist der Komplex, der sich zwischen zwei einzelsträngigen Polynukleotidsequenzen über Watson-Crick Basenpaarungen oder nicht-kanonische Basenpaarungen zwischen den komplementären Basen bildet.
„Hybridisierung" ist der Prozess, durch den sich zwei komplementäre Polynukleotidstränge verbinden, um eine doppelsträngige Struktur zu bilden („Hybrid").
„Komplementarität" ist eine Eigenschaft, die durch die Rasensequenz eines Einzelstrangs von DNA oder RNA, der über Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Watson-Crick Rasenpaaren auf den entsprechenden Strängen ein Hybrid oder doppelsträngige DNA:DNA, RNA:RNA oder DNA:RNA bilden kann, verliehen wird. Adenin (A) komplementiert gewöhnlich Thymin (T) oder Uracil (U), wohingegen Guanin (G) gewöhnlich Cytosin (C) komplementiert.
„Fehlpaarung” bezieht sich auf jede Paarung von zwei Nukleotiden in einem Hybrid, die nicht-kanonische Watson-Crick Wasserstoffbrückenbindungen bilden. Zusätzlich kann zum Zwecke der folgenden Diskussionen eine Fehlpaarung eine Insertion oder Deletion in einem Strang des Hybrids einschließen, was zu einem ungepaarten Nukleotid/ungepaarten Nukleotiden führt.
Der Ausdruck „Stringenz" wird verwendet, um die Temperatur und Lösungsmittelzusammensetzung, die während der Hybridisierung und den folgenden Prozessierungsschritten bestehen, zu beschreiben. Unter Bedingungen hoher Stringenz bilden sich nur hochkomplementäre Nukleinsäurehybride; Hybride ohne einen ausreichenden Grad an Komplementarität werden sich nicht bilden. Dementsprechend bestimmt die Stringenz der Assaybedingungen die benötigte Menge an Komplementarität, die zwischen zwei Polynukleotidsträngen, die ein Hybrid bilden, benötigt wird. Stringenzbedingungen werden so gewählt, dass die Differenz in der Stabilität zwischen dem Hybrid, das mit dem Ziel gebildet wird, und einem Hybrid mit Nicht-Ziel Polynukleotiden maximiert wird.
Der Ausdruck „Sondenspezifität" bezieht sich auf eine Eigenschaft einer Sonde, die deren Eigenschaft beschreibt, zwischen Ziel und Nicht-Ziel Sequenzen zu unterscheiden. Die Sondenspezifität hängt von der Sequenz und den Assaybedingungen ab und kann absolut sein (d. h. die Sonde kann zwischen dem Zielorganismus und jedem Nicht-Zielorganismus unterscheiden) oder sie kann funktional sein (d. h. die Sonde kann zwischen dem Zielorganismus und jedem anderen Organismus, der gewöhnlich in einer bestimmten Probe vorhanden ist, unterscheiden). Viele Sondensequenzen können abhängig von den Bedingungen bei der Verwendung für sowohl breite als auch enge Spezifitätsbestimmungen verwendet werden.
„Polynukleotid" bedeutet entweder RNA oder DNA zusammen mit jedem synthetischen Nukleotidanalog oder anderen Molekülen, die in der Sequenz vorhanden sein können, und die die Hybridisierung des Polynukleotids mit einem zweiten Molekül, das eine komplementäre Sequenz besitzt, nicht verhindern. Der Ausdruck schließt Polymere, die Analoga von natürlich auftretenden Nukleotiden enthalten, ein und schließt insbesondere Analoga ein, die Methoxygruppen an der 2'-Position der Ribose besitzen (OMe). Wie hierin verwendet, besitzen Methoxypolynukleotide oder Oligonukleotide, die „T" Reste enthalten, eine Methoxygruppe an der 2'-Position des Riboserests und ein Uracil an der Basenposition des Nukleotids. Wenn auf sie spezielle als „OMeT" Bezug genommen wird, ist gemeint, dass die Basenposition des Nukleotids von einem Thyminrest besetzt ist.
Ein „Oligonukleotid" ist ein Polynukleotidmolekül, das eine Länge von 10 bis 100 Nukleotiden oder bevorzugter 10 bis 50 Nukleotiden besitzt. Gewöhnlich werden Oligonukleotide durch organisch-chemische Verfahren synthetisiert und sind einzelsträngig, sofern nicht anders angegeben. Oligonukleotide können mit einem nachweisbaren Marker markiert sein.
Ein „Helferoligonukleotid" ist ein Oligonukleotid, das eine Region eines Zielpolynukleotids bindet, die nicht die Region ist, die durch eine Assaysonde gebunden wird. Diese Oligonukleotide verleihen der angesteuerten Region des einzelsträngigen Polynukleotids neue Sekundär- und Tertiärstrukturen, so dass die Bindungsrate der Assaysonde erhöht wird. Obwohl Helfernukleotide nicht mit einem nachweisbaren Marker markiert sind, ermöglichen sie die Bindung von markierten Sonden und verstärken so indirekt die Hybridisierungssignale.
Ein „Mikroorganismus" oder eine „Mikrobe" ist ein Bakterium, ein Pilz oder ein Protozoon.
Ein „pan-bakterieller Organismus" ist ein Mikroorganismus, der eher als ein Bakterium als jeder andere Zelltyp klassifiziert wird. Alle Eubakterien, aber nicht notwendigerweise Archaebakterien, werden als pan-bakterielle Organismen klassifiziert. Hefen oder andere Pilze oder eukaryontische Organismen werden nicht als pan-bakterielle Organismen klassifiziert.
Ein „pan-Pilz Organismus" ist ein Mikroorganismus, der eher als ein Pilz als irgendein anderer Zelltyp klassifiziert wird. Alle Hefen werden notwendigerweise als pan-Pilz Organismen klassifiziert. Natürlich können Eubakterien und Archaebakterien, die Mitglieder eines anderen taxonomischen Reichs sind, nicht als pan-Pilz Organismen klassifiziert werden.
Eine „biologische Probe" bezieht sich auf eine Probe von Material, das auf die Anwesenheit von Mikroorganismen hin getestet werden soll. Die biologische Probe kann von einem Organismus, wie z. B. einem menschlichen Patienten, einem Versuchstier, wie z. B. einer Maus, einer Ratte, einem Schwein, einem Affen oder einem anderen Mitglied der Primatenfamilie, durch die Entnahme einer Blutprobe, einer Sputumprobe, einer Probe der Spinatflüssigkeit oder einer Urinprobe erhalten werden. Gewöhnlich enthält eine biologische Probe hybridisierbare Polynukleotide. Diese Polynukleotide können von Organismen, die die biologische Probe umfasst, freigesetzt worden sein oder können alternativ von den Organismen in der Probe unter Verwendung von Techniken, wie z. B. Ultraschallaufschluss oder enzymatischer oder chemischer Lyse von Zellen, um Polynukleotide freizusetzen, so dass sie für die Hybridisierung mit einer Polynukleotidsonde verfügbar sind, freigesetzt werden.
Ein „bestätigendes Ergebnis" ist ein Ergebnis, das an einer Adresse einer Sondenmatrix erhalten wird, und das eine Information liefert, die notwendig ist, ein anderes Ergebnis, das an einer anderen Adresse in derselben Sondenmatrix erhalten wird, zu interpretieren. Z. B. kann, wenn ein erstes Ergebnis anzeigt, dass ein Organismus entweder ein Gram⁽⁺⁾ Bakterium oder ein Pilz ist, ein Ergebnis, das anzeigt, dass der Organismus ebenfalls rRNA, die an eine pan-bakterielle Adresse hybridisiert ist, enthielt, ein bestätigendes Ergebnis sein, das anzeigt, dass der Organismus ein Gram⁽⁺⁾ Bakterium war.
Eine „Vergleichstabelle" ist eine Sammlung von Daten, die mögliche Kombinationen von positiven und negativen Hybridisierungsergebnissen an jeder Adresse in einem Sondenmatrix-Hybridisierungsverfahren darstellt, zusammen mit einer damit verbundenen Interpretation von jedem Dateneintrag in der Sammlung. Eine Vergleichstabelle kann auf einem computerlesbaren Medium gespeichert werden.
Nützlichkeit des matrixbasierten Verfahrens zum Nachweis und zur Identifikation von Mikroben Das matrixbasierte Verfahren zum Identifizieren von Mikroorganismen ist breit für Tests in klinischen Laboren, Tests von Nahrungsmitteln und Umwelttests nützlich. Die Erfindung kann verwendet werden, um Organismen zu identifizieren, die kultiviert worden sind, aber das Wachstum des Organismus auf spezialisierten Medien ist zur Bestimmung der Identität des Organismus nicht erforderlich. Das System ist insbesondere nützlich für die schnelle klinische Diagnose von mikrobiellen Infektionen, einschließlich Infektionen des Mundraums, des Blutkreislaufs (Blutvergiftung und Fungämie), der Genitalien und des perigenitalen Gewebes, des Harntrakts, des Gastrointestinaltrakts, traumatischen und operativen Wunden, des Herzgewebe (infektiöse Endokarditis), der Augen, des Gehörapparats und der cerebralen Spinalflüssigkeit. Das System ist ebenfalls nützlich zum Überwachen des Vorhandenseins von potentiell gefährlichen Mikroben in immungeschwächten Individuen, wie z. B. Individuen, die mit HIV infiziert sind, oder solchen, die mit Immunsuppressiva, die bei Knochenmarkstransplantation verwendet werden, behandelt werden, selbst wenn das Individuum keine Symptome einer Infektion zeigt. Auf die gleiche Art und Weise sind die erfindungsgemäßen Verfahren für den Nachweis von Infektionen im Kontext der Veterinärdiagnose von Haustieren (z. B. Rindermastitis) nützlich.
Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden, um die Anwesenheit von einer oder mehreren Arten von Mikroben in Umweltproben nachzuweisen. Z. B. kann die Erfindung verwendet werden, um die Wirksamkeit von städtischer Abwasserbehandlung oder den Grad an Verunreinigungen in Freizeitwasserquellen zu überwachen. Das Testen von Umweltproben gemäß den hierin beschriebenen Verfahren erlaubt den Nachweis von unerwünschten Mikroben in wässrigen oder nichtwässrigen Systemen. Mikroben von besonderem Interesse gemäß diesem Aspekt der Erfindung verursachen Korrosion, Akkumulation von Biomasse oder sind an Abbauprozessen von Rohrleitungen, Lagerungstanks oder Prozessierungseinrichtungen beteiligt. Das Testen von Umweltwasserproben auf Mikroben, die Herstellungsprozesse, wie z. B. die Herstellung von Papier, Textilien und elektronischen Komponenten, positiv oder negativ beeinflussen, kann ebenfalls unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren durchgeführt werden. Die Erfindung kann ebenfalls zum Nachweis von Mikroben in Nahrungsmittelproben oder landwirtschaftlichen Proben verwendet werden. Organismen von besonderem Interesse in Verbindung mit diesem Aspekt der Erfindung können zur Prävention von Krankheiten oder als Indikatoren von Umweltverschmutzung verwendet werden. Zusätzlich zum Überwachen der Proben auf schädliche Mikroben (d. h. Verunreinigungen) kann die vorliegende Erfindung ebenfalls zum Nachweis, zur Identifizierung und zur Quantifizierung von nützlichen Mikroben, wie z. B. solchen, die in natürlich fermentierten Nahrungsmitteln und Getränken vorkommen, verwendet werden.
Zusätzlich können die unten detailliert beschriebenen Verfahren zur Erforschung neuer anti-mikrobieller Therapeutika verwendet werden. Insbesondere können die matrix-basierten Verfahren zur Identifikation von Mikroben zum schnellen Kontrollieren, ob Kandidaten für antimikrobielle Agenzien mikrobielles Wachstum in vitro oder in vivo verhindern oder hemmen, verwendet werden. Des Weiteren kann das erfindungsgemäße Verfahren zum Überwachen der Empfänglichkeit eines Organismus gegenüber einem Antibiotikum, entweder in einer gemischten Kultur oder als gereinigtes Isolat, verwendet werden.
Minimale Sondenmatrizen
Gemäß dem hierin offenbarten Verfahren wird eine biologische Probe, die Polynukleotide enthält, an eine Sammlung von Polynukleotidsonden hybridisiert, wobei jede dieser Sonden Bindungsspezifität für eine ribosomale Nukleinsäure von mindestens einer Mikrobe besitzt. Die Sammlung von Sonden ist in eine Reihe von „Adressen" organisiert, die Informationen über das Vorhandensein oder das Fehlen von einer oder von mehreren Polynukleotidsequenzen in einer Probe, die Nukleinsäuren enthält, liefern. Bedeutsamerweise ist die in vitro Amplifikation von ribosomalen Nukleinsäuresequenzen für den Erfolg des hierin offenbarten Verfahrens nicht erforderlich. Tatsächlich wird bevorzugt, dass, obwohl eine in vitro Amplifizierung von rRNA oder rDNA Sequenzen gegebenenfalls vor dem Hybridisierungsschritt durchgeführt werden kann, Polynukleotide, die aus der biologischen Probe freigesetzt worden sind, ohne einen vorangehenden Amplifizierungsschritt an die Sammlung von Polynukleotidsonden hybridisiert werden. Nach dem Hybridisierungsverfahren wird jede der Adressen analysiert, um zu bestimmen, ob ein positives oder negatives Hybridisierungsergebnis erhalten worden ist.
Eine minimale Sondenmatrix schließt zwei Loci ein und besitzt eine einzelne Sonde, die sich am ersten Locus befindet, und eine Vielzahl von Sonden, die sich an dem zweiten Locus befinden. Eine beispielhafte erste Adresse einer Sondenmatrix kann verwendet werden, um rRNA von jedem bakteriellen Organismus nachzuweisen. Eine beispielhafte zweite Adresse kann verwendet werden, um die rRNA von jedem Pilzorganismus sowie von Gram⁽⁺⁾ Bakterien Bakterien nachzuweisen. Das kann dadurch erreicht werden, dass in der ersten Vertiefung einer 96-well Mikrotiterplatte eine Polynukleotidsonde deponiert wird, die ein rRNA Segment hybridisiert, das in allen Arten von Bakterien konserviert ist. Eine zweite Vertiefung würde eine Kombination einer Sonde, die ein rRNA Segment hybridisiert, das in allen Arten von Pilzen konserviert ist, hybridisiert und eine Sonde, die die rRNA von Gram⁽⁺⁾ aber nicht Gram^(–) Bakterien hybridisiert. Diese Zwei-Locus-Matrix würde, wenn sie mit Polynukleotiden, die aus einer einzelnen, gut isolierten Kolonie von Organismen hybridisiert wird, Antworten auf drei Fragen liefern. Insbesondere wäre die beispielhafte Zwei-Locus-Matrix in der Lage anzuzeigen, ob der Organismus bakteriellen Ursprungs war; ob ein bakterieller Organismus ein Gram⁽⁺⁾ oder Gram^(–) Bakterium war; und ob der Organismus ein Pilz war (was gleichzeitig eine bakterielle Identifikation in einem unimikrobiellen System ausschließt).
Die Tatsache, dass diese drei Fragen eindeutig durch das Analysieren der Ergebnisse, die von nur zwei Loci erhalten werden, beantwortet werden können, zeigt, wie ein Matrixansatz verwendet werden kann, um den Wert der Daten aus einer sehr einfachen Testvorrichtung zu maximieren. Da jeder der beiden Loci eines von zwei Ergebnissen erzeugt, wobei es sich entweder um ein positives oder ein negatives Ergebnis handelt, ist die Anzahl von möglichen Ergebnissen die Anzahl von möglichen Ergebnissen an jedem Locus (2) hoch der Anzahl von Loci in der Matrix (2). Somit gibt es für eine Zwei-Locus-Matrix 2² oder 4 mögliche Ergebnisse.

Die Interpretation dieser Ergebnisse kann durch Bezugnahme auf Tabelle 1, in der positive Hybridisierungsergebnisse durch „(+)" und negative Hybridisierungsergebnisse durch „(–)" angezeigt werden, verstanden werden. TABELLE 1 Interpretation von Ergebnissen von einer beispielhaften Zwei-Locus-Matrix

	(pan-Pilz/Gram⁽⁺⁾)(–)	(pan-Pilz/Gram⁽⁺⁾)(+)
pan-bakteriell (–)	(–/–): Fehlen von Bakterien oder Pilzen	(–/+): Pilzorganismus
pan-bakteriell (+)	(+/–): Gram⁽⁺⁾ Bakterien	(+/+): Gram⁽⁺⁾ Bakterien

Die Information in Tabelle 1 repräsentiert eine Art von „Vergleichs"-Tabelle, die verwendet werden kann, um ein Profil von Hybridisierungsergebnissen zu decodieren und dadurch die Art von Organismus, die untersucht wird, zu identifizieren. Wenn die Gram⁽⁺⁾ Sonde in dem obigen Beispiel durch eine artspezifische Sonde für E. coli ersetzt wird, wäre die modifizierte Zwei-Locus-Matrix nützlich um zu bestimmen, ob ein Organismus ein Bakterium oder ein Pilz und ob ein nachgewiesenes Bakterium E. coli ist.
Ergebnisse eines Sondenmatrix-Hybridisierungsverfahren können entweder manuell unter Verwendung einer Tastatur oder direkt über eine Schnittstelle aus einer automatischen Vorrichtung, wie z. B. einen Plattenausleser, einen Filmscanner oder ein Luminometer, in einen Computer oder Datenprozessor („Computer") eingegeben werden. Der Computer kann die positiven und negativen Hybridisierungsergebnisse für einen bestimmten Organismus sortieren, um ein Profil zu erstellen. Dieses Profil kann dann mit einer Vergleichstabelle, die in einer Speichervorrichtung, die mit dem Computer verbunden ist, gespeichert ist, verglichen werden, um das Hybridisierungsprofil mit Hybridisierungsergebnissen, die unter Verwendung von Kontrollorganismen erhalten wurden, in Verbindung zu bringen und dadurch die Identität, oder im Fall von zweideutigen Ergebnissen, die für mehr als einen Organismus charakteristisch sind, die Kandidatenidentität des Organismus, der verwendet wurde, um das Verfahren durchzuführen, zu bestimmen.
Z. B. kann ein Computer, der über eine Schnittstelle mit einem Luminometer verbunden ist, in einer Speichervorrichtung eine Vergleichstabelle für die vier möglichen Ergebnisse, die in Tabelle 1 gezeigt sind, gespeichert haben. Als Antwort auf den Erhalt eines Eingangssignals, das das (+/+) Hybridisierungsergebnis darstellt, würde ein Algorithmus, der von dem Computer verwendet wird, das Ergebnis mit der Vergleichstabelle vergleichen und eine Ausgabe liefern, die anzeigt, dass die Organismen, die untersucht wurden, Gram⁽⁺⁾ Bakterien waren. Alternative Ergebnisse für die Eingaben (–/–), (+/–) und (–/+) würden entsprechend Ausgaben verursachen, die das Fehlen von hybridisierenden bakteriellen oder Pilz-Polynukleotidarten, das Vorhandensein von Bakterien neben Gram⁽⁺⁾ Bakterien und das Vorhandensein von einem Pilzorganismus anzeigen. Ein ähnlicher Prozess zum Dekodieren von komplexeren Matrizen, die mehr als zwei Loci besitzen, kann unter Verwendung desselben Verfahrens durchgeführt werden. Es sollte offensichtlich sein, dass komplexere Matrizen eine vollständigere Identifikation von Organismen liefern werden.
In einem anderen Beispiel des sonden-matrix-basierten Verfahrens kann ein dritter Locus zum Nachweis einer bestimmten Mikroorganismenart zu der oben beschriebenen Zwei-Locus-Matrix hinzugefügt werden. Insbesondere kann der erste Locus Information über das Vorhandensein von pan-bakteriellen rRNA Sequenzen liefern, der zweite Locus kann Informationen über die Hybridisierung einer pan-Pilz Sonde und einer Sonde für Gram⁽⁺⁾ Bakterien liefern und ein dritter Locus kann Informationen über die Identität einer bestimmten Art von Bakterien und Pilzen liefern. Ein beispielhafter dritter Locus könnte eine artspezifische Sonden für E. coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa und Streptococcus pneumoniae besitzen. Tabelle 2 präsentiert die erwarteten Ergebnisse für Hybridisierungsergebnisse unter Verwendung dieser Drei-Locus-Matrix. Da jeder der drei Loci eins von zwei Ergebnissen liefert, wird die Anzahl von Einträgen in dieser Tabelle durch 2³ oder 8 angegeben. Die Ergebnisse, die in der folgenden Tabelle präsentiert werden, gehen wiederum von einer reinen Kultur einer einzelnen Art von Organismus aus.

TABELLE 2 Interpretation von Ergebnissen aus einer beispielhaften Drei-Locus-Matrix

pan-bakterielle/pan-Pilz & Gram⁽⁺⁾/Art Sonden	Interpretation
(–/–/–)	keine Bakterien oder Pilze nachgewiesen
(+/–/–)	Gram^(–) Bakterien nachgewiesen
(+/+/–)	Gram⁽⁺⁾ Bakterien nachgewiesen; aber nicht S. aureus oder S. pneumoniae
(+/+/+)	Gram⁽⁺⁾ Bakterien nachgewiesen, die entweder S. aureus oder S. pneumoniae sind
(–/–/+)	kein sinnvolles Ergebnis
(–/+/–)	ein anderer Pilz als C. albicans nachgewiesen
(–/+/+)	C. albicans nachgewiesen
(+/–/+)	Bakterien als entweder E. coli oder P. aeruginosa nachgewiesen

Die Information, die in Tabelle 2 präsentiert wird, stellt eine Vergleichstabelle dar, die verwendet werden kann, um jedes Ergebnis, das mit der beispielhaften Drei-Locus-Matrix erhalten wird, zu interpretieren. Es sollte wiederum offensichtlich sein, dass die Ergebnisse, die unter Verwendung einer Drei-Locus-Matrix erhalten werden, ausreichend sind, um einen größeren Bereich an Identifizierungsinformation zu liefern als eine Matrix, die sich nur in einem einzelnen Locus unterscheidet. In dem obigen Beispiel war die Drei-Locus-Matrix ausreichend um: (1) einen Organismus als entweder bakteriell oder Pilz zu klassifizieren; (2) ein Bakterium als entweder Gram⁽⁺⁾ oder Gram^(–) zu identifizieren; (3) zu bestimmen, ob die Pilzart C. albicans ist oder nicht; (4) anzuzeigen, ob ein Gram^(–) Bakterium entweder E. coli oder P. aeruginosa ist; (5) anzuzeigen, ob ein Gram⁽⁺⁾ Bakterium entweder S. aureus oder S. pneumoniae ist; (6) anzuzeigen, ob eine Bakterienkultur, die nicht Gram⁽⁺⁾ ist, entweder E. coli oder P. aeruginosa ist.
Bedeutsamerweise zeigen die Ergebnisse, die in Tabelle 2 präsentiert werden, dass es annehmbar ist, Einträge in der Vergleichstabelle zu haben, die zweideutig sind, da diese Ergebnisse bei der Diagnose einer Infektion dennoch bedeutsam sein können. Z. B. zeigt das „(+/+/–)" Ergebnis in der Tabelle an, dass der Organismus ein anderes Gram⁽⁺⁾ Bakterium als S. aureus oder S. pneumoniae war. Es ist somit erlaubt, ein nicht eindeutiges Identifikationsschema zu verwenden, um bestimmte Organismen von einer Diagnose auszuschließen. Es ist auf gleiche Weise erlaubt, einen Organismus als einen einer Anzahl von unterschiedlichen Arten von Organismen zu identifizieren und dennoch ein klinisch bedeutsames Ergebnis zu erhalten, das verwendet werden kann, um eine angemessene Antibiotika-Therapie festzulegen. Das wird durch das „(+/–/+)" Ergebnis in Tabelle 2 veranschaulicht, das anzeigt, dass ein bakterieller Organismus einer von zwei Kandidaten war.
Zusätzlich zeigen die Ergebnisse in Tabelle 2, dass es annehmbar ist, Einträge in der Vergleichstabelle zu haben, die nicht sinnvoll sind. In diesem Beispiel war das Ergebnis „(–/–/+)" nicht sinnvoll, da es nicht möglich sein würde, ein positives Hybridisierungsergebnis an dem dritten Locus zu erhalten, ohne auch ein positives Hybridisierungsergebnis an mindestens einem der ersten beiden Loci zu erhalten. Somit ist es erlaubt, mögliche Sonden-Matrix-Hybridisierungsergebnisse zu haben, die nicht sinnvoll sind. Wir merken jedoch an, dass eine Archaebakteriensonde, die nicht mit der rRNA von Eubakterien kreuzreagiert, unter der Sammlung von artspezifischen Sonden an der dritten Adresse positioniert werden könnte und dem „(–/–/+)" Ergebnis eine Bedeutung geben würde.
Es ist klar, dass eine Sondenmatrix, die nur zwei Adressen besitzt, nützliche Information über die Identität eines Organismus, der untersucht wird, liefern kann. Z. B. würde, wenn die erste Adresse bakterielle Organismen nachweist und die zweite Adresse Pilzorganismen nachweist, diese Zwei-Adressen-Matrix nützlich sein, um zu bestimmen, ob ein Organismus bakteriell oder ein Pilz ist. Das Hinzufügen einer dritten Adresse zu der Matrix würde eine zusätzliche Information liefern und würde die Nützlichkeit der Matrix vergrößern. Eine beispielhafte dritte Adresse würde die rRNA von Gram⁽⁺⁾ und Gram^(–) Bakterien, z. B. durch den Nachweis der rRNA von Gram⁽⁺⁾ Bakterien, unterscheiden. Somit würde ein Ergebnis mit einer Drei-Adressen-Matrix, das positive Hybridisierungsergebnisse für eine pan-bakterielle Sonde und eine Gram⁽⁺⁾ Sonde, aber negative Ergebnisse mit einer pan-Pilz Hybridisierungssonde anzeigt, das Vorhandensein von Gram⁽⁺⁾ Bakterien und das Fehlen von Pilzen anzeigen. Das Hinzufügen einer vierten Adresse zu der Matrix liefert noch größere Funktionalität. Eine beispielhafte vierte Adresse würde Bakterien in der Actinomyceten Untergruppe von Gram⁽⁺⁾ Bakterien nachweisen. Das Hinzufügen einer fünften Adresse zu der Matrix könnte verwendet werden, um Organismen zu identifizieren, die enterische Bakterien oder Mitglieder der Gattung Enterococcus sind. Das könnte durch das Verwenden einer Vielzahl von rRNA spezifischen Sonden, die positive Hybridisierungssignale ergeben, wenn eine dieser beiden Arten von Bakterien vorhanden ist, erreicht werden. Bemerkenswerterweise sind in verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung die Sonden, die Spezifität für die rRNA von Enterococcus oder enterischen Bakterien besitzen, an unterschiedlichen Orten und an einem gemeinsamen Ort in einer Testvorrichtung aufgebracht. Eine sechste Adresse könnte verwendet werden, um Bakterien zu identifizieren, die zu der Gattung Staphylococcus und der Gruppe Campylobacter gehören. Wiederum sind in verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung die Sonden, die Spezifität für die rRNA von der Gattung Staphylococcus und der Campylobacter Gruppe von Bakterien besitzen, an verschiedenen Orten und an einem gemeinsamen Ort in einer Testvorrichtung aufgebracht. Eine siebte Adresse, die eine Sammlung von artspezifischen Sonden darstellt, kann Informationen liefern, die ausreichen, um eine bestimmte Art mit Sicherheit zu identifizieren. Z. B. könnte die siebte Adresse artspezifische Sonden für E. coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa und Streptococcus pneumoniae einschließen. Obwohl diese Arten sehr unterschiedliche Organismen darstellen, ist ersichtlich, dass jedes positive Hybridisierungssignal mit einer artspezifischen Sonde einer siebten Adresse in Kombination mit oder im Kontext von allen anderen Ergebnissen, die an den anderen Adressen der Matrix erhalten werden, interpretiert werden muss. Dasselbe trifft für negative Hybridisierungsergebnisse, die an der siebten Adresse beobachtet werden, zu. Jede der vorangegangenen beispielhaften Matrizen repräsentiert eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung. Es ist natürlich selbstverständlich, dass Sonden Bindungsspezifität für entweder rRNA oder rDNA besitzen können, obwohl sich die vorangegangenen Beispielfälle speziell auf rRNA-spezifische Sonden bezogen haben.
Matrix-basierte Verfahren zur Identifizierung eines Organismus
Ein Schlüsselmerkmal des matrix-basierten Hybridisierungsverfahrens betrifft das Verhältnis zwischen festen Adressen, die die Matrix bilden. Bevorzugte Sondenmatrizen schließen eine Kombination von Adressen „höherer Ordnung" und „niederer Ordnung" ein. Eine Adresse höherer Ordnung wird immer zum Identifizieren von mehr als einer Art von Organismen verwendet und umfasst vollständig Organismen, die an mindestens einer anderen Adresse derselben Matrix identifiziert werden. Somit würde eine Adresse, die die Actinomyceten Untergruppe von Gram⁽⁺⁾ Bakterien identifiziert, in Bezug auf eine andere Adresse, die für die breitere Kategorie von Gram⁽⁺⁾ Bakterien spezifisch ist, als Adresse niederer Ordnung betrachtet. Dasselbe Verhältnis charakterisiert Adressen, die zum Identifizieren von Gram⁽⁺⁾ Bakterien und pan-bakteriellen Organismen nützlich sind. Vorteilhafterweise bedeutet die Redundanz, die inhärent mit der Fähigkeit einer bestimmten rRNA oder rDNA Art an mehr als eine Adresse in einer Sondenmatrix zu hybridisieren verbunden ist, dass sowohl positive als auch negative Hybridisierungsergebnisse informativ sind. Sondenmatrizen, die drei Adressen umfassen, können zusätzlich zu den Adressen höherer Ordnung und niederer Ordnung eine Adresse mittlerer Ordnung einschließen.
Es wird bevorzugt, dass Adressen höherer Ordnung, mittlerer Ordnung und niederer Ordnung über eine molekulare Taxonomie-Hierarchie in Beziehung zueinander stehen. Adressen höherer Ordnung identifizieren breite Kategorien von Arten von Mikroorganismenzellen. Z. B. kann eine Adresse höherer Ordnung zum Identifizieren von pan-bakteriellen Organismen verwendet werden. Eine Adresse mittlerer Ordnung könnte die Untergruppe von Gram⁽⁺⁾ Bakterien identifizieren. Eine Adresse niederer Ordnung könnte dann die Actinomyceten Untergruppe von Gram⁽⁺⁾ Bakterien Bakterien identifizieren. Noch eine Adresse niederer Ordnung könnte eine bestimmte Art, die ein Mitglied der Actinomyceten ist, wie z. B. Streptococcus pneumoniae, identifizieren.
Ergebnisse von sonden-matrix-basierten Hybridisierungsverfahren zeigen an, ob Zielnukleinsäuren positiv an vorherbestimmte Adressen hybridisieren oder nicht. Da die Polynukleotidsonde(n), die eine bestimmte Adresse darstellt/darstellen, erlaubterweise Fehlpaarungen mit positiv hybridisierenden Zielsequenzen enthalten kann, sollte verstanden werden, dass ein positive Hybridisierungssignal nicht notwendigerweise anzeigt, dass die Komplementäre Sequenz der Sonde in der Zielnukleinsäuresequenz gefunden wird. Das kann in solchen Beispielen der Fall sein, in denen eine einzelne Hybridisierungssonde verwendet wird, um eine Sammlung von Mikroorganismen, wie z. B. pan-bakterielle Organismen oder eine Gattung von Bakterien, zu identifizieren. Es sollte jedoch ebenfalls verstanden werden, dass in bestimmten Fällen ein positives Hybridisierungssignal eine präzise Entsprechung zwischen der Sequenz einer Sonde und der komplementären Sequenz, die in dem Zielpolynukleotid gefunden wird, anzeigt. Das trifft häufig für Fälle zu, die artspezifische Sonden einschließen. In solchen Fällen ist es wünschenswert, eine Probe zu besitzen, die insbesondere eine einzelne Art von Zielnukleinsäure hybridisiert.
Die Ergebnisse von Sonden-Matrix-Hybridisierungsverfahren sind am informativsten, wenn sie im Kontext von anderen Ergebnissen desselben Verfahrens interpretiert werden. Ein positives Hybridisierungsergebnis an einer Adresse höherer Ordnung zeigt an, dass ein Testorganismus ein Mitglied der Gruppe von Organismen ist, die an dieser Adresse identifiziert werden. Z. B. zeigt ein positives Hybridisierungsergebnis an einer Adresse, die panbakterielle Organismen identifiziert, an, dass der Testorganismus bakteriell ist, aber liefert keine zusätzliche Information bezüglich der Identität des Organismus. Ein positives Hybridisierungsergebnis an einer Adresse mittlerer Ordnung zeigt an, dass der Testorganismus ein Mitglied der Untergruppe von Organismen ist, die an der Adresse höherer Ordnung identifiziert werden, die ebenfalls Mitglieder der Sammlung von Organismen sind, die an der Adresse mittlerer Ordnung identifiziert werden. Natürlich würden ein positives Hybridisierungsergebnis an der Adresse höherer Ordnung und ein negatives Hybridisierungsergebnis an der Adresse mittlerer Ordnung bedeuten, dass der Testorganismus nicht unter der Gruppe von Organismen, die an der Adresse mittlerer Ordnung identifiziert werden, ist. Z. B. würden positive Hybridisierungsergebnisse an pan-bakteriellen und Gram⁽⁺⁾ Adressen in einer Sondenmatrix anzeigen, dass ein Organismus ein Mitglied der Gram⁽⁺⁾ Untergruppe von Bakterien ist. Ein negatives Hybridisierungsergebnis würde anzeigen, dass der Organismus sich von einem Organismus, der ansonsten ein positives Hybridisierungssignal erzeugt hätte, unterscheidet. Somit würde ein negatives Hybridisierungsergebnis an einer Adresse zum Nachweis von Gram⁽⁺⁾ Bakterien anzeigen, dass der Testorganismus kein Gram⁽⁺⁾ Bakterium war. Schließlich zeigt ein positives Hybridisierungssignal an einer Adresse niederer Ordnung an, dass der Testorganismus ein Mitglied der Gruppe von Organismen, die durch diese Adresse niederer Ordnung identifiziert werden, ist. Wenn die Adresse niederer Ordnung einer bestimmten Art entspricht, dann identifiziert das positive Ergebnis die Art des Testorganismus.
Natürlich wird der Durchschnittsfachmann erkennen, dass das Verhältnis unter den Adressen höherer Ordnung/Adressen mittlerer Ordnung/Adressen niederer Ordnung in einer Sondenmatrix ein relatives ist. Während eine Gram⁽⁺⁾ Adresse in Bezug auf eine Actinomyceten Adresse eine Adresse höherer Ordnung ist (weil die Actinomyceten eine Untergruppe von Gram⁽⁺⁾ Organismen darstellen), kann eine Gram⁽⁺⁾ Adresse in Bezug auf eine Adresse, die pan-bakterielle Organismen identifiziert, auch als Adresse niederer Ordnung betrachtet werden (weil Gram⁽⁺⁾ Organismen eine Untergruppe von pan-bakteriellen Organismen darstellen). Im Kontext einer Sondenmatrix mit drei Adressen, die eine pan-bakterielle Adresse, eine Gram⁽⁺⁾ Adresse und eine Actinomyceten Adresse einschließt, würde die Gram⁽⁺⁾ Adresse jedoch aufgrund ihrer Beziehung zu den anderen Adressen in der Matrix als Adresse mittlerer Ordnung betrachtet.
Die zusammengefasste Sammlung von positiven und negativen Ergebnissen eines Sonden-Matrix-Hybridisierungsverfahrens kann interpretiert werden, um Information über die Identität eines Organismus, der in der biologischen Probe vorhanden ist, zu liefern. Bedeutsamerweise können im Kontext der Sondenmatrix negative Ergebnisse hochinformativ sein. In vielen Fällen wird es möglich sein, die Identität eines Organismus auf dem Level der Art zu bestimmen. Es ist jedoch nicht immer notwendig, eine Identifikation auf dem Level der Art zu erreichen, um nützliche Informationen zu erhalten. Das reine Bestimmen der breiten taxonomischen Eigenschaften eines Organismus oder sogar das Ausschließen einer oder mehrerer Arten von einer Sammlung von Kandidatenorganismen kann unter klinischen Gegebenheiten hochinformativ sein.
Tatsächlich kann es hochinformativ sein, zu bestimmen, ob ein Organismus, der für eine Infektion verantwortlich ist, ein Bakterium oder ein Pilz ist. Diese grundlegende Information würde nützlich sein, um zu bestimmen, ob ein anti-bakterielles Agens oder ein Anti-Pilzagens verwendet werden sollte, um eine Infektion zu behandeln. Alternativ kann es nützlich sein festzustellen, ob eine bakterielle Infektion durch Gram⁽⁺⁾ oder Gram^(–) Organismen verursacht wird, da Infektionen, die durch diese beiden Arten von Bakterien verursacht werden, gewöhnlich mit unterschiedlichen Antibiotika-Kuren behandelt werden und unterschiedliche klinische Prognosen besitzen. Ein anderer Vorteil des matrix-basierten Ansatzes zum Identifizieren von Mikroben bezieht sich auf die Schnelligkeit, mit der Ergebnisse erhalten werden.
In der Praxis eines klinischen Labors ist es oftmals notwendig, eine biologische Probe von einem Patienten zu erhalten, der eine Infektion hat, für die der verursachende Organismus identifiziert werden muss. Die biologische Probe kann in der Form eines Abstrichs oder einer Probe einer Körperflüssigkeit vorliegen. Z. B. kann die Probe eine Sputumprobe sein, wenn der Patient an einer Atemwegsinfektion leidet, oder eine Blutprobe, wenn eine Bakterämie oder Blutvergiftung vermutet wird. Die biologische Probe kann dann für einen Zeitraum kultiviert werden, so dass die Anzahl von Organismen als Ergebnis des Wachstums der Organismen erhöht wird. Dann können metabolische oder biochemische Tests vorgenommen werden, um weitere Information über den kultivierten Organismus zu erhalten.
Der matrix-basierte Ansatz zum Identifizieren von Mikroben unterscheidet sich von konventionellen Ansätzen in mehreren Beziehungen. Anstelle als eine Reihe von unabhängigen Test durchgeführt zu werden, wird die Matrix-Hybridisierung gleichzeitig ausgeführt und vorzugsweise auf derselben Plattform, so dass es nicht notwendig ist, ein Ergebnis von einem ersten Test zu erhalten, bevor ein zweiter Test ausgewählt und begonnen wird. Wie oben angegeben, sind negative Ergebnisse in der Matrix bedeutsam, da sie vor einem Hintergrund von positiven Hybridisierungsergebnissen interpretiert werden.
Bedeutsamerweise kann der Sonden-Matrix-Ansatz, der hierin beschrieben wird, die Identität eines Organismus aus einer Sammlung von Daten auflösen, die sonst nur eine mehrdeutige Information liefern würden. In einigen Fällen kann eine Adresse in einer Sondenmatrix anzeigen, ob eine biologische Probe rRNA enthält, die eine oder mehrere unterschiedliche Polynukleotidsonden hybridisiert. Z. B. kann eine einzelne Adresse in einer Sondenmatrix artspezifische Sonden für E. coli, S. aureus, C. albicans, P. aeruginosa und S. pneumoniae enthalten. Ein positives Hybridisierungssignal an dieser Adresse würde mehrdeutig das Vorhandensein von einer oder mehreren dieser fünf Arten von Mikroorganismen anzeigen. Wenn jedoch bestätigende Ergebnisse von anderen Adressen in der Matrix in Betracht gezogen werden, kann der Ursprung der hybridisierenden rRNA geklärt werden. Z. B. wäre in Anbetracht eines positiven Hybridisierungsergebnisses an einer Adresse, die einer pan-bakteriellen Sonde entspricht und einem negativen Ergebnis an einer Adresse, die einer pan-Pilz Sonde entspricht, klar, dass der Organismus nicht die Hefe C. albicans sein kann, da die pan-Pilz Sonde ein negatives Hybridisierungssignal ergab. Wenn es ferner in Bezug auf ein positives Hybridisierungssignal an einer Adresse für Gram⁽⁺⁾ Bakterien betrachtet wird, wird klar, dass der Mikroorganismus nicht E. coli oder P. aeruginosa sein kann, da diese Organismen Gram^(–) Bakterien sind. Somit muss die biologische Probe, die dem Test unterzogen wird, entweder Staphylococcus aureus oder Streptococcus pneumoniae sein. Schließlich wird, wenn diese zusammengefassten Ergebnisse ferner im Hinblick auf ein positives Hybridisierungssignal an einer Adresse, die die Gattung Staphylococcus oder die Campylobacter Gruppe von Bakterien repräsentiert, betrachtet wird, klar, dass der Organismus, der in der biologischen Probe enthalten ist, S. aureus sein muss, da S. pneumoniae weder ein Staphylokokken noch ein Campylobacter Organismus ist. Auf diese Weise ist es möglich, zu einer eindeutigen Schlussfolgerung über die Identität eines Organismus zu kommen, wenn mit einer Sammlung von ansonsten mehrdeutigen Ergebnissen konfrontiert.
Ribosomale Nukleinsäuren als Indikatoren des Vorhandenseins eines Organismus
Es ist im Allgemeinen wahr, dass das Vorhandensein von Mikroorganismen in einer biologischen Probe angezeigt wird, wenn die biologische Probe auch rRNA oder rDNA enthält, die für den Mikroorganismus charakteristisch ist. Somit ist das Vorhandensein einer bestimmten rRNA in einer biologischen Probe diagnostisch für das Vorhandensein eines Mikroorganismus, der diese rRNA produziert. Wenn eine Hybridisierungsreaktion ein positives Ergebnis mit einer Sonde, die für Gram⁽⁺⁾ Bakterien spezifisch ist, ergibt, würde dieses Ergebnis das Vorhandensein von einer oder mehreren Arten von Gram⁽⁺⁾ Bakterien in der biologischen Probe anzeigen. Im Gegensatz dazu würde ein negatives Ergebnis das Fehlen von Gram⁽⁺⁾ Bakterien anzeigen. Natürlich kann eine Reihe von positiven und negativen Kontrollhybridisierungen parallel durchgeführt werden, um die Richtigkeit der Testergebnisse zu bestätigen.
Molekulare phylogenetische Verwandtschaften zum Nachweis und zur Identifizierung von Mikroorganismen
Matrix-basierte Verfahren zum Identifizieren eines Mikroorganismus verwenden vorzugsweise Polynukleotidsonden, die Adressen entsprechen, die die ribosomalen Nukleinsäuren von Organismen gemäß bekannten molekularen phylogenetischen Verwandtschaften unterscheiden. Sonden, die zum Treffen dieser Unterscheidungen nützlich sind, werden hierin als „taxonomische Differentiatoren" bezeichnet. Es ist ein Ziel der Erfindung, einen optimalen Satz von Polynukleotidsonden zur Unterscheidung zwischen den molekularen phylogenetischen Divergenzpunkten, die ribosomale Nukleinsäuren von unterschiedlichen Arten und Gruppen von Mikroorganismen unterscheiden, zu verwenden.
Wenn eine Sondenmatrix unter Verwendung von Adressen, die über molekularen Taxonomie-Hierarchien verbunden sind, konstruiert wird, wird es möglich, die Eigenschaften von Mikroorganismen in klinisch relevanten Details basierend auf nur einer minimalen Anzahl von Hybridisierungssonden zu klassifizieren. Wiederum ist dieses Merkmal der Erfindung möglich, da sowohl positive als auch negative Hybridisierungsergebnisse im Kontext eines Sonden-Matrix-Hybridisierungsverfahrens bedeutsam sind.
Der Ausdruck „molekularen Taxonomie-Hierarchie" wird hierin verwendet, um auf Verwandtschaften zwischen Organismen auf dem Level des Reichs, der Abteilung, der Klasse, der Ordnung, der Familie, der Gattung, der Untergattung, der Art und des Stamms, die mittels verwandter Nukleinsäuresequenzen nachgewiesen werden können, Bezug zu nehmen. Z. B. kann eine bestimmte Bakterienart eine ribosomale Nukleinsäuresequenz besitzen, die eine einzigartige Domäne (die diagnostisch für diese Art wäre) und eine gemeinsame Domäne, die einer Gattung von Bakterien gemeinsam ist, einschließt. Diese hierarchische Verwandtschaft unter Adressen trägt zu der breiten Verwendbarkeit des sonden-matrix-basierten Verfahrens zur Identifikation von Mikroorganismen bei.
Bevorzugte Sondenmatrizen besitzen mindestens eine Adresse höherer Ordnung und eine Adresse niederer Ordnung. Andere bevorzugte Probenmatrizen schließen ferner mindestens eine Adresse mittlerer Ordnung ein. Noch andere bevorzugte Probenmatrizen schließen ferner sowohl mindestes eine Adresse mittlerer Ordnung als auch mindestens eine Adresse, die spezifisch für einen Organismus ist, der zu einem taxonomischen Reich gehört, das von dem Reich, das Organismen, die an einer Adresse höherer Ordnung identifizierbar sind, unterschiedlich ist, ein. Z. B. wäre ein Beispiel einer Adresse, die für einen Organismus in einem unterschiedlichen taxonomischen Reich spezifisch ist, eine Adresse für Organismen aus dem Reich Eukaryotae (das das Reich Fungi, das Reich Protoctista, das Reich Animalia und das Reich Plantae einschließt), wenn die Adresse höherer Ordnung in einer bestimmten Sondematrix pan-bakterielle Organismen (die Mitglieder des Reiches Procaryotae sind) identifiziert. Wenn die Adressen höherer, mittlerer und niederer Ordnung in einer Sondenmatrix bakterielle Organismen identifizieren, identifiziert eine vierte Adresse in bestimmten bevorzugten Matrizen Pilzorganismen.

Zahlreiche Probenmatrizen mit drei Adressen können hergestellt und gemäß den hierin beschriebenen Verfahren verwendet werden. Tabelle 3 liefert funktionale Beschreibungen von einigen Adressen, die in verschiedenen Probenmatrizen mit drei Adressen verwendet werden können. TABELLE 3 Funktionale Beschreibungen von beispielhaften Drei- Adressen-Matrizen

Adresse höherer Ordnung	Adresse mittlerer Ordnung	Adresse niederer Ordnung
identifiziert eine Sammlung von Organismen	identifiziert eine Untergruppe von Organismen, die an der Adresse höherer Ordnung identifiziert werden können	identifiziert eine Untergruppe von Organismen, die an der Adresse mittlerer Ordnung identifiziert werden können
Familie	Gattung	Untergattung
Gattung	Untergattung	Art
pan-bakteriell	bakterielle Familie	bakterielle Art

Tabelle 3 illustriert funktionale Beziehungen zwischen Adressen höherer Ordnung, mittlerer Ordnung und niederer Ordnung in einer Sammlung von Matrizen mit drei Adressen. Im Allgemeinen identifiziert die Adresse niederer Ordnung eine Untergruppe von Organismen, die an der Adresse mittlerer Ordnung identifiziert werden können, und die Adresse mittlerer Ordnung identifiziert eine Untergruppe von Organismen, die an der Adresse höherer Ordnung in der Sondenmatrix identifiziert werden können. Diese Beziehung würde eine Sondenmatrix charakterisieren, die Adressen für: (1) pan-bakterielle Organismen, (2) Organismen, die in die Gattung Staphylococcus fallen, und (3) die Art S. aureus besitzt. In einem anderen Beispiel kann die Adresse höherer Ordnung Organismen identifizieren, die zu einer taxonomischen Familie gehören, die Adresse mittlerer Ordnung kann Organismen identifizieren, die zu einer taxonomischen Gattung gehören, und die Adresse niederer Ordnung kann Organismen identifizieren, die zu einer Untergattung gehören. Dasselbe Muster von Beziehungen trifft auch für Adressen, die Organismen, die zu einer Gattung, einer Untergattung und einer bestimmten bakteriellen Art gehören, identifizieren, zu. Natürlich kann die Adresse höherer Ordnung Organismen von einem bestimmten Reich, wie z. B. dem Reich Procaryotae, das alle Bakterien umfasst, identifizieren. Tatsächlich sind Sondenmatrizen, die eine pan-bakterielle Adresse einschließen, in der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt.
Beispielhafte taxonomische Differentiatoren
Organismen, die an einer pan-bakteriellen Adresse positive Hybridisierungsergebnisse ergeben, schließen alle Bakterien ein, die an eine Gram⁽⁺⁾ Adresse, eine Actinomyceten Adresse, eine Adresse, die Bakterien in der Familie Enterobacteriaceae nachweist, eine Adresse, die Bakterien in der Gattung Staphylococcus nachweist, eine Adresse, die Campylobacter Arten nachweist oder bakterielle Artenadressen in der Matrix hybridisieren. Die pan-bakterielle Adresse hybridisiert keine Nukleinsäuren von Pilzorganismen.
Organismen, die positive Hybridisierungsergebnisse an einer pan-Pilz Adresse erzeugen, schließen Candida albicans und andere Pilzarten, nicht aber bakterielle Organismen, ein.
Die Unterscheidung zwischen Gram⁽⁺⁾ und Gram^(–) Bakterien kann auf einem von zwei Wegen erfolgen. Zum Einen kann ein positives Hybridisierungssignal an einer Adresse, die für Gram⁽⁺⁾ Bakterien spezifisch ist, anzeigen, dass ein Organismus ein Gram⁽⁺⁾ Bakterium, und nicht ein Gram^(–) Bakterium Bakterium ist. Zweitens kann ein positives Hybridisierungssignal an einer Adresse, die spezifisch für Gram^(–) Bakterien Bakterien ist, anzeigen, dass ein Organismus ein Gram^(–) Bakterium Bakterium und nicht ein Gram⁽⁺⁾ Bakterium ist. Wie in den Arbeitsbeispielen hierin veranschaulicht, wurde üblicherweise eine Adresse, die für Gram⁽⁺⁾ Bakterien spezifisch ist, verwendet, um diese Unterscheidung zu machen. Organismen, die an der Gram⁽⁺⁾ Adresse positive Hybridisierungsergebnisse ergeben, schließen die Actinomyceten, Bakterien, die der Gattung Staphylococcus zugerechnet werden, Bakterien der Gattung Enterococcus, aber nicht Bakterien der Familie Enterobacteriaceae ein.
Die Actinomyceten oder die „Hoch (G + C)" Untergruppe von Gram⁽⁺⁾ Bakterien sind eine besondere evolutionäre Linie innerhalb der Eubakterien. Die Actinomyceten weisen als Ergebnis einer charakteristisch hohen Mutationsrate sehr ungewöhnliche phänotypische Eigenschaften auf. Viele Mitglieder dieser Gruppe von Bakterien erzeugen Antibiotika und werden häufig im Erdboden gefunden. Actinomyceten-Bakterien sind für eine Reihe von wichtigen Tierkrankheiten, einschließlich Tuberkulose, Lepra, Diphtherie und Zahnfleischerkrankungen verantwortlich. Die Gattungen Corynebacterium und Mycobacterium sind Beispiele von Actinomyceten, die wichtige humane Pathogene sind. Immungeschwächte Individuen sind insbesondere gegenüber Infektionen durch Mycobacteria avium, Mycobacteria intracellulare und Mycobacteria scrofulaceum, die alle einzelne Arten der Actinomyceten sind, anfällig. Die Actinomyceten schließen ein: Corynebacterium aquaticum, Corynebacterium jeikieum, Corynebacterium xerosis, Micrococcus luteus, Propionibacterium acnes, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium terrae, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium simiae, Mycobacterium avium, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium smegatis, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium gastri, Mycobacterium xenopi, Mycobacterium marinum und Mycobacterium phlei.
Mitglieder der Gattungen, die zu der Familie Enterobacteriaceae gehören, gehören zu den pathogensten und am häufigsten gefundenen Organismen in der klinischen Mikrobiologie. Diese großen Gram^(–) Stäbchen verursachen viele Arten von menschlichen Infektionen, einschließlich Abszessen, Lungenentzündungen, Meningitis, bakteriellem Durchfall, Typhus, Blutvergiftung und Nahrungsmittelvergiftung. Da viele unterschiedliche Arten in dieser Familie ähnliche Symptome verursachen können, sind biochemische oder Nukleinsäure-Tests für die Identifikation, die Diagnose und Behandlung der Infektion entscheiden. Die Familie Enterobacteriaceae schließt ein: Citrobacter diversus, Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Enterobacter agglomerans, Enterobacter cloacae, Enterobacter fragilis, Enterobacter gergoviae, Escherichia coli, Escherichia fergusonii, Escherichia hermanii, Hafnia alvei, Klebsiella oxytoca, Klebsiella ozaenae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella rhinoscleromatis, Proteus mirabilis, Proteus penneri, Proteus vulgaris, Providencia alcalifaciens, Providencia rettgeri, Providencia stuartii, Salmonella enteritidis, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Shigella dysenteriae, Shigella sonnei, Yersinia enterocolitica, Yersinia intermedia, Yersinia pseudotuberculosis und Morganella morganii.
Bakterien, die Mitglieder der Gattung Enterococcus sind, sind Teil der normalen Flora des Gastrointestinaltrakts, können aber Infektionen des Harntrakts, von Wunden, Peritonitis, Blutvergiftung und Endokarditis verursachen. Diese Gattung wird in drei Gruppen unterteilt, die aus den folgenden Arten bestehen: Gruppe I, E. avium, E. pseudoavium, E. malodoratus und E. raffinosus; Gruppe II, E. faecalis, E. solitarius, E. gallinarium, E. faecium, E. casseliflavus und E. mundtii; Gruppe III, E. durans, E. hirae und E. faecalis (asac). Bis heute gab es nur ein Isolat von E. solitarius, dem Typenstamm der Art. Eine kürzlich nationale Studie von Enterococcen, die aus menschlichen Infektionen isoliert wurden, zeigte an, dass Isolate von E. faecalis und E. faecium 98% der Proben ausmachen (Facklam et al., 1985. Kapitel 16. Streptococci and aerococci, S. 154–175. In Lennette et al., (Hrg.) Manual of Clinical Microbiology, Vierte Auflage. American Society for Microbiology, Washington, D. C.). Bakterien, die unter die Gattung Enterococcus fallen, schließen ein: E. avium, E. pseudoavium, E. malodoratus, E. raffinosus, E. faecalis, E. solitarius, E. gallinarum, E. faecium, E. casseliflavus, E. mundtii, E. durans und E. hirae. Die Sonde, die in den hierin beschriebenen Verfahren verwendet wurde, wies spezifisch alle Arten von Enterococcus außer E. solitarius nach.
Die Gattung Staphylococcus wird in zwei Hauptgruppen unterteilt: Aureus und nicht-Aureus. S. aureus ist die Ursache von Infektionen des Weichgewebes sowie dem toxischen Schocksyndrom (TSS). Dieser Organismus kann durch ein positives Ergebnis in einem Koagulasetest von anderen Arten von Staphylokokken unterschieden werden (alle anderen Arten sind negativ). Die pathogenen Wirkungen von Staphylococcus sind hauptsächlich mit den Toxinen, die sie produzieren, verbunden. Das S. aureus Enterotoxin verursacht eine schnell ausbrechende Nahrungsmittelvergiftung, die zu Krämpfen und schwerem Erbrechen führen kann. Infektionen können häufig auf verunreinigtes Fleisch zurückgeführt werden, das nicht vollständig gegart wurde. Diese Mikroben sekretieren ebenfalls Leukocidin, ein Toxin, das weiße Blutzellen zerstört und zu der Bildung von Pickeln und Akne führt. Insbesondere wurde gefunden, dass S. aureus der Verursacher von solchen Erkrankungen wie Pneumonie, Meningitis, Furunkeln, Arthritis und Osteomyelitis (chronische Knocheninfektion) ist. Bakterien, die unter die Gattung Staphylococcus fallen, schließen ein: Staphylococcus aureus, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus delphi, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus simulans und Staphylococcus wameri.
Organismen, die als Campylobacter Arten klassifizierbar sind, sind Gram⁽⁺⁾ Bakterien, die 5–11% aller Durchfallerkrankungsfälle in den Vereinigten Staaten verursachen. Diese Organismen erreichen Zellbeweglichkeit durch polare Flagellen, die aus der geschwungenen stäbchenförmigen Zelle entspringen. Die am häufigsten isolierte Art von Campylobacter ist C. jejuni, ein Organismus, der gastrointestinale Infektionen verursacht. Menschen erwerben den Organismus häufig durch das Essen von rohem Hühnchen oder das Trinken von verunreinigter Milch und Wasser. Die Infektion führt gewöhnlich zu Fieber, Krämpfen und blutigen Durchfällen. Dieser Organismus kann ebenfalls eine Blutvergiftung in Menschen verursachen. Bakterien, die als Campylobacter Arten klassifizierbar sind, schließen ein: Campylobacter jejuni, Campylobacter coli und Campylobacter laridis.
Während Kriterien, wie z. B. Morphologie, Farbe und metabolische Erfordernisse verwendet werden können, um phylogenetische Verwandtschaften unter Organismen zu charakterisieren, wurde ein besonders nützlicher Satz von Beziehungen, die sich für die molekulare genetische Analyse anbieten, im Zuge der Entwicklung dieser Erfindung identifiziert. Diese Verhältnisse sind in den 1–3 illustriert.
Wie in 1 angezeigt, sind Polynukleotidsonden an „pan-bakteriellen" und „pan-Pilz" Adressen nützlich, um zu bestimmen, ob eine biologische Probe ribosomale Nukleinsäuren, die bakteriellen oder Pilz Ursprungs sind, enthält. Mikroorganismen der bakteriellen Abstammungslinie können an einer Adresse, die einer Polynukleotidsonde entspricht, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren von Gram⁽⁺⁾ Bakterien, aber nicht die ribosomalen Nukleinsäuren von Gram⁽⁺⁾ Bakterien hybridisiert, in Gram⁽⁺⁾ oder Gram⁽⁺⁾ unterteilt unterteilt werden. Interessanterweise ist bekannt, dass einige Bakterien innerhalb der Klasse von Gram⁽⁺⁾ Bakterien die Eigenschaft verloren haben, die ihnen die Fähigkeit verleiht, in dem Gram-Färbungsverfahren positiv gefärbt zu werden. Diese Bakterien würden fälschlicherweise mittels Färbung als Gram^(–) Bakterien klassifiziert, aber haben die molekularen phylogenetischen Eigenschaften von Gram⁽⁺⁾ Bakterien auf dem Level der Polynukleotidsequenz beibehalten. Ein besonders nützlicher taxonomischer Differentiator schließt die Unterteilung von Gram⁽⁺⁾ Bakterien in die „Niedrig (G + C)" und die „Hoch (G + C)" oder „Actinomyceten" Gruppen an einer Adresse ein, die Actinomyceten identifiziert. Es ist selbstverständlich, dass diese Kategorisierung von Bakterien sich auf den gesamten genomischen molaren Prozentsatz von Guanin und Cytosin (G + C) bezieht. 2 illustriert insbesondere, wie mehrere klinisch relevante Bakterien bis hinunter zum Gattungs- und sogar Art-Level typisiert werden können, nachdem sie als Mitglieder der Hoch (G + C) oder Niedrig (G + C) Gruppen von Gram⁽⁺⁾ Bakterien kategorisiert worden sind. Die Figur zeigt ebenfalls, wie Enterococcus Bakterien als Mitglieder der Niedrig (G + C) Gruppen von Gram⁽⁺⁾ Bakterien klassifiziert werden können. 3 zeigt ein Schema zur Unterklassifizierung von verschiedenen Arten von Gram^(–) Bakterien. Die Figur zeigt insbesondere, wie mehrere verschiedene bakterielle Arten, einschließlich E. coli, eine gemeinsame molekulare phylogenetische Verwandtschaft als Mitglieder der Gruppe der Enterobacteriaceae oder der „enterischen Bakterien" zeigen.
Pfeile, die in jeder der 1–3 auftauchen, zeigen phylogenetische Verwandtschaften an und begründen Wege zum Identifizieren von Mikroorganismen. Z. B. zeigt 2, dass S. aureus ein Bakterium ist, das ein Mitglied der Gattung Staphylococcus ist, und als ein Mitglied der Niedrig (G + C) Untergruppe von Gram⁽⁺⁾ Bakterien klassifiziert wird. Somit würde erwartet, dass rRNA von S. aureus mit: einer pan-bakteriellen Sonde, einer Sonde für Gram⁽⁺⁾ Bakterien, einer Sonde, die für die Gattung Staphylococcus spezifisch ist, und einer artspezifischen Sonde für S. aureus hybridisiert. Da dieses Bakterium ein Mitglied der Niedrig (G + C) Untergruppe von Gram⁽⁺⁾ Bakterien ist, wird mit einer Sonde, die spezifisch für die Hoch (G + C) Untergruppe von Gram⁽⁺⁾ Bakterien ist, keine Hybridisierung erwartet. Dementsprechend können die Beziehungen, die in den 1–3 dargestellt sind, verwendet werden, um Profile von positiven und negativen Hybridisierungen für ribosomale Nukleinsäuren an verschiedenen Adressen in einer Sondenmatrix vorherzusagen.
Somit bezieht sich ein Aspekt der vorliegenden Erfindung auf Verfahren zum Identifizieren von Mikroben, wobei Sammlungen von Adressen, die Hybridisierungssonden umfassen, die Bindungsspezifität für ribosomale Nukleinsäure-Zielsequenzen besitzen, Organismen basierend auf molekularer Phylogenese unterscheiden. Besonders bevorzugte Sonden, die in dem Verfahren verwendet werden können, können: (1) Bakterien von Pilzen unterscheiden, (2) Gram⁽⁺⁾ Bakterien von Gram^(–) Bakterien Bakterien unterscheiden, (3) die Hoch (G + C) Untergruppe von Gram⁽⁺⁾ Bakterien identifizieren, (4) Bakterien, die Mitglieder der Familie Enterobacteriaceae sind, identifizieren, (5) Bakterien, die als Enterokokken gruppiert werden, identifizieren, (6) Bakterien, die Mitglieder der Gattung Staphylococcus sind, identifizieren, (7) Bakterien, die Mitglieder der Gruppe Campylobacter sind, identifizieren, und (8) Identifikationen von E. coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa und Streptococcus pneumoniae auf dem Level der Art ermöglichen. Es ist selbstverständlich, dass eine positive Identifikation eines Mikroorganismus auf dem Level der Art durch ein positives Hybridisierungsergebnis mit einer artspezifischen Sonde angezeigt wird. Das trifft ebenfalls für die positive Identifikation von Mikroorganismen als Gram⁽⁺⁾ Bakterien zu. Gram^(–) Bakterien werden jedoch als Untergruppe von Bakterien identifiziert, die ribosomale Nukleinsäuren besitzen, die nicht an eine Sonde, die für Gram⁽⁺⁾ Bakterien spezifisch ist, hybridisieren. Dieser subtraktive Ansatz, um Gram^(–) Bakterien Bakterien zu identifizieren, ist sowohl einfach als auch sehr bequem, da die Gram^(–) Bakterien divergenter sind als die Gram⁽⁺⁾ Bakterien. Während es notwendig sein kann, mehrere verschiedene Sonden zu verwenden, um einen beträchtlichen Anteil der Gram^(–) Bakterien zu identifizieren, können Gram⁽⁺⁾ Bakterien unter Verwendung einer einzelnen Sonde identifiziert werden. Das Begrenzen der Anzahl von Sonden in einer Hybridisierungsreaktion reduziert gewöhnlich die Wahrscheinlichkeit für nicht erwünschte Kreuzhybridisierung. Nichtsdestotrotz kann eine Polynukleotidsonde, die für Gram^(–) Bakterien spezifisch ist, verwendet werden, um die ribosomalen Nukleinsäuren von Gram⁽⁺⁾ Bakterien von denen von Gram^(–) Bakterien zu unterscheiden.
Ein bevorzugter Satz von Adressen, der nützlich ist, um die matrix-basierte Klassifikation von Mikroorganismen durchzuführen, schließt ein: eine pan-bakterielle Adresse; eine pan-Pilz Adresse; eine Adresse zum Unterscheiden von Gram⁽⁺⁾und Gram^(–) Bakterien, und eine Adresse zum Identifizieren der Actinomyceten Untergruppe von Gram⁽⁺⁾ Bakterien. Eine Adresse für Bakterien in der Familie Enterobacteriaceae ist ferner für die Verwendung in Kombination mit dem vorangegangenen Satz von Adressen bevorzugt, da die zusätzliche Information, die durch diese Adresse geliefert wird, nützlich ist, um Gram^(–) Bakterien zu kategorisieren. Eine Adresse für Bakterien in der Gattung Enterococcus ist auf gleiche Art und Weise nützlich, um Einsicht in die Identität von Organismen, die unter die Kategorie von Niedrig (G + C) Gram⁽⁺⁾ Bakterien fallen, zu erhalten. Andere nützliche Adressen identifizieren Mitglieder der Gattung Staphylococcus und der Campylobacter Gruppe von Bakterien. Schließlich schließen Identifikationen auf dem Level der Art unter Verwendung des matrixbasierten Assays ein: eine artspezifische Adresse für E. coli (ein Gram^(–) Bakterium, das ein Mitglied der Familie Enterobacteriaceae ist), eine artspezifische Adresse für Staphylococcus aureus (ein Mitglied der Niedrig (G + C) Untergruppe von Gram⁽⁺⁾ Bakterien, das unter die Gattung Staphylococcus fällt), eine artspezifische Adresse für Candida albicans (ein Pilz), eine artspezifische Adresse für Pseudomonas aeruginosa (ein Gram^(–) Bakterium), und eine artspezifische Adresse für Streptococcus pneumoniae (ein Mitglied der Niedrig (G + C) Untergruppe von Gram⁽⁺⁾ Bakterien). Jede dieser Adressen kann durch eine oder mehrere Polynukleotidsonden, die auf einem bestimmten Locus in einer Testvorrichtung, wie z. B. jede der hierin beschriebenen, aufgebracht ist, repräsentiert werden.

Tabelle 4 präsentiert einige der besonders bevorzugten Sondenmatrizen mit drei Adressen, die Adressen höherer Ordnung, mittlerer Ordnung und niederer Ordnung einschließen. Die Einträge in der Tabelle illustrieren spezifisch einige der besonders bevorzugten Kombinationen von Adressen, die verwendet werden können, um aufgabenspezifische Sondenmatrizen zu erzeugen. Diese Matrizen besitzen ihren größten Nutzen in Fällen, in denen die Identität eines Organismus bereits grob bestimmt worden ist. Insbesondere sind die Sondenmatrizen, die in Tabelle 4 aufgelistet sind, für die weitere Charakterisierung von bakteriellen Organismen (Reihen 1–7) und Pilzorganismen (Reihe 8) nützlich. TABELLE 4 Beispielhafte Matrizen mit drei Adressen

Adresse höherer Ordnung	Adresse mittlerer Ordnung	Adresse niederer Ordnung
pan-bakteriell	Gram⁽⁺⁾	Actinomyceten
Gram⁽⁺⁾	Actinomyceten	Sonde für bakterielle Arten, die an der Actinomyceten Adresse nachgewiesen werden
pan-bakteriell	Gram⁽⁺⁾	Sonde für eine Bakterienart, die an der Gram⁽⁺⁾ Adresse nachgewiesen wird
pan-bakteriell	Familie Enterobacteria ceae	Sonde für eine bakterielle Art, die an der Enterobacteriaceae Adresse nachgewiesen wird
pan-bakteriell	Gattung Staphylococcus	Sonde für eine bakterielle Art, die an der Adresse für die Gattung Staphylococcus nachgewiesen wird
pan-bakteriell	Gattung Enterococcus	Sonde für eine bakterielle Art, die an der Adresse für die Gattung Enterococcus nachgewiesen wird
pan-bakteriell	Gattung Campylobacter	Sonde für eine bakterielle Art, die an der Adresse für die Gattung Campylobacter nachgewiesen wird
pan-Pilz	Gruppe Candida	Sonde für eine Pilzart, die an einer Adresse für die Candida Gruppe nachgewiesen wird

Ein klinisch wichtiger Teil der Actinomyceten Untergruppe von Gram⁽⁺⁾ Bakterien schließt die Organismen: Mycobacteria tuberculosis, Mycobacteria bovis, Mycobacteria bovis BCG und Mycobacteria africanum ein, die den Mycobacterium tuberculosis Komplex (TB Komplex) ausmachen. Diese Klassifikation wird spezifisch in 2 dargestellt. Organismen des TB Komplexes sind für signifikante Morbidität und Mortalität in Menschen verantwortlich. M. tuberculosis ist das häufigste TB Komplex Pathogen, das aus Menschen isoliert wird. M. bovis BCG kann von infizierten Tieren auf Menschen übertragen werden. M. africanum verursacht Lungentuberkulose im tropischen Afrika. Das U.S. Patent Nr. 5,906,917 , dessen Offenbarung hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist, lehrt zwei hochspezifische Hybridisierungssonden, die zur Identifizierung des TB Komplexes nützlich sind. Die erste Sonde hat die Sequenz GGTAGCGCTGAGACATATCCTCC (SEQ ID NO: 42) und kann in Zusammenhang mit Helferoligonukleotiden, die die Sequenzen CCGCTAACCACGACACTTTCTGTACTGCCTCTCAGCCG (SEQ ID NO: 43) und CACAACCCCGCACACACAACCCCTACCCGGTTACCC (SEC ID NO: 44) besitzen, verwendet werden. Die zweite Sonde hat die Sequenz CAGAACTCCACACCCCCGAAG (SEQ ID NO: 45) und kann in Zusammenhang mit Helferoligonukleotiden, die die Sequenzen TGATTCGTCACGGGCGCCCACACACGGGTACGGGAATATCAACCC (SEQ ID NO: 46) und CTACTACCAGCCGAAGTTCCCACGCAGCCC (SEQ ID NO: 47) und GGAGTTGATCGATCCGGTTTTGGGTGGTTAGTACCGC (SEQ ID NO: 48) und GGGGTACGGGCCGTGTGTGTGCTCGCTAGAGGCTTTTCTTGGC (SEQ ID NO: 49) besitzen, verwendet werden. Diese Sonden sind besonders zur Identifizierung von Untergruppen von Actinomyceten Bakterien in Sondenmatrizen bevorzugt. Insbesondere schließen besonders bevorzugte Sondenmatrizen Adressen für Gram⁽⁺⁾ Bakterien, Actinomyceten und den TB Komplex ein. Andere besonders bevorzugte Sondenmatrizen schließen Adressen für pan-bakterielle Organismen, Gram⁽⁺⁾ Bakterien und den TB Komplex ein. Die TB Komplex Adresse erlaubt die Identifikation von einer Untergruppe von Organismen, die positive Hybridisierungssignale an eine Adresse höherer Ordnung erzeugen können, wie z. B. pan-bakterielle, Gram⁽⁺⁾ und Actinomyceten Adressen.
Listeria monocytogenes ist ein Gram⁽⁺⁾ Bakterium, das kein Mitglied der Actinomyceten ist. Dieser Organismus ist hauptsächlich ein Bakterium im Erdreich, das über die Umwelt verteilt ist. Dieser Organismus, der in Wasserquellen, landwirtschaftlichen Produkten und Tieren gefunden worden ist, ist seit mehr als 50 Jahren als menschliches Pathogen erkannt worden. Es ist das ätiologische Agens von Listeriose, die Meningitis, Encephalitis, Blutvergiftung und Endokarditis in Menschen verursacht. U.S. Patent Nr. 6,028,187 , dessen Offenbarung hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist, lehrt eine hochspezifische Hybridisierungssonde, die zur Hybridisierung der ribosomalen Nukleinsäuren von Listeria monocytogenes verwendet werden kann. Diese Sonde besitzt die Sequenz CTGAGAATAGTTTTATGGGATTAGCTCC (SEQ ID NO: 50) und kann in Zusammenhang mit einem Helferoligonukleotid, das die Sequenz GGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAA (SEQ ID NO: 51) hat, verwendet werden. Diese Sonde ist nützlich, um Untergruppen von Gram⁽⁺⁾ Bakterien in Sondenmatrizen zu identifizieren. Besonders bevorzugte Sondenmatrizen, die nützlich sind, um Hybridisierungsverfahren durchzuführen, schließen Adressen für Gram⁽⁺⁾ Bakterien und Listeria monocytogenes ein. Andere besonders bevorzugte Sondenmatrizen schließen Adressen für pan-bakterielle Organismen, Gram⁽⁺⁾ Bakterien und Listeria monocytogenes ein. Die Listeria monocytogenes Adresse erlaubt die Identifikation einer Untergruppe von Organismen, die an Adressen höherer Ordnung, wie z. B. pan-bakteriellen und Gram⁽⁺⁾ Adressen, positive Hybridisierungssignale erzeugen.
Andere bevorzugte Adressen niederer Ordnung, die in Zusammenhang mit Adressen höherer und mittlerer Ordnung verwendet werden können, wie z. B. der pan-bakteriellen Adresse und der Gram⁽⁺⁾ Adresse, schließen eine Adresse für Staphylococcus aureus und eine Adresse für Streptococcus pneumoniae ein.
Eine E. coli Adresse kann als eine Adresse niederer Ordnung in Kombination mit Adressen für pan-bakterielle Organismen und einer Adresse für Bakterien in der Familie Enterobacteriaceae verwendet werden.
Eine Staphylococcus aureus Adresse kann als eine Adresse niederer Ordnung in Kombination mit Adressen für pan-bakterielle Organismen und einer Adresse für Bakterien in der Gattung Staphylococcus verwendet werden.
Bevorzugte Adressen, die zu jeder der oben beschriebenen Matrizen mit drei Adressen hinzugefügt werden können, schließen eine Adresse zum Identifizieren von pan-Pilz Organismen und eine Adresse zum Identifizieren bestimmter Arten von Pilzorganismen, wie z. B. Candida albicans, ein.
Zusätzlich zu den Sonden zur Identifizierung von pan-Pilz Organismen und der Hefeart Candida albicans wird eine andere Sonde als ein Bestandteil von Sondenmatrizen, die verwendet werden können, um Pilze zu klassifizieren, besonders bevorzugt. Insbesondere schließen bestimmte besonders bevorzugte Sondenmatrizen Polynukleotidsonden ein, die spezifische ribosomale Nukleinsäuren von einer Vielzahl von Candida Arten, einschließlich C. albicans. C. tropicalis, C. dubliniensis, C. viswanathii und C. parapsilosis hybridisieren, ohne andere Arten, wie z. B. C. krusei oder C. glabrata zu hybridisieren. Diese Hybridisierungsspezifität wird durch eine Sonde, die die Sequenz GCGTCAATAAAAGAACAACAACCGATCCC (SEQ ID NO: 55) besitzt, bereitgestellt. Diese Sonde kann in Zusammenhang mit Helferoligonukleotiden, die die Sequenzen TAGTCGGCATAGTTTATGGTTAAGAC (OMeT) (SEQ ID NO: 56) und CCCAGAACCCAAAGACTTTGATTTCTCGTAAGGTGCCGATT (SEQ ID NO: 57) besitzen, verwendet werden. Diese Polynukleotide werden als Bestandteile in Sondenmatrizen, die eine Adresse besitzen, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren von C. albicans, C. tropicalis, C. dubliniensis, C. viswanathii und C. parapsilosis hybridisiert, besonders bevorzugt. Bemerkenswerterweise würde diese Adresse mit Bezug auf die Kombination einer pan-Pilz Adresse und einer Adresse, die C. albicans identifiziert, als eine Adresse mittlerer Ordnung betrachtet. Somit schließt eine besonders bevorzugte Sondenmatrix mit drei Adressen, die mit den Erfordernissen und Richtlinien, die hierin beschrieben werden, in Einklang ist, ein: (1) eine pan-Pilz Adresse, die ribosomale Nukleinsäuren von einer Vielzahl von Pilzarten, aber keine Bakterienarten hybridisiert, (2) eine Adresse für die Candida Gruppe, die ribosomale Nukleinsäuren von einer Vielzahl von Candida Arten, einschließlich C. albicans, C. tropicalis, C. dubliniensis, C. viswanathii und C. parapsilosis hybridisiert, und (3) eine Candida albicans Adresse, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren von Candida albicans hybridisiert.
Alternative Hybridisierungssonden können als ein Bestandteil von Sondenmatrizen zur spezifischen Identifikation von ribosomalen Nukleinsäuren von Candida albicans verwendet werden. Z. B. kann eine Sonde, die die Sequenz CGGCCATAAAGACCTACCAAGCG (SEQ ID NO: 52) besitzt, im Zusammenhang mit Helferoligonukleotiden, die die Sequenzen CCAGTTCTAAGTTGATCGTTAAACGTGCCCCGGA (SEQ ID NO: 53) und TGTCTACAGCAGCATCCACCAGCAGTCCGTCGTG (SEQ ID NO: 54) besitzen, zur Hybridisierung von ribosomalen Nukleinsäuren von zahlreichen C. albicans Stämmen und C. dubliniensis zu hybridisieren, ohne wesentlich ribosomale Nukleinsäuren von C. tropicalis, C. viswanathii, C. glabrata, C. krusei oder C. parapsilosis zu hybridisieren. Diese Polynukleotide werden als Bestandteile in Sondenmatrizen, die eine Adresse einschließen, die spezifisch C. albicans und C. dubliniensis identifiziert, besonders bevorzugt.
Ein besonders nützliches Klassifizierungssystem, das die Vorteile von phylogenetischen Unterschieden zwischen Bakterien ausnutzt, wurde entwickelt, um die Identifikation von nicht pathogenen Staphylokokken Bakterien zu erlauben. Zuerst wurde eine Sonde für die Gattung Staphylococcus verwendet, um Organismen als Mitglieder der breiten Gattung von Staphylokokken Bakterien zu identifizieren. Eine artspezifische Sonde wurde unabhängig verwendet, um Staphylococcus aureus zu identifizieren. Ausgerüstet mit dem Wissen über das Hybridisierungsprofil dieser beiden Sonden ist es möglich, eine Gruppe von Bakterien, auf die hierin als „Staph-Not-Aureus" (SNA) Bezug genommen wird, eine klinisch relevante Identifikation von Bakterien, die eine der häufigsten Ursachen von falsch-positiven Blutkulturen sind, zu identifizieren. Während Staphylococcus aureus als ein „tatsächliches Pathogen" betrachtet wird, wenn es in einer Blutkultur nachgewiesen wird, werden Staphylokokken Bakterien, die von einer anderen Art als S. aureus sind, im Allgemeinen als verunreinigende Hautbakterien betrachtet, die unweigerlich während der Blutentnahme gesammelt wurden.
Somit können über die Bestimmung, ob Bakterien, die ribosomale Nukleinsäuren besitzen, die eine Sonde, die für die Gattung Staphylococcus spezifisch ist, ebenfalls eine S. aureus artspezifische Sonde hybridisieren, sehr nützliche Informationen über die Identität von Staphylokokken Bakterien abgeleitet werden. Jedes Bakterium, das rRNA oder rDNA besitzt, die die Sonde für die Gattung Staphylococcus hybridisiert, aber nicht die S. aureus artspezifische Sonde, wird als SNA klassifiziert. Wenn eine Blutkulturflasche SNA Bakterien enthält, zeigt dieses Ergebnis an, dass die Kultur wahrscheinlich eine falsch-positive Kultur ist, die mit Bakterien von einer Hautoberfläche, die zum Zeitpunkt der Blutentnahme nicht ausreichend frei von Mikroorganismen des Donors war, beimpft wurde. Das stellt ein einfaches Beispiel dafür dar, wie eine Sammlung von Hybridisierungssonden, die Spezifität für molekulare phylogenetische Verzweigungspunkte besitzen, verwendet werden kann, um Mikroorganismen als Mitglieder einer Gattung oder Art zu identifizieren.
Alternative Verfahren zur Unterscheidung zwischen pathogenen S. aureus und harmlosen Staphylokokken Bakterien von der Haut schließen das Durchführen eines Standard Koagulationstest ein. Während die meisten Kulturen von S. aureus koagulieren, zeigen Kulturen von harmlosen Staphylokokken Bakterien gewöhnlich diese Eigenschaft nicht. Diese harmlosen Staphylokokken Bakterien, die nicht koagulieren, werden als „coagulase-negative Staph" oder „CONS" bezeichnet. Die Fähigkeit, einen positiven Koagulasetest zu zeigen, variiert zwischen kommerziellen Tests für dieselbe Bakterienart. Somit können die Verfahren zur Identifizierung von Mikroorganismen, die hierin beschrieben werden, vorzugsweise einen Schritt zur Identifizierung von COLAS als Untergruppe von Staphylokokken Bakterien, die nicht eine S. aureus artspezifische Hybridisierungssonde hybridisieren, einschließen.
Eine Sondenmatrix zum Nachweis von ribosomalen Nukleinsäuren von nicht-aureus Staphylokokken schließt eine Adresse zum Nachweise von Bakterien, die Mitglieder der Gattung Staphylococcus sind, und eine Adresse zum Nachweise der Art S. aureus ein. Eine Adresse zum Hybridisieren ribosomaler Nukleinsäuren von pan-bakteriellen Organismen kann gegebenenfalls aus Bequemlichkeit eingeschlossen sein. Positive Hybridisierungsergebnisse an der pan-bakteriellen Adresse, der Staphylococcus Gattungsadresse und der S. aureus Adresse würden das Vorhandensein von S. aureus in der Testprobe anzeigen. Im Gegensatz dazu würde die Gegenwart von nicht-aureus Staphylokokken Bakterien („SNA") durch positive Hybridisierungsergebnisse an der pan-bakteriellen Adresse und der Staphylococcus Gattungsadresse, aber einem negativen Ergebnis an der S. aureus Adresse angezeigt. Natürlich kann die Nützlichkeit dieser Matrix ferner durch das Einschließen von Adressen für pan-Pilz Organismen und für die Art Candida albicans erweitert werden. In der Tat schließt eine besonders bevorzugte Sondenmatrix ein: (1) eine pan-bakterielle Adresse, (2) eine Adresse für Bakterien, die unter die Gattung Staphylococcus fallen, (3) eine Adresse für die Art Staphylococcus aureus und (4) eine Adresse für pan-Pilz Organismen. Gegebenenfalls kann eine zusätzliche Adresse für die Art Candida albicans eingeschlossen sein. In einer noch bevorzugteren Sondenmatrix sind einige dieser Adressen an einem oder mehreren gemeinsamen Orten kombiniert. Dieser letztere Aspekt der Erfindung wird als „Hybridisierungssonden-Multiplexing" bezeichnet.
Hybridisierungssonden-Multiplexing
Ein anderes Merkmal der Erfindung bezieht sich auf den „Multiplexing" Aspekt von Sonden-Hybridisierungsverfahren. Multiplexing bezieht sich auf eine Vielzahl von Nukleinsäuresonden, die physikalisch an einem einzigen Ort in einer Testvorrichtung kombiniert werden, so dass ein qualitativ positives Hybridisierungssignal an dem Ort anzeigt, dass eine der Sonden an ein Ziel hybridisiert ist, ohne anzuzeigen, welche der Vielzahl von Sonden hybridisiert ist. Da ein einzelner Ort in einer Testvorrichtung eine Vielzahl von Polynukleotid-Hybridisierungssonden aufnehmen kann, die zum Anzeigen des Vorhandenseins oder des Fehlens von einer oder mehreren ribosomalen Nukleinsäuresequenzen verwendet werden können, wird sowohl auf den physikalischen Ort als auch die Arten von Mikroorganismen, die durch ein positives Hybridisierungssignal an dem Ort identifiziert werden, hierin als „Adresse" Bezug genommen.
Während der Entwicklung der Erfindung wurde entdeckt, dass einige der Nukleinsäuresonden günstigerweise in derselben Hybridisierungsreaktion kombiniert werden konnten und Ergebnisse liefern, die nützlich sind, um zu bestimmen, ob eine oder mehrere verschiedene Arten von Mikroorganismen in der biologischen Probe vorhanden waren. Z. B. können Sonden, die spezifisch für Bakterien in der Familie Enterobacteriaceae und Bakterien in der Gattung Enterococcus sind, an einem ersten gemeinsamen Ort kombiniert werden, da die Einzigartigkeit des Hybridisierungsprofils für alle Mikroorganismen, die in der Sondenmatrix identifiziert werden können, durch diese Kombination nicht gefährdet wird. Auf gleiche Weise können Sonden, die für Bakterien, die unter die Gattung Staphylococcus und unter die Campylobacter Gruppe fallen, an einem zweiten gemeinsamen Ort kombiniert werden, ohne die Einzigartigkeit des Hybridisierungsprofils zu gefährden. Vorteilhafterweise wird es, wenn eine Sondenmatrix eine Vielzahl von Adressen, die als einzigartige Wege zur Identifizierung von verschiedenen Mikroorganismen dienen, möglich, gemischte Kulturen von Mikroorganismen nachzuweisen und aufzulösen.
Da negative Hybridisierungsergebnisse im Kontext eines Sonden-Matrix-Hybridisierungsverfahrens bedeutsam sind, können bestimmte Adressen an einem gemeinsamen Ort kombiniert werden, ohne die Fähigkeit, aus den Hybridisierungsergebnissen sehr nützliche Informationen zu entnehmen, zu gefährden. Dieser Punkt kann durch das Inbetrachtziehen einer Sondenmatrix veranschaulicht werden, die einschließt: (a) eine panbakterielle Adresse, (b) eine Adresse zum Nachweis von Gram⁽⁺⁾ Bakterien, (c) eine Adresse für die bakterielle Art Staphylococcus aureus, (d) eine Adresse für pan-Pilz Organismen, und (e) eine Adresse für die Pilzart Candida albicans. Ohne die Integrität der Information, die aus den Hybridisierungsergebnissen abgeleitet werden kann, zu gefährden, kann die Matrix unter Verwendung von vier Orten wie folgt konfiguriert werden: (1) pan-bakterielle Adresse, (2) pan-Pilz Adresse, (3) Gram⁽⁺⁾ Adresse, und (4) Artadressen für S. aureus und C. albicans. In diesem Beispiel können die zwei Artadressen kombiniert werden, da ein positive Hybridisierungsergebnis an dem gemeinsamen Ort notwendigerweise von einem positiven Ergebnis an entweder (1) der pan-bakteriellen Adresse und der Gram⁽⁺⁾ Adresse oder (2) der pan-Pilz Adresse begleitet wird. Das erstere Hybridisierungsergebnis zusammengenommen mit einem positiven Hybridisierungsergebnis an der Artadresse würde anzeigen, dass der Testorganismus das Bakterium S. aureus war. Im Gegensatz dazu würde das letztere Hybridisierungsergebnis anzeigen, dass der Organismus die Hefe C. albicans war. Das zeigt, wie der Artursprung einer ribosomalen Nukleinsäure von einem positiven Hybridisierungsergebnis an einer einzelnen Adresse, die mehr als eine Art von Organismen identifiziert, bestimmt werden kann.
In der Tat wird es auch bei der Verwendung von komplexen Matrizen bevorzugt, eine Sammlung von artspezifischen Sonden an einer einzelnen Adresse in der Matrix zu kombinieren. Eine bevorzugte Sammlung von Artensonden würde z. B. Sonden einschließen, die Spezifität für die rRNA von E. coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa und Streptococcus pneumoniae besitzen. Wiederum würden positive Hybridisierungsergebnisse an einer Matrixadresse, die dieser Sammlung von Artensonden entsprechen würde, einfach durch das Betrachten von Ergebnissen von anderen Adressen in der Matrix aufgelöst werden. Es ist jedoch wichtig, dass die Nukleinsäuren, die durch die artspezifischen Sonden, die an einer einzelnen Adresse in der Sondenmatrix aufgebracht sind, hybridisiert werden, voneinander durch identifizierende Informationen, die durch mindestens eine andere Adresse in der Sondenmatrix geliefert werden, unterscheidbar sind. Somit muss eine Adresse, die einer Sammlung von Sonden entspricht, die Spezifität für verschiedene mikrobielle Arten besitzt, jeweils einem einzigartigen Muster von Beziehungen höherer Ordnung zwischen den anderen Adressen entsprechen. Die Profile von positiven und negativen Hybridisierungsergebnissen an den verschiedenen Adressen in der Sondenmatrix können einfach unter Verwendung einer „Vergleichstabelle" aufgelöst werden.
Das Bestimmen, welche Sonden an demselben Ort in einer matrix-basierten Hybridisierungsreaktion kombiniert werden können, ist ein Fall von Routinepraxis. In der Tat kann basierend auf bekannten molekularen phylogenetischen Verwandtschaften, die einfach aus der wissenschaftlichen Literatur erhältlich sind, jedes Bakterium von Interesse ein Profil von erwarteten positiven und negativen Hybridisierungsergebnissen für jede einer Sammlung von Adressen in einer bestimmten Matrix zugewiesen bekommen. Jede Mikroorganismenart, die einer artspezifischen Hybridisierungssonde in der Matrix entspricht, muss durch ein einzigartiges Profil von positiven und negativen Hybridisierungsergebnissen identifizierbar sein, um diese Art eindeutig zu identifizieren.
Neben bestimmten Sonden, die vorzugsweise in Hybridisierungen verwendet werden, die an physikalisch verschiedenen Orten durchgeführt werden, können die verbleibenden Sonden in der Matrix in jeder Kombination gemischt werden, vorausgesetzt, dass die Sonden nicht an demselben Ort kombiniert werden, wenn eine solche Kombination zu einer Matrix führt, in der zwei verschiedene artspezifische Sonden sich durch ein gemeinsames Hybridisierungsprofil auszeichnen. Z. B. wäre es in einer Sondenmatrix, die Adressen für pan-bakterielle Organismen, Gram⁽⁺⁾ Bakterien, die Actinomyceten Untergruppe von Gram⁽⁺⁾ Bakterien und die Gattung Staphylococcus besitzt, nicht annehmbar, eine einzelne Adresse zu haben, die artspezifische Sonden für sowohl Staphylococcus aureus als auch Staphylococcus epidermidis repräsentiert, da die Hybridisierungsprofile für diese beiden Arten in der Matrix nicht unterscheidbar wären. Daher können, wenn eine Identifikation auf dem Level der Art gewünscht ist, Sonden an einer gemeinsamen Adresse kombiniert werden, solange das Profil von positiven und negativen Hybridisierungsergebnissen, das jeder Artidentifikation entspricht, von allen anderen Profilen in der Matrix unterscheidbar ist. Dasselbe trifft für phylogenetische Gruppierungen höherer Ordnung, einschließlich Gruppierungen auf dem Level der Gattung, zu.
Es sollte angemerkt werden, dass, sofern nicht unterscheidbare Marker für Hybridisierungssonden, die Nukleinsäuren von verschiedenen Arten von Organismen nachweisen, verwendet werden, ein positives Hybridisierungssignal an einer Adresse, die vielen Artensonden entspricht, nicht eindeutig identifiziert, welche der Artensonden für die Hybridisierung verantwortlich ist. In einem solchen Fall hängt die Auflösung bis auf den Level einer Hybridisierungssonde von der Interpretation des Ergebnisses im Kontext von anderen Ergebnissen an anderen Adressen in der Sondenmatrix ab.
Schließlich liefert der hierin beschriebene Multiplex Hybridisierungsansatz noch weitere Vorteile, weil die Komplexität der Instrumentalisierung, die benötigt wird, um den Assay durchzuführen, minimiert wird. Insbesondere erfordert das erfindungsgemäße Verfahren keinen komplizierten Laborapparat zum Durchführen des Protokolls oder zum Auslesen der Assayergebnisse. Das Verfahren passt in den klinischen Standardalgorithmus und die Standardgeräteplattform und erfordert somit keine teure Ausstattung, die für den Assay gedacht ist. Somit ist keine spezielle Instrumentenplattform zur Durchführung der hierin beschriebenen Sonden-Matrix-Hybridisierungsverfahren erforderlich.
Spezifische Beispiele von Hybridisierungssonden Multiplexing

Multiplexing in Sondenmatrizen liefert ein Mittel zum Entnehmen proportional großer Mengen von Hybridisierungsdaten aus einer relativ kleinen Anzahl von Loci. Ein Beispiel einer nützlichen Sondenmatrix, das die oben beschriebenen Adressen in einer Multiplex-Konfiguration mit vier Loci verwendet, besitzt die folgende Struktur:

Locus	Adresse
1	pan-bakteriell
2	pan-Pilz
3	Gram⁽⁺⁾ und Candida Gruppe (C. albicans/
	C. tropicalis/C. dubliniensis/C. viswanathii/
	C. parapsilosis)
4	Staphylococcus aureus und Candida albicans

Da jede unimikrobielle biologische Probe nicht gleichzeitig sowohl bakterielle als auch Pilzorganismen enthalten würde, folgt, dass entweder die bakteriellen oder Pilz-Adressen mittlerer und niederer Ordnung an dem dritten und vierten Loci ausgetauscht werden können, um eine Matrix zu ergeben, die die folgende Struktur besitzt:

Locus	Adresse
1	pan-bakteriell
2	pan-Pilz
3	Gram⁽⁺⁾ und Candida albicans
4	Staphylococcus aureus und Candida Gruppe
	(C. albicans/C. tropicalis/C. dubliniensis/C.
	viswanathii/C. parapsilosis)

Diese beiden Beispiele von Multiplex Hybridisierungssonden beschreiben bevorzugte Sondenmatrizen in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung. Diese Matrizen schließen drei Adressen, die spezifisch für ribosomale Nukleinsäuren von bakteriellen Organismen und drei Adressen, die spezifisch für ribosomale Nukleinsäuren von Pilzorganismen sind, ein. Die Adressen für jede der bakteriellen und Pilzunterteilungen stehen miteinander als Adressen höherer Ordnung, mittlerer Ordnung und niederer Ordnung in Beziehung. Diese Matrizen veranschaulichen ebenfalls besondere Beispiele, in denen Adressen höherer Ordnung für Organismen, die zu verschiedenen Reichen gehören, in derselben Sondenmatrix kombiniert sind. Schließlich erlaubt das Multiplexing der Adressen in diesen Matrizen die Konfiguration einer Vorrichtung, die sechs Adressen an nur vier Loci besitzt.
Chemische Struktur von Oligonukleotiden
Oligonukleotide, die zum Durchführen von Sonden-Matrix-Hybridisierungsverfahren nützlich sind, können mit chemischen Gruppen modifiziert werden, um ihre Leistung zu verbessern. Es ist somit selbstverständlich, dass Bezugnahmen auf „Oligonukleotidsonden" oder „Helferoligonukleotide" oder einfach „Oligonukleotide" oder „Sonden" Polymere von nativen Nukleotiden sowie Polymere, die mindestes ein Nukleotidanalog einschließen, umfassen.
Rückgrat-modifizierte Oligonukleotide, wie z. B. solche, die Phosphorthioat- oder Methylphosphonatgruppen besitzen, sind Beispiele von Analoga, die in Zusammenhang mit Oligonukleotiden der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Diese Modifikationen machen die Oligonukleotide gegenüber der nukleolytischen Aktivität von bestimmten Polymerasen oder Nukleaseenzymen resistent. Andere Analoga, die in die Strukturen der hierin offenbarten Oligonukleotide eingebaut werden können, schließen Peptidnukleinsäuren oder „PNAs" ein. Die PNAs sind Verbindungen, die Liganden umfassen, die anstelle an ein Phosphodiester-Rückgrat an ein Peptidrückgrat gebunden sind. Beispielhafte Liganden schließen entweder die vier natürlich auftretenden Haupt-DNA Basen (d. h. Thymin, Cytosin, Adenin oder Guanin) oder andere natürlich auftretende Nukleobasen (z. B. Inosin, Uracil, 5-Methylcytosin oder Thiouracil) oder artifizielle Basen (z. B. Bromthymin, Azaadenin oder Azaguanin, etc.) ein, die über einen geeigneten Linker an das Peptidrückgrat gebunden sind. Die PNAs sind in der Lage, komplementäre ssDNA und RNA Stränge zu binden. Verfahren zur Herstellung und Verwendung von PNAs werden in U.S. Patent Nr. 5,539,082 offenbart. Eine andere Art von Modifikation, die verwendet werden kann, um die Oligonukleotide, die die hierin beschriebenen Sequenzen besitzen, herzustellen, schließt die Verwendung von Nicht-Nukleotid-Linkern (z. B. Arnold, et al., „Non-Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes", U.S. Patent No. 6,031,091 , hierin durch Bezugnahme eingeschlossen) ein, die zwischen Nukleotiden in der Nukleinsäurekette eingebaut sind, und die nicht mit der Hybridisierung oder der Elongation eines Primers interferieren.
Beispiele von nützlichen Polynukleotidsonden
Polynukleotidsonden, die zum Identifizieren von Mikroben gemäß den hierin beschriebenen Verfahren nützlich sind, hybridisieren typischerweise rRNA oder rDNA von bestimmten Gruppen oder Arten von Mikroorganismen mit hoher Spezifität. Z. B. kann eine „pan-bakterielle" Sonde, die spezifisch die rRNA von allen oder nahezu allen bekannten Bakterienarten hybridisiert, ohne Pilzorganismen zu hybridisieren, verwendet werden, um zu bestimmen, ob eine biologische Probe Bakterien enthält. Auf gleiche Weise ist eine „pan-Pilz” Sonde, die spezifisch die rRNA von allen oder nahezu allen bekannten Pilzarten hybridisiert, ohne bakterielle rRNA zu hybridisieren, nützlich um zu bestimmen, ob eine rRNA Probe Pilze enthält. Tabelle 5 präsentiert Polynukleotidsequenzen von Sonden, die verwendet worden sind, um die Erfindung zu veranschaulichen. Natürlich wird der Durchschnittsfachmann erkennen, dass die Sonden, die in der Tabelle dargestellt sind, durch andere Sonden ersetzt werden können.
TABELLE 5
Die Sonden und Helfer, die in Tabelle 5 gezeigt sind, hybridisieren spezifisch die entsprechenden Ziel rRNAs, die in der Tabelle angegeben sind, und identifizieren so eine Sammlung von Organismen, die oben in Zusammenhang mit den beispielhaften taxonomischen Differentiatoren aufgelistet wurden.
Obwohl die erfindungsgemäßen Vorrichtungen und Verfahren unter Verwendung von bestimmten Oligonukleotidsonden veranschaulicht worden sind, ist selbstverständlich, dass diese durch andere Nukleinsäuresonden mit gleichermaßen guten Ergebnissen ersetzt werden können. Z. B. lehren Hogan et al., in U.S. Patent Nr. 5,541,308 eine Sammlung von Oligonukleotidsonden, die in Hybridisierungsassays verwendet werden können, um einen breiten phylogenetischen Querschnitt von Bakterien nachzuweisen. Diese Sammlung von Sonden könnte an einer pan-bakteriellen Adresse in einer alternativen Sondenmatrix verwendet werden. Eine alternative Hybridisierungssonde, die in Sondenmatrizen an einer Adresse zum Nachweis von ribosomalen Nukleinsäuren von pan-bakteriellen Organismen verwendet worden ist, besitzt die Sequenz GGAACTTACCCGACAAGGAATTTCGCTACCTTAGG (SEQ ID NO: 58) und kann in Zusammenhang mit Helferoligonukleotiden, die die Sequenzen ACCGTTATAGTTACGGCCGCCGTTTACCGGGGCTTC (SEQ ID NO: 59), GCCTGGCCATCATTACGCCATTCGTGCAGGTC (SEQ ID NO: 60) und GCCCAAATCGTTACGCCTTTCGTGCGGGTC (SEQ ID NO: 61) besitzen, verwendet werden. Diese Polynukleotide werden als Bestandteile in Sondenmatrizen, die eine Adresse besitzen, die pan-bakterielle Organismen identifiziert, besonders bevorzugt und können die pan-bakterielle Sonde, die in den Arbeitsbeispielen beschrieben wird, mit gleichermaßen guten Ergebnissen ersetzen. U.S. Patent Nr. 5,541,308 lehrt weiter Oligonukleotidsonden, die mit der rRNA von zahlreichen Pilzorganismen reagieren. Auf die gleiche Weise offenbaren Weisburg et al. in U.S. Patent Nr. 5,403,710 zwei „pan-generische" Sonden, die Nukleinsäuren von den meisten Pilzen hybridisieren. Jeder dieser letzteren Sätze von Sonden könnte in einer alternativen Sondenmatrix als eine pan-Pilz Adresse verwendet werden. U.S. Patent Nr. 5,635,348 offenbart die Sequenzen von Sonden, die nützlich sind, um Gram⁽⁺⁾ und Gram^(–) Bakterien zu identifizieren. Oligonukleotid-Hybridisierungssonden, die nützlich sind, um die Hoch (G + C) Untergruppe von Gram⁽⁺⁾ Bakterien zu identifizieren, werden von Roller et al. in J. Gen. Micro. 138: 1167 (1992) und in Microbiology 149: 2849 (1994) offenbart. Sheiness et al. lehren in U.S. Patent Nr. 5,776,694 eine Sonde, die Spezifität für Enterobacteriaceae besitzt. Hogan et al. offenbaren in U.S. Patent Nr. 5,674,684 Hybridisierungssonden, die Bindungsspezifität für die rRNAs von Enterokokken besitzen, und offenbaren und beanspruchen alternative Hybridisierungssonden, die Bindungsspezifität für die rRNAs von Campylobacter besitzen. Somit wird der Durchschnittsfachmann anerkennen, dass Nukleinsäuresonden neben denen, die spezifisch in Tabelle 5 beschrieben werden, verwendet werden können, um die hierin offenbarten matrixbasierten Hybridisierungsverfahren durchzuführen.
Wie in der vorangegangenen Tabelle angezeigt, können mehrere verschiedene artspezifische Sonden verwendet werden, um ein Sonden-Matrix-Hybridisierungsverfahren durchzuführen. Um die Erfindung zu veranschaulichen, wurden artspezifische Sonden zur Identifizierung von E. coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa und Streptococcus pneumoniae verwendet. Es ist dem Durchschnittsfachmann klar, dass zusätzliche zu dem Satz, der in den hierin detailliert beschriebenen Beispielen verwendet wurde, artspezifische Sonden hinzugefügt werden können oder diese ersetzen können. Natürlich unterliegt die Auswahl von artspezifischen Sonden der Voraussetzung, dass das Profil von positiven und negativen Hybridisierungsergebnissen an den verschiedenen Adressen in der Matrix einzigartig für jede artspezifische Sonde ist. Zwei Mikroorganismen, die durch verschiedene artspezifische Sonden repräsentiert werden, sollten nicht an allen anderen Adressen in der Matrix identische Hybridisierungsprofile besitzen, wenn eine Identifikation auf dem Level der Art gewünscht wird.
Nützliche Polynukleotid Markierungs-, Hybridisierungs- und Nachweissysteme
Es kann im Wesentlichen jedes Markierungs- und Nachweissystem, das zum Überwachen von spezifischer Nukleinsäurehybridisierung verwendet werden kann, in Zusammenhang mit den hierin offenbarten Sondenmatrizen verwendet werden. Eingeschlossen in der Sammlung von nützlichen Markern sind: Radiomarker, Enzyme, Haptene, verbundene Oligonukleotide, chemolumineszente Moleküle und redoxaktive Reste, die gegenüber elektronischen Nachweisverfahren empfänglich sind. Bevorzugte chemolumineszente Moleküle schließen Acridiniumester der Art, die von Arnold et al. in U.S. Patent Nr. 5,283, 174 für die Verwendung in Zusammenhang mit homogenen Schutzassays und der Art, wie sie von Woodhead et al. in U.S. Patent Nr. 5,656,207 für die Verwendung in Zusammenhang mit Assays, die multiple Ziele in einer einzelnen Reaktion quantifizieren, verwendet werden, ein. Bevorzugte elektronische Markierungs- und Nachweisansätze werden in U.S. Patent Nr. 5,591,578 und Nr. 5,770,369 und der veröffentlichten Internationalen Patentanmeldung WO 98/57158 offenbart. Redoxaktive Reste, die in der vorliegenden Erfindung als Marker nützlich sind, schließen Übergangsmetalle, wie z. B. Cd, Mg, Cu, Co, Pd, Zn, Fe und Ru ein.
Es sollte offensichtlich sein, dass die Sondenmatrizen, die gemäß den hierin beschriebenen Verfahren hergestellt sind, nicht-zufällige Sequenzen besitzen, die unter Verwendung von analytischen Techniken, die auf molekularer phylogenetischer Analyse basieren, ausgewählt wurden. Sonden der Erfindung besitzen vorzugsweise Längen von 14 bis 45 Nukleotiden oder bevorzugter zwischen 16 und 30 Nukleotiden, aber können bis zu 100 Nukleotiden lang sein. Helferoligonukleotide haben vorzugsweise ähnliche Längen. Die Tatsache, dass die erfindungsgemäßen Sondenmatrizen nicht-zufällige Sequenzen besitzen, steht im Gegensatz zu den kurzen, zufälligen Oligonukleotidsequenzen, die in Arrays hoher Dichte auf „DNA Mikrochips" der Art, wie sie für das Durchführen von Gen-Expressionsstudien verwendet werden (Science 282: 396 (1998)), aufgebracht sind.
Bedingungen hoher Stringenz, die nützlich sind, um die hierin offenbarten Hybridisierungsverfahren durchzuführen, schließen Bedingungen von 55–65°C ein, wenn die Salzkonzentration im Bereich von 0,6–0,9 M liegt. Bevorzugte Salze schließen Lithiumchlorid ein, aber andere Salze, wie z. B. Natriumchlorid und Natriumcitrat können ebenfalls in der Hybridisierungslösung verwendet werden. Andere nützliche Hybridisierungsbedingungen hoher Stringenz werden alternativ durch 0,48 M Natriumphosphatpuffer, 0,1% Natriumdodecylsulfat und jeweils 1 mM EDTA und EGTA, oder durch 0,6 M LiCl, 1% Lithiumlaurylsulfat, 60 mM Lithiumsuccinat und jeweils 10 mM EDTA und EGTA bereitgestellt. Es wird bevorzugt, dass alle Sonden, die in einer Sondenmatrix verwendet werden, Tm-Werte besitzen, die innerhalb von 15°C voneinander liegen. Es wird ferner bevorzugt, dass alle Sonden, die in einer Sondenmatrix verwendet werden, die für die Hybridisierung bei ungefähr 60°C optimiert ist, Tm-Werte im Bereich von 63°C bis ungefähr 78°C besitzen.
Bemerkenswerterweise wurden Verfahren, die für die Freisetzung der Nukleinsäuren, die den hierin offenbarten Hybridisierungsverfahren unterzogen werden können, aus Mikroorganismen geeignet sind, von Clark et al. in U.S. Patent Nr. 5,837,452 und von Kacian et al. in U.S. Patent Nr. 5,364,763 beschrieben.
Für das Durchführen von Hybridisierungsreaktionen nützliche Apparatur
Das matrix-basierte Verfahren zum Identifizieren von Mikroorganismen kann unter Verwendung von jedem von mehreren verschiedenen Arten von Testformaten durchgeführt werden. Beispiele von Formaten, die verwendet werden können, um die Hybridisierung durchzuführen, schließen ein, aber sind keineswegs begrenzt auf: einzelne Röhrchen, wobei eine oder mehrere Sonden physikalisch von anderen Sonden oder Sammlungen von Sonden, die in anderen Röhrchen enthalten sind, isoliert werden können; die Vertiefungen einer 96-Well oder anderen Multi-Well-Mikrotiterplatte; und ein fester Träger, wie z. B. ein Teststäbchen oder ein „DNA-Chip", wobei auf dem Träger an verschiedenen Adressen Polynukleotidsonden in einer Konfiguration mit Abstand zueinander immobilisiert sind.
Die Identifizierung von Mikroorganismen mittels des erfindungsgemäßen Nukleinsäuretestsystems kann vorzugsweise durchgeführt werden, ohne einen in vitro Amplifizierungsschritt zu erfordern. Es wird angenommen, dass alternative Identifizierungssysteme für Mikroorganismen, die einen vorangehenden Amplifizierungsschritt verwenden, z. B. unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), für falsch-positiven Ergebnissen, die aus Umgebungsverunreinigung stammen, empfänglich sind. Diese falsch-positiven Ergebnisse können aufgrund von falschen Probeentnahmetechniken im klinischen Labor, dem Übertrag einer Kontamination aus Amplifizierungsreaktionen, die hohe Konzentrationen an Amplicons besitzen, oder durch die Kontamination von Laborreagenzien, die für die Prozessierung der Proben oder die Nukleinsäureamplifizierung verwendet werden, auftreten. Alle diese Schwierigkeiten können vermieden werden, wenn Polynukleotide aus einer biologischen Probe dem Sonden-Matrix-Hybridisierungsverfahren unterzogen werden, ohne zuerst einen in vitro Amplifizierungsschritt zu durchlaufen.
Gemäß einem Ansatz zum Durchführen der matrixbasierten Hybridisierungsverfahren können die Sonden mit unterscheidbaren Markern markiert sein. Beispiele von besonders bevorzugten Chemolumineszenzmarkern, die verwendet werden können, um die hierin beschriebenen Verfahren durchzuführen, sind die Acridiniumester(AE)-Marker, die von Woodhead et al., in U.S. Patent Nr. 5,756,011 offenbart werden. Insbesondere kann eine Einzeladresse verschiedene Sonden einschließen, die unabhängig mit Chemolumineszenzmarkern markiert sind, die die höchsten Energien zu verschiedenen Zeiten nach der Erzeugung einer Lichtemission emittieren. Materialien und Verfahren, die verwendet werden können, um unterscheidbare Sonden, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung nützlich sind, herzustellen und zu verwenden, können in U.S. Patent Nr. 5,756,011 gefunden werden. Fluoreszenz-Marker, die nach Exzitation Licht verschiedener Wellenlängen erzeugen, stellen noch andere Beispiele von unterscheidbaren Markern dar, die in Zusammenhang mit den hierin beschriebenen Verfahren verwendet werden können. Auf diese Weise können zwei Sonden, die unterscheidbare Marker verwenden, voneinander unterschieden werden, obwohl sie an demselben Ort einer Testvorrichtung kombiniert sind. Dementsprechend ist es möglich, eine große Anzahl von verschiedenen Sonden an einer einzelnen Adresse zu kombinieren, und dennoch in der Lage zu sein, die Ergebnisse der Hybridisierung für die verschiedenen Sonden oder Sätze von Sonden zu unterscheiden.
Kits zum Durchführen von Sonden-Matrix-Hybridisierungsverfahren
Die Materialien, die zum Durchführen der Sonden-Matrix-Hybridisierungsverfahren verwendet werden, können in Kits, die zum Durchführen der diagnostischen Verfahren verwendet werden können, eingeschlossen werden. Die Kits schließen mindestens eine Vorrichtung, die eine Vielzahl von Sonden zur Hybridisierung von Nukleinsäuren von Testorganismen beinhaltet, und Anweisungen zur Durchführung eines Nukleinsäure-Hybridisierungsverfahrens unter Verwendung der Vorrichtung ein. Die Vorrichtung schließt eine Vielzahl von Adressen höherer und niederer Ordnung, im Wesentlichen wie hierin offenbart, zum Hybridisieren von ribosomalen Nukleinsäuren von Mikroorganismen, die dem Test unterzogen werden, ein. Diese Adressen können den hierin spezifisch offenbarten Adressen entsprechen, können aber auch andere Adressen einschließen, solange die Beziehung zwischen Adressen höherer, mittlerer und niederer Ordnung beibehalten wird. Die Kits können gegebenenfalls Anweisungen zum Nachweis von spezifischen Hybriden zwischen Sonden, die die verschiedenen Adressen umfassen, und ribosomalen Ziel-Nukleinsäuren, die aus biologischen Proben erhalten wurden, die dem Test mit der Vorrichtung unterzogen werden, enthalten. Die Anweisungen können entweder gedruckte Anweisungen oder Anweisungen, die auf einem computerlesbaren Medium, wie z. B. einer magnetischen oder optischen Diskette, gespeichert sind, sein.
Analytische Vorrichtungen zur Interpretation der Hybridisierungsergebnisse
Die Ergebnisse von Sonden-Matrix-Hybridisierungsverfahren können manuell oder mit der Hilfe eines Computers oder Datenprozessors („Prozessors") interpretiert oder analysiert werden. Die Ergebnisse des Hybridisierungsverfahrens können über eine Anwenderschnittstelle, wie z. B. eine Tastatur, in den Prozessor eingegeben werden oder direkt aus einer automatisierten Vorrichtung, wie z. B. einem Plattenausleser, Filmscanner oder Luminometer, über eine Maschinen-Schnittstelle eingegeben werden. Der Prozessor kann dann die positiven und negativen Hybridisierungsergebnisse sortieren, um ein Profil zu erstellen. Dieses Profil wird dann mit einer Vergleichstabelle, die in einer Speichervorrichtung, die mit dem Computer verbunden ist, gespeichert ist, verglichen. Die Vergleichstabelle bringt verschiedene Profile von Hybridisierungsergebnissen mit verschiedenen Mikroorganismenidentitäten in Verbindung. Auf diesem Weg kann ein Hybridisierungsprofil, das unter Verwendung der Sondenmatrix bestimmt wurde, mit der Identität oder in Fällen von mehrdeutigen Ergebnissen, die charakteristisch für mehr als einen Organismus sind Kandidatenidentität des Organismus, der die Quelle der Nukleinsäuren, die verwendet wurden, um das Hybridisierungsverfahren durchzuführen, war, in Verbindung gebracht werden.
Wie angegeben, schließen automatisierte Vorrichtungen, die zum Analysieren der Ergebnisse von Sonden-Matrix-Hybridisierungsverfahren nützlich sind, eine Speichereinheit ein, in der eine Vergleichstabelle gespeichert ist, die die Identitäten von Mikroorganismen mit positiven und negativen Hybridisierungsergebnissen an einer Reihe von unterschiedlichen Adressen in einer Sondenmatrix korreliert. Adressen, die beim Durchführen der Erfindung besonders nützlich sind, schließen ein: (a) eine Adresse, die die ribosomalen Nukleinsäuren von pan-bakteriellen Organismen, aber nicht pan-Pilz Organismen nachweist; (b) eine Adresse, die ribosomale Nukleinsäuren von pan-Pilz Organismen, aber nicht pan-bakteriellen Organismen nachweist; (c) eine Adresse, die die ribosomalen Nukleinsäuren von Gram⁽⁺⁾ Bakterien und die ribosomalen Nukleinsäuren von Gram^(–) Bakterien unterscheidet; und (d) eine Adresse, die ribosomale Nukleinsäuren von der Aktinomyceten Untergruppe von Gram⁽⁺⁾ Bakterien nachweist. Typische Speichereinheiten schließen Festplatten und Diskettenlaufwerke, die magnetische Speichermedien umfassen, ein. Eine automatisierte Vorrichtung, die für die Interpretation der Ergebnisse von Sonden-Matrix-Hybridisierungsverfahren verwendet worden ist, verwendete eine interne Computer-Festplatte als Speichervorrichtung, die als Aufbewahrungsort für die Vergleichstabelle diente.
Es ist selbstverständlich, dass ein positives Hybridisierungsergebnis an einer bestimmten Adresse in der Sondenmatrix nicht notwendigerweise anzeigt, dass die Zielnukleinsäure genau das Komplementär der Sequenz enthält, die als Sonde verwendet wurde. Z. B. kann es sein, dass eine bestimmt Sonde trotz des Vorhandenseins von einer oder einer kleinen Anzahl von Fehlpaarung(en) zwischen der Sonde und den rRNA Zielsequenzen die rRNA von im Wesentlichen allen Bakterienarten hybridisiert. Das zeigt, wie ein positives Ergebnis an einer bestimmten Adresse „diagnostisch" für eine Klasse von Organismen sein könnte, obwohl die Sondensequenz nicht notwendigerweise in den Genomen dieser Klasse von Organismen vorhanden ist. Wie hierin verwendet, bedeutet „diagnostisch", dass für ein positives Hybridisierungssignal gesagt werden kann, dass ein hybridisierendes Polynukleotid einen bestimmten Ursprungs besitzt. Bedeutsamerweise ist, obwohl ein positives Hybridisierungssignal, das aus einer genauen Übereinstimmung zwischen einer Sonde und einem Ziel resultiert, ein positives Ergebnis an einer entsprechenden Adresse ergeben würde, der entgegengesetzte Fall nicht notwendigerweise wahr. Insbesondere beweist ein positives Hybridisierungssignal an einer Adresse nicht notwendigerweise, dass das Zielpolynukleotid eine Sequenz enthält, die perfekt oder vollständig zu der Sonde komplementär ist.
Automatisierte Vorrichtungen, die zum Analysieren der ribosomalen Nukleinsäuren eines Mikroorganismus nützlich sind, schließen ebenfalls einen Prozessor ein, der mit der Speichereinheit verbunden ist. Teilweise wird der Prozessor zum Ausführen eines Algorithmus verwendet, der das Profil der Hybridisierungsdaten mit den Identitäten von Organismen, die ribosomale Nukleinsäuresequenzen besitzen, die zu den Hybridisierungsergebnissen geführt haben könnten, korreliert. Der Prozessor kann ebenfalls eine quantitative Analyse durchführen, um eine Basis dafür zu liefern, um zu bestimmen, ob ein numerisches Ergebnis aus einem Hybridisierungsverfahren positiv oder negativ ist. Während es verschiedene Ansätze gibt, denen gefolgt werden kann, um diese Bestimmung durchzuführen, nutzt ein bevorzugter Ansatz den Vorteil des „Teil-Ganz" Verhältnisses unter Sonden, die Teil der Matrix sind, aus. Z. B. würde ein positives Ergebnis angezeigt, wenn der Hybridisierungswert größer als ein unterer Schwellenwert ist und mindestens mehrfach größer ist als der negative Kontroll-Hybridisierungswert. Wenn erst einmal jedes Hybridisierungssignal als entweder positiv oder negativ bestimmt worden ist, kann die Sammlung von Ergebnissen als ein Profil, ein Wert oder eine „Folge" zusammengestellt werden, das/der/die mit der Vergleichstabelle, die in der Speichereinheit gespeichert ist, verglichen werden kann. Eine beispielhafte Folge von Ergebnissen für eine Sondenmatrix mit vier Adressen würde (1011) oder (+/–/+/+) sein, wobei „1" oder „+" positive Hybridisierungsergebnisse darstellt und „0" oder „–" negative Hybridisierungsergebnisse darstellt.

Kommerziell erhältliche Tabellenkalkulations-Computersoftware kann einfach angepasst werden, um den Vergleichsalgorithmus auszuführen. Z. B. wurde speziell das EXCEL Tabellenkalkulationsprogramm, das von Microsoft Corp. (Redmond, WA) verkauft wird, zur Erzeugung einer beispielhaften automatisierten Vorrichtung zur Analyse von Sonden-Matrix-Hybridisierungsergebnissen verwendet. Ein Teil einer Vergleichstabelle, die in der beispielhaften Vorrichtung enthalten ist, besaß die folgende Struktur:

Adresse							Ausgabe
1	2	3	4	5	6	7
+	–	+	–	+	–	–	Enterococcus
+	–	+	–	–	+	+	Staphylococcus aureus
+	–	+	–	–	+	–	Staphylococcus außer S. aureus
							(„SNA")
+	–	+	–	–	–	+	Streptococcus pneumoniae
+	–	+	–	–	–	–	Gram⁽⁺⁾ Bakterien; nicht die
							Actinomyceten Untergruppe von
							Gram⁽⁺⁾ Bakterien, nicht
							Enterococcus, nicht ein
							Mitglied der Gattung
							Staphylococcus und nicht
							Streptococcus pneumoniae

Gegebenenfalls liefert ein Ergebnis, das von der analytischen Einheit ausgegeben wird, eine Liste von Kandidaten-Organismen, die einem Ergebnis aus der Vergleichstabelle entspricht. Z. B. könnte ein Computer-Algorithmus zur Identifizierung von Kandidaten-Organismen dem Anwender der Vorrichtung einen Hyperlink zum Ansehen einer Liste von Kandidaten-Organismen anbieten. In diesem Beispiel könnte der Eintrag, der (+/–/+/–/+/–/–) entspricht, mit einem Hyperlink verbunden sein, der Kandidaten- Organismen identifiziert als: Enterococcus casseliflavus, Enterococcus durans, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarum, Enterococcus hirae und Enterococcus mundtii. Diese Liste von Kandidaten-Organismen ist aus der Information, die in Tabelle 6 enthalten ist, abgeleitet.
Ausgabeeinheiten, die mit der automatisierten Analyseeinheit verwendet werden können, schließen solche ein, die entweder vorübergehende oder permanente Ausgaben erzeugen. Vorübergehende Ausgabe schließen solche ein, die auf visuellen Anzeigetafeln oder Bildschirmen erscheinen. Permanente Ausgabe schließen gedruckte Unterlagen, wie z. B. solche ein, die durch einen Drucker, der mit einem Prozessor verbunden ist, erzeugt werden. Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass jede dieser Arten von Ausgabeeinheiten mit dem Prozessor verbunden werden kann, so dass die Ergebnisse des Vergleichs zwischen den in den Prozessor eingegebenen Ergebnissen und der in der Speichereinheit gespeicherten Vergleichstabelle dem Anwender oder Betreiber der automatisierten Vorrichtung geliefert werden können.
Spezifische Beispiele von Sondenmatrizen
Es wurde gefunden, dass eine Version der Sondenmatrix zur Identifizierung einer großen Breite von Mikroorganismen, einschließlich denen, die am häufigsten für eine Bakterämie oder Blutvergiftung verantwortlich sind, besonders nützlich ist. Eine Bakterämie ist das Vorhandensein von Bakterien im Blutkreislauf, wie es nach vielen kleineren operativen Eingriffen für einige Stunden auftreten kann. Eine Blutvergiftung ist die schnelle Vermehrung von Bakterien und zeichnet sich durch das Vorhandensein von bakteriellen Toxinen im Blut aus. Eine Blutvergiftung ist immer eine ernste, lebensbedrohliche Erkrankung. Wie oben angegeben, schließt die typische klinische Laborpraxis, die für den Nachweis und die Identifizierung von Organismen, die eine dieser Erkrankungen verursachen, verwendet wird, das Beimpfen einer sterilen Blutkulturflasche mit einer kleinen Menge von Patientenblut ein, um Mikroorganismen, die sich in dem Blut befinden, zu vermehren. Das Verfahren beginnt damit, dass ein Phlebologe die Hautfläche, die zur Entnahme von venösem Blut punktiert wird, gründlich reinigt. Dieses Verfahren kann das Abwischen des Bereichs mit Alkohol und einer iod-haltigen Lösung einschließen. Beispiele von automatisierten Systemen, die verwendet werden können, um das Wachstum von Mikroorganismen in den Blutflaschen zu überwachen, schließen das BACTEC 9240 (Becton Dickinson, Sparks, MD), das BACT/ALERT (Organon TEknika, Durham, NC) und ESP (Difco, Detroit, MI) ein. Nach einem Zeitraum von mehreren Stunden bis Tagen werden Flaschen, die Kohlendioxid produzieren, durch ein automatisiertes Überwachungssystem identifiziert, die Flaschen werden geöffnet und die Organismen, die in den Flaschen enthalten sind, werden einer Gram-Färbung, einem metabolischen Standardtest für die Wachstumserfordernisse oder die Fähigkeit, bestimmte nachweisbare Substrate abzubauen, unterzogen. Einige Organismen, die nur kleine Mengen von Kohlendioxid erzeugen, erfordern fünf Tage Kultur, bevor sie ein positives Signal auslösen. Oft werden falsch-positive Ergebnisse erhalten, wenn verunreinigende Hautbakterien in die Blutflasche eingebracht werden, oder wenn die Patientenblutprobe eine ausreichend hohe Anzahl von respirierenden weißen Blutzellen enthält. Vorangegangene Untersuchungen von Bakterämie und Blutvergiftung schlossen, dass nur ungefähr 20 Mikroorganismenarten 95% der Isolate aus Blutflaschen ausmachen. Es sollte somit klar sein, dass es unnötig ist, die Möglichkeit zu besitzen, die Arten von allen bekannten Bakterienarten und Pilzarten zu bestimmen, um einen besonders nützlichen Testapparat zu erzeugen, der klinisch relevante Informationen liefert.
Beispiel 1 beschreibt Verfahren, die verwendet wurden, um den Mechanismus, der dem Sondenmatrixansatz zur Identifizierung von Mikroorganismen zugrunde liegt, zu demonstrieren. In diesem Beispiel wurden Hybridisierungsreaktionen unter Verwendung einer Sammlung von gereinigten rRNAs oder polynukleotidenthaltenden Lysaten, die von Kontroll-Mikroorganismen, die bekannte Identitäten besaßen, erhalten wurden, durchgeführt.
Beispiel 1
Identifikation von Kontroll-Mikroorganismen unter Verwendung einer Sonden-Matrix-Hybridisierung
Jedes von sieben getrennten Hybridisierungs-Gefäßen (entweder Röhrchen oder Mikrotiter-Wells) erhielt eine Sammlung von AE-markierten Sonden und nicht-markierten Helfer-Oligonukleotiden, wie in Tabelle 5 angegeben. Jede der Sonden war für die rRNA einer Art von Organismus oder einer bestimmte Gruppe von Organismen spezifisch. In diesem Verfahren wurden Acridiniumester-markierte Sonden, die die Sequenzen, die in Tabelle 5 angegeben sind, besaßen, unter Verwendung der folgenden Adressen verwendet: (1) pan-bakteriell; (2) pan-Pilz; (3) Gram⁽⁺⁾; (4) Actinomyceten Untergruppe von Gram⁽⁺⁾; (5) die Familie Enterobacteriaceae und die Gruppe Enterococcus; (6) die Gattung Staphylococcus und die Campylobacter Gruppe; und (7) artspezifische Sonden für E. coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa und Streptococcus pneumoniae. Jede Adresse schloss ungefähr 0,1 pmol der jeweiligen AE-markierten Sonde und ungefähr 10 pmol des jeweiligen Helfer-Oligonukleotids ein. Es wurde entweder ungefähr 1,0–100 fmol gereinigter rRNA oder eine Menge von Lysat, die eine äquivalente Menge von rRNA von kultivierten Bakterien, die von der American Type Culture Collection (ATTC) oder von unserem Laborvorrat an Organismen erhalten wurde, enthielt zu der Mischung der Sonden für jede Adresse in der Matrix gegeben. Nach der Hybridisierung der Mischungen unter Bedingungen hoher Stringenz wurde der Marker, der an nicht hybridisierte Sonde gebunden war, inaktiviert und die spezifisch hybridisierte Sonde durch Luminometrie im Wesentlichen gemäß dem Verfahren, das von Arnold et al., in U.S. Patent Nr. 5,283,174 , dessen Offenbarung hierin durch Bezugnahme oben eingeschlossen worden ist, angegeben ist, quantifiziert.
Die qualitativen Ergebnisse, die in Tabelle 6 präsentiert sind, zeigen, wie eine große Anzahl von verschiedenen Mikroben unter Verwendung einer einzigen Sondenmatrix typisiert werden kann. Adressen, die quantitative Hybridisierungssignale ergaben, die mindestens 2-fach größer als Hintergrundsignale, die in negativen Kontrollreaktionen nachgewiesen wurden, waren, wurden als positive Hybridisierungsergebnisse darstellend eingestuft. Hinterlegte Einträge in Tabelle 6 repräsentieren positive Hybridisierungsergebnisse an den angezeigten Adressen. Tabelle 6 Qualitative Hybridisierungsergebnisse

*"GP#" identifiziert Organismen über Master log Nummern für Gen-Probe Incorporated.

Die Ergebnisse, die in Tabelle 6 präsentiert werden, bestätigten, dass das Hybridisierungsverfahren das erwartete Muster von Ergebnissen an jeder der sieben Adressen in der Matrix ergab. Z. B. ergab rRNA von S. aureus ein positives Hybridisierungssignal an der pan-bakteriellen Adresse und ein negatives Hybridisierungssignal an der pan-Pilz Adresse der Matrix. Das bestätigte, wie erwartet, das Fehlen jeder von Pilzen abgeleiteten rRNA in der S. aureus rRNA Probe. Das positive Signal an der Gram⁽⁺⁾ Adresse war mit der Tatsache konsistent, dass S. aureus ein Gram⁽⁺⁾ Bakterium ist. Die negativen Ergebnisse an Adressen, die der Actinomyceten Untergruppe von Gram⁽⁺⁾ Bakterien und den Familien Enterobacteriaceae und der Enterococcus Gruppe entsprachen, bestätigte, dass S. aureus nicht unter den Bakterien, die als Actinomyceten klassifiziert werden, oder unter der enterischen oder Enterococcus Gruppe von Bakterien war. Da S. aureus ein Mitglied der Gattung Staphylococcus ist, war, obwohl er nicht ein Mitglied der Campylobacter Gruppe ist, ein positives Hybridisierungssignal an der sechsten Adresse, die diesen Sonden entsprach, angemessen. Dieses letztere Ergebnis stellt beispielhaft dar, wie eine positive Hybridisierung mit jedem einer Vielzahl von Sonden an einer bestimmten Adresse ein positives Signal ergibt. Schließlich war das positive Hybridisierungssignal an der siebten Adresse, die einer Sammlung von artspezifischen Sonden entspricht, richtig, da dieser Locus eine artenspezifische Sonde für S. aureus einschloss.
Bedeutsamerweise wäre, wenn das positive Hybridisierungssignal an der Adresse, die den fünf artenspezifischen Sonden entsprach, getrennt von den anderen Ergebnissen in der Matrix in Betracht gezogen worden wäre, nur eine mehrdeutige Interpretation der Daten möglich gewesen. Insbesondere hätte das Ergebnis angezeigt, dass die hybridisierenden rRNAs von mindestens einer der Arten, die durch E. coli, S. aureus, C. albicans, P. aeruginosa und S. pneumoniae angegeben werden, stammen. Wenn jedoch im Kontext der anderen Ergebnisse in der Hybridisierungsmatrix betrachtet, wird klar, dass bestimmte dieser Arten durch andere Ergebnisse in der Matrix ausgeschlossen wurden. Z. B. bedeutete das negative Ergebnis an der Adresse, die der pan-Pilz Sonde entsprach, dass die hybridisierende rRNA nicht von der Hefe C. albicans stammen konnte. Auf gleiche Weise bedeutete das negative Hybridisierungssignal an der Adresse, die den enterischen Bakterien und Enterococcus entsprach, dass die hybridisierende rRNA an der artspezifischen Adresse nicht von E. coli, das ein enterisches Bakterium ist, stammen konnte. Die positiven Hybridisierungsergebnisse an den Adressen, die den Staphylokokken und Campylobacter Gruppen Sonden an der sechsten Adresse in der Matrix entsprachen, bedeutete, dass das positive Hybridisierungssignal an der artspezifischen Adresse nicht auf entweder P. aeruginosa oder S. pneumoniae zurückzuführen sein kann, da diese Organismen an der Adresse, die der Gattung Staphylococcus und der Gruppe Campylobacter entspricht, negative Hybridisierungsergebnisse ergeben hätten. Das zeigt, wie die rRNA von einem Organismus ein unterscheidbares Muster von Hybridisierungsergebnissen unter Verwendung des oben beschriebenen Sonden-Matrix-Ansatzes ergibt.
Bedeutsamerweise repräsentiert Tabelle 6 ebenfalls eine Vergleichstabelle, die verwendet werden kann, um die Identität eines Organismus, der durch eines der qualitativen Hybridisierungsprofile in der Tabelle charakterisiert wird, zu dekodieren. Z. B. sollte beim Betrachten der Tabelle 6 klar sein, dass ein Profil, das durch „(+/–/+/–/–/+/+/)" angegeben wird, entsprechend den positiven und negativen Hybridisierungsergebnissen an den sieben Adressen in der Tabelle, einen Mikroorganismus als Staphylococcus aureus identifizieren würde.
Während der Entwicklung der Erfindung wurde überraschenderweise entdeckt, dass das matrix-basierte Verfahren zum Identifizieren von Mikroorganismen ebenfalls die Identitäten von Mikroorganismen, die in einer gemischten Probe von Mikroorganismen enthalten sind, auflösen kann. Insbesondere wurde gefunden, dass sogar anscheinend gut isolierte Kolonien, die auf Nähragar-Platten in mikrobiologischen Laboratorien wachsen, gelegentlich mehr als eine Art von Mikroorganismen enthalten. Diese Fähigkeit, das Vorhandensein von mehr als einem Organismus nachzuweisen, und die Fähigkeit, die Identitäten dieser Organismen ohne weitere Isolations- oder Reinigungsschritte zu bestimmen, liefert starke Beweise für die Vorteile der Erfindung gegenüber alternativen molekulardiagnostischen Techniken. Z. B. würde die Sequenzierung von Polynukleotiden einer Mischung von Vorlagen, die rRNA oder rDNA von verschiedenen Organismen repräsentieren, mehrdeutige Ergebnisse liefern, die nicht verlässlich in unabhängige Sequenzen unterteilt werden könnten. Auf die gleiche Art und Weise können sonden-basierte Verfahren zur Identifizierung von Mikroorganismen, die weniger verständliche Hybridisierungsstrategien verwenden, einschließlich Strategien, die keine bestätigenden Ergebnisse von negativen Hybridisierungssignalen ableiten, das Vorhandensein eines zweiten Organismus übersehen, wenn ein positives Hybridisierungsergebnis mit einer ersten artspezifischen Sonde erhalten wird. Somit kann das hierin offenbarte Verfahren verwendet werden, um Analysen durchzuführen, die durch alternative Ansätze sonst nicht durchgeführt werden könnten.
Die quantitative Natur der Ergebnisse, die in dem matrix-basierten Verfahren zur Mikrobenidentifikation erhalten werden können, zusammen mit der Fähigkeit, Rückschlüsse aus negativen Hybridisierungsergebnissen zu ziehen, wenn eine Sonde ein Ziel-Polynukleotid nicht hybridisiert, ist die Basis, die dieser einzigartigen Eigenschaft der Erfindung zugrunde liegt. Tatsächlich kann das Normieren der Ergebnisse eines Matrix-Hybridisierungsverfahrens auf das Signal, das an einer pan-bakteriellen oder einer pan-Pilz Adresse gemessen wird, das System ausreichend quantitativ machen, so dass einige Mischungen von Mikroorganismen in einem einzigen Hybridisierungsverfahren aufgelöst werden können.
Beispiel 2 beschreibt die Verfahren, die zeigten, dass das matrix-basierte Verfahren zur Identifikation von Mikroben Mischungen von Mikroorganismen nachweisen und auflösen konnte.
Beispiel 2
Auflösung von gemischten Kulturen von Mikroorganismen Mehrere bakterielle Kontroll-rRNA-Proben wurden unter Verwendung einer Sondenmatrix mit sieben Adressen, wie unter Beispiel 1 beschrieben, getestet. Lysate, die rRNAs von drei verschiedenen Stämmen von Streptococcus pyogenes (Stämme A-C) enthielten, wurden in der Sondenmatrix getestet. Es wurden die Hybridisierungs- und Quantifizierungsverfahren, die von Arnold et al., in U.S. Patent Nr. 5,283,174 offenbart werden, verwendet, um Ziel-rRNAs, die an die Sonden an den verschiedenen Adressen gebunden waren, zu quantifizieren. Ein vierter Stamm (Stamm D) derselben Art von Bakterien, wurde ebenfalls gemäß demselben Verfahren getestet.

Tabelle 7 präsentiert normierte quantitative Ergebnisse, die Hybridisierungssignale an jeder der Adressen in der Sondenmatrix anzeigen. Die durchschnittlichen relativen Lichteinheit-(RLU)-Ergebnisse für S. pyogenes Stämme A-C an jeder der sieben Adressen erscheinen in der ersten Reihe der Tabelle. Ergebnisse, die für S. pyogenes Stamm D erhalten wurden, erscheinen in der zweiten Reihe der Tabelle. Alle Werte sind auf die Ergebnisse normiert, die an der entsprechenden pan-bakteriellen Adresse erhalten wurden. In diesem Fall wurden normierte Werte, die größer als 20% des pan-bakteriellen Signals waren, als positiv betrachtet. TABELLE 7 Auflösung einer gemischten bakteriellen Kultur durch Sonden-Matrix-Analyse*

Probe	pan-bakteriell	pan-Pilz	Gram⁽⁺⁾	Hoch (G + C)	enterisch; Enterncoccus	Staph Gattung; Campylobacter	A rtenAdresse
Strep. pyogenes Stämme A-C (Durchschnitt, n = 3)	100	0,5	31	1,0	1,3	0,8	2,5
Strep. pyo genes Stamm D	100	0,5	51	0,8	1,5	29	2,3

* Numerische Werte wurden auf das Hybridisierungssignal, das an der pan-bakteriellen Adresse beobachtet wurde, normiert und werden als Prozentsätze (%) angegeben

Wie in Tabelle 7 gezeigt, ergaben die normierten Durchschnitte für drei verschiedene Stämme von S. pyogenes (Stämme A-C) ein Profil, das positive Hybridisierungsergebnisse an der pan-bakteriellen und Gram⁽⁺⁾ Adresse zeigt. Im Vergleich ergab der vierte Stamm der Art (Stamm D) ein Profil, das positive Hybridisierungsergebnisse an der pan-bakteriellen, Gram⁽⁺⁾ und Gattung Staphylococcus/Campylobacter Gruppe Adresse zeigte, mit einem im Vergleich zu dem Durchschnitt der anderen Stämmen leicht erhöhten relativen Signal an der Gram⁽⁺⁾ Adresse. Da S. pyogenes ein Gram⁽⁺⁾ Bakterium ist, das kein Mitglied der Gattung Staphylococcus oder der Campylobacter Gruppe ist, war klar, dass das positive Hybridisierungssignal, das an der Gattung Staphylococcus/Campylobacter Adresse beobachtet wurde, auf das Vorhandensein von hybridisierender rRNA von einem kontaminierenden Bakterium neben S. pyogenes zurückzuführen sein muss. Da Campylobacter Bakterien Gram^(– ⁾ sind, Staphylokokken Bakterien Gram⁽⁺⁾ sind und angesichts der Beobachtung, dass das relative Signal an der Gram⁽⁺⁾ Adresse erhöht und nicht erniedrigt war, folgt, dass Gram⁽⁺⁾ Staphylokokken als Verunreinigung in der Anfangsprobe von Bakterien, die verwendet wurde, um die rRNA für die Hybridisierung herzustellen, vorhanden gewesen sein müssen. Da die artspezifische S. aureus Sonde, die an der Artenadresse in der Matrix vorhanden ist, kein positives Hybridisierungssignal ergab, folgt, dass das kontaminierende Bakterium ein anderes Staphylococcus Bakterium als S. aureus, d. h. ein „SNA" gewesen sein muss. Das zeigt, wie das matrix-basierte Verfahren zum Identifizieren von Mikroben Mischungen von Mikroorganismen auflösen kann. Zahlreiche andere Beispiele von gemischten Populationen von Mikroben wurden ebenfalls unter Verwendung dieser Technik aufgelöst.
Wie oben angegeben, kann in mindestens einigen Fällen das matrix-basierte Verfahren zur Identifikation von Mikroben vorteilhafterweise verwendet werden, um die Identitäten von Organismen, die in gemischten Populationen vorhanden sind, aufzulösen. Um den quantitativen Aspekt des Verfahrens zu demonstrieren, wurde ein Experiment durchgeführt, um: (a) tatsächliche Hybridisierungsergebnisse, die bei Verwendung von Mischungen von Kontroll-Lysaten erhalten werden, und (b) quantitative Werte, die für die Hybridisierung, basierend auf Ergebnissen, die unter Verwendung von isolierten Kontrollen erhalten wurden, vorhergesagt wurden, zu vergleichen. In dem ersten Teil des Experiments wurden bekannte Mengen von Lysaten von drei bakteriellen Arten kombiniert und gemäß einem Standard-Sonden-Matrix-Hybridisierungsverfahren hybridisiert. In der zweiten Hälfte des Verfahrens wurden Mischungen der rRNA-enthaltenden Lysate hergestellt und demselben Hybridisierungsverfahren unterzogen. Die Ergebnisse, die für diese gemischten Proben erhalten wurden, wurden mit den Werten verglichen, die basierend auf den proportionalen Beiträgen von jedem Bestandteil in der Mischung erwartet worden wären, um zu zeigen, wie gemischte Proben quantitativ aufgelöst werden können. Obwohl das folgende beispielhafte Verfahren Mischungen von Lysaten verwendete, die getrennt voneinander aus kultivierten Mikroorganismen hergestellt wurden, sollte selbstverständlich sein, dass Lysate, die von gemischten Kulturen von Mikroorganismen hergestellt wurden, ähnliche Ergebnisse ergeben würden.
Beispiel 3 beschreibt das Verfahren, das zeigte, dass Nukleinsäureproben von zwei verschiedenen Mikroorganismen unter Verwendung eines Sonden-Matrix-Hybridisierungs-Protokolls quantitativ aufgelöst werden konnten.
Beispiel 3
Auflösen von gemischten Populationen von Mikroorganismen unter Verwendung einer Polynukleotid-Sonden-Matrix

Drei unterschiedliche rRNA-enthaltende bakterielle Lysate wurden hergestellt und dem Sonden-Matrix-Hybridisierungs- und -Nachweisverfahren, das in Beispiel 1 beschrieben wird, unterzogen. Enterococcus faecalis (ATTC# 29212; ein Gram⁽⁺⁾ Enterococcus), Streptococcus uberis (ATTC# 27958; ein Gram⁽⁺⁾ Bakterium) und E. coli (ATTC# 10798; ein Gram^(–) Mitglied der Enterobacteriaceae) wurden in diesem Verfahren als Quellen der rRNA verwendet. Eine Mischung von rRNAs, die aus E. coli, C. albicans, S. aureus und M. chelonae gereinigt wurde, diente als positive Hybridisierungskontrolle, wohingegen der Hybridisierungspuffer als negative Kontrolle diente. Das Volumen der rRNA-enthaltenden Lysate, die in den 100 μl Hybridisierungsreaktionen verwendet wurden, wurde konstant bei 50 μl gehalten. Tabelle 8 präsentiert die quantitativen Hybridisierungsergebnisse, die unter Verwendung jedes der drei bakteriellen Lysate isoliert voneinander erhalten wurden. TABELLE 8 Sonden-Matrix-Hybridisierung unter Verwendung von bakteriellen Lysat-Kontrollen (in RLU)

Adresse	positive Kontrolle	negative Kontrolle	S. uberis	E. coli	E. faecalis
pan-bakteriell	152480	603	86520	35860	79210
pan-Pilz	44200	760	628	603	595
Gram⁽⁺⁾	90390	873	47270	818	44730
Hoch (G + C)	90680	1173	1020	1132	1038
enterisch/ Enterococcus	31560	2113	1810	29040	37600
Gattung Staph/ Campylobacter	26060	883	822	817	803
Artensonden	100790	2116	1854	32390	1784

Hybridisierungs- und Nachweisverfahren wurden ebenfalls unter Verwendung von Lysaten von Enterococcus faecalis und Streptococcus uberis, die in Volumenverhältnissen von 4:1, 1:1 und 1:4 kombiniert worden waren, durchgeführt. Lysate von E. coli und Streptococcus uberis wurden gleichermaßen in Verhältnissen von 1:1 und 1:4 kombiniert und dann in dem Hybridisierungsverfahren verwendet. Die Ergebnisse, die unter Verwendung dieser gemischten Proben erhalten wurden, werden in Tabelle 9 präsentiert. TABELLE 9 Hybridisierungsergebnisse (in RLU) für bakterielle Lysate, die in variierenden Anteilen kombiniert wurden

Adresse	Ef/Su (4:1)	Ef/Su (1:1)	Ef/Su (1:4)	Ec/Su (4:1)	Ec/Su (1:1)	Ec/Su (1:4)
pan-Bakteriell	84500	88730	85000	47710	60500	72950
pan-Pilz	715	675	647	637	669	624
Gram⁽⁺⁾	48960	45850	46480	9064	23350	37440
Hoch (G + C)	1120	1094	1162	1013	1027	1028
enterisch/ Enterococcus	34070	23080	10542	24130	17030	8066
Gattung Staph/ Campylobacter	900	860	783	850	812	817
Artensonden	2470	2414	2005	26610	17410	8433

Ec ist E. coli
Ef ist Enterococcus faecalis
Su ist Streptococcus uberis

Schließlich wurden die gemessenen RLU-Werte, die in Tabelle 9 präsentiert sind, mit Werten verglichen, die basierend auf proportionalen Kombinationen der numerischen Ergebnisse, die in Tabelle 8 präsentiert wurden, erwartet wurden. Die Ergebnisse dieses letzteren Vergleichs sind als Prozentsätze in Tabelle 10 präsentiert. TABELLE 10 Vorhergesagte Hybridisierungsergebnisse als Prozentsätze von gemessenen Werten

Adresse	Ef/Su (4:1)	Ef/Su (1:1)	Ef/Su (1:4)	Ec/Su (4:1)	Ec/Su (1:1)	Ec/Su (1:4)
pan-Bakteriell	95	93	100	96	101	105
pan-Pilz	na	na	na	na	na	na
Gram⁽⁺⁾	92	100	101	112	103	101
Hoch (G + C)	na	na	na	na	na	na
enterisch/ Enterococcus	89	85	85	98	91	90
Gattung Staph/ Campylobacter	na	na	na	na	na	na
Artensonden	na	na	na	99	98	94

Ec ist E. coli
Ef ist Enterococcus faecalis
Su ist Streptococcus uberis
na ist „nicht anwendbar"

Die Ergebnisse, die in Tabelle 10 gezeigt sind, zeigen, dass die berechneten Werte und die tatsächlichen Werte für die Sonden-Hybridisierung in dem matrix-basierten Verfahren nahe beieinander lagen.
Tatsächlich unterschieden sich die tatsächlichen und vorhergesagten Werte für die Hybridisierung voneinander um nicht mehr als ungefähr 15%. Das beweist, dass das Sonden-Matrix-basierte Hybridisierungsverfahren verwendet werden kann, um quantitative Hybridisierungsdaten, die die relativen Beiträge von rRNAs von verschiedenen Mikroorganismenarten, die in der Mischung enthalten sind, widerspiegeln, abzuleiten. Somit kann das matrix-basierte Hybridisierungs-Protokoll verwendet werden, um die relativen Beiträge von verschiedenen Mikroorganismen in gemischten Populationen von Mikroorganismen zu bestimmen.
Die folgenden Beispiele beschreiben, wie das matrixbasierte Verfahren zur Mikroben-Identifikation verwendet werden kann, um Blutvergiftung zu diagnostizieren.
Beispiel 4
Diagnose von Blutvergiftung unter Verwendung einer matrix-basierten Mikroben-Identifikation
Ein menschlicher Patient, von dem vermutet wird, dass er eine Infektion im Blut besitzt, wird zuerst von einem Arzt identifiziert. Dem Patienten wird an einer Stelle der Haut, die mit Alkohol und einer Iodlösung gemäß standardmedizinischen Verfahren gereinigt worden ist, eine venöse Blutprobe entnommen. Die Probe wird verwendet, um eine Blutkulturflasche zu beimpfen, die dann bei 37°C gehalten und auf die CO₂-Produktion in einem automatisierten Inkubator hin überwacht wird. Nach zwei Tagen scheint die Kultur trüb und wird durch visuelle Inspektion als gas-produzierende Mikroorganismen enthaltend eingestuft. Eine flüssige Probe, die aus der Kulturflasche entfernt wird, wird selektiven Zentrifugierungsschritten unterzogen (Davis et al., J. Clin Microbiol. 29: 2193 (1991)), um Mikroorganismen zu sammeln. Zuerst wird eine 1,5 ml-Probe der Brühe aus der Flasche entfernt und für 2 Sekunden bei ungefähr 9600 × g zentrifugiert, um rote Blutzellen zu sedimentieren. Der Überstand wird isoliert und einer Zentrifugation bei 9600 × g für 1 Minute unterzogen, um die Mikroben zu konzentrieren. Das resultierende Pellet wird mittels Standardlaborverfahren lysiert und die freigesetzten Polynukleotide einer matrix-basierten Hybridisierungs-Analyse unter Verwendung der Sondenmatrix mit sieben Adressen, die unter Beispiel 1 beschrieben wird, unterzogen. Positive Hybridisierungssignale werden nur an der pan-Pilz Adresse und an den Adressen, die den artspezifischen Sonden für E. coli, S. aureus, C. albicans, P. aeruginosa und S. pneumoniae entsprechen, nachgewiesen. Basierend auf diesen Ergebnissen wird geschlussfolgert, dass das Blut des Patienten Candida albicans beinhaltet. Eine entsprechende anti-Pilz Therapie wird sofort begonnen und der Zustand des Patienten verbessert sich.
Wie hierin beschrieben, kann das matrix-basierte Verfahren zur Identifikation von Mikroben klar eine Identifikation von Mikroorganismen auf dem Level der Art, mit der Genauigkeit eines Amplifizierungs- und Sequenzierungsprotokolls, aber mit den Vorteilen und der Einfachheit eines Sonden-Hybridisierungs-Ansatzes liefern. Das matrix-basierte Verfahren zur Identifizierung von Mikroben bietet jedoch auch die zusätzliche Fähigkeit, Identitäten von Mikroben, die in gemischten Kulturen von Mikroorganismen enthalten sind, aufzulösen. Außerdem erhält das matrix-basierte Verfahren zur Identifikation von Mikroben sinnvolle Informationen auch aus negativen Hybridisierungsergebnissen, ein Merkmal, das kein Bestandteil anderer molekulardiagnostischer Verfahren ist.
Diese Erfindung wurde mit Bezugnahme auf eine Reihe von spezifischen Beispielen und Ausführungsformen beschrieben. Natürlich deuten sich dem Fachmann bei der Betrachtung der vorangegangenen detaillierten Beschreibung eine Reihe von anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung von alleine an. Somit ist der wahre Umfang der vorliegenden Erfindung durch Bezugnahme auf die angehängten Patentansprüche zu bestimmen.
SEQUENCE LISTING

Claims

Eine Vorrichtung zum Hybridisieren von Nukleinsäuren umfassend: einen festen Träger; und eine Vielzahl von Adressen, die auf dem festen Träger angeordnet sind, wobei jede Adresse mindestens eine Sonde umfasst, die unter Hybridisierungsbedingungen hoher Stringenz ribosomale Nukleinsäuren von mindestens einer Mikrobenart hybridisiert, wobei die Vielzahl von Adressen einschließt: Eine Adresse höherer Ordnung; Eine Adresse mittlerer Ordnung; und Eine Adresse niederer Ordnung, wobei die Adresse niederer Ordnung ribosomale Nukleinsäuren einer Untergruppe von Organismen, die ribosomale Nukleinsäuren besitzen, die an die Adresse mittlerer Ordnung hybridisieren, hybridisiert; und wobei die Adresse mittlerer Ordnung ribosomale Nukleinsäuren einer Untergruppe von Organismen, die ribosomale Nukleinsäuren besitzen, die an die Adresse höherer Ordnung hybridisieren, hybridisiert, wobei die Adresse niederer Ordnung des Weiteren mindestens eine Sonde umfasst, die unter Hybridisierungsbedingungen hoher Stringenz an ribosomale Nukleinsäuren einer Mikrobenart hybridisiert, die keine ribosomalen Nukleinsäuren besitzen, die an eine oder beide einer Adresse höherer Ordnung und einer Adresse mittlerer Ordnung hybridisieren.
Die Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei der feste Träger ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einer Platte mit vielen Vertiefungen (multiwell Platte) und einer Vielzahl einzelner Röhrchen, die jeweils in einer Anordnung mit Abstand zueinander gehalten werden.
Die Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Adresse höherer Ordnung eine panbakterielle Adresse ist, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren einer Vielzahl von Gram(+) Bakterienarten, einer Vielzahl von Bakterienarten der Familie Enterobacteriaceae, einer Vielzahl von Bakterienarten der Gattung Enterococcus, eine Vielzahl von Bakterienarten der Gattung Staphylococcus und eine Vielzahl von Bakterienarten der Gattung Campylobacter hybridisiert.
Die Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Adresse höherer Ordnung eine pan-fungale Adresse ist, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren einer Vielzahl von Pilzarten hybridisiert.
Die Vorrichtung nach Anspruch 3 ferner umfassend eine pan-fungale Adresse die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren einer Vielzahl von Pilzarten hybridisiert.
Die Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Adresse höherer Ordnung eine Gram(+) Adresse ist, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren einer Vielzahl von Gram(+) Bakterienarten hybridisiert.
Die Vorrichtung nach Anspruch 3 oder 5, wobei die Adresse mittlerer Ordnung ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einer Gram(+) Adresse, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren einer Vielzahl von Gram(+)-Bakterien hybridisiert, einer Adresse für die Familie Enterobacteriaceae, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren einer Vielzahl von Bakterien der Familie Enterobacteriaceae hybridisiert, einer Adresse für die Gattung Staphylococcus, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren einer Vielzahl von Arten der Gattung Staphylococcus hybridisiert, einer Adresse für die Gattung Enterococcus, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren einer Vielzahl von Arten der Gattung Enterococcus hybridisiert, und einer Campylobacter Adresse, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren einer Vielzahl von Campylobacter-Arten hybridisiert.
Die Vorrichtung gemäß Anspruch 7, wobei die Adresse mittlerer Ordnung die Gram(+) Adresse ist, und wobei die Adresse niederer Ordnung eine Actinomycetes Adresse umfasst, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren einer Vielzahl von Bakterien, die zu der Hoch (G + C) Untergruppe von Gram(+)-Bakterien gehören, hybridisiert.
Die Vorrichtung nach Anspruch 7, wobei die Adresse mittlerer Ordnung die Gram(+) Adresse ist, und wobei die Adresse niederer Ordnung eine Adresse umfasst, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren einer Vielzahl von Mycobacterium-Arten, ribosomale Nukleinsäuren von Streptococcus pneumoniae, ribosomale Nukleinsäuren von Listeria monocytogenes oder ribosomale Nukleinsäuren von Staphylococcus aureus hybridisiert.
Die Vorrichtung nach Anspruch 9, wobei die Vielzahl von Mycobacterium-Arten Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium bovis BCG und Mycobacterium africanum umfasst.
Die Vorrichtung nach Anspruch 7, wobei die Adresse mittlerer Ordnung die Adresse für die Familie Enterobacteriaceae ist und wobei die Adresse niederer Ordnung eine E. coli Adresse umfasst, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren von E. coli hybridisiert.
Die Vorrichtung nach Anspruch 7, wobei die Adresse mittlerer Ordnung die Adresse für die Gattung Staphylococcus ist und wobei die Adresse niederer Ordnung eine Staphylococcus aureus Adresse umfasst, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren von Staphylococcus aureus hybridisiert.
Die Vorrichtung nach Anspruch 7, wobei die Adresse mittlerer Ordnung die Adresse für die Gattung Enterobacter oder die Campylobacter Adresse ist.
Die Vorrichtung nach Anspruch 6, wobei die Adresse niederer Ordnung eine Adresse umfasst, die ribosomale Nukleinsäuren von Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium bovis BCG und Mycobacterium africanum nachweist.
Die Vorrichtung nach Anspruch 4, wobei die Adresse mittlerer Ordnung spezifisch ribosomale Nukleinsäuren einer Vielzahl von Candida-Arten, umfassend Candida albicans, Candida tropicalis, Candida dubliniensis, Candida viswanathii und Candida parapsilosis, und wobei die Adresse niederer Ordnung spezifisch ribosomale Nukleinsäuren von Candida albicans und Candida dubliniensis aber nicht Candida tropicalis, Candida viswanathii und Candida parapsilosis hybridisiert.
Die Vorrichtung nach Anspruch 8 ferner umfassend eine pan-fungale Adresse, die ribosomale Nukleinsäuren einer Vielzahl von Pilzarten hybridisiert.
Die Vorrichtung nach Anspruch 16, wobei die Vielzahl von Adressen ferner eine Adresse einschließt, die ribosomale Nukleinsäuren von Bakterien der Familie Enterobacteriaceae hybridisiert.
Die Vorrichtung nach Anspruch 16, wobei die Vielzahl von Adressen ferner eine Adresse einschließt, die ribosomale Nukleinsäuren von Enterococcus-Bakterien hybridisiert.
Die Vorrichtung nach Anspruch 17, wobei die Vielzahl von Adressen ferner eine Adresse einschließt, die ribosomale Nukleinsäuren von Enterococcus-Bakterien hybridisiert.
Die Vorrichtung nach Anspruch 16 ferner umfassend eine einzelne Adresse, die ribosomale Nukleinsäuren von Enterococcus-Bakterien und ribosomale Nukleinsäuren von Bakterien der Familie Enterobacteriaceae hybridisiert.
Die Vorrichtung nach Anspruch 16, wobei die Vielzahl von Adressen ferner eine Adresse einschließt, die ribosomale Nukleinsäuren von Bakterien der Gattung Staphylococcus und/oder ribosomale Nukleinsäuren einer Vielzahl von Bakterien der Gattung Campylobacter hybridisiert.
Die Vorrichtung nach Anspruch 19, wobei die Vielzahl von Adressen ferner eine Adresse, die ribosomale Nukleinsäuren von Bakterien der Gattung Staphylococcus hybridisiert, und eine Adresse, die ribosomale Nukleinsäuren einer Vielzahl von Bakterien der Gattung Campylobacter hybridisiert, einschließt.
Die Vorrichtung nach Anspruch 20, wobei die Vielzahl von Adressen ferner eine einzelne Adresse einschließt, die ribosomale Nukleinsäuren von Bakterien der Gattung Staphylococcus und ribosomale Nukleinsäuren einer Vielzahl von Bakterien der Gattung Campylobacter hybridisiert.
Die Vorrichtung nach Anspruch 22, wobei die Vielzahl von Adressen ferner mindestens eine Adresse einschließt, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren einer einzelnen Mikroorganismenart hybridisiert.
Die Vorrichtung nach Anspruch 24, wobei die einzelne Mikroorganismenart aus der Gruppe, die aus Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans und Staphylococcus aureus besteht, ausgewählt wird.
Die Vorrichtung gemäß Anspruch 23, wobei die Vielzahl von Adressen ferner eine Vielzahl von Adressen, die einzeln ribosomale Nukleinsäuren einer Vielzahl von Arten von Mikroorganismen hybridisieren, einschließt.
Die Vorrichtung nach Anspruch 16, wobei die pan-bakterielle Adresse eine Polynukleotidsonde umfasst, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 58 besitzt.
Die Vorrichtung nach Anspruch 16, wobei die pan-fungale Adresse eine Polynukleotidsonde umfasst, die die Sequenz von SEQ ID NO: 4 besitzt.
Die Vorrichtung nach Anspruch 16, wobei die Gram(+) Adresse eine Polynukleotidsonde umfasst, die die Sequenz von SEQ ID NO: 7 besitzt.
Die Vorrichtung nach Anspruch 16, wobei die Actinomycetes Adresse eine Polynukleotidsonde umfasst, die die Sequenz von SEQ ID NO: 10 besitzt.
Die Vorrichtung nach Anspruch 16, wobei die pan-bakterielle Adresse eine Polynukleotidsonde umfasst, die eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 58 besitzt, die pan-fungale Adresse eine Polynukleotidsonde umfasst, die die Sequenz von SEQ ID NO: 4 besitzt, die Gram(+) Adresse eine Polynukleotidsonde umfasst, die die Sequenz von SEQ ID NO: 7 besitzt, und wobei die Actinomycetes Adresse eine Polynukleotidsonde umfasst, die die Sequenz von SEQ ID NO: 10 besitzt.
Die Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei jede von mindestens einer Sonde mit einem Acridiniumester markiert ist.
Verfahren zum Analysieren einer biologischen Probe von der vermutet wird, dass sie Mikroorganismen enthält, umfassend die Schritte: Kultivieren der biologischen Probe für einen Zeitraum, um die Anzahl jeglicher darin enthaltener Mikroorganismen zu erhöhen; Freisetzen von Polynukleotiden aus jeglichen in der kultivierten Probe enthaltenen Mikroorganismen; Hybridisieren der freigesetzten Polynukleotide mit einer Sondenmatrix unter Bedingungen hoher Stringenz, wobei die Polynukleotid Sondenmatrix eine Vielzahl von Adressen umfasst, wobei jede Adresse mindestens eine Sonde umfasst, die ribosomale Nukleinsäuren von einer oder mehreren Arten von Mikroorganismen hybridisiert, wobei die Vielzahl von Adressen Eine Adresse höherer Ordnung; Eine Adresse mittlerer Ordnung; und Eine Adresse niederer Ordnung einschließt, und wobei die Adresse niederer Ordnung ribosomale Nukleinsäuren von einer Untergruppe von Organismen, die ribosomale Nukleinsäuren besitzen, die an der Adresse mittlerer Ordnung hybridisieren, hybridisiert, und wobei die Adresse mittlerer Ordnung ribosomale Nukleinsäuren von einer Untergruppe von Organismen, die ribosomale Nukleinsäuren besitzen, die an der Adresse höherer Ordnung hybridisieren, hybridisiert, wobei die Adresse niederer Ordnung ferner mindestens eine Sonde umfasst, die unter Hybridisierungsbedingungen hoher Stringenz an ribosomale Nukleinsäuren einer Mikrobenart hybridisiert, die keine ribosomalen Nukleinsäuren besitzen, die an eine oder beide einer Adresse höherer Ordnung und einer Adresse mittlerer Ordnung hybridisieren, Nachweis der positiven und negativen Hybridisierungsergebnisse für jede der Vielzahl von Adressen um ein Hybridisierungsprofil zu erstellen; Vergleich des Hybridisierungsprofils mit einer Übersichtstabelle, die die Identitäten von Mikroorganismen mit den Hybridisierungsergebnissen an jeder der Adressen korreliert, und dadurch Erhalt von Informationen hinsichtlich der Identität von in der Probe enthaltenen Mikroorganismen.
Das Verfahren nach Anspruch 33, wobei der Schritt des Hybridisierens unter Bedingungen hoher Stringenz Hybridisieren unter den Bedingungen 0,6 M LiCl, 1% Lithiumlaurylsulfat, 60 mM Lithiumsuccinat und jeweils 10 mM EDTA und EGTA umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 34, wobei die Adresse höherer Ordnung in dem Hybridisierungsschritt eine pan-bakterielle Adresse ist, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren einer Vielzahl von Arten Gram(+)-Bakterien, einer Vielzahl von Bakterienarten der Familie Enterobacteriaceae, einer Vielzahl von Bakterienarten der Gattung Enterococcus, einer Vielzahl von Bakterienarten der Gattung Staphylococcus und einer Vielzahl von Bakterienarten der Gattung Campylobacter hybridisiert, und wobei die Vielzahl von Adressen in dem Hybridisierungsschritt ferner eine pan-fungale Adresse einschließt, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren von einer Vielzahl von Pilzarten hybridisiert.
Das Verfahren nach Anspruch 35, wobei die Adresse mittlerer Ordnung in dem Hybridisierungsschritt eine Gram(+) Adresse ist, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren einer Vielzahl Gram(+) Bakterienarten hybridisiert, und wobei die Adresse niederer Ordnung in dem Hybridisierungsschritt eine Actinomycetes Adresse ist, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren einer Vielzahl von Bakterien, die zu der Hoch (G + C) Untergruppe von Gram(+) Bakterien gehören, hybridisiert.
Das Verfahren nach Anspruch 36, wobei die biologische Probe eine Blutprobe ist, von der vermutet wird, dass sie Mikroorganismen enthält, die für Bakterämie, Septikämie oder Fungämie verantwortlich sind, und wobei der Kultivierungsschritt das Beimpfen einer Blutkonserve mit einem Aliquot der Blutprobe und danach das Inkubieren der beimpften Blutkonserve umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 37, wobei der Nachweisschritt den Nachweis mittels Luminometrie umfasst.
Verfahren zum Analysieren einer Probe die ribosomale Nukleinsäuren enthält umfassend die Schritte: Hybridisieren der Probe mit einer Sondenmatrix unter Bedingungen hoher Stringenz, um eine hybridisierte Probe zu erhalten, wobei die Sondenmatrix eine Vielzahl von Adressen umfasst, einschließlich Einer Adresse höherer Ordnung; Einer Adresse mittlerer Ordnung; und Einer Adresse niederer Ordnung, wobei die Adresse niederer Ordnung ribosomale Nukleinsäuren einer Untergruppe von Organismen, die ribosomale Nukleinsäuren besitzen, die an der Adresse mittlerer Ordnung hybridisieren, hybridisiert, und wobei die Adresse mittlerer Ordnung ribosomale Nukleinsäuren einer Untergruppe von Organismen, die ribosomale Nukleinsäuren besitzen, die an der Adresse höherer Ordnung hybridisieren, hybridisiert, wobei die Adresse niederer Ordnung ferner mindestens eine Sonde umfasst, die unter Hybridisierungsbedingungen hoher Stringenz an ribosomale Nukleinsäuren einer Mikrobenart hybridisiert, die keine ribosomalen Nukleinsäuren besitzen, die an eine oder beide einer Adresse höherer Ordnung und einer Adresse mittlerer Ordnung hybridisieren, Analysieren der hybridisierten Probe um eine erste Gruppe von Adressen, die mindestens eine Sonde besitzen, die komplementär zu in der Probe enthaltenen ribosomalen Nukleinsäuren ist, und eine zweite Gruppe von Adressen, die nicht mindestens eine Sonde besitzen, die komplementär zu in der Probe enthaltenen ribosomalen Nukleinsäuren ist, zu identifizieren; und Bestimmen anhand der ersten und zweiten Gruppe von Adressen, die in dem Analyseschritt identifiziert wurden, welches einer Gruppe von Mikroorganismen ribosomale Nukleinsäuren besitzt, die ein entsprechendes Profil von ribosomalen Nukleinsäuresequenzen haben, und dadurch Bestimmen des mikrobiellen Ursprungs der RNA-enthaltenden Probe.
Das Verfahren nach Anspruch 39, wobei die Adresse höherer Ordnung in dem Hybridisierungsschritt eine pan-bakterielle Adresse ist, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren ribosomale Nukleinsäuren einer Vielzahl von Gram(+) Bakterienarten, einer Vielzahl von Bakterienarten der Familie Enterobacteriaceae, einer Vielzahl von Bakterienarten der Gattung Enterococcus, eine Vielzahl von Bakterienarten der Gattung Staphylococcus und eine Vielzahl von Bakterienarten der Gattung Campylobacter hybridisiert, und wobei die Vielzahl von Adressen in dem Hybridisierungsschritt ferner eine pan-fungale Adresse einschließt, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren einer Vielzahl von Pilzarten hybridisiert.
Das Verfahren nach Anspruch 40, wobei die Adresse mittlerer Ordnung in dem Hybridisierungsschritt eine Gram(+) Adresse ist, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren einer Vielzahl von Gram(+) Bakterienarten hybridisiert, und wobei die Adresse niederer Ordnung in dem Hybridisierungsschritt eine Actinomycetes Adresse ist, die spezifisch ribosomale Nukleinsäuren einer Vielzahl von Bakterien, die zu der Hoch (G + C) Untergruppe von Gram(+) Bakterien gehören, hybridisiert.
Das Verfahren nach Anspruch 41, wobei der Analyseschritt die Analyse mittels Luminometrie umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 42, wobei der Hybridisierungsschritt bei zwischen 55°C und 65°C durchgeführt wird.