ES2265344T3 - Sondas de polinucleotido para la deteccion y cuantificacion de actinomicetos. - Google Patents
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Abstract
Una sonda de oligonucleótido que hibrida específicamente una región diana del ácido nucleico de los actinomicetos, correspondiente a las posiciones de los nucleótidos 1986-2064 del ARNr 23S de E. coli, en condiciones de hibridación altamente restrictivas, para formar un dúplex detectable sonda:diana, teniendo dicha sonda de oligonucleótido una longitud de hasta 100 nucleótidos y comprendiendo por lo menos 17 nucleótidos contiguos contenidos dentro de la secuencia de SEQ ID NO:10 ó el complemento de la misma.
Description
Sondas de polinucleótido para la detección y
cuantificación de actinomicetos.
La presente invención se refiere a sistemas para
la detección del ácido nucleico. Más específicamente, la invención
se refiere a sondas de polinucleótido que tienen especificidad para
unirse al ARNr ó ADNr del subgrupo de bacterias
Gram-positivas conocidas como
"actinomicetos".
Los actinomicetos, o subgrupo "(G+C)
superior" de bacterias Gram-positivas
(Gram^{(+)}), constituyen una línea claramente evolucionada
dentro de las eubacterias. Los actinomicetos presentan
características fenotípicas altamente inusuales como consecuencia
de una velocidad de mutación característicamente alta. Muchos
miembros de este grupo de bacterias producen antibióticos y se
encuentran habitualmente en el suelo. Los actinomicetos son
responsables de muchas importantes enfermedades de los animales,
entre las que se incluyen la tuberculosis, la lepra, la difteria y
enfermedades periodontales. Notablemente, los individuos
inmunodeficientes son particularmente susceptibles a la infección
con el Mycobacteria avium, Mycobacteria intracellulare, y
Mycobacteria scrofulaceum, todas las cuales son especies
individuales entre los actinomicetos. Además, los actinomicetos son
responsables de muchas enfermedades de vegetales económicamente
importantes.
Es bien conocido que dos cadenas simples de
ácido desoxirribonucleico ("ADN") o ácido ribonucleico
("ARN") pueden asociarse o "hibridar" entre sí para
formar una estructura de cadena doble con dos cadenas sustentadas
mutuamente mediante enlaces de hidrógeno entre los pares de base
complementarias. Las cadenas individuales de ácido nucleico están
formadas por nucleótidos que contienen las bases: adenina (A),
citosina (C), timina (T), guanina (G), uracilo (U), e inosina (I).
En la estructura de doble helicoide de los ácidos nucleicos, el
hidrógeno de la base adenina se une con la base timina o uracilo, el
hidrógeno de la base guanina se une con la base citosina y el
hidrógeno de la base inosina se une con la adenina, citosina o
uracilo. En cualquier punto a lo largo de la cadena, se pueden
encontrar por lo tanto los clásicos pares de bases
"Watson-Crick" A:T ó A:U, T:A ó U:A y G:C ó
C:G. Sin embargo, se pueden encontrar también A:G, G:U y otros pares
de bases "tambaleantes" o mal emparejadas, además de los pares
de bases tradicionales ("canónicos").
Se obtendrá un híbrido de ácido nucleico de
doble cadena si un primer polinucleótido monocatenario entra en
contacto en condiciones promotoras de hibridación, con un segundo
polinucleótido monocatenario que tenga un suficiente número de
bases contiguas complementarias a la secuencia del primer
polinucleótido. En condiciones apropiadas pueden formarse híbridos
ADN/ADN, ARN/ADN ó ARN/ARN.
Generalmente, una sonda es un polinucleótido
mono-catenario que tiene algún grado de
complementariedad con la secuencia del ácido nucleico que hay que
detectar ("secuencia diana"). Las sondas habitualmente están
marcadas con un grupo detectable como p. ej., un radioisótopo, un
antígeno o un grupo quimioluminiscente.
Descripciones de hibridación de un ácido
nucleico como procedimiento para la detección de secuencias
particulares de ácido nucleico, están dadas por Kohne en la patente
U.S. nº 4.851.330 y por Hogan et al., en las patentes U.S.
n^{os} 5.541.308 y 5.681.698 y en EPA 080907. Estas referencias
describen también métodos para la determinación de la presencia de
organismos que contienen ARN en una muestra que podría contener
dichos organismos. Estos procedimientos requieren sondas que sean
suficientemente complementarias para el ARN ribosómico (ARNr) de
uno o más organismos no víricos o grupos de organismos no víricos.
De acuerdo con el método, los ácidos nucleicos de la muestra que
hay que ensayar, y una sonda apropiada, se mezclan en primer lugar y
a continuación se incuban en condiciones especificadas de
hibridación. Convencionalmente, pero no necesariamente, la sonda
estará marcada con una marca detectable. La reacción de hibridación
resultante se ensaya a continuación, para detectar y cuantificar la
cantidad de sonda marcada que ha formado estructuras dúplex con el
fin de detectar la presencia del ARNr contenido en la muestra de
ensayo.
Con la excepción de los virus, todos los
organismos procariotas contienen genes de ARNr que codifican
homólogos de moléculas de procariotas ARNr 5S, 16S y 23S. En los
eucariotas estas moléculas de ARNr son el ARNr 5S, ARNr 5,8S, ARNr
18S y ARNr 28S, las cuales son substancialmente similares a las
moléculas procariotas. Sondas para la detección de
sub-secuencias de ARNr específicamente definidas, en
particular, organismos o grupos de organismos en una muestra, han
sido descritos anteriormente. Estas secuencias de sondas altamente
específicas presentan la ventaja de que no reaccionan con los
ácidos nucleicos de cualquier otra especie de bacteria o agente
infeccioso en condiciones restrictivas apropiadas.
La presente invención proporciona sondas de
polinucleótido que pueden emplearse para detectar los actinomicetos
de una manera altamente específica.
\newpage
Un aspecto de la presente invención se refiere a
una sonda de oligonucleótido que hibrida específicamente en
condiciones altamente restrictivas de hibridación con una región
diana de ácido nucleico característica de las bacterias
actinomicetos para formar un dúplex sonda:diana detectable. Esta
región diana corresponde a las posiciones 1986-2064
de los nucleótidos del ARNr de E. coli. La sonda de
oligonucleótido inventada tiene una longitud de hasta 100
nucleótidos e incluye por lo menos 17 nucleótidos contiguos
contenidos dentro de la secuencia de SEQ ID NO:10 ó el complemento
de la misma. En ciertas versiones, la sonda de oligonucleótido
incluye por lo menos 25 nucleótidos contiguos, y puede incluir por
lo menos 29 nucleótidos contiguos contenidos dentro de la secuencia
de SEQ ID NO:10. La condición de una hibridación con alta
restrictividad puede ser proporcionada, o bien por un tampón de
fosfato de sodio 0,48 M, 0,1% de dodecil sulfato de sodio y 1 mM de
cada uno de EDTA y EGTA, o bien mediante 0,6 M de LiCl, 1% de lauril
sulfato de litio, 60 mM de succinato de litio y 10 mM de cada uno
de EDTA y EGTA. La sonda de oligonucleótido puede estar constituida
por ADN, pero también puede incluir por lo menos un análogo de
nucleótido. Por ejemplo, la sonda puede incluir por lo menos un
análogo de nucleótido que tiene un grupo metoxilo en la posición 2'
de un grupo ribosa. En una versión de la sonda de oligonucleótido
inventada, tiene una secuencia que es una cualquiera de SEQ ID NO:1
ó el complemento de la misma, la SEQ ID NO:2 ó el complemento de la
misma, ó SEQ ID NO:3 ó el complemento de la misma. En una versión
preferida, la secuencia del oligonucleótido viene dada por SEQ ID
NO:2 ó SEQ ID NO:3, y el oligonucleótido es un oligonucleótido
auxiliar. Cualquiera de los oligonucleótidos descritos puede
incluir una marca detectable: Ejemplos particulares de marcas
detectables son las marcas quimioluminiscentes y las marcas
radiactivas. En otra versión preferida, el oligonucleótido tiene una
secuencia dada por SEQ ID NO:1. Este
oligo-nucleótido es particularmente útil como sonda
de hibridación, y puede incluir una marca detectable. Una marca
altamente detectable preferida para la sonda de hibridación es un
éster de acridinio.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a la composición de la sonda para detectar ácidos nucleicos de las
bacterias actinomicetos. Esta composición comprende una sonda de
oligonucleótido que hibrida en condiciones altamente restrictivas
con una región diana del ácido nucleico de los actinomicetos, que
corresponde a las posiciones 1986-2064 de los
nucleótidos de ARNr 23S de E. coli, para formar un dúplex
diana:sonda detectable. Esta sonda de oligonucleótido tiene una
longitud de hasta 100 bases de nucleótidos e incluye por lo menos
17 nucleótidos contiguos contenidos dentro de la secuencia de SEQ ID
NO:10 ó el complemento de la misma. En condiciones de hibridación
altamente restrictivas la sonda de oligonucleótido hibrida
específicamente con los ácidos nucleicos presentes en
Corynebacterium aquaticum, Corynebacterium jeikieum,
Corynebacterium xerosis, Micrococcus luteus Propionibacterium acnes,
Mycobacterium chelonae, Mycobacterium terrae, Mycobacterium
intracellulare, Mycobacterium simiae, Mycobacterium avium,
Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium
kansasii, Mycobacterium smegatis, Mycobacterium fortuitum,
Mycobacterium gastri, Mycobacterium xenopi, Mycobacterium
marinum y Mycobacterium phlei. Se prefiere que la sonda
de oligonucleótido tenga una longitud de hasta 100 bases de
nucleótido e incluyan por lo menos 25 nucleótidos contiguos
contenidos dentro de la secuencia de SEQ ID NO:10 ó el complemento
de la misma. En ciertas versiones, la sonda de oligonucleótido
inventada está constituida de ADN. Ejemplos de condiciones útiles
de hibridación altamente restrictivas son alternativamente
proporcionadas mediante tampón de fosfato de sodio 0,48 M, 0,1% de
dodecil sulfato de sodio y 1 mM de cada uno de EDTA y EGTA, ó
mediante LiCL 0,6 M, 1% de lauril sulfato de litio, 60 mM de
succinato de litio y 10 mM de cada uno de EDTA y EGTA. En una
versión altamente preferida, la sonda de oligonucleótido tiene la
secuencia de SEQ ID NO:1 ó el complemento de la misma. En una
versión preferida, la longitud de la sonda de oligonucleótido puede
ser hasta de 60 bases. Una sonda de oligonucleótido altamente
preferida tiene la longitud y la secuencia de SEQ ID NO:1. Ciertas
versiones de la composición de la sonda inventada incluyen una marca
detectable en la sonda de oligonucleótido. Por ejemplo, cuando la
sonda de oligonucleótido tiene una longitud de hasta 60 nucleótidos,
la sonda de oligonucleótido puede incluir una marca detectable.
Alternativamente, cuando la sonda de oligonucleótido tiene la
secuencia de SEQ ID NO:1, puede incluirse una marca detectable.
Independientemente de si la composición de la sonda incluye una
sonda de oligonucleótido marcada de 17-100
nucleótidos de longitud, ó de 17-60 nucleótidos de
longitud, o teniendo la secuencia de SEQ ID NO:1, la marca
detectable puede ser, o bien una marca quimioluminiscente (tal como
un éster de acridinio) o bien una marca radiactiva. Se prefiere que
estas sondas de oligonucleótidos marcadas se empleen en combinación
con por lo menos un oligonucleótido auxiliar que facilite la
formación del dúplex sonda:diana detectable en condiciones de
hibridación altamente restrictivas. Por lo menos uno de los
oligonucloeótidos auxiliares puede incluir por lo menos un análogo
de nucleótido. Un ejemplo de análogo de nucleótido altamente
preferido sería uno en el cual un grupo ribosa tiene un grupo
metoxilo situado en la posición 2'. En una versión altamente
preferida de la invención, la sonda de oligonucleótido marcada,
independientemente de su longitud, se emplea en combinación con por
lo menos un oligonucleótido auxiliar que tiene la secuencia de SEQ
ID NO:2 ó SEQ ID NO:3.
Todavía otro aspecto de la invención se refiere
a un método para la detección de la presencia de bacterias
actinomicetos en una muestra de ensayo. Este método comprende los
pasos para la provisión a dicha muestra de ensayo, de la
composición de una sonda que comprende una sonda de oligonucleótido
que hibrida en condiciones altamente restrictivas con una región
diana de un ácido nucleico de actinomicetos correspondiente a las
posiciones 1986-2064E de un nucleótido de ARNr 23S
de E.coli, para formar un dúplex diana:sonda detectable,
teniendo dicha sonda de oligonucleótido una longitud de hasta 100
bases de nucleótido y comprendiendo por lo menos 25 nucleótidos
contiguos contenidos en la secuencia SEQ ID NO:10 ó el complemento
de la misma, y en donde en dichas condiciones de hibridación, dicha
sonda de oligonucleótidos hibrida específicamente con los ácidos
nucleicos presentes en Corynebacterium aquaticum,
Corynebacterium jeikieum, Corynebacterium xerosis, Micrococcus
luteus, Propionibacterium acnes, Mycobacterium chelonae,
Mycobacterium terrae, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium
simiae, Mycobacterium avium, Mycobacterium scrofulaceum,
Mycobacterium gordonae, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium
smegatis, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium gastri,
Mycobacterium xenopi, Mycobacterium marinum y Mycobacterium
phlei. A continuación, la mezcla resultante se hibrida en
condiciones altamente restrictivas, de manera que cualquier ácido
nucleico de actinomicetos que pueda estar presente en la muestra de
ensayo, se combina con la composición de la sonda para formar un
dúplex sonda: diana. Finalmente, el método comprende la detección
del dúplex sonda:diana como un indicador de la presencia de
bacterias actinomicetos en la muestra de ensayo. En una versión del
método inventado, la muestra de ensayo incluye bacterias, y se
efectúa un paso preliminar para liberar el ácido nucleico de todas
las bacterias que puedan estar presentes en dicha muestra de ensayo.
En una versión diferente del método, la muestra de ensayo es un
lisado. En general, las condiciones de hibridación altamente
restrictivas pueden ser proporcionadas o bien mediante (a) un tampón
de fosfato de sodio 0,48%, 0,1% de dodecil sulfato de sodio y 1 mM
de cada uno de EDTA y EGTA, ó mediante (b) 0,6 M de LiCl, 1% de
lauril sulfato de litio, 60 mM de succinato de litio y 10 mM de
cada uno de EDTA y EGTA. Sin embargo, se comprende que otras
condiciones de hibridación altamente restrictivas pueden dar también
buenos resultados. En una versión preferida, la sonda de
oligonucleótido empleada en el método inventado tiene la longitud y
la secuencia de SEQ ID NO:1. Cuando este es el caso, la sonda de
oligonucleótido puede incluir una marca detectable. En una versión
altamente preferida, la sonda de oligonucleótido marcada tiene la
secuencia SEQ ID NO:1, la marca sobre la sonda es un éster de
acridinio, y el paso de detección en el método inventado comprende
la realización de una luminometría para detectar los dúplex sonda:
diana. En casos en que la sonda de oligonucleótido marcada tiene
la secuencia de SEQ ID NO:1, la composición de la sonda puede
incluir además por lo menos un oligonucleótido auxiliar que
facilita la formación de los dúplex sonda:diana. Ejemplos de
oligonucleótidos auxiliares están contenidos en las secuencias de
SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3.
Todavía otro aspecto de la invención se refiere
a un kit que puede emplearse para la detección de la presencia de
ácidos nucleicos de actinomicetos en una muestra de ensayo. El kit
contiene una composición de sonda que incluye una sonda de
oligonucleótido que hibrida en condiciones altamente restrictivas
con una región diana del ácido nucleico de los actinomicetos
correspondiente a las posiciones 1986-2064 del
nucleótido ARNr 23S de E. coli, para formar un dúplex
diana:sonda detectable. La sonda de oligonucleótido tiene una
longitud de hasta 100 bases de nucleótidos e incluye por lo menos
25 nucleótidos contiguos contenidos dentro de la secuencia SEQ ID
NO:10 ó el complemento de la misma. En las condiciones de
hibridación altamente restrictivas, la sonda de oligonucleótido
hibrida específicamente con los ácidos nucleicos presentes en
Corynebacterium aquaticum, Corynebacterium jeikieum,
Corynebacterium xerosis, Micrococcus luteus, Propionibacterium
acnes, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium terrae, Mycobacterium
intracellulare, Mycobacterium simiae, Mycobacterium avium,
Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium
kansasii, Mycobacterium smegatis, Mycobacterium fortuitum,
Mycobacterium gastri, Mycobacterium xenopi, Mycobacterium
marinum y Mycobacterium phlei. Además, el kit inventado
incluye instrucciones impresas especificando en el orden de
aplicación, los pasos a seguir para la detección del ácido nucleico
de actynomicetos, mediante la detección de un complejo entre la
sonda de oligonucleótido y un ácido nucleico diana de actynomicetos.
Tanto la composición de la sonda como las instrucciones impresas
están en una combinación envasada que comprende los dos.
Como se emplea en la presente, los siguientes
términos tienen los significados que se describen, a no ser que se
diga expresamente otra cosa.
Un "nucleótido" es una subunidad de un
ácido nucleico, y consiste en un grupo fosfato, un azúcar de 5
átomos de carbono y una base nitrogenada. El azúcar de 5 átomos de
carbono encontrado en el ARN es la ribosa. En el ADN, el azúcar de
5 átomos de carbono es la 2'-desoxirribosa. El
azúcar de un 5'-nucleótido contiene un grupo
hidroxilo (-OH) en la posición 5' del carbono-5. El
término incluye también los análogos de los nucleótidos tal como se
encuentran en la naturaleza y particularmente incluye los análogos
que tienen un grupo metoxilo en la posición 2' de la ribosa (OMe).
Como se emplea en la presente, los metoxi oligonucleótidos que
contienen radicales "T" tienen un grupo metoxi en la posición
2' del grupo ribosa y un uracilo en la posición de la base del
nucleótido.
Una "unidad no nucleótido" es una unidad
que no participa significativamente en la hibridación de un
polímero. Estas unidades no deben, por ejemplo, participar en
ninguna unión significativa de hidrógeno con un nucleótido y
excluirían las unidades que tienen como componente una de las cinco
bases de nucleótidos o análogos de los mismos.
Un "oligonucleótido" es un polímero de un
nucleótido que tiene dos o más subunidades nucleótido unidas
covalentemente entre sí. Los oligonucleótidos tienen generalmente
de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 nucleótidos de
longitud. Los grupos azúcar de las subunidades nucleótido pueden ser
ribosa, desoxirribosa o derivados modificados de los mismos tales
como OMe. Las subunidades nucleótido pueden juntarse mediante
enlaces tales como enlaces fosfodiéster, enlaces modificados o
mediante grupos nonucleótidos que no evitan la hibridación del
oligonucleótido con su secuencia nucleótido diana complementaria.
Los enlaces modificados incluyen aquellos en los cuales un enlace
estándar fosfodiéster es reemplazado con un enlace diferente, tal
como un enlace fosforotioato, un enlace metilfosfonato, o un enlace
peptídico neutro. Los análogos de la base nitrogenada pueden ser
también componentes de oligonucleótidos de acuerdo con la
invención.
Un "ácido nucleico diana" es un ácido
nucleico que comprende una secuencia diana de ácido nucleico.
Una "secuencia de ácido nucleico diana",
"secuencia de nucleótidos diana" ó "secuencia diana" es
una secuencia de desoxirribonucleótidos o de ribonucleótidos
específicos que puede ser hibridada mediante un oligonucleótido.
Una "sonda de oligonucleótido" es un
oligonucleótido que tiene una secuencia de ácido nucleico lo
suficientemente complementaria para que su secuencia diana de ácido
nucleico sea capaz de formar un dúplex sonda:diana híbrido
detectable en condiciones de hibridación altamente restrictivas. Una
sonda de oligonucleótido es una especie química aislada y puede
incluir nucleótidos adicionales fuera de la región diana de tal
longitud para que los nucleótidos no eviten la hibridación en las
condiciones altamente restrictivas de hibridación. Las secuencias
no complementarias tales como secuencias promotoras, sitios de
reconocimiento de endonucleasa de restricción, o secuencias que
confieren una deseable estructura secundaria o terciaria tales como
un sitio catalítico activo, pueden emplearse para facilitar la
detección empleando las sondas inventadas. Una sonda de
oligonucleótido puede marcarse opcionalmente con un grupo
detectable tal como un radioisótopo, un grupo fluorescente, un grupo
quimioluminiscente, una enzima o un ligando, los cuales pueden
emplearse para detectar o confirmar la hibridación de la sonda con
su secuencia diana. Las sondas de oligonucleótido se prefiere que
estén en el margen de tamaño de 10 a 100 nucleótidos de
longitud.
longitud.
Un "grupo detectable" es una molécula unida
a, o sintetizada como una parte de, una sonda de ácido nucleico.
Esta molécula debe ser inequívocamente detectable y debe permitir
que la sonda sea detectable como un resultado. Estos grupos
detectables son a menudo radioisótopos, moléculas
quimioluminiscentes, enzimas, haptenos o incluso una secuencia
oligonucleótido única.
Un "híbrido" o un "dúplex" es un
complejo formado entre dos secuencias de ácido nucleico
monocatenarias, de pares de bases Watson-Crick o
pares de bases no canónicas entre las bases complementarias.
"Hibridación" es el procedimiento por el
cual dos cadenas complementarias de ácido nucleico se combinan para
formar una estructura de doble cadena ("híbrido o dúplex").
"Complementario" es una propiedad conferida
por la secuencia de bases de un ADN ó ARN monocatenario, los cuales
pueden formar un híbrido o un ADN:ADN, ARN:ARN ó ADN:ARN de doble
cadena, a través de enlaces hidrógeno entre pares de bases
Watson-Crick sobre las respectivas cadenas. La
adenina (A) complementa habitualmente la timina (T) ó uracilo (U),
mientras la guanina (G) complementa habitualmente la citosina
(C).
"Emparejamiento" se refiere a cualquier
apareamiento en un híbrido, de dos nucleótidos que no forman enlaces
canónicos de hidrógeno Watson-Crick. Además, para
los fines de las descripciones que siguen, un emparejamiento puede
incluir una inserción o deleción en una cadena del híbrido que
resulta en un(os) nucleótido(s) no
apareado(s).
El término "restrictividad" se emplea para
describir la temperatura y composición del disolvente existentes
durante la hibridación y los subsiguientes pasos del proceso. En
condiciones altamente restrictivas, sólo se formarán híbridos de
ácido nucleico altamente complementarios; los híbridos sin un
suficiente grado de complementariedad no se formarán. En
consecuencia, la restrictividad de las condiciones de ensayo
determina la cantidad de complementariedad necesaria entre dos
cadenas de ácido nucleico que forman un híbrido. Las condiciones de
restrictividad se escogen para maximizar la diferencia de
estabilidad entre el híbrido formado con la diana y el ácido
nucleico no-diana. Ejemplos de condiciones altamente
restrictivas figuran en los ejemplos de trabajo.
El término "especificidad de la sonda" se
refiere a las características de una sonda que definen su capacidad
para distinguir secuencias diana de secuencias
no-diana.
El término "región variable" se refiere a
un polímero nucleótido que difiere mediante por lo menos una base
entre el organismo diana y organismos no-diana
contenidos en la muestra.
Una "región conservada" es una subsecuencia
de ácido nucleico que no es variable entre por lo menos dos
diferentes polinucleótidos.
"Bacterias" son miembros del grupo
filogenético eubacterias, el cual se considera uno de los tres
reinos primarios.
El término "divergencia de secuencias" se
refiere a un proceso mediante el cual los polímeros de nucleótidos
se vuelven menos similares durante la evolución.
El término "convergencia de secuencias" se
refiere a un proceso mediante el cual los polímeros de nucleótidos
se vuelven más similares durante la evolución.
"Tm" se refiere a la temperatura a la cual
el 50% de la sonda se ha convertido de la forma hibridada a la
forma no hibridada.
Un "oligonucleótido auxiliar" es un
oligonucleótido que se une a una región de un ácido nucleico diana
distinta de la región que está unida mediante una sonda de
oligonucleótido. Los oligonucleótidos auxiliares imponen nuevas
estructuras secundarias y terciarias sobre la región diana del ácido
nucleico monocatenario de forma que la velocidad de unión de la
sonda de oligonucleótido se acelera. Aunque los oligonucleótidos
auxiliares no estén marcados con una marca detectable, cuando se
emplean juntamente con sondas de oligonucleótido marcadas,
facilitan la unión de las sondas marcadas y así potencian
indirectamenre las señales de hibridación.
Las frases "consiste esencialmente de" ó
"que consisten esencialmente de", significan que el
oligonucleótido tiene una secuencia de nucleótidos substancialmente
similar a una secuencia de nucleótidos especificada. Cualesquiera
adiciones o supresiones son variaciones, pero no de material, de la
secuencia de nucleótidos especificada que no evitan que el
oligonucleótido tenga su reivindicada propiedad, tal como ser capaz
de hibridar con preferencia en condiciones altamente restrictivas
con su ácido nucleico diana sobre ácidos nucleicos
no-diana.
Una persona experta en la técnica comprenderá
que las sondas de la invención que substancialmente corresponden,
pueden variar de la referida secuencia e hibridan todavía con la
misma secuencia de ácido nucleico diana. Esta variación del ácido
nucleico puede especificarse en términos de un porcentaje de
idénticas bases dentro de la secuencia o el porcentaje de bases
perfectamente complementarias entre la sonda y su secuencia diana.
Las sondas de la presente invención corresponden substancialmente a
la secuencia de ácido nucleico si estos porcentajes son del 100% al
80% ó de 0 emparejamientos de bases en una secuencia diana de 10
nucleótidos a 2 bases emparejadas en una secuencia diana de 10
nucleótidos. En versiones preferidas, el porcentaje es de 100% a
85%. En versiones más preferidas, este porcentaje es del 90% al
100%; en otras versiones preferidas este porcentaje es del 95% al
100%.
Por "suficiente complementariedad" o
"substancialmente complementarios" se entienden ácidos
nucleicos que tienen una suficiente cantidad de nucleótidos
contiguos complementarios para formar en condiciones de hibridación
altamente restrictivas, un híbrido que es estable para la
detección.
Por "híbrido de ácido nucleico" o "dúplex
sonda:diana" se entiende una estructura que es una estructura de
doble cadena, unida por hidrógeno, de preferencia de 10 a 100
nucleótidos de longitud, con más preferencia de 14 a 50 nucleótidos
de longitud. La estructura es lo suficiente estable para ser
detectada por medios tales como una detección con luz
quimioluminiscente o fluorescente, autorradiografía, análisis
electroquímico o electroforesis sobre gel. Dichos híbridos incluyen
las moléculas dúplex ARN:ARN, ARN:ADN ó ADN:ADN.
Por "sentido negativo" se entiende una
molécula de ácido nucleico perfectamente complementaria a una
molécula de ácido nucleico de referencia (es decir, un
sentido).
"ARN y ADN equivalentes" se refiere a
moléculas de ARN y ADN que tienen las mismas propiedades de
hibridación con pares de bases complementarias. Los ARN y ADN
equivalentes tienen diferentes grupos azúcar (es decir, ribosa en
lugar de desoxirribosa) y pueden diferir por la presencia de uracilo
en el ARN y timina en el ADN. Las diferencias entre los ARN y ADN
equivalentes no contribuyen a diferencias en las secuencias de
ácidos nucleicos substancialmente correspondientes, debido a que
los equivalentes tienen el mismo grado de complementariedad con una
secuencia particular.
Por "hibridar de preferencia" significa que
en condiciones de hibridación altamente restrictivas, las sondas de
oligonucleótidos pueden hibridar sus ácido nucleicos diana para
formar híbridos sonda:diana estables (indicando con ello la
presencia de ácidos nucleicos diana) sin formar híbridos sonda:no
diana estables (que indicarían la presencia de ácidos nucleicos
no-diana de otros organismos). De esta forma, la
sonda hibrida con el ácido nucleico diana en una extensión lo
suficientemente más grande que con el ácido nucleico
no-diana, para permitir a un experto en la técnica
el detectar exactamente la presencia de bacterias actinomicetos y
distinguir su presencia de la de otros organismos. La preferente
hibridación puede medirse empleando técnicas ya conocidas en la
especialidad y descritas en la presente. Por ejemplo, cuando se
compara con la hibridación con los ácidos nucleicos de C.
albicans, las sondas de oligonucleótidos de la invención
hibridan de preferencia los ácidos nucleicos de los actinomicetos
en una proporción aproximada de 100 a 2.000 veces más.
Una "región de secuencias de ácido nucleico
diana" de actinomicetos, se refiere a una secuencia de ácido
nucleico presente en el ácido nucleico de las bacterias
actinomicetos o una secuencia complementaria de la misma, la cual
no está presente en los ácidos nucleicos de otras especies. Ácidos
nucleicos que tienen secuencias de nucleótidos complementarias con
una secuencia diana, pueden generarse mediante técnicas de
amplificación diana tales como la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) ó amplificación inducida por transcripción (por
ejemplo Kacian y Fultz, Nucleic Acid Sequence Amplification Methods
("Métodos de amplificación de la secuencia de un ácido
nucleico"), patente US nº 5.824.518).
La figura 1 muestra la alineación de una sonda
de oligonucleótido y dos oligonucleótidos auxiliares con una
colección de secuencias diana positivamente reactivas y no
reactivas.
En la presente describimos secuencias preferidas
de nucleótidos diana para sondas de oligonucleótido y
oligonucleótidos auxiliares que pueden emplearse para detectar e
identificar ARNr ó ADNr de bacterias actinomicetos. Se describen
particularmente, sondas de polinucleótido altamente preferidas y
oligonucleótidos auxiliares accesorios que son útiles para detectar
específicamente los actinomicetos. Las sondas, que son
complementarias a secuencias particulares de ARNr del ARNr 23S,
tienen la ventaja de que son capaces de distinguir los actinomicetos
de los vecinos filogenéticamente más próximos conocidos.
Además de tener secuencias de ácido nucleico que
permiten la hibridación con las secuencias de ARN ribosómico (ARNr)
ó ADN ribosómico (ADNr) de las bacterias actinomicetos, las sondas
de oligonucleótido de la invención son por lo menos el 90%
complementarias, de preferencia perfectamente complementarias, para
por lo menos una parte de la región de secuencias diana descrita,
identificada por SEQ ID NO:11. Dicha parte tiene de preferencia por
lo menos, 17 nucleótidos de longitud, con mayor preferencia por lo
menos, 25 nucleótidos de longitud, y todavía con mayor preferencia
por lo menos, 29 nucleótidos de longitud.
Como se ha indicado más arriba, los
oligonucleótidos inventados se dirigen a las secuencias de ácido
nucleico diana de las bacterias actinomicetos. Estos
oligonucleótidos pueden emplearse como sondas que hibridan
preferentemente con una región diana del ácido nucleico de los
actinomicetos, para formar un dúplex detectable que indica la
presencia de bacterias actinomicetos. Alternativamente, los
oligonucleótidos inventados pueden emplearse como oligonucleótidos
auxiliares que hibridan con la región diana del ácido nucleico de
los actinomicetos en condiciones de hibridación altamente
restrictivas, y que pueden potenciar la formación de un dúplex entre
una sonda de oligonucleótido marcada y su ácido nucleico diana
complementario.
En versiones preferidas, las sondas de
oligonucleótidos descritas en la presente hibridan selectivamente
con los ácidos nucleicos de bacterias actinomicetos, con
preferencia a los de otros organismos en condiciones de hibridación
altamente restrictivas. En algunas versiones de la presente
invención, la sonda de oligonucleótido comprende un grupo
detectable tal como un éster de acridinio o un radioisótopo.
Los métodos preferidos para la detección de la
presencia de bacterias actinomicetos incluyen el paso de la puesta
en contacto de una muestra de ensayo en condiciones de hibridación
altamente restrictivas con una sonda de oligonucleótido que de
preferencia hibrida con una secuencia diana del ácido nucleico de
actinomicetos, en lugar de una secuencia del ácido nucleico de
otros organismos. De preferencia, la secuencia diana del ácido
nucleico es completamente complementaria a una secuencia de por lo
menos 17 nucleótidos contiguos, con más preferencia por lo menos 25
nucleótidos contiguos, y todavía con mayor preferencia por lo menos,
29 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia dada por SEQ ID
NO:11. Así, los oligonucleótidos de utilidad en conexión con la
invención tienen de preferencia hasta 100 nucleótidos de longitud y
tienen por lo menos 17 nucleótidos contiguos, con mayor preferencia
por lo menos 25 nucleótidos contiguos y todavía con mayor
preferencia, por lo menos 29 nucleótidos contiguos contenidos en la
secuencia dada por
GGTCTTTCCGTCCTGCCGCGCGTAACGAGCATCTTTACTCGTAGTGCAATTTCGCCGAGT
CTGTGGTTGAGACAGTGGG (SEQ ID NO:10) ó el complemento de la misma. Los
oligonucleótidos pueden ser equivalentes a ARN y ADN, y pueden
contener análogos de nucleótidos.
En el desarrollo de la invención fueron
alineadas secuencias de ARNr de una colección de organismos afines
y sin afinidad, para identificar secuencias conservadas candidatas
presentes en el ARNr 23S que podrían emplearse para distinguir los
organismos actinomicetos de otras bacterias así como de organismos
eucariotas. Las secuencias de ARNr ó ADNr de los actinomicetos y
vecinos filogenéticos distantes fueron alineados para descubrir
áreas de la máxima homología. Regiones homólogas fueron examinadas
para detectar la variación de secuencias con el fin de identificar
las secuencias de ARNr que fueron conservadas entre los
actinomicetos y que mostraron emparejamientos con otros géneros
íntimamente y lejanamente afines. Las secuencias deducidas como
sondas candidatos de acuerdo con los métodos descritos más
adelante, fueron finalmente ensayadas frente a un panel de
estándares de ARNr y lisados de bacterias para verificar su
utilidad como sondas en las condiciones del laboratorio.
Las secuencias de polinucleótidos de ARNr se
determinan más convenientemente empleando un procedimiento de
secuenciado de los didesoxinucleótidos. En este procedimiento,
cebadores oligonucleótidos de aproximadamente
10-100 bases de longitud y complementarios a las
regiones conservadas de ARNr de cualquiera de las subunidades 5S,
16S ó 23S del ribosoma, pueden extenderse mediante transcriptasa
inversa. Los productos de la extensión de ADN resultante pueden a
continuación secuenciarse, bien mediante degradación química o bien
mediante secuenciado del didesoxinucleótido (Lane et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6955 (1985)). De
acuerdo con otro método preferido, pueden también determinarse las
secuencias genómicas que codifican el ARNr.
La fuerte interdependencia de la estructura
secundaria y la función de las moléculas de ARNr es ya bien
conocida. En efecto, se restringen eficazmente los cambios
evolutivos de la secuencia primaria del ARNr de manera que la
estructura secundaria de la molécula se mantenga. Por ejemplo, si
una base es cambiada en un lado de la hélice de una molécula de
ARNr, tiene lugar a continuación un cambio compensador en el otro
lado de la hélice para mantener la complementariedad (lo cual
recibe el nombre de covariancia). Esta relación permite
"alinear" dos secuencias de ARNr muy diferentes, basándose en
la secuencia primaria conservada y los elementos conservados de la
estructura secundaria. Una vez las secuencias han sido alineadas
resulta posible identificar las regiones conservadas y variables de
la secuencia de ARNr.
Las regiones variables de los ARNr se
identificaron mediante análisis comparativo empleando secuencias de
ARNr ya publicadas y las secuencias que fueron determinadas durante
el desarrollo de la presente invención. Puede emplearse o adaptarse
software comercialmente disponible para la finalidad descrita en la
presente. Dado que la evolución de la secuencia en cada una de las
regiones variables (por ejemplo, abarcando un mínimo de 10
nucleótidos) de ARNr es, en la mayor parte divergente y no
convergente, podemos con toda confianza diseñar sondas basadas en
unas pocas secuencias de ARNr que difieren entre el organismo diana
y sus elementos afines filogenéticamente más íntimos. En efecto,
hemos detectado suficiente variación entre las secuencias de ARNr
de numerosos organismos diana y sus más íntimos elementos afines
filogenéticamente en una muestra única para permitir el diseño de
una sonda que pudiera emplearse de acuerdo con los métodos descritos
más adelante.
Pueden emplearse las siguientes normas generales
para diseñar las sondas que tengan características deseables de
acuerdo con la presente invención. La manipulación de uno o más de
los muchos factores que influyen sobre la extensión y especificidad
de una reacción de hibridación puede determinar la sensibilidad y
especificidad de una sonda en particular. Esto es así tanto si la
sonda es perfectamente complementaria en toda la longitud de la
secuencia diana del polinucleótido como si no lo es. A continuación
se exponen las normas para la preparación de las sondas útiles en
conexión con la invención.
En primer lugar, la estabilidad del híbrido
sonda:ácido nucleico diana, debe escogerse de manera que sea
compatible con las condiciones del ensayo. Esto puede realizarse
evitando largas secuencias ricas en A y T, terminando los híbridos
con pares de bases G:C y diseñando la sonda de manera que la Tm sea
la apropiada para las condiciones estándar a emplear en el ensayo.
La secuencia de nucleótidos de la sonda debería escogerse de manera
que la longitud y el % de G y el % de C den por resultado una sonda
que tenga un Tm aproximadamente 2-10ºC más alto
que la temperatura a la cual se efectuará el ensayo final. La
composición de bases de la sonda es importante debido a que los
pares de bases G:C tienen mayor estabilidad térmica cuando se las
compara con los pares de bases A:T ó A:U. Así, los híbridos que
implican ácidos nucleicos complementarios que tienen un alto
contenido de G:C serán estables a altas temperaturas cuando se
comparan con híbridos que tienen un contenido G:C más bajo.
Las condiciones de fuerza iónica y temperatura a
las cuales una reacción de hibridación se efectuará también deben
ser consideradas cuando se diseña una sonda que tiene una estructura
cargada negativamente, tal como se conseguiría mediante uniones
fosfodiéster entre los nucleótidos. Es generalmente conocido que la
velocidad de hibridación aumenta cuando la fuerza iónica de la
mezcla de reacción aumenta. De manera similar, la estabilidad
térmica de los híbridos aumenta con el aumento de la fuerza iónica.
A la inversa, los reactivos que rompen el enlace hidrógeno tales
como la formamida, urea, DMSO y los alcoholes aumentan la
restrictividad de la hibridación. La desestabilización de los
enlaces de hidrógeno mediante reactivos de esta clase puede reducir
grandemente la Tm. En general, la hibridación óptima para las sondas
de oligonucleótidos sintéticas de aproximadamente
10-50 bases de longitud, tiene lugar aproximadamente
5ºC por debajo de la temperatura de fusión para un dúplex dado. Las
reacciones de hibridación efectuadas por debajo del óptimo de
temperatura pueden permitir que secuencias de base emparejadas
hibriden y se obtenga como resultado una especificidad reducida de
la sonda.
En segundo lugar, la posición a la cual la sonda
se une con su polinucleótido diana debe escogerse para minimizar la
estabilidad de los híbridos formados entre los sonda:
polinucleótidos no-diana. Esto puede lograrse
minimizando la longitud de los complementariamente perfectos con
los polinucleótidos de organismos no-diana, evitando
las regiones de homología ricas en G:C con secuencias
no-diana, y mediante el posicionamiento de la sonda
para extender los emparejamientos desestabilizantes tanto como sea
posible. El que una secuencia de la sonda sea útil para la
detección de sólo un tipo específico de organismo, depende en gran
manera de las diferencias de estabilidad térmica entre los híbridos
sonda:diana y los híbridos sonda: no diana. Las diferencias en la
Tm deben ser tan grandes como sea posible para producir sondas de
alta especificidad.
La longitud de la secuencia de ácido nucleico
diana y la longitud correspondiente de la secuencia de la sonda son
también factores importantes a ser considerados cuando se diseña una
sonda útil para la detección específica de actinomicetos. Mientras
que es posible para los polinucleótidos que no son perfectamente
complementarios, hibridar entre sí, el tramo más largo de la
secuencia de bases perfectamente homologa será habitualmente el
determinante primario de la estabilidad del híbrido.
En tercer lugar, las regiones de ARNr que son
conocidas por formar fuertes estructuras internas inhibidoras de la
hibridación de una sonda, son menos preferidas como dianas. Las
sondas que tienen una extensiva autocomplementariedad deben también
ser evitadas. Como se ha indicado más arriba, la hibridación es la
asociación de dos cadenas sencillas de ácido nucleico
complementario para formar una estructura de doble cadena unida por
hidrógenos. Si una de las dos cadenas es completamente o
parcialmente de doble cadena, entonces será menos capaz de
participar en la formación de un nuevo híbrido. Es importante que
todas las moléculas de ARNr formen híbridos intramoleculares muy
estables.
La velocidad y extensión de la hibridación entre
una sonda y su diana puede aumentarse substancialmente mediante el
diseño de una sonda tal que una porción substancial de la secuencia
de interés es monocatenaria. Si el ácido nucleico diana que hay que
detectar es una secuencia genómica que codifica un RNAr, entonces
esta diana estará naturalmente en forma de una doble cadena. Este
es también el caso con los productos de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR). Estas dianas de doble cadena son naturalmente
inhibidoras de la hibridación con una sonda. Finalmente, pueden
formarse híbridos indeseables intramolecularmente e
intermolecularmente entre una sola molécula de la sonda o entre
diferentes moléculas de la sonda si hay suficiente
autocomplementariedad. Así, una autocomplementariedad extensiva en
una secuencia de una sonda debe evitarse.
\newpage
De preferencia, las sondas útiles para efectuar
los procedimientos descritos más adelante, hibridarán solamente en
condiciones altamente restrictivas. En estas condiciones solamente
se formarán híbridos de ácido nucleico altamente complementarios
(es decir, los que tienen por lo menos 14 a 17 bases en una serie
contigua de bases siendo complementaria). Los híbridos no se
formarán en ausencia de un suficiente grado de complementariedad.
En consecuencia, la restrictividad de las condiciones de ensayo
determina la cantidad de complementariedad necesaria entre dos
cadenas de ácido nucleico que forman un híbrido. La restrictividad
se escoge para maximizar la diferencia de estabilidad entre el
híbrido formado con el ácido nucleico diana y el ácido nucleico
no-diana. Ejemplos de condiciones altamente
restrictivas se emplean en los ejemplos que se describen más
adelante.
Mientras las sondas de oligonucleótidos de
diferentes longitudes y composición de bases, puede emplearse para
la detección de los actinomicetos, las sondas preferidas en esta
invención tienen longitudes de hasta 100 nucleótidos y con más
preferencia 60 nucleótidos. Los márgenes de longitud preferidos para
los oligonucleótidos inventados son de 10 a 100 bases de longitud,
o con mayor preferencia, de 15 a 50 bases de longitud y son
suficientemente homólogas con el ácido nucleico diana para permitir
la hibridación en condiciones altamente restrictivas tales como las
empleadas en los ejemplos que se describen más adelante. Sin
embargo, las secuencias específicas de la sonda que se describen
más adelante pueden también ser proporcionadas en un vector de
clonación o transcripto de un ácido nucleico, u otro ácido nucleico
más largo y todavía puede emplearse para detectar miembros de los
actinomicetos.
Todos los oligonucleótidos de la presente
invención pueden modificarse con grupos químicos para potenciar su
rendimiento. Así, hay que comprender que las referencias a "sondas
de oligonucleótidos" u " oligonucleótidos auxiliares" ó
simplemente "oligonucleótidos" abarcan los polímeros de
nucleótidos naturales así como los polímeros que incluyen por lo
menos un análogo de nucleótido.
Oligonucleótidos de estructura modificada, tales
como los que contienen grupos fosforotionato o metilfosfonato, son
ejemplos de análogos que pueden emplearse junto con los
oligonucleótidos de la presente invención. Estas modificaciones
convierten a los oligonucleótidos en resistentes a la actividad
nucleolítica de ciertas polimerasas o a la nucleasa enzima. Otros
análogos que pueden incorporarse en las estructuras de los
oligonucleótidos descritos en la presente, incluyen los ácidos
péptido nucleicos, ó "APN". Los "APN" son compuestos que
comprenden ligandos unidos a una estructura de péptido más bien que
a una estructura de fosfodiéster. Los ligandos representativos
incluyen o bien las cuatro principales bases de ADN que se
encuentran en la naturaleza (a saber, timina, citosina, adenina o
guanina) u otras nucleobases que se encuentran en la naturaleza (p.
ej., inosina, uracilo,
5-metil-citosina o tiouracilo) ó
bases artificiales (p. ej., bromotimina, azaadeninas o azaguaninas,
etc.) unidas a una estructura de péptido a través de un empalme
adecuado. Los APN son capaces de unir complementariamente las
cadenas de ADNss y ARN. Métodos para obtener y emplear los APN
están descritos en la patente U.S. nº 5.539.082. Otro tipo de
modificación que puede emplearse para obtener oligonucleótidos que
tengan las secuencias descritas en la presente implica el empleo de
empalmes no-nucleótidos (p. ej., Arnold et
al., "Non-Nucleotide Linking Reagents for
Nucleotide Probes" ("Reactivos de unión con
no-nucleótidos para sondas de nucleótidos",
patente U.S. nº 6.031.091, incorporados entre nucleótidos en la
cadena de ácido nucleico, los cuales no interfieren con la
hibridación o la prolongación de un
cebador.
cebador.
Una composición que incluye una sonda de
oligonucleótido, bien sea sola o en combinación con uno o más
oligonucleótidos auxiliares, puede emplearse para la detección del
ARNr ó ADNr de bacterias de actinomicetos en un ensayo de
hibridación. Oligonucleótidos definidos que pueden emplearse para la
puesta en práctica de la invención pueden obtenerse mediante
cualquiera de los diferentes métodos ya bien conocidos, incluyendo
la síntesis química en fase sólida automatizada empleando
precursores de la cianoetilfosforamidita (Barone et al.,
Nucl. Acids Res. 12:4051 (1984). Otros métodos bien
conocidos para la preparación de oligonucleótidos sintéticos pueden
ser también empleados.
Esencialmente, cualquier marcado y sistema de
detección que pueden emplearse para la monitorización de la
hibridación específica de ácido nucleico puede emplearse junto con
la sondas descritas en la presente cuando se desea una sonda
marcada. Incluidas entre la colección de marcas útiles están: las
marcas isotópicas, enzimas, haptenos, oligonucleótidos empalmados,
moléculas quimioluminiscentes y grupos redox activos que son aptos
para los métodos de detección electroquímica. Marcas de isótopos
estándar que pueden emplearse para producir oligonucleótidos
marcados incluyen los H^{3}, S^{35}, P^{32}, I^{125},
Co^{57} y C^{14}. Cuando se emplean sondas marcadas
radiactivamente los híbridos pueden ser detectados por
autorradiografía, contaje de centelleo o contaje gamma.
Materiales no isotópicos pueden también
emplearse para el marcado de sondas de oligonucleótidos. Estas
marcas no-isotópicas pueden colocarse internamente
o al final de la sonda de oligonucleótido. Los nucleótidos
modificados pueden incorporarse enzimaticamente o químicamente
pudiendo efectuarse las modificaciones de la sonda durante o
después de la síntesis, por ejemplo, mediante el empleo de grupos de
empalme no-nucleótidos. Marcas no isotópicas
incluyen las moléculas fluorescentes, moléculas quimioluminiscentes,
enzimas, cofactores, substratos de enzimas, haptenos u otros
ligandos. Los ésteres de acridinio son marcas no isotópicas
particularmente preferidas para la detección de híbridos de
sondas.
En efecto, puede emplearse cualquier número de
diferentes marcas no isotópicas para la preparación de
oligonucleótidos marcados de acuerdo con la invención. Las
moléculas quimioluminiscentes preferidas incluyen los ésteres de
acridinio del tipo descrito por Arnold et al., en la patente
U.S. nº 5.283.174 para emplear en conexión con ensayos de
protección homogéneos, y del tipo descrito por Woodhead et
al., en la patente U.S. nº 5.656.207 para emplear en conexión
con ensayos que cuantifican dianas múltiples en una sola reacción.
La patente U.S. 5.998.135 describe todavía otro método que puede
emplearse para el marcado y detección de sondas de la presente
invención empleando la fluorometría para detectar la emisión de
fluorescencia de marcas de metales lantánidos dispuestos en sondas,
en donde la emisión de estas marcas se potencia cuando están
situadas en íntima proximidad con un socio de transferencia de
energía. Métodos preferidos de marcado electroquímico y detección
están descritos en la patente U.S. n^{os} 5.591.578 y 5.770.369,
y la Patente Internacional publicada, nº PCT/US98/12082. Grupos
redox activos útiles como marcas electroquímicas en la presente
invención incluyen los metales de transición como Cd, Mg, Cu, Co,
Pd, Zn, Fe y Ru.
Aquellas personas que tienen un nivel normal de
expertos en la técnica, apreciarán que pueden emplearse
procedimientos alternativos para la detección de ácidos nucleicos
de las bacterias de actinomicetos empleando las sondas inventadas
utilizando o bien sondas marcadas o sondas sin marcar. Por ejemplo,
los métodos de ensayo de hibridación que no se basan en el empleo
de una sonda marcada están descritos en la patente U.S. nº
5.945.286, la cual describe la inmovilización de las sondas sin
marcar obtenidas de ácidos péptido nucleicos (APN) y detectablemente
marcadas intercalando moléculas que se unen a los dúplex de sonda
de APN de doble cadena/ácido nucleico diana. En estos
procedimientos así como en ciertos procedimientos de detección
electroquímica como los descritos en la Solicitud de la Patente
Internacional Publicada nº PCT/US98/12082 titulada "Detection of
Analytes Using Reorganization Energy" ("Detección de analitos
empleando energía de reorganización"), la Solicitud de Patente
Internacional publicada nº PCT/US98/12430 titulada "Electronic
Methods for the Detection of Analytes" ("Métodos electrónicos
para la detección de analitos"), y la Solicitud de Patente
Internacional publicada nº PCT/US97/20014 titulada "Electrodes
Linked Via Conductive Oligomers to Nucleic Acids" ("Electrodos
empalmados a ácidos nucleicos mediante oligómeros conductores"),
no es necesario que la sonda de oligonucleótido contenga una marca
detectable.
La aceptabilidad del producto final después de
la síntesis y purificación de un oligonucleótido puede verificarse
mediante uno cualquiera de diferentes procedimientos. En primer
lugar, puede emplearse la electroforesis sobre gel de
poliacrilamida para determinar el tamaño y pureza del
oligonucleótido de acuerdo con los métodos estándar de laboratorio
(ver Molecular Cloning: A Laboratory Manual ("Clonación
Molecular: Un Manual de Laboratorio"), Sambrook et al.,
eds. Cold Spring Harbor Lab. Publ., 11.51, (1989)).
Alternativamente, pueden emplearse procedimientos de cromatografía
líquida de alta presión ("HPLC") para la misma finalidad.
La hibridación entre la sonda de oligonucleótido
marcada, y el ácido nucleico diana en los procedimientos descritos
más adelante, puede potenciarse mediante el empleo de
"oligonucleótidos auxiliares" sin marcar, de acuerdo con el
procedimiento descrito por Hogan et al., en la patente U.S.
nº 5.030.557 titulada "Means and Methods for Enhancing Nucleic
Acid Hybridization" ("Medios y métodos para potenciar la
hibridación de ácidos nucleicos"). Como se ha indicado más
arriba, los oligonucleótidos auxiliares se unen a una región del
ácido nucleico distinta de la región a la que se une la sonda de
ensayo. Esta unión presupone nuevas estructuras secundaria y
terciaria en la región diana del ácido nucleico monocatenario, y
acelera la velocidad de unión de la sonda. Los oligonucleótidos
auxiliares que pueden emplearse en combinación con sondas de
oligonucleótidos marcadas de la presente invención, tienen de
preferencia de 17 a 100 nucleótidos de longitud y tienen una
secuencia que incluye por lo menos 17 nucleótidos contiguos
contenidos dentro de la secuencia de SEQ ID NO:10. Otros
oligonucleótidos auxiliares preferidos tienen longitudes de hasta
100 nucleótidos, e incluyen por lo menos 25 nucleótidos contiguos
contenidos dentro de la secuencia de SEQ ID NO:10.
Los expertos en la técnica apreciarán que
factores que afectan la estabilidad térmica de un híbrido
sonda:diana pueden influenciar también la especificidad de la
sonda. En consecuencia, el perfil de fusión, incluyendo la
temperatura de fusión (Tm) de los híbridos sonda:diana, debe
determinarse empíricamente para cada combinación sonda:diana. Un
método preferido para realizar esta determinación está descrita por
Arnold et al., en la patente U,S. nº 5.283.174 titulada
"Homogeneous Protection Assay" ("Ensayo de protección
homogénea").
Un método para la medición de Tm de un híbrido
sonda:diana consiste en efectuar un ensayo de protección de la
hibridación. De acuerdo con el método de este ensayo, un híbrido
sonda:diana se forma en condiciones de un exceso de la diana en una
solución tamponada de succinato de litio, conteniendo lauril sulfato
de litio. Se diluyen alícuotas del híbrido "preformado" en el
tampón de hibridación y se incuba durante cinco minutos a varias
temperaturas partiendo por debajo de la Tm anticipada (típicamente
55ºC) y aumentando en 2-5 grados de incremento.
Esta solución se diluye a continuación con un tampón de borato
débilmente alcalino y se incuba a una temperatura inferior (por
ejemplo 50ºC) durante diez minutos. Un éster de acridinio (AE) unido
a una sonda monocatenaria se hidrolizará en estas condiciones,
mientras que un éster de acridinio unido a una sonda hibridada
estará relativamente "protegido". Este procedimiento recibe el
nombre de ensayo de protección de la hibridación ("HPA"). La
cantidad de quimioluminiscencia que queda es proporcional a la
cantidad de híbrido y se mide en un luminómetro mediante la adición
de peróxido de hidrógeno seguida por la adición de álcali. Los
datos se registran en una gráfica como tanto por ciento de la señal
máxima (normalmente a partir de la temperatura mínima), con
respecto a la temperatura. La Tm se define como el punto de
temperatura en el cual queda el 50% de la señal máxima.
En un método alternativo, la Tm de un híbrido
sonda: diana puede determinarse empleando una muestra marcada con
un isótopo. En todos los casos la Tm para un híbrido dado variará en
función de la concentración de las sales, detergentes y otros
solutos contenidos en la solución de hibridación. Todos estos
factores influyen la estabilidad relativa del híbrido durante la
desnaturalización térmica (Molecular Cloning; A Laboratory
Manual ("Clonación molecular: Un manual de laboratorio"),
Sambrook et al., eds. Cold Spring Harbor Lab. Publ., 9.51
(1989)).
La velocidad a la cual una sonda hibrida con su
diana, es una medida de la estabilidad térmica de la estructura
secundaria de la diana en la región de la sonda, y puede
determinarse empleando C_{0}t_{1/2} mediciones. Estas
mediciones cinéticas de la velocidad de hibridación se expresan en
unidades de (moles de nucleótido por litro) x (segundos). Expresado
más simplemente, el valor C_{0}t_{1/2} es la concentración de la
sonda multiplicado por la vida media de la hibridación a dicha
concentración. Este valor puede determinarse hibridando varias
cantidades de sonda a una cantidad constante de ácido nucleico diana
durante un tiempo fijado. Por ejemplo 0,05 pmoles de diana se
incuban con 0,012, 0,025, 0,05, 0,1 y 0,2 pmoles de sonda durante
30 minutos. El C_{0}t_{1/2} puede también determinarse
hibridando la diana y la sonda en condiciones de un exceso de diana
y a continuación midiendo el aumento de formación del dúplex con el
tiempo. La cantidad de híbrido presente puede medirse empleando el
procedimiento HPA descrito más arriba, o mediante el contaje del
centelleo si se emplea una sonda marcada radiactivamente en el
procedimiento. La señal medida, cuando se emplea una sonda marcada
con AE, se registra a continuación en una gráfica como el logaritmo
del tanto por ciento del máximo de unidades de luz relativa
("RLU") a partir de la mayor concentración de sonda, con
respecto a la concentración de la sonda (moles de nucleótido por
litro). El valor C_{0}t_{1/2} se determina gráficamente a
partir de la concentración correspondiente al 50% de la hibridación
máxima multiplicado por el tiempo de duración de la hibridación en
segundos. Estos valores oscilan desde 9x10^{-6} hasta 9x10^{-5},
siendo los valores preferidos inferiores a 3,5x10^{-5}. Valores
similares pueden obtenerse midiendo la radiactividad y registrando
en una gráfica el % de hibridación en un momento del tiempo dado,
con respecto a la extensión máxima.
En un método preferido de determinación de si
una muestra biológica contiene ARNr ó ADNr, lo cual indicaría la
presencia de miembros de los actinomicetos, los ácidos nucleicos
pueden liberarse a partir de las células bacterianas mediante
disrupción sónica, por ejemplo de acuerdo con el método descrito por
Murphy et al., en la patente U.S. nº 5.374.522. Otros
métodos conocidos para la disrupción de las células incluyen el
empleo de enzimas, choque osmótico, tratamiento químico, y mezclado
en el Vortex con perlas de vidrio. Otros métodos adecuados para la
liberación de los ácidos nucleicos de microorganismos que pueden ser
sometidos a métodos de hibridación descritos en la presente, han
sido descritos por Clark et al. en la patente U.S. nº
5.837.452 y por Kacian et al., en la patente U.S. nº
5.5.364.763. Después de, o juntamente con, la liberación del ARNr,
puede añadirse la sonda marcada en presencia de agentes acelerantes
e incubarse a la temperatura óptima de hibridación durante un
período de tiempo necesario para lograr una reacción de hibridación
significativa.
La siguiente secuencia de polinucleótidos se
caracterizó mediante los criterios de longitud, Tm y secuencia de
nucleótidos y se descubrió que era específica para el ARNr de los
actinomicetos CGAGCATCTTTACTCGTAGTG
CAATTTCG (SEQ ID NO:1). Este polinucleótido, al que en la presente se le designa como MtuB2011 es complementario de un segmento único descubierto en el ARNr 23S de todos los actinomicetos. Una lista representativa de bacterias de actinomicetos puede encontrarse en la tabla 2. La sonda tiene 29 bases de longitud, tiene un empalme RXL entre 11 y 12 nucleótidos a partir del extremo 5' y tiene una Tm de 65,5ºC y ARNr hibridado del Mycobacterium avium en una región correspondiente a las bases 2011-2040 del ARNr 23S de E. coli.
CAATTTCG (SEQ ID NO:1). Este polinucleótido, al que en la presente se le designa como MtuB2011 es complementario de un segmento único descubierto en el ARNr 23S de todos los actinomicetos. Una lista representativa de bacterias de actinomicetos puede encontrarse en la tabla 2. La sonda tiene 29 bases de longitud, tiene un empalme RXL entre 11 y 12 nucleótidos a partir del extremo 5' y tiene una Tm de 65,5ºC y ARNr hibridado del Mycobacterium avium en una región correspondiente a las bases 2011-2040 del ARNr 23S de E. coli.
Esta sonda es una ilustración de un
oligonucleótido que: (1) hibrida el ácido nucleico diana en
condiciones de hibridación altamente restrictivas, (2) tiene una
longitud de hasta 100 bases de nucleótidos, y (3) incluye por lo
menos 17 nucleótidos contiguos contenidos dentro de la región diana
1986-2064 identificada mediante SEQ ID NO:10 ó su
complemento. Otros oligonucleótidos que tienen estas propiedades se
contemplan para emplear como sondas de detección en el ensayo de
hibridación y están comprendidas por la invención.
De forma similar, los oligonucleótidos que
tienen las secuencias de SEQ ID NO:2 y 3 se describen en la presente
como ilustración de oligonucleótidos auxiliares de utilidad.
Igualmente que los oligonucleótidos auxiliares empleados en los
ejemplos de trabajo de la presente, otros oligonucleótidos
auxiliares comprendidos por la invención tienen también secuencias
de hasta 100 nucleótidos de longitud y además tienen por lo menos 17
ó más, de preferencia por lo menos 25 nucleótidos contiguos dentro
de la región diana identificada mediante SEQ ID NO:10 ó su
complemento.
Como se indica más adelante, la sonda MtuB2011
hibridó el ARNr de los actinomicetos de una manera que fue
promovida por el empleo de oligonucleótidos auxiliares. De acuerdo
con el procedimiento empleado para efectuar esta determinación, se
puso en contacto el oligonucleótido monocatenario de la sonda
marcado en el extremo 5', con el ARNr de Mycobacterium avium
en presencia o ausencia de oligonucleótidos auxiliares. Las
moléculas de la sonda que hibridaron el ARNr para formar híbridos
de doble cadena, fueron separadas de las moléculas monocatenarias
de la sonda mediante captura con hidroxiapatita. Los híbridos de
doble cadena se unieron a la hidroxiapatita y fueron detectados y
cuantificados mediante contaje de centelleo. La extensión de la
hibridación se calculó a continuación como un tanto por ciento.
Como se indica más adelante, la Tm del híbrido sonda:diana tuvo la
ventaja de que fue significativamente aumentada en presencia de uno
o más oligonucleótidos auxiliares.
El ejemplo siguiente describe los métodos
empleados para demostrar que la sonda MtuB2011 hibridó con el ARNr
de Mycobacterium avium y que esta interacción fue facilitada
incluyendo oligonucleótidos auxiliares en la mezcla de
hibridación.
\newpage
Ejemplo
1
Se determinaron los valores de Tm para los
híbridos sonda:diana y auxiliar:diana, empleando una sonda marcada
en el extremo con la secuencia de MtuB2011, y los oligonucleótidos
auxiliares marcados en el extremo seleccionados del grupo formado
por: (A) OMeFraB1986 y (B) OMeFraB2040. La secuencia de MtuB2011 es
CGAGCATCTT
TACTCGTAGTGCAATTTCG (SEQ ID NO:1), la secuencia de OMeFraB1986 es CCGAGUCUGUGGUUG AGA
CAGUGGG (SEQ ID NO:2) y la secuencia de OMeFraB2040 es GGUCUUUCCGUCCUGCCGCGCGUAA (SEQ ID NO:3). Se seleccionaron los oligonucleótidos auxiliares A y B para la unión con el ARNr de actinomicetos en regiones de la molécula inmediatamente adyacentes a la sonda, el auxiliar A uniendo aproximadamente en la región 1986-2010 de ARNr 23S, y el auxiliar B uniendo en la región 2040-2064 del ARNr 23S. La sonda y los oligonucleótidos auxiliares fueron marcados en el extremo 5' empleando [\gamma-P^{32}]ATP como un fosfato dador y T4 polinucleótido quinasa, para catalizar la reacción de transferencia del fosfato, esencialmente como se describe en Molecular Cloning: A Laboratory Manual ("Clonación Molecular: un Manual de Laboratorio") (Sambrook et al., eds. Cold Spring Harbor Lab. Publ. 10.59 (1989)). Los oligonucleótidos auxiliares marcados en el extremo se combinaron por separado con ARNr purificado del Mycobacterium gordonae y el oligonucleótido de la sonda se combinó con ARNr purificado del Mycobacterium avium para proporcionar las condiciones de un exceso de diana. En ensayos que incluían tanto la sonda como los oligonucleótidos auxiliares, solamente la sonda se marcó en el extremo, y cada oligonucleótido auxiliar estaba presente por lo menos en un exceso 10 veces molar respecto al ARNr del Mycobacterium avium que sirvió como diana. Todas las mezclas se hibridaron por completo en una solución que contenía tampón de fosfato de sodio 0,48 M, 0,1% de dodecilsulfato de sodio, 1 mM de EDTA y 1 mM de EGTA. Como controles negativos la sonda y/o los oligonucleótidos auxiliares se hibridaron en ausencia del ácido nucleico diana. Al final del procedimiento de hibridación, las mezclas se diluyeron y se pasaron por una columna de hidroxiapatita para separar los ácidos nucleicos monocatenarios de los híbridos de doble cadena. La cantidad de radiactividad en la columna a través del flujo representaba la sonda monocatenaria y se midió por contaje del centelleo. La presencia de radiactividad unida a la hidroxiapatita se midió separadamente por contaje del centelleo. La extensión de la formación de híbrido, expresada en tanto por ciento se calculó dividiendo la cantidad de sonda (medida en cpm) unida a la hidroxiapatita por la cantidad total de sonda (en cpm) que se aplicó a la columna. Los resultados de estos procedimientos están resumidos en la
tabla 1.
TACTCGTAGTGCAATTTCG (SEQ ID NO:1), la secuencia de OMeFraB1986 es CCGAGUCUGUGGUUG AGA
CAGUGGG (SEQ ID NO:2) y la secuencia de OMeFraB2040 es GGUCUUUCCGUCCUGCCGCGCGUAA (SEQ ID NO:3). Se seleccionaron los oligonucleótidos auxiliares A y B para la unión con el ARNr de actinomicetos en regiones de la molécula inmediatamente adyacentes a la sonda, el auxiliar A uniendo aproximadamente en la región 1986-2010 de ARNr 23S, y el auxiliar B uniendo en la región 2040-2064 del ARNr 23S. La sonda y los oligonucleótidos auxiliares fueron marcados en el extremo 5' empleando [\gamma-P^{32}]ATP como un fosfato dador y T4 polinucleótido quinasa, para catalizar la reacción de transferencia del fosfato, esencialmente como se describe en Molecular Cloning: A Laboratory Manual ("Clonación Molecular: un Manual de Laboratorio") (Sambrook et al., eds. Cold Spring Harbor Lab. Publ. 10.59 (1989)). Los oligonucleótidos auxiliares marcados en el extremo se combinaron por separado con ARNr purificado del Mycobacterium gordonae y el oligonucleótido de la sonda se combinó con ARNr purificado del Mycobacterium avium para proporcionar las condiciones de un exceso de diana. En ensayos que incluían tanto la sonda como los oligonucleótidos auxiliares, solamente la sonda se marcó en el extremo, y cada oligonucleótido auxiliar estaba presente por lo menos en un exceso 10 veces molar respecto al ARNr del Mycobacterium avium que sirvió como diana. Todas las mezclas se hibridaron por completo en una solución que contenía tampón de fosfato de sodio 0,48 M, 0,1% de dodecilsulfato de sodio, 1 mM de EDTA y 1 mM de EGTA. Como controles negativos la sonda y/o los oligonucleótidos auxiliares se hibridaron en ausencia del ácido nucleico diana. Al final del procedimiento de hibridación, las mezclas se diluyeron y se pasaron por una columna de hidroxiapatita para separar los ácidos nucleicos monocatenarios de los híbridos de doble cadena. La cantidad de radiactividad en la columna a través del flujo representaba la sonda monocatenaria y se midió por contaje del centelleo. La presencia de radiactividad unida a la hidroxiapatita se midió separadamente por contaje del centelleo. La extensión de la formación de híbrido, expresada en tanto por ciento se calculó dividiendo la cantidad de sonda (medida en cpm) unida a la hidroxiapatita por la cantidad total de sonda (en cpm) que se aplicó a la columna. Los resultados de estos procedimientos están resumidos en la
tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
| Oligonucleótido(s) | % de hibridación | Tm (ºC) |
| MtuB2011 (sonda) | 84 | 65,5 |
| Auxiliar A. OMeFraB1986 | 96 | 78 |
| Auxiliar B. OMeFraB2040 | 96 | \approx80 |
| Sonda + auxiliar A | 98 | 68 |
| Sonda + auxiliar B | 97 | 67 |
| Sonda + auxiliar A + auxiliar B | 96 | 69,5 |
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de este procedimiento confirmaron
que la sonda marcada en el extremo hibridó el ARNr del
Mycobacterium avium y/o Mycobacterium gordonae e
indicaron que esta interacción fue facilitada ventajosamente por
los oligonucleótidos auxiliares. Nosotros observamos particularmente
que el Tm del complejo sonda:diana podía aumentarse de 65,5 a
69,5ºC cuando ambos oligonucleótidos auxiliares se incluyeron en la
reacción de hibridación. Aunque la sonda puede emplearse o bien
sola o bien en combinación con uno o más oligonucleótidos auxiliares
para la hibridación del ARNr de los actinomicetos, los experimentos
descritos más adelante para caracterizar la sonda, se efectuaron
empleando la sonda en combinación con oligonucleótidos auxiliares
que tenían las secuencias de OMeFraB1986 y OMeFraB2040. Las
combinaciones de sonda y oligonucleótidos auxiliares útiles en los
procedimientos descritos en la presente tienen de preferencia
valores de Tm de sonda:diana en el margen de aproximadamente
65-70ºC en las condiciones descritas más arriba.
La especificidad de la sonda se confirmó
demostrando la hibridación positiva con los ARNr de un panel de
especificidad. La colección de organismos empleados como fuentes de
ácidos nucleicos diana en este procedimiento representaban una
amplia sección cruzada taxonómica de organismos y un grupo vecino lo
más próximo posible. En el procedimiento que sigue, se compararon
los resultados cuantitativos empleando la sonda de hibridación
marcada AE, con la cantidad de ARNr bacteriano presente en cada
muestra empleando una sonda de control positivo. Esta sonda de
control positivo que hibrida el ARNr de todas las especies de
bacterias, fue particularmente útil para confirmar la presencia de
ARNr bacteriano en muestras que fallaron la hibridación con la sonda
MtuB2011. En este caso, la sonda de control positivo proporcionó la
confirmación de la presencia de ARNr hibridable y así validó los
resultados negativos. En el caso de dianas de ARNr fúngico, una
sonda de hibridación de ARNr fúngico ampliamente reactiva sirvió
como control positivo.
Los ejemplos siguientes describen los métodos
empleados para demostrar que la sonda MtuB2011 hibridó con los ARNr
de un panel de organismos actinomicetos.
Ejemplo
2
Los lisados de bacterias ó ARN purificado se
emplearon como dianas de ácidos nucleicos para la hibridación de
una sonda que tiene la secuencia CGAGCATCTTTACTCGTAGTGCAATTTCG
(MtuB2011) (SEQ ID NO: 1) juntamente con oligonucleótidos
auxiliares que tienen las secuencias CCGAGUCUGUGGUUGAGAC AGUGGG
(OMeFraB1986) (SEQ ID NO: 2) y GGUCUUUCCGUCCUGC CGCGCGUAA
(OMeFraB2040) (SEQ ID NO:3). Los organismos empleados como fuentes
de ARNr en este procedimiento fueron o bien aislados clínicos
tipificados o fueron obtenidos a partir de la American Type Culture
Collection ("Colección americana de cultivos tipo")(ATCC).
Todas las muestras están identificadas en la Tabla 2 mediante el
número principal de registro para la Gen-Probe
Incorporated. La mayor parte de muestras fueron obtenidas de la
ATCC. Muestras paralelas de cada ARNr fueron hibridadas con una
sonda de control positivo que tenía la secuencia CGACAAGGAAUUUCGC
(OMe Eco B 1933) (SEQ ID NO:4) y oligonucleótidos auxiliares sin
marcar que tenían las secuencias UACCUUAGGACCGUUAU (OMe Eco B 1916)
(SEQ ID NO:5) y CAGGUCGGAACUUACC (OMe Eco B 1949a) (SEQ ID NO:6).
La solución de hibridación contenía LiCl 0,6 M, 1% de lauril sulfato
de litio, 60 mM de succinato de litio y 10 mM de cada uno de EDTA y
EGTA, pH 5,5. Tanto la sonda MtuB2011 como la sonda de control
positivo estaban marcadas con éster de acridinio esencialmente de
acuerdo con el método descrito en la patente U.S. nº. 5.185.439,
titulada "Acridinium Ester Labeling and Purification of Nucleotide
Probes" ("Marcado con éster de acridinio y purificación de
sondas de nucleótidos"). Al final de la reacción de hibridación,
el éster de acridinio unido a la sonda sin hibridar se volvió no
quimioluminiscente en condiciones suavemente alcalinas, mientras
que el éster de acridinio unido a la sonda hibridada permaneció
resistente a la inactivación. Las condiciones para la hidrólisis y
detección de la sonda hibridada marcada con éster de acridinio están
descritas por Arnold et al., en Clin. Chem.
35:1588(1989)). Las magnitudes de la hibridación de la
sonda en estos procedimientos fueron cuantificadas mediante
luminometría empleando procedimientos familiares a los normalmente
expertos en la técnica. La magnitud de la señal de la sonda de
actinomicetos se dividió a continuación por la magnitud de la señal
del control positivo bacteriano para tener resultados
cuantitativamente normalizados en el estudio. Las muestras que
tuvieron señales con la sonda MtuB2011 mayores del 30% de la señal
del control positivo indicaron la hibridación específica con la
sonda MtuB2011 con auxiliares, mientras que valores menores
indicaron resultados negativos para el formato del ensayo. Los
resultados del ensayo están compendiados en la
tabla 2.
tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Los resultados presentados en la tabla 2
confirman que la sonda dirigida contra el ARNr de los actinomicetos
hibrida eficazmente las muestras de ARNr de numerosas especies de
actinomicetos.
La especificidad de la sonda específica para
actinomicetos fue además investigada mediante la hibridación de la
sonda marcada con una colección de especies representando un amplio
espectro de organismos filogenéticamente diferentes. En este
procedimiento, la sonda marcada AE se mezcló separadamente con los
ARNr individuales que contenían lisados de organismos que solamente
eran filogenéticamente diferentes en relación con los actinomicetos.
Los resultados de la hibridación positiva obtenidos empleando la
sonda de control positivo y los resultados negativos obtenidos
empleando la sonda MtuB2011 en los siguientes procedimientos,
indicaron además que la sonda MtuB2011 tenía la ventaja de ser
altamente específica para los organismos actinomicetos.
El ejemplo siguiente describe métodos
adicionales empleados para demostrar la especificidad de la sonda.
Más particularmente, los siguientes procedimientos mostraron que la
sonda MtuB2011 no efectuó ninguna hibridación cruzada con los
lisados de organismos no-filogenéticamente
afines.
Ejemplo
3
Se efectuaron ensayos de hibridación empleando
sondas marcadas AE y oligonucleótidos auxiliares de acuerdo con los
procedimientos descritos en el ejemplo anterior excepto que los
lisados que contenían el ARNr aislado de numerosas especies
diferentes sirvieron como ácidos nucleicos diana. Los resultados del
procedimiento están compendiados en la tabla 3. Una sonda fúngica
total que tenía la secuencia GTCTGGA CCTGGTGAGTTTCCC (SEQ ID NO:7),
y oligonucleótidos metoxi auxiliares que tenían las secuencias
CGUGUUGAGUCAAAUUAAGCCGC (SEQ ID NO:8) y GCUCUCAAUCUGUCAAUCCUUAUUGU
(SEQ ID NO:9) se emplearon como controles positivos para detectar el
ARNr fúngico. Los resultados obtenidos en los procedimientos de
hibridación que emplean ARNr diana a partir de organismos fúngicos,
están compendiados en la tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Los resultados que figuran en la tabla 3 y tabla
4 confirman que la sonda MtuB2011 no efectuó ninguna hibridación
cruzada con ARNr de numerosas especies bacteriana y fúngicas no
afines. Tomados juntamente con los resultados de hibridación
positivos que figuran en la tabla 2, es evidente que la sonda fue
altamente específica para el ARNr de los actinomicetos.
Estos resultados confirmaron que las nuevas
sondas descritas en la presente eran capaces de detectar los
actinomicetos. Además, las sondas eran capaces de distinguir los
actinomicetos de organismos filogenéticamente íntimamente
afines.
Esta invención ha sido descrita con referencia a
un número de ejemplos específicos y versiones de la misma. Por
supuesto, un número de diferentes versiones de la presente invención
se sugerirán a la misma por los expertos normalmente en la técnica
después de revisar la descripción anterior detallada. Así pues, el
verdadero ámbito de la presente invención debe determinarse por
referencia a las reivindicaciones del apéndice.
<110> Gen-Probe
incorporated
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Sondas de polinucieótidos para la
detección y cuantificación de los actinornicetos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> GP109-PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/132,412
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-05-03
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160>19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Actinomicetos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgagcatctt tactcgtagt gcaatttcg
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Actinomicetos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgagucugu gguugagaca guggg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Actinomicetos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggucuuuccg uccugccgcg cguaa
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pan-bacteriano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgacaaggaa uuucgc
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pan-bacteriano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipuaccuuagga ccguuau
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pan-bacteriano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaggucggaa cuuacc
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pan-fúngico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtctggacct ggtgagtttc cc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pan-fúngico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcguguugagu caaauuaagc cgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pan-fúngico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcucucaauc ugucaauccu uauugu
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Actinamicetos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Actinomicetos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. aureus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> E. coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Frankia sp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> M. tuberculosis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(83)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=a, g, c, u
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> C. xerosis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=a, g, c, u
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. griseus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<213> M. avium
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(85)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=a, g, c, u
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> N. asteroides
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
<110> Gen-Probe
Incorporated
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Sondas de polinucieótidos para la
detección y cuantificación de los actinomicetos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> GP109-PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/US00/12243
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2000-05-03
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/132,412
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-05-03
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda para la hibridación de los
ácidos nucleicos ribosómicos de bacterias de Actinomicetos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgagcatctt tactcgtagt gcaatttcg
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido auxiliar para la
hibridación de los ácidos nucleicos ribosómicos de bacterias de
Actinomicetos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgagucugu gguugagaca guggg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido auxiliar para la
hibridación de los ácidos nucleicos ribosómicos de bacterias de
Actinomicetos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggucuuuccg uccugccgcg cguaa
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda para la hibridación de ácidos
nucleicos ribosómicos de organismos
pan-bacterianos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgacaaggaa uuucgc
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido auxiliar para la
hibridación de ácidos nucleicos ribosómicos de organismos
pan-bacterianos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipuaccuuagga ccguuau
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido auxiliar para la
hibridación de ácidos nucleicos ribosómicos de organismos
pan-bacterianos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaggucggaa cuuacc
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda para la hibridación de ácidos
nucleicos ribosómicos de organismos pan-fúngícos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtctggacct ggtgagtttc cc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oiigonucleótido auxiliar para la
hibridación de ácidos nucleicos de organismos
pan-fúngicos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcguguugagu caaauuaagc cgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido auxiliar para la
hibridación de ácidos nucleicos de organismos
pan-fúngicos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcucucaauc ugucaauccu uauugu
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia contigua de la sonda para
la hibridación de ácidos nucleicos ribosómicos de bacterias de
Actinomicetos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia diana contigua de ácidos
nucleicos ribosómicos para bacterias de Actinomicetos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphyiococcus aureus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(86)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Segmento de ARNr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica frustada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(86)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Segmento de ARNr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Frankia sp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(85)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Segmento de ARNr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<301> Normand et al.
\vskip0.400000\baselineskip
<302> Análisis de un operón de ARN
ribosómico
\vskip0.400000\baselineskip
<303> Gen
\vskip0.400000\baselineskip
<304> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<306> 119-124
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<212> RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mtycobacterium
tuberculosis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica frustada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(83)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=a, g, c, u
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica frustada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(83)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> segmento de ARNr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium xerosis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica frustada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=a, g, c, u
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica frustada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Segmento de ARNr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptomyces gríseos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica frustada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(86)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Segmento de ARNr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium avium
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica frustada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(85)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=a, g, c, u
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica frustada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(85)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Segmento de ARNr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nocardia asteroides
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica frustada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(85)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>Segmento de ARNr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (37)
1. Una sonda de oligonucleótido que hibrida
específicamente una región diana del ácido nucleico de los
actinomicetos, correspondiente a las posiciones de los nucleótidos
1986-2064 del ARNr 23S de E. coli, en
condiciones de hibridación altamente restrictivas, para formar un
dúplex detectable sonda:diana, teniendo dicha sonda de
oligonucleótido una longitud de hasta 100 nucleótidos y
comprendiendo por lo menos 17 nucleótidos contiguos contenidos
dentro de la secuencia de SEQ ID NO:10 ó el complemento de la
misma.
2. La sonda de oligonucleótido de la
reivindicación 1, en donde dicha sonda comprende por lo menos 25, de
preferencia por lo menos 29 nucleótidos contiguos contenidos dentro
de la secuencia de SEQ ID NO:10.
3. La sonda de oligonucleótido de la
reivindicación 1, en donde las condiciones de hibridación altamente
restrictivas están proporcionadas por (a) tampón de fosfato de sodio
0,48 M, 0,1% de dodecil sulfato de sodio, 1 mM de cada uno de los
EDTA y EGTA, ó (b) 0,6 M de LiCl, 1% de lauril sulfato de litio, 60
mM de succinato de litio y 10 mM de cada uno de los EDTA y
EGTA.
4. La sonda de oligonucleótido de la
reivindicación 1, en donde dicha sonda de oligonucleótido comprende
ADN.
5. La sonda de oligonucleótido de la
reivindicación 1, en donde dicha sonda de oligonucleótido comprende
por lo menos un análogo de nucleótido.
6. La sonda de oligonucleótido de la
reivindicación 5, en donde por lo menos un análogo de nucleótido
comprende un grupo metoxilo en la posición 2' de un grupo
ribosa.
7. La sonda de oligonucleótido de la
reivindicación 1, en donde dicha sonda de oligonucleótido tiene una
secuencia seleccionada del grupo formado por SEQ ID NO:1 ó el
complemento de la misma, SEQ ID NO:2 ó el complemento de la misma,
y SEQ ID NO:3 ó el complemento de la misma.
8. El oligonucleótido de la reivindicación 7, en
donde dicha secuencia viene dada por SEQ ID NO:2 ó SEQ ID NO:3,
siendo dicho oligonucleótido un oligonucleótido auxiliar.
9. La sonda de oligonucleótido de la
reivindicación 7, comprendiendo además una marca detectable.
10. La sonda de oligonucleótido de la
reivindicación 9, en donde la marca detectable es una marca
quimioluminiscente o una marca radiactiva.
11. La sonda de oligonucleótido de la
reivindicación 7, en donde dicha secuencia viene dada por SEQ ID
NO:1.
12. La sonda de oligonucleótido de la
reivindicación 11, en donde dicha sonda de oligonucleótido comprende
además una marca detectable.
13. La sonda de oligonucleótido de la
reivindicación 12, en donde la marca detectable es un éster de
acridinio.
14. Una composición de una sonda para la
detección de ácidos nucleicos de bacterias actinomicetos, la cual
comprende:
una sonda de oligonucleótido que hibrida en
condiciones altamente restrictivas con una región diana del ácido
nucleico de los actinomicetos, correspondiente a las posiciones
1986-2064 de los nucleótidos de ARNr 23S de E.
coli, para formar un dúplex detectable diana:sonda, en donde
dicha sonda de oligonucleótido tiene una longitud de hasta 100
bases de nucleótidos y comprende por lo menos 17 nucleótidos
contiguos contenidos dentro de la secuencia de SEQ ID NO:10 ó el
complemento de la misma, y
en donde en condiciones altamente restrictivas
dicha sonda de oligonucleótido hibrida específicamente los ácidos
nucleicos presentes en Corynebacterium aquaticum, Corynebacterium
jeikieum, Corynebacterium xerosis, Micrococcus luteus,
Propionibacterium acnes, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium
terrae, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium simiae,
Mycobacterium avium, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium
gordonae, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium smegatis,
Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium gastri, Mycobacterium xenopi,
Mycobacterium marinum y Mycobacterium phlei.
15. La composición de la sonda de la
reivindicación 14, en donde dicha sonda de oligonucleótido tiene una
longitud de hasta 100 bases de nucleótidos y comprende por lo menos
25 nucleótidos contiguos contenidos dentro de la secuencia de SEQ
ID NO:10 ó el complemento de la misma.
16. La composición de la sonda de la
reivindicación 14, en donde la sonda de oligonucleótido comprende
ADN.
17. La composición de la sonda de la
reivindicación 14, en donde dichas condiciones altamente
restrictivas están proporcionadas por
(a) tampón de fosfato de sodio 0,48 M, 0,1% de
dodecil sulfato de sodio, 1 mM de cada uno de EDTA y EGTA, ó
(b) 0,6 M de LiCl, 1% de lauril sulfato de
litio, 60 mM de succinato de litio y 10 mM de cada uno de EDTA y
EGTA.
18. La composición de la sonda de la
reivindicación 14, en donde dicha sonda de oligonucleótido comprende
la secuencia de SEQ ID NO:1 ó el complemento de la misma.
19. La composición de la sonda de la
reivindicación 14, en donde la longitud de dicha sonda de
oligonucleótido es de hasta 60 bases.
20. La composición de la sonda de la
reivindicación 14, en donde dicha sonda de oligonucleótido tiene la
longitud y secuencia de SEQ ID NO:1.
21. La composición de la sonda de una cualquiera
de las reivindicaciones 14, 19 y 20, en donde dicha sonda de
oligonucleótido comprende además una marca detectable.
22. La composición de la sonda de la
reivindicación 21, en donde la marca detectable es una marca
quimioluminiscente o una marca radiactiva.
23. La composición de la sonda de la
reivindicación 22, en donde la marca quimioluminiscente es un éster
de acridinio.
24. La composición de la sonda de la
reivindicación 22, la cual comprende además por lo menos un
oligonucleótido auxiliar que facilita la formación de un dúplex
sonda:diana detectable, en dichas condiciones de hibridación.
25. La composición de la sonda de la
reivindicación 24, en donde por lo menos un oligonucleótido auxiliar
incluye por lo menos un análogo de nucleótido.
26. La composición de la sonda de la
reivindicación 25, en donde por lo menos un análogo de nucleótido
comprende un grupo ribosa que tiene un grupo metoxilo dispuesto en
la posición 2'.
27. La composición de la sonda de la
reivindicación 24, en donde por lo menos un oligonucleótido auxiliar
tiene una secuencia seleccionada del grupo formado por SEQ ID NO:2
y SEQ ID NO:3.
28. Un método para la detección de la presencia
de actinomicetos en una muestra de ensayo, el cual comprende los
pasos de:
(a) provisión a dicha muestra de ensayo de una
composición de una sonda que comprende una sonda de oligonucleótido
que hibrida en condiciones fuertemente restrictivas con una región
diana de ácido nucleico de actinomicetos, que corresponde a las
posiciones 1986-2064 del nucleótido de ARNr 23S de
E. coli, para formar un dúplex detectable diana:sonda,
teniendo dicha sonda de oligonucleótido una longitud de hasta 100
bases de nucleótidos y comprendiendo por lo menos 25 nucleótidos
contiguos contenidos dentro de la secuencia de SEQ ID NO:10 ó el
complemento de la misma, y en donde en estas condiciones de
hibridación dicha sonda de oligonucleótido hibrida específicamente
los ácidos nucleicos presentes en Corynebacterium aquaticum,
Corynebacterium jeikieum, Corynebacterium xerosis, Micrococcus
luteus, Propionibacterium acnes, Mycobacterium chelonae,
Mycobacterium terrae, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium
simiae, Mycobacterium avium, Mycobacterium scrofulaceum,
Mycobacterium gordonae, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium
smegatis, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium gastri,
Mycobacterium xenopi, Mycobacterium marinum y Mycobacterium
phlei;
(b) hibridación en condiciones altamente
restrictivas de cualquier ácido nucleico de actinomicetos que pueda
estar presente en la muestra de ensayo, con dicha composición de la
sonda para formar un dúplex sonda: diana; y
(c) detección de dicho dúplex sonda:diana como
un indicador de la presencia de actinomicetos en la muestra de
ensayo.
29. El método de la reivindicación 28, en donde
dicha muestra de ensayo puede contener bacterias, y en donde antes
del paso (a) existe un paso para la liberación del ácido nucleico de
cualquier bacteria que pueda estar presente en dicha muestra de
ensayo.
30. El método de la reivindicación 28, en donde
dicha muestra de ensayo es un lisado.
31. El método de la reivindicación 28, en donde
dichas condiciones altamente restrictivas de hibridación se
proporcionan:
(a) mediante un tampón de fosfato de sodio 0,48
M, 0,1% de dodecil sulfato de sodio, y 1 mM de cada uno de EDTA y
EGTA, ó
(b) mediante 0,6 M de LiCl, 1% de lauril sulfato
de litio, 60 mM de succinato de litio y 10 mM de cada uno de EDTA y
EGTA.
32. El método de la reivindicación 28, en donde
la sonda de oligonucleótido tiene la longitud y secuencia de SEQ ID
NO:1.
33. El método de la reivindicación 32, en donde
la sonda de oligonucleótido contiene una marca detectable.
34. El método de la reivindicación 33, en donde
la marca detectable es un éster de acridinio, y en donde el paso de
detección comprende la realización de una luminometría para detectar
cualquier dúplex sonda:diana.
35. El método de la reivindicación 33, en donde
dicha composición de la sonda comprende además por lo menos un
oligonucleótido auxiliar que facilita la formación del dúplex
sonda:diana.
36. El método de la reivindicación 35, en donde
dicho oligonucleótido auxiliar se selecciona del grupo formado por
SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3.
37. Un kit para la detección de la presencia de
ácidos nucleicos de actinomicetos en una muestra de ensayo, el cual
comprende:
una composición de una sonda que comprende una
sonda de oligonucleótido que hibrida en condiciones altamente
restrictivas con una región diana de ácido nucleico de actinomicetos
correspondiente a las posiciones 1986-2064 de
nucleótidos de ARNr 23S de E. coli para formar un dúplex
sonda:diana detectable, teniendo dicha sonda de oligonucleótido una
longitud de hasta 100 bases de nucleótidos y comprendiendo por lo
menos 25 nucleótidos contiguos contenidos dentro de la secuencia de
SEQ ID NO:10 ó el complemento de la misma, y
en donde en dichas condiciones de hibridación
dicha sonda de oligonucleótido hibrida específicamente los ácidos
nucleicos presentes en Corynebacterium aquaticum, Corynebacterium
jeikieum, Corynebacterium xerosis, Micrococcus luteus,
Propionibacterium acnes, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium
terrae, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium simiae,
Mycobacterium avium, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium
gordonae, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium smegatis,
Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium gastri, Mycobacterium xenopi,
Mycobacterium marinum y Mycobacterium phlei.
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