JP2005204582A

JP2005204582A - オリゴヌクレオチド及びそれを用いた非定型抗酸菌群の検出方法

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Publication number: JP2005204582A
Application number: JP2004015195A
Authority: JP
Inventors: Naozumi Oda; 直純小田
Original assignee: Asahi Kasei Corp
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 2004-01-23
Filing date: 2004-01-23
Publication date: 2005-08-04

Abstract

【課題】Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉを迅速、特異的かつ高感度に検出する一本鎖オリゴヌクレオチドプライマーとその使用方法を提供することにある。
【解決手段】Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列中の特異的な配列に対するＬＡＭＰ反応のプライマーを設計し、このプライマーを用いてＬＡＭＰ反応を行う。
【選択図】なし

Description

本発明は、非定型抗酸菌群を短時間に特異的に検出するオリゴヌクレチド、及び該オリゴヌクレチドをプライマーとして用いたＬＡＭＰ法により非定型抗酸菌群の核酸を増幅する方法に関する。

非定型抗酸菌症のうち、Ｍ．ａｖｉｕｍやＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅにて引き起こされるＭ．ａｖｉｕｍｃｏｍｐｌｅｘ症、およびＭ．ｋａｎｓａｓｉｉが原因のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ症は、比較的患者数が多く、これら抗酸菌を迅速かつ正確に同定する検査方法の確立が求められている。

抗酸菌の検査方法は、臨床抗酸菌研究会編集「抗酸菌検査法−遺伝子技術による迅速診断−」医歯薬出版株式会社、１９９７年６月１０日、に詳しく紹介されている。まず、染色法として、チール・ネールゼン（Ｚｉｅｈｌ−Ｎｅｅｌｓｅｎ）染色法、キニヨン（Ｋｉｎｙｏｕｎ）染色法、蛍光染色法が知られている。これらは、喀痰や気道分泌液等の検体中の抗酸菌を、短時間で検出することが可能であるが、検出感度が極めて低いとされている。一方、小川培地等の固形培地を使った分離培養法は、抗酸菌の検出率が染色法よりも優れているが、抗酸菌が２分裂に要する時間は１０〜１５時間を要するため、抗酸菌同定に必要量の抗酸菌を得るまでに２〜４週間を要する。これら抗酸菌検査の問題点を解決するため、近年、核酸増幅技術を応用し、結核菌のゲノムＤＮＡやＲＮＡを検出する技術が開発されている。

ＬＡＭＰとはＬｏｏｐ−ＭｅｄｉａｔｅｄＩｓｏｔｈｅｒｍａｌＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎの略で、Ｎｏｔｏｍｉらによって開発された簡易・迅速・精確・安価に核酸を増幅する技術で、日本特許番号第３３１３３５８号、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２８，ｅ６３，２０００、ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２９０，１１９５−１１９８，２００２、ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，４７，Ｎｏ．９，１７４２−１７４３，２００１に報告されている。これは通常、１対のインナープライマーと１対のアウタープライマーを併せた２対計４種のプライマー、あるいは、これに１対のループプライマーを加えた３対計６種のプライマーと、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとを使って通常１０分〜６０分程度で鋳型となる核酸を増幅する方法である。ＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）法と違い、増幅反応が一定温度で進むのが特徴である。

ＬＡＭＰ反応の検出は、ＬＡＭＰ増幅産物をアガロースゲル電気泳動にかけてＬＡＭＰ反応に特徴的なラダーのバンドを確認する方法や、ＬＡＭＰ反応産物にエチジウムブロマイドやＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ等の核酸インターカレーターを添加して検出する方法がある。また、ＬＡＭＰ反応時の生成物であるピロリン酸と反応バッファー中のマグネシウムイオンにて生じる沈殿物を検出する方法が国際公開番号ＷＯ０１／８３８１７Ａ１、および、ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２８９，１５０−１５４，２００２に示されている。

日本特許第２９７６４０６号に、ｒＲＮＡ遺伝子にて非ウィルス性の生物を検出・同定する方法が記載されている。ウィルスを除くあらゆる細胞はリボソームを含み、従ってゲノム上にｒＲＮＡ遺伝子がコードされている。ｒＲＮＡ遺伝子は種々の生物間にて相同性の高い保存された配列と、相同性が低く特異性の高い配列とを有しており、様々な生物種の検出および同定に極めて有用である。

Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅをＬＡＭＰ法にて検出することが、Ｉｗａｍｏｔｏらによって、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４１，Ｎｏ．６，２６１６−２６２２，Ｊｕｎｅ２００３にて報告された。Ｉｗａｍｏｔｏらは、生物種の同定に有用なジャイレースＢ（ｇｙｒＢ）という遺伝子配列に対してＬＡＭＰ反応用のプライマーを設計し、臨床サンプルや精製ゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ＬＡＭＰ反応を行い、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅを特異的に検出することを示した。また、その検出感度は、精製ゲノムＤＮＡをテンプレートとした場合、３５分の反応において、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅのいずれも、１０００コピーであることを示した。

本発明者は、先に出願した特願２００３−１４４７１２において、ＬＡＭＰ法にて結核菌群の遺伝子を迅速かつ特異的に増幅・検出する方法とこれに用いる結核菌群遺伝子検出用核酸を発明した。この特願２００３−１４４７１２では、結核菌Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのゲノムＤＮＡ１ｐｇ（結核菌およそ２１０個相当）を２５分以内で検出可能なＬＡＭＰ反応用核酸とその検出方法を示した。

つまり、主な非定型抗酸菌症の原因菌であるＭ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの検出・同定についても、より検出感度がよく、より検出時間の短い方法が求められている。

日本特許第３３１３３５８号国際公開番号ＷＯ０１／８３８１７Ａ１日本特許第２９７６４０６号臨床抗酸菌研究会編集「抗酸菌検査法−遺伝子技術による迅速診断−」医歯薬出版株式会社、１９９７年６月１０日ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２８，ｅ６３，２０００ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２９０，１１９５−１１９８，２００２ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，４７，Ｎｏ．９，１７４２−１７４３，２００１ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２８９，１５０−１５４，２００２ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４１，Ｎｏ．６，２６１６−２６２２，Ｊｕｎｅ２００３

本発明が解決しようとする課題は、高い検出感度、高い特異性、短時間での増幅、を満たすＭ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、及びＭ．ｋａｎｓａｓｉｉを検出するためのＬＡＭＰ反応用オリゴヌクレオチド、並びにそれを用いたＬＡＭＰ法によるＭ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、及びＭ．ｋａｎｓａｓｉｉを迅速に検出する方法を提供することにある。

本発明者は、前記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、及びＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列からＭ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、及びＭ．ｋａｎｓａｓｉｉのそれぞれに特異的な配列を見出し、この菌特異的な配列に対して検出感度・選択性が高く短時間での核酸増幅が可能なＬＡＭＰ反応用核酸プライマーを設計・作製し、この核酸プライマーを用いたＬＡＭＰ法によるＭ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの迅速診断方法を見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下の発明を提供する。
（１）配列番号１３又は１４に記載の塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチド。
（２）配列番号１８又は１９に記載の塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチド。
（３）配列番号２１又は２２に記載の塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチド。
（４）配列番号１６、１７、２０又は２３に記載の塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチド。

（５）ＬＡＭＰ法におけるインナープライマーとして配列番号１３または１４に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを用いる、ＬＡＭＰ法にてＭ．ａｖｉｕｍの核酸を増幅する方法。
（６）ＬＡＭＰ法におけるループプライマーとして配列番号１６または１７に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを用いる、ＬＡＭＰ法にてＭ．ａｖｉｕｍの核酸を増幅する方法。
（７）ＬＡＭＰ法におけるインナープライマーとして配列番号１３または１４に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを用い、ループプライマーとして配列番号１６または１７に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを用いる、ＬＡＭＰ法にてＭ．ａｖｉｕｍの核酸を増幅する方法。

（８）ＬＡＭＰ法におけるインナープライマーとして配列番号１８または１９に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを用いる、ＬＡＭＰ法にてＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅの核酸を増幅する方法。
（９）ＬＡＭＰ法におけるループプライマーとして配列番号２０または１７に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを用いる、ＬＡＭＰ法にてＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅの核酸を増幅する方法。
（１０）ＬＡＭＰ法におけるインナープライマーとして配列番号１８または１９に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを用い、ループプライマーとして配列番号２０または１７に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを用いる、ＬＡＭＰ法にてＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅの核酸を増幅する方法。

（１１）ＬＡＭＰ法におけるインナープライマーとして配列番号２１または２２に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを用いる、ＬＡＭＰ法にてＭ．ｋａｎｓａｓｉｉの核酸を増幅する方法。
（１２）ＬＡＭＰ法におけるループプライマーとして配列番号２３または１７に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを用いる、ＬＡＭＰ法にてＭ．ｋａｎｓａｓｉｉの核酸を増幅する方法。
（１３）ＬＡＭＰ法におけるインナープライマーとして配列番号２１または２２に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを用い、ループプライマーとして配列番号２３または１７に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを用いる、ＬＡＭＰ法にてＭ．ｋａｎｓａｓｉｉの核酸を増幅する方法。

（１４）配列番号１３または１４に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つ、及び／又は配列番号１６または１７に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを含む、（５）から（７）のいずれかに記載の方法でＭ．ａｖｉｕｍの核酸をＬＡＭＰ法にて検出するためのキット。
（１５）配列番号１８または１９に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つ、及び／又は配列番号２０または１７に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを含む、（８）から（１０）のいずれかに記載の方法でＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕａｌｒｅの核酸をＬＡＭＰ法にて検出するためのキット。
（１６）配列番号２１または２２に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つ、及び／又は配列番号２３または１７に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを含む、（１１）から（１３）のいずれかに記載の方法でＭ．ｋａｎｓａｓｉｉの核酸をＬＡＭＰ法にて検出するためのキット。

本発明によれば、Ｍ．ａｖｉｕｍｃｏｍｐｌｅｘ症の原因菌であるＭ．ａｖｉｕｍやＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、およびＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ症の原因菌であるＭ．ｋａｎｓａｓｉｉを、高感度で、短時間に、特異的に検出することができる。

以下、本発明の実施の形態について更に詳しく述べる。
本明細書中において、核酸の塩基配列中のＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃは、デオキシリボヌクレオチド中のアデニン塩基、グアニン塩基、チミン塩基、シトシン塩基を示す。

ＬＡＭＰ反応に用いるインナープライマーとはＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーとを示す。ＦＩＰプライマーは、５’側にターゲット核酸配列の表鎖に相同的なＦ１ｃと呼ばれる配列、３’側にターゲット核酸配列の裏鎖に相補的なＦ２と呼ばれる配列、とを有するオリゴヌクレオチドであり、ＢＩＰプライマーは、５’側にターゲット核酸配列の裏鎖に相同的なＢ１ｃと呼ばれる配列、３’側にターゲット核酸配列の表鎖に相補的なＢ２と呼ばれる配列、とを有するオリゴヌクレオチドである。アウタープライマーとは、Ｆ３プライマーとＢ３プライマーを示し、Ｆ３プライマーはターゲット核酸配列の裏鎖に相補的なオリゴヌクレオチド、Ｂ３プライマーはターゲット核酸の表鎖に相補的なオリゴヌクレオチドである。ループプライマーは、ＦＬプライマーとＢＬプライマーを示し、ＬＡＭＰによる核酸の増幅反応を促進する。ＦＬプライマーはＦ２配列に相補的なＦ２ｃ配列とＦ１ｃ配列の間の配列に相補的な配列、ＢＬプライマーはＢ２配列に相補的なＢ２ｃ配列とＢ１ｃ配列の間の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。これらインナープライマー、アウタープライマー、および、ループプライマーの設計方法は、先の特許文献１、非特許文献２〜６、および、Ｗｅｂサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｉｋｅｎ．ｃｏ．ｊｐ／に公開されている。

具体的には、まず、標的核酸について、5'側からF3、F2、F1、B1c、B2c、B3cの６つの領域を規定し、この６つの領域の相補的な領域をF3c、F2c、F1c、B1、B2、B3と規定し、次の通り4種類のプライマーを設計する。

（１）FIPプライマー：標的核酸のF2領域を3'端に持ち、5'末端側に標的核酸のF1cと同じ配列を持つように設計する。
（２）F3プライマー：標的核酸のF3領域を持つように設計する。
（３）BIPプライマー：標的核酸のB2領域を3'端に持ち、5'末端側に標的核酸のB1cと同じ配列を持つように設計する。
（４）B3プライマー：標的核酸のB3領域を持つように設計する。

LAMP法においては、ダンベル構造の5’末端側のループの1本鎖部分（B1領域とB2領域の間、あるいは F1領域とF2領域の間）に相補的な配列を持つループプライマー（それぞれループプライマーB（本発明においてはＢＬプライマー）、ループプライマーF（本発明においてはＦＬプライマー））を用いることによりDNA合成の起点を増やすことが可能となる。ループプライマーを用いることにより、増幅時間は、ループプライマーを使用しない場合の1/3〜1/2となることが期待される。

本発明者は、先に出願した特願２００３−１４４７１２において、結核菌群の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をターゲットとした結核菌群核酸検出用ＬＡＭＰプライマー、および、このプライマーを用いた結核菌群の核酸を迅速かつ特異的に増幅・検出する方法を発明した。

Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの検出についても、結核菌群と同様の１６ＳＲｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡ遺伝子が有用であると考え、この遺伝子配列をターゲットとしてＬＡＭＰ反応用の核酸プライマーを設計した。

先ず、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの１６ＳＲｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡ遺伝子の部分配列を明からにした。これら配列番号４から６記載の非定型抗酸菌Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの塩基配列と、配列番号７から１２に記載した結核菌群の核酸増幅用ＬＡＭＰ用プライマーの塩基配列とを照らし合わせ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ特異的ＬＡＭＰ反応用プライマー及びプライマーセットを得ることができた。

このＭ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ特異的ＬＡＭＰ反応用プライマーミックスを調製し、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７Ｒａ、Ｍ．ａｖｉｕｍ（ＡＴＣＣ１５７６９）、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ（ＡＴＣＣ１９０７５）、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ（ＡＴＣＣ１２４７６）のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＬＡＭＰ反応を行った。

その結果、いずれのプライマーミックスも菌特異的な増幅がみられ、他のマイコバクテリウム属と交差しない、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ特異的ＬＡＭＰ反応用プライマーとそれを使ったＭ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ検出方法を発明するに至った。

本発明で用いるインナープライマーとしては、Ｍ．ａｖｉｕｍの核酸を増幅するための配列番号１３又は１４に記載の塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチド、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅの核酸を増幅するための配列番号１８又は１９に記載の塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチド、並びにＭ．ｋａｎｓａｓｉｉの核酸を増幅するための配列番号２１又は２２に記載の塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドが挙げられる。

本発明で用いるアウタープライマーとしては、F3として配列番号９に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられ、B3として配列番号１５記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。

また、本発明で用いるループプライマーとしては、FLとしては配列番号１６、２０又は２３に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられ、BLとしては配列番号１７に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。

本発明においてインナープライマー、アウタープライマーまたはループプライマーとして用いる上記オリゴヌクレオチドは何れも、当業者に周知の方法である固相合成法により合成することができる。このような合成のための装置は、例えば、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどの業者から販売されている。

また、本発明のオリゴヌクレオチドとしては、本明細書の配列表の配列番号で示される特定の塩基配列を含む限り、オリゴヌクレオチドを構成するデオキシリボースや塩基について、その一部に他の分子が付加したり、その一部が他の分子で置換されるなどにより修飾されているものでもよい。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドとしては、ＬＡＭＰ法で結核菌のＤＮＡを増幅した後、そのオリゴヌクレオチドの検出を簡略化するため、プライマーとするオリゴヌクレオチドの5’末端を蛍光色素であるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識したオリゴヌクレオチドや、プライマーとするオリゴヌクレオチドの5´末端にビオチンを結合し、アビジンと共有結合させたペルオキシダーゼを結合させ得るものでもよい。

本発明におけるＬＡＭＰ法では、標的遺伝子を含む試料、プライマー（FIP, F3, BIP, B3）、鎖置換型DNA Polymerase、dNTPs、及び反応緩衝液を含む反応液を調製し、６４〜６５℃で１０分から１時間程度インキュベーションすることにより、増幅産物あるいは増幅の有無を検出することができる。増幅産物の検出は簡易検出及びリアルタイム検出が可能であり、増幅する時間は、ループプライマーを利用することで更に短縮することができる。

ＬＡＭＰ法は、具体的には以下の通り行なうことができる。即ち、インナープライマー（ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマー）、ループプライマー（ＦＬプライマーおよびＢＬプライマー）及びアウタープライマー（Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマー）を含むプライマーセットを作製し、これを適当なマイクロチューブに添加し、氷上に置く。ＬＡＭＰ反応液としては、２０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭＫＣｌ、８ｍＭＭｇＳＯ₄、１０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．８ＭＢｅｔａｉｎｅ、２．８ｍＭｄＧＴＰ、２．８ｍＭｄＣＴＰ、２．８ｍＭｄＡＴＰ、２．８ｍＭｄＴＴＰ、所定量の試料（即ち、結核菌ゲノムＤＮＡを含む試料）を添加し、全容量を適量に調整し、氷上に置く。これに、ＢｓｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＬａｒｇｅＦｒａｇｍｅｎｔ（ＮＥＷＥＮＧＬＡＮＤＢｉｏＬａｂｓ）を添加して全容量を調整し、混和した後、例えば、６４℃にて１５分から１時間反応させることによりＬＡＭＰ反応を行なう。

ＬＡＭＰ反応におけるインナープライマーの濃度は、ＬＡＭＰ反応が進む限り特に限定されないが、一般的にはプライマーの各々につき、１０〜７０ｐｍｏｌ／２５μｌ、好ましくは３０〜５０ｐｍｏｌ／２５μｌ、例えば４０ｐｍｏｌ／２５μｌとすることができる。

ＬＡＭＰ反応におけるループプライマーの量は、ＬＡＭＰ反応が進む限り特に限定されないが、一般的にはプライマーの各々につき、１０〜１５０ｐｍｏｌ／２５μｌ、好ましくは１０〜１００ｐｍｏｌ／２５μｌ、例えば２０、４０または６０ｐｍｏｌ／２５μｌとすることができる。

ＬＡＭＰ反応におけるアウタープライマーの量は、ＬＡＭＰ反応が進む限り特に限定されないが、一般的にはプライマーの各々につき、２〜２０ｐｍｏｌ／２５μｌ、好ましくは２〜１０ｐｍｏｌ／２５μｌ、例えば５ｐｍｏｌ／２５μｌとすることができる。

ＬＡＭＰ反応による増幅反応の過程では、副産物としてピロリン酸マグネシウムが産生される。この副産物は、増幅産物と比例して産生されることから、増幅産物量が非常に多いＬＡＭＰ法では白濁として観察することができる。即ち、ＬＡＭＰ法ではこの白濁の有無で標的遺伝子の有無を確認することができる。また、ＬＡＭＰ反応とその後の反応産物の検出は、ＬＡＭＰ反応専用リアルタイム濁度測定装置ＬＡ―２００（テラメックス社）などの市販の装置を用いて行なうことができる。

あるいは、蛍光インターカレーター（例えば、エチジウムブロマイド等）の存在下で増幅させた増幅産物の入ったチューブにＵＶランプを照射することにより、鋳型DNA（標的遺伝子）が存在する場合には、蛍光強度が上がり、肉眼でも増幅の有無、いわゆる標的遺伝子の有無を確認することができる。

上記以外としては、ＬＡＭＰ反応後、反応産物を電気泳動により分離し、エチジウムブロマイドあるいはサイバーグリーンで核酸染色を行い、増幅されたヌクレオチド配列の塩基長が、上述の標的配列の塩基長と等しければ検体中に検出対象の結核菌が存在すると判定できる。増幅されたヌクレオチド配列の検出には、クロマトグラフィーを使用することもできる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

［実施例１］
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７Ｒａ、Ｍ．ａｖｉｕｍ（ＡＴＣＣ１５７６９）、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ（ＡＴＣＣ１９０７５）、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ（ＡＴＣＣ１２４７６）のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、配列番号１と２のオリゴヌクレオチドプライマーを使ってＰＣＲ反応を行い、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の部分配列のＤＮＡフラグメントを得た。配列番号１と２のオリゴヌクレオチドプライマーをシークエンス反応用のプライマーとして用い、先に得られたＰＣＲ産物の塩基配列をＡＢＩ社蛍光ＤＮＡシークエンサー３７００にて明らかにした。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７Ｒａの塩基配列を配列番号３に、Ｍ．ａｖｉｕｍ（ＡＴＣＣ１５７６９）の塩基配列を配列番号４に、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ（ＡＴＣＣ１９０７５）の塩基配列を配列番号５に、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ（ＡＴＣＣ１２４７６）の塩基配列を配列番号６に示した。

これらＭ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの塩基配列と、特願２００３−１４４７１２に記載した結核菌群の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を特異的に検出するＬＡＭＰ反応用プライマーのＦＩＰプライマー（配列番号７）、ＢＩＰプライマー（配列番号８）、Ｆ３プライマー（配列番号９）、Ｂ３プライマー（配列番号１０）、ＦＬプライマー（配列番号１１）、ＢＬプライマー（配列番号１２）の塩基配列とを比較参照した結果、表１に示すＭ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉのＬＡＭＰ反応用プライマーを見出すことができた。なお一部プライマーについては、その塩基配列が同一であることも判明した。

インナープライマーとして４０ｐｍｏｌのＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマー、ループプライマーとして４０ｐｍｏｌのＦＬプライマーおよびＢＬプライマー、アウタープライマーとして５ｐｍｏｌのＦ３プライマーおよびＢ３プライマー、を含む表２に記載のプライマーミックスを調製し、各々０．２ｍｌマイクロチューブ（栄研化学）に添加し氷上に置いた。ＬＡＭＰ反応液として、２０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭＫＣｌ、８ｍＭＭｇＳＯ₄、１０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．８ＭＢｅｔａｉｎｅ、２．８ｍＭｄＧＴＰ、２．８ｍＭｄＣＴＰ、２．８ｍＭｄＡＴＰ、２．８ｍＭｄＴＴＰと、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、または、Ｍ．ａｖｉｕｍ、または、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、または、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉのゲノムＤＮＡ２ｎｇ（菌４．３×１０⁵個相当）を添加し、全容量を２４μｌとし氷上に置いた。これに、８ｕｎｉｔｓ／μｌのＢｓｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＬａｒｇｅＦｒａｇｍｅｎｔ（ＮＥＷＥＮＧＬＡＮＤＢｉｏＬａｂｓ）１μｌを添加して全容量を２５μｌとし、ゆっくり混和した後、速やかにＬＡＭＰ反応専用リアルタイム濁度測定装置ＬＡ―２００（テラメックス社）にセットし、６４℃にて４０分間反応させ、増幅反応中の濁度を測定した結果を図１〜３に示す。いずれのプライマーセットとも特異的な増幅のみが観察され、非特異的な増幅は見られなかった。

［実施例２］
インナープライマーとして４０ｐｍｏｌのＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマー、ループプライマーとして４０ｐｍｏｌのＦＬプライマーおよびＢＬプライマー、アウタープライマーとして５ｐｍｏｌのＦ３プライマーおよびＢ３プライマー、を含む表２に記載のプライマーミックスを調製し、各々０．２ｍｌマイクロチューブ（栄研化学）に添加し氷上に置いた。ＬＡＭＰ反応液として、２０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭＫＣｌ、８ｍＭＭｇＳＯ₄、１０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．８ＭＢｅｔａｉｎｅ、２．８ｍＭｄＧＴＰ、２．８ｍＭｄＣＴＰ、２．８ｍＭｄＡＴＰ、２．８ｍＭｄＴＴＰと、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、または、Ｍ．ａｖｉｕｍ、または、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、または、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉのゲノムＤＮＡ１００、１０、１、０．１ｐｇを添加し、全容量を２４μｌとし氷上に置いた。これに、８ｕｎｉｔｓ／μｌのＢｓｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＬａｒｇｅＦｒａｇｍｅｎｔ（ＮＥＷＥＮＧＬＡＮＤＢｉｏＬａｂｓ）１μｌを添加して全容量を２５μｌとし、ゆっくり混和した後、速やかにＬＡＭＰ反応専用リアルタイム濁度測定装置ＬＡ−２００（テラメックス社）にセットし、６４℃にて４０分間反応させ、増幅反応中の濁度を測定した結果を図４〜６に示す。Ｍ．ａｖｉｕｍおよびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ検出用プライマーセットではゲノムＤＮＡ１ｐｇ（菌２１０個相当）、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ検出用プライマーセットではゲノムＤＮＡ１０ｐｇ（菌２１００個相当）を検出することができた。

本発明のオリゴヌクレオチドを使ってＬＡＭＰ反応を行うことにより、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕａｌｒｅ、及びＭ．ｋａｎｓａｓｉｉを特異的かつ高感度に検出することが可能となり、医療分野で好適に利用できる。

実施例１のＭ．ａｖｉｕｍ検出用プライマーを使ったＬＡＭＰ反応のリアルタイム濁度測定結果。図中のＭｔｕはＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、ＭａｖはＭ．ａｖｉｕｍ、ＭｉｎはＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、ＭｋａはＭ．ｋａｎｓａｓｉｉのゲノムＤＮＡを示す。実施例１のＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ検出用プライマーを使ったＬＡＭＰ反応のリアルタイム濁度測定結果。図中のＭｔｕはＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、ＭａｖはＭ．ａｖｉｕｍ、ＭｉｎはＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、ＭｋａはＭ．ｋａｎｓａｓｉｉのゲノムＤＮＡを示す。実施例１のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ検出用プライマーを使ったＬＡＭＰ反応のリアルタイム濁度測定結果。図中のＭｔｕはＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、ＭａｖはＭ．ａｖｉｕｍ、ＭｉｎはＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、ＭｋａはＭ．ｋａｎｓａｓｉｉのゲノムＤＮＡを示す。実施例２のＭ．ａｖｉｕｍ検出用プライマーを使ったＬＡＭＰ反応のリアルタイム濁度測定結果。１００、１０、１、０．１ｐｇのＭ．ａｖｉｕｍのゲノムＤＮＡをＬＡＭＰ反応のテンプレートとして使用。実施例２のＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ検出用プライマーを使ったＬＡＭＰ反応のリアルタイム濁度測定結果。１００、１０、１、０．１ｐｇのＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅのゲノムＤＮＡをＬＡＭＰ反応のテンプレートとして使用。実施例２のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ検出用プライマーを使ったＬＡＭＰ反応のリアルタイム濁度測定結果。１００、１０、１、０．１ｐｇのＭ．ｋａｎｓａｓｉｉのゲノムＤＮＡをＬＡＭＰ反応のテンプレートとして使用。

Claims

配列番号１３又は１４に記載の塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチド。
配列番号１８又は１９に記載の塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチド。
配列番号２１又は２２に記載の塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチド。
配列番号１６、１７、２０又は２３に記載の塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチド。
ＬＡＭＰ法におけるインナープライマーとして配列番号１３または１４に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを用いる、ＬＡＭＰ法にてＭ．ａｖｉｕｍの核酸を増幅する方法。
ＬＡＭＰ法におけるループプライマーとして配列番号１６または１７に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを用いる、ＬＡＭＰ法にてＭ．ａｖｉｕｍの核酸を増幅する方法。
ＬＡＭＰ法におけるインナープライマーとして配列番号１３または１４に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを用い、ループプライマーとして配列番号１６または１７に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを用いる、ＬＡＭＰ法にてＭ．ａｖｉｕｍの核酸を増幅する方法。
ＬＡＭＰ法におけるインナープライマーとして配列番号１８または１９に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを用いる、ＬＡＭＰ法にてＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅの核酸を増幅する方法。
ＬＡＭＰ法におけるループプライマーとして配列番号２０または１７に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを用いる、ＬＡＭＰ法にてＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅの核酸を増幅する方法。
ＬＡＭＰ法におけるインナープライマーとして配列番号１８または１９に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを用い、ループプライマーとして配列番号２０または１７に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを用いる、ＬＡＭＰ法にてＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅの核酸を増幅する方法。
ＬＡＭＰ法におけるインナープライマーとして配列番号２１または２２に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを用いる、ＬＡＭＰ法にてＭ．ｋａｎｓａｓｉｉの核酸を増幅する方法。
ＬＡＭＰ法におけるループプライマーとして配列番号２３または１７に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを用いる、ＬＡＭＰ法にてＭ．ｋａｎｓａｓｉｉの核酸を増幅する方法。
ＬＡＭＰ法におけるインナープライマーとして配列番号２１または２２に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを用い、ループプライマーとして配列番号２３または１７に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを用いる、ＬＡＭＰ法にてＭ．ｋａｎｓａｓｉｉの核酸を増幅する方法。
配列番号１３または１４に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つ、及び／又は配列番号１６または１７に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを含む、請求項５から７のいずれかに記載の方法でＭ．ａｖｉｕｍの核酸をＬＡＭＰ法にて検出するためのキット。
配列番号１８または１９に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つ、及び／又は配列番号２０または１７に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを含む、請求項８から１０のいずれかに記載の方法でＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕａｌｒｅの核酸をＬＡＭＰ法にて検出するためのキット。
配列番号２１または２２に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つ、及び／又は配列番号２３または１７に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つを含む、請求項１１から１３のいずれかに記載の方法でＭ．ｋａｎｓａｓｉｉの核酸をＬＡＭＰ法にて検出するためのキット。