CN110273015A - 一种基于lamp技术的堪萨斯分枝杆菌可视化检测方法 - Google Patents

一种基于lamp技术的堪萨斯分枝杆菌可视化检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明通过设计LAMP反应体系的引物混合液并在LAMP反应之后利用横流生物传感条进行检测，获得了一种堪萨斯分枝杆菌可视化检测方法。本发明设计的引物混合液的引物序列为：F3：GGCAATGTCGATGACAACAG；B3：ACATCGGCCAGATCCTG；FIP：CCGAGCCGAACCAGATCGTGCTGCAGTTCGGCCTCCT；BIP：AAGGTTGGCCGCCCAGTAAACCCACCTGGGATGG；LF：GACTCCGGTGTTCGA；LB：GTGAACCCGCGATCT。本发明的检测限低，对于DNA样品的检测限仅为1fg/μL，对于唾液样品的检测限仅为50CFU/mL。

Description

一种基于LAMP技术的堪萨斯分枝杆菌可视化检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种基于LAMP技术的堪萨斯分枝杆菌可视化检测方法。
背景技术
非结核性分枝杆菌是除了结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌之外的分枝杆菌，其分布广泛，主要存在于土壤和水中，包括快速生长菌和慢速生长菌两类。堪萨斯分枝杆菌属于慢速生长菌一类，是一种条件致病菌，主要引起人体肺部感染和肺外播散性感染。患有慢性肺病和肿瘤的患者、感染结核分枝杆菌和酗酒的人们感染堪萨斯分枝杆菌的几率较高。在中国，堪萨斯分枝杆菌是鸟胞类非结核分枝杆菌之后第二大引发疾病的慢速生长的非结核性分枝杆菌。
堪萨斯分枝杆菌与结核分枝杆菌的DNA相似。因此，在进行检测时，将两种菌进行区分，非常重要。传统的堪萨斯分枝杆菌检测方法是将细菌培养之后进行生化检测，这种方法不仅耗时且精度不高。而利用包括气相色谱、高效液相色谱和飞行时间质谱在内的色谱法对堪萨斯分枝杆菌进行检测则需要昂贵的仪器和复杂的操作步骤。相较之下，分子检测法更具优势。然而，目前的基因芯片法、反向杂交法和测序法仍然存在设备成本过高、检测时间较长的缺点。
因此，需要一种简单易行、设备成本低、检测精度高的堪萨斯分枝杆菌的检测方法。
发明内容
针对现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种对堪萨斯分枝杆菌进行检测的方法，该方法具有设备要求低、检测时间短、检测结果可视化的优点、检测限低和检测精度高的优点。
为了实现上述目的，本发明提供了如下方案：
一种基于LAMP技术的堪萨斯分枝杆菌可视化检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)构建LAMP反应体系，体系由引物混合液、反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、去离子水和待测DNA构成；进行LAMP反应时，在60～70℃下进行延伸反应，在80～95℃下进行终止反应；
(2)利用横流生物传感条对步骤(1)LAMP反应产物进行检测，在硝酸纤维素膜上发现两条红线，即表示待测DNA来自于堪萨斯分枝杆菌；
所述反应缓冲液为脱氧核糖核酸恒温扩增试剂盒中的2×反应缓冲液；
所述引物混合液中的引物的序列由5′–3′如下：
F3 GGCAATGTCGATGACAACAG
B3 ACATCGGCCAGATCCTG
FIP CCGAGCCGAACCAGATCGTGCTGCAGTTCGGCCTCCT
BIP AAGGTTGGCCGCCCAGTAAACCCACCTGGGATGG
LF GACTCCGGTGTTCGA
LB GTGAACCCGCGATCT
。
所述LAMP反应体系中，每25μL含有如下组分：
1.4μL所述引物混合液、12.5μL所述反应缓冲液、1.0μL BstDNA聚合酶、1.0μL待测DNA、9.1μL去离子水。
所述延伸反应时间为30～60min。
作为本发明的一个可选技术方案，所述反应缓冲液由如下成分组成：
作为本发明的一个优选技术方案，终止反应时，温度为85℃，时间为5min，或者，温度为95℃，时间为2min。
作为本发明的一个优选技术方案，所述延伸温度为67℃。
作为本发明的一个优选技术方案，所述延伸反应时间为40min。
作为本发明的一个可实施方案，在FIP引物的5’端用5-羧基荧光素标记；在LF引物的5’端用生物素标记。
作为本发明的一个优选技术方案，所述引物混合物中，各引物的浓度为：F3：0.1μM、B3：0.1μM、FIP：0.4μM、BIP：0.4μM、LF：0.2μM、LB：0.2μM。
作为本发明的一个可实施方案，进行步骤(2)时，将0.5μL步骤(1)所得扩增产物与100μL传感条缓冲液先后置于横流生物传感条的点样区中，待传感条缓冲液被吸收之后，在硝酸纤维素膜上发现两条红线(分别是Control Line，Test Line)，即表示待测DNA来自于堪萨斯分枝杆菌。在硝酸纤维素膜上发现一条红线(Control Line)，即表示无堪萨斯分枝杆菌；出现其他情况，表示实验失效。
作为本发明的一个可实施方案，所述传感条缓冲液为含有1％吐温-20、浓度为10mM的PBS溶液，其pH＝7.4。
本发明的有益效果：
1、本发明实现了对堪萨斯分枝杆菌的可视化检测；
2、本发明不需配备昂贵设备，只需一台恒温设备或水浴锅即可，设备成本低廉；
3、本发明所需时间少，最佳反应条件下，延伸时间只需40分钟，整个实验可在1小时内完成；
4、本发明的检测限低，对于DNA样品的检测限仅为1fg/μL，对于唾液样品的检测限仅为50CFU/mL。
附图说明
图1为本发明通过实时浊度仪测定的最佳延伸温度的实验结果图；
图2为利用浊度仪对扩增产物的检测限的检测结果图，图中，从左至右，检测样品分别为堪萨斯分枝杆菌DNA(1ng/μL,10pg/μL,1pg/μL,100fg/μL,10fg/μL,1fg/μL,0.1fg/μL)和双蒸水(DDW)；
图3为利用比色法对扩增产物的检测限的检测结果图，图中，从左至右，检测样品分别为堪萨斯分枝杆菌DNA(1ng/μL,10pg/μL,1pg/μL,100fg/μL,10fg/μL,1fg/μL,0.1fg/μL)和双蒸水(DDW)；
图4为LFB对扩增产物的检测限的检测结果图，图中，从左至右，检测样品分别为堪萨斯分枝杆菌DNA(1ng/μL,10pg/μL,1pg/μL,100fg/μL,10fg/μL,1fg/μL,0.1fg/μL)和双蒸水，检测时的延伸反应时间为60分钟；
图5为最佳延伸时间的实验结果图，其中，第一排从左到右的分别为堪萨斯分枝杆菌DNA(1ng/μL,10pg/μL,1pg/μL,100fg/μL,10fg/μL,1fg/μL,0.1fg/μL)，延伸时间为40分钟；第二排从左到右的分别为堪萨斯分枝杆菌DNA(1ng/μL,10pg/μL,1pg/μL,100fg/μL,10fg/μL,1fg/μL,0.1fg/μL)，延伸时间为30分钟；
图6为本发明特异性检测结果图，其中，各反应样品为：
1-1 M.kansasii ATCC12478；
1-2～1-25 M.kansasii isolated strains(NTRL)；
2-1 M.tuberculosis H37Rv(ATCC27294)；
2-2～2-12 M.tuberculosis isolated strains(NTRL)；
3-1 M.intracellulare ATCC13950；
3-2～3-4 M.intracellulare isolated strains(NTRL)；
4-1 M.chelonae ATCC14472；
4-2～4-3 M.chelonae isolated strains(NTRL)；
5-1 M.fortuitum ATCC6841；
5-2～5-3 M.fortuitum isolated strains(NTRL)；
6-1 M.gordonae ATCC14470；
6-2～6-3 M.gordonae isolated strains(NTRL)；
7-1 M.abscessus ATCC19977；
7-2～7-6 M.abscessus isolated strains(NTRL)；
8 M.aurum ATCC23366；
9 M.neoaurum ATCC25795；
10 M.marinum ATCC927；
11 M.gilvum ATCC43909；
12 M.aichiense ATCC27280；
13 M.smegmatis ATCC19420；
14 M.para-fortuitum ATCC19686；
15 M.terrae ATCC15755；
16 M.nonchromogenicum ATCC19530；
17 M.vaccae ATCC15483；
18-1 M.avium ATCC25291；
18-2～18～5 isolated strains(NTRL)；
19 M.phlei ATCC11758；
20 M.scro-fulaceum ATCC19981；
21 M.gastri ATCC15754；
22 M.triviale ATCC23292；
23 M.xenopi ATCC19250；
24 M.africanum ATCC25420；
25 M.bovis BCG ATCC 19274；
26 M.tuberculosis H37Ra(ATCC 25177)；
27 M.bovis ATCC19210；
28 M.malmoense ATCC29571；
29 M.arupense isolated strains(NTRL)；
30 M.kumamotonense isolated strains(NTRL)；
31 M.paragordonae isolated strains(NTRL)；
32 M.scrofulaceum isolated strains(NTRL)；
33-1～33-2双蒸水；
34 K.peneumoniae isolated strains(NTRL)；
35 N.meningitidis isolated strains(NTRL)；
36 S.pneumoniae isolated strains(NTRL)；
其中，isolated strains(NTRL)意为来自中国国家结核病参比实验室(NTRL)分离的临床菌株；
图7为本发明人工痰样检测结果图，其中，从左到右的样品为浓度为5000CFU/mL、500CFU/mL、50CFU/mL和25CFU/mL堪萨斯分枝杆菌、结核分枝杆菌、双蒸水。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
下述实验例中的主要实验原料及设备
横流生物传感条(Lateral Flow Biosensor，简称LFB)、脱氧核糖核酸恒温扩增试剂盒和Te核酸扩增指示剂购于北京海泰正源；TE缓冲液、溶菌酶和蛋白酶K购于北京索莱宝科技有限公司；十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和十二烷基硫酸钠(SDS)购于Amresco公司。
所用的85株分枝杆菌和3株呼吸道致病菌(表1所示)来自于中国国家结核病参比实验室(NTRL)。所有的分枝杆菌在改良Loewenstein-Jensen培养基(购于赛诺特生物有限公司)中于37℃培养。这些菌的基因组DNA通过CTAB-苯酚-氯仿提取法进行提取，之后利用Nano drop ND-100仪进行定量并梯度稀释至1ng/μL,10pg/μL,1pg/μL,100fg/μL,10fg/μL,1fg/μL和0.1fg/μL用来进行检测限测定实验。
实施例1(Loop-Mediated Isothermal Amplification-Lateral FlowBiosensor)LAMP-LFB标准检测与特异性检测
1、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)LAMP-LFB检测引物如表1和表2所示：
表1
其中，FIP的5’端用5-羧基荧光素标记，LF的5’端用生物素标记。
表2
其中，FIP的5’端用5-羧基荧光素标记，LF的5’端用生物素标记。
2、LAMP检测：参考文献(Wang Y,Wang Y,Xu H,et al:Rapid and sensitivedetection of Listeria ivanovii by loop-mediated isothermal amplification ofthe smcL gene.PLoS One 9:e115868,2014)中的标准LAMP实验条件进行LAMP-LFB反应实验以验证堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)LAMP-LFB检测引物的匹配性。在LAMP反应中，25μL扩增体系包含1.4μL引物(如表3所示)，12.5μL 2×反应缓冲液(脱氧核糖核酸恒温扩增试剂盒)、1.0μL Bst DNA聚合酶(10U)和1.0μL模板DNA，9.1μL去离子水(或8.1μL去离子水与1.0μL Te核酸扩增指示剂)。反应产物利用Te核酸扩增指示剂、浊度仪(LA-320C)和横流生物传感条进行验证。
3、LFB检测：将0.5μL LAMP产物和100μL传感条缓冲液(10mM PBS,pH 7.4，1％Tween-20)先后分别加在横流生物传感条的点样区中。2分钟后，待传感条吸满全部缓冲液之后，LAMP产物的检测结果在硝酸纤维素膜(简称NC膜)上以红线形式呈现。
Te核酸扩增指示剂阳性组的扩增产物的颜色由紫色变为天蓝色，阴性组和空白对照组的颜色仍为紫色。LFB检测阳性组可观察到两条肉眼可见红线，分别为Control Line(简称CL)，Test Line(简称TL)，而阴性组和空白对照组仅可观察到一条对照线(CL)。堪萨斯分枝杆菌M.kansasii(ATCC12478)为阳性菌株，结核分枝杆菌M.tuberculosis H37Rv(ATCC 27294)为阴性对照组，双蒸水作为空白对照组。最佳的扩增条件为：在65-70℃延伸60分钟，于85℃下反应5分钟终止反应。
实验结果：
如表3所示，进行LAMP检测时，标准菌株M.kansasii ATCC 12478及其它临床分离堪萨斯分枝杆菌的检测结果为阳性，而M.tuberculosis H37Rv(ATCC27294)及其它受试菌的检测结果为阴性。这说明本发明的引物可以特异性的检测堪萨斯分枝杆菌。
表3
表中，“+”意为阳性结果，“-”意为阴性结果，Isolated strains(NTRL)意为来自中国国家结核病参比实验室(NTRL)分离的菌株。
如图6所示，进行LFB检测时，M.kansasii ATCC 12478及其它临床分离堪萨斯分枝杆菌的检测结果为阳性(出现两条红线)，而其它菌仅有一条红线。这说明本发明对于堪萨斯分枝杆菌的可视化检测具有高度的特异性。
实施例2最佳延伸温度实验优化实验
在实施例1的基础上，将M.kansasii ATCC 12478的DNA(1ng per reaction)作为阳性对照组以确定最佳的延伸温度。选取65-70℃作为延伸温度区间，并利用实时浊度计进行检测。如图1所示，最佳的延伸温度为67℃。
实施例3检测限实验
在实施例1、2的基础上，通过对基因组DNA模板进行梯度稀释(1ng/μL,10pg/μL,1pg/μL,100fg/μL,10fg/μL,1fg/μL和0.1fg/μL)进行检测限测定实验。将M.kansasii-LAMP-LFB测试的结果与Te核酸扩增指示剂和实时浊度仪检测结果进行比较，测试重复三次。
如图2～4所示，对不同浓度的堪萨斯分枝杆菌基因组DNA和双蒸水在67℃延伸温度下进行LAMP扩增60分钟，通过浊度仪、Te核酸扩增指示剂和LFB检测，可知本发明可以对1fg的DNA进行检测。
实施例4最佳延伸时间实验优化实验
在实施例1、2、3的基础上，通过将堪萨斯分枝杆菌M.kansasii-LAMP-LFB检测的延伸温度设置为67℃，时间设置为30分钟和40分钟，并与延伸时间为60分钟的试验结果进行对比，然后，将反应产物用横流生物传感条进行分析，各实验重复三次。
如图5所示，通过LAMP检测不同浓度的M.kansasii模板DNA(1ng/μL,10pg/μL,1pg/μL,100fg/μL,10fg/μL,1fg/μL和0.1fg/μL)，并用LFB进行检测，结果显示最佳的延伸时间为40分钟。
实施例5人工痰样检测限实验
在实施例1、2、3、4的基础上，在进行上述堪萨斯分枝杆菌M.kansasii-LAMP-LFB检测法参数的优化之后，利用含M.kansasii(ATCC 12478)和M.tuberculosis H37Rv(ATCC27294)人工痰样来检测实验的准确性。实验中的DNA利用煮沸法将从含M.kansasii的人工痰样(浓度为5000CFU/mL,500CFU/mL,50CFU/mL,25CFU/mL)和含M.tuberculosis H37Rv的唾液样品(浓度为5000CFU/mL)中进行提取而得。在本次试验中，所加的模板DNA量为5μL。
如图7所示，本发明可以实现对50CFU/mL堪萨斯分枝杆菌痰样的检测。
序列表
<110> 四川省疾病预防控制中心
<120> 一种基于LAMP技术的堪萨斯分枝杆菌可视化检测方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
ggcaatgtcg atgacaacag 20
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
acatcggcca gatcctg 17
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
ccgagccgaa ccagatcgtg ctgcagttcg gcctcct 37
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
aaggttggcc gcccagtaaa cccacctggg atgg 34
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
gactccggtg ttcga 15
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
gtgaacccgc gatct 15

Claims (10)

1.一种基于LAMP技术的堪萨斯分枝杆菌可视化检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)构建LAMP反应体系，体系由引物混合液、反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、去离子水和待测DNA构成；进行LAMP反应时，在60～70℃下进行延伸反应，在80～95℃下进行终止反应；
(2)利用横流生物传感条对步骤(1)LAMP反应产物进行检测，在硝酸纤维素膜上发现两条红线，即表示待测DNA来自于堪萨斯分枝杆菌；
所述反应缓冲液为脱氧核糖核酸恒温扩增试剂盒中的2×反应缓冲液；
所述引物混合液中的引物的序列由5′–3′如下：
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述LAMP反应体系中，每25μL含有如下组分：
1.4μL所述引物混合液、12.5μL所述反应缓冲液、1.0μL Bst DNA聚合酶、1.0μL待测DNA、9.1μL去离子水。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，延伸反应时间为30～60min。
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述反应缓冲液由如下成分组成：
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，终止反应时，温度为85℃，时间为5min，或者，温度为95℃，时间为2min。
6.根据权利要求1～4任一项所述的检测方法，其特征在于，所述延伸温度为67℃；和/或，所述延伸反应时间为40min。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在FIP引物的5’端用5-羧基荧光素标记；在LF引物的5’端用生物素标记。
8.根据权利要求1或7所述的检测方法，其特征在于，所述引物混合物中，各引物的浓度为：F3：0.1μM、B3：0.1μM、FIP：0.4μM、BIP：0.4μM、LF：0.2μM、LB：0.2μM。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，进行步骤(2)时，将0.5μL步骤(1)所得扩增产物与100μL传感条缓冲液先后置于横流生物传感条的点样区中，待传感条缓冲液被吸收之后，在硝酸纤维素膜上发现两条红线，即表示待测DNA来自于堪萨斯分枝杆菌。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述传感条缓冲液为含有1％吐温-20、浓度为10mM的PBS溶液，其pH＝7.4。
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CHUANG CHEN, ET AL.: ""Detection of Mycobacterium kansasii using a combination of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) and lateral flow biosensors"", 《INTERNATIONAL MICROBIOLOGY》 *

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