CN102732601B - 一种基于恒温核酸扩增技术诊断结核病的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于恒温核酸扩增技术诊断结核病的试剂盒。本发明提供了一种辅助鉴定致病性分枝杆菌的专用引物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成。本发明还保护含有所述专用引物的试剂盒。本发明提供的试剂盒灵敏度高、特异性强，且操作简便、所需设备简单、成本低廉，可用于检测致病性分枝杆菌，进而辅助结核病诊断，具有重大应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于恒温核酸扩增技术诊断结核病的试剂盒。
背景技术
分枝杆菌属(Mycobacterium)是一类细长略弯曲的微生物，有时有分枝或出现丝状体。本属细菌的主要特点是细胞壁含有大量脂质，主要是分枝菌酸。这和其染色性、生长特性、致病性、抵抗力等密切相关。一般不易着色，若经加温或延长染色时间而着色后能抵抗强脱色剂盐酸乙醇的脱色，故又称抗酸杆菌(acid-fast bacilli)。该菌属无鞭毛、无芽胞、不产生内、外毒素，其致病性和菌体成分有关。引起的疾病都呈慢性，并伴有肉芽肿。分枝杆菌属种类较多，其中的致病菌主要有M.tuberculosis、M.bovis、M.africanum和M.microti，称为结核分枝杆菌复合群，是结核病的病原菌。
目前结核病的诊断还存在很多问题。
痰涂片抗酸染色在肺结核诊断上有比较高的特异性，但敏感性低，约为15％-30％。结核分枝杆菌培养需要2-6周，技术较复杂、费用高、时间长。
X线检查在结核病的诊断上有比较重要的参考价值，但通常而言缺乏特异性，在很多情况下与其他疾病的鉴别诊断比较困难，特别是不典型病变。
血清学诊断方法(如ELISA)具有简单快速的优点，易于推广应用，是目前研究比较多的结核病诊断方法之一，但该方法在结核病诊断的特异性和敏感性方面还有待提高。对血清学诊断方法的系统分析显示，现有商品化血清学试剂诊断肺结核的敏感性在10％到90％之间，特异性介于47％至100％；菌阳病人诊断的敏感性和特异性明显高于菌阴患者；肺外结核诊断的敏感性在0％到100％之间，特异性为59％-100％；说明这些血清学诊断试剂对肺结核，特别是肺外结核的诊断价值有限。
基于细胞免疫反应的ELISPOT(enzyme-linked immunospot assay)主要通过检测抗原诱导的IFN-γ分泌来诊断结核病及潜伏感染，同以往方法相比具有较好的特异性和敏感性。但该方法基于单一细胞因子的分泌，受影响因素比较多，有报道显示，其诊断活动性结核病的敏感性只有64％。
荧光实时定量PCR(polymerase chain reaction)技术虽然在结核病诊断上具有较高的敏感性和特异性，但需要专用设备，费用高，使用受到很大限制。
环介导基因恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是一种新型恒温基因扩增技术，该技术敏感性和特异性高，而且扩增只需单一的恒定温度，可以在简单的实验条件下开展，不需要专门的扩增和检测仪器，具有比常规PCR技术更广泛的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于恒温核酸扩增技术诊断结核病的试剂盒。
本发明提供了一种辅助鉴定致病性分枝杆菌的专用引物，由序列表的序列1所示DNA(IS1081-F3)、序列表的序列2所示DNA(IS1081-B3)、序列表的序列3所示DNA(IS1081-FIP)和序列表的序列4所示DNA组成(IS1081-BIP)。
所述致病性分枝杆菌可为M.tuberculosis(如ATCC 27294)、M.bovis(如ATCC19210)、M.africanum(如ATCC 25420)和M.microti(如ATCC 19422)中的一种或几种。M.为Mycobacterium的缩写。M.tuberculosis、M.bovis、M.africanum和M.microti，称为结核分枝杆菌复合群，是结核病的病原菌。
所述专用引物可用于制备如下(a)和/或(b)和/或(c)：
(a)辅助鉴定致病性分枝杆菌的试剂盒；
(b)辅助鉴定肺结核患者的试剂盒；
(c)辅助鉴定结核性胸膜炎患者的试剂盒。
所述致病性分枝杆菌可为M.tuberculosis(如ATCC 27294)、M.bovis(如ATCC19210)、M.africanum(如ATCC 25420)和M.microti(如ATCC 19422)中的一种或几种。
本发明还保护一种试剂盒，含有所述专用引物；所述试剂盒的功能为如下(a)和/或(b)和/或(c)：
(a)辅助鉴定致病性分枝杆菌；
(b)辅助鉴定肺结核患者；
(c)辅助鉴定结核性胸膜炎患者。
所述致病性分枝杆菌可为M.tuberculosis(如ATCC 27294)、M.bovis(如ATCC19210)、M.africanum(如ATCC 25420)和M.microti(如ATCC 19422)中的一种或几种。
所述专用引物可用于辅助鉴定致病性分枝杆菌。
所述致病性分枝杆菌可为M.tuberculosis(如ATCC 27294)、M.bovis(如ATCC19210)、M.africanum(如ATCC 25420)和M.microti(如ATCC 19422)中的一种或几种。
为了保证实验的准确性，每次最好设立阴性对照(不含结核分枝杆菌核酸的液体，如无菌超纯水或TE缓冲液)和阳性对照(结核分枝杆菌核酸，或确定含有结核分枝杆菌的样本)。
应用所述专用引物辅助鉴定致病性分枝杆菌、辅助鉴定肺结核患者或辅助鉴定结核性胸膜炎患者时，可采用以下方法：以待测样本的基因组DNA为模板，用所述专用引物进行环介导基因恒温扩增，根据扩增情况辅助鉴定。
所述环介导基因恒温扩增的反应体系中，所述IS1081-F3的浓度可为0.2μmol，所述IS1081-B3的浓度可为0.2μmol，所述IS1081-FIP的浓度可为1.6μmol，所述IS1081-BIP的浓度可为1.6μmol。
25μl所述环介导基因恒温扩增的反应体系具体可为：含12.5μl 2×LAMP reactionbuffer(Eiken Chemical，Tochigi，Japan)，1μl Bst DNA聚合酶(Riken Chemical，Tochigi，Japan)，1μl Fluorescent Detection Reagent(Eiken Chemical，Tochigi，Japan)，0.2μmol IS1081-F3、0.2μmol IS1081-B3、1.6μmol IS1081-FIP、1.6μmolIS1081-BIP和1μl基因组DNA，其余为水。
所述环介导基因恒温扩增的反应条件具体可为：65℃恒温孵育60分钟至90分钟。
为了防止实验室LAMP反应交叉污染，LAMP反应完成后不要开盖。
本发明建立了基于结核分枝杆菌IS1081基因的环介导基因恒温扩增试剂盒，该试剂盒灵敏度高、特异性强，且操作简便、所需设备简单、成本低廉，可用于检测致病性分枝杆菌，进而辅助结核病诊断，具有重大应用前景。
附图说明
图1为IS1081基因部分序列及环介导基因恒温扩增引物所在的位点。
图2为环介导基因恒温扩增结果(浊度观察)；各反应管对应的LAMP反应体系中分别含有1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg结核分枝杆菌基因组DNA；NC代表阴性对照；PC代表阳性对照。
图3为环介导基因恒温扩增结果(荧光观察)；各反应管对应的LAMP反应体系中分别含有1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg结核分枝杆菌基因组DNA；NC代表阴性对照；PC代表阳性对照。
图4为环介导基因恒温扩增结果(琼脂糖凝胶电泳观察)；各泳道对应的LAMP反应体系中分别含有1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg结核分枝杆菌基因组DNA；NC代表阴性对照；PC代表阳性对照。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。敏感性：确诊为肺结核的病人中，LMAP检测为阳性的病人所占的比例。特异性：LMAP检测为阳性的病人中，确诊为肺结核的病人所占的比例。
实施例1、专用引物的制备
合成表1所示的各条引物。专用引物由四条引物(IS1081-F3、IS1081-B3、IS10811-FIP、IS1081-BIP)组成。IS1081-F3、IS1081-B3、IS1081-FIP、IS1081-BIP的核苷酸序列见表1。
表1专用引物中的各条引物的核苷酸序列
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) |
| IS1081-F3(序列表的序列1) | TCTCATCTTATCGACGCCGA |
| IS1081-B3(序列表的序列2) | CGGGTGTCGAAATCACGGT |
| IS1081-FIP(序列表的序列3) | GGCGATGAACGTCGAGAGCAGCAGCTTCTGGCTGACCAA |
| IS1081-BIP(序列表的序列4) | TTGATGGGGGCTGAAGCCGATTGCGCTGATTGGACCG |
结核分枝杆菌H37Rv标准株IS1081转座酶基因序列(GenBank：BX842575)如序列表的序列5所示，引物所在位点见图1。专用引物扩增IS1801靶基因的部分片段(203bp)。
实施例2、专用引物检测致病性分枝杆菌的灵敏度和特异性
待测样本分别为：20种分枝杆菌标准株和3株非分枝杆菌对照株(见表2)。ATCC即美国模式培养物集存库(American type culture collection)，网址为http://www.atcc.org/。
将待测样本分别进行如下实验：
1、提取基因组DNA
将待测样本无菌处理后加入含5mg/ml溶菌酶的TE缓冲液，37℃过夜孵育；然后加入蛋白酶A(终浓度为2mg/ml)和SDS(终浓度为1％；质量百分含量)，56℃水浴锅过夜孵育；然后采用酚-氯仿法提取基因组DNA，溶于10mM Tris-HCl缓冲液，-20℃冻存备用。
2、环介导基因恒温扩增(LAMP)
LAMP反应体系(25μl)：含12.5μl 2×LAMP reaction buffer(Eiken Chemical，Tochigi，Japan)，1μl Bst DNA聚合酶(Eiken Chemical，Tochigi，Japan)，1μlFluorescent Detection Reagent(Eiken Chemical，Tochigi，Japan)，0.2μmolIS1081-F3、0.2μmol IS1081-B3、1.6μmol IS1081-FIP、1.6μmol IS1081-BIP和1μl基因组DNA，其余为水；采用1μl 10mM Tris-HCl缓冲液作为基因组DNA的阴性对照；采用1ng M.tuberculosis(ATCC 27294)的基因组DNA作为阳性对照。
将含有LAMP反应体系的反应管在65℃恒温孵育60分钟后，在日光下观察反应管内液体的浊度，在365nm紫外灯下观察反应管内液体的荧光，并用1.5％琼脂糖电泳分析DNA扩增产物。结果表明：只有M.tuberculosis(ATCC 27294)、M.bovis(ATCC19210)、M.africanum(ATCC 25420)、M.microti(ATCC 19422)四种致病性分枝杆菌反应管内的液体在日光下能观察到浑浊，在紫外灯下有荧光显示，琼脂糖电泳可见扩增的核酸产物；其他分枝杆菌标准株和3株其他细菌的反应管内的液体在日光下均不能观察到浑浊，且在紫外灯下均没有荧光显示。
结果见表2(反应体系中含有1ng基因组DNA)。
M.tuberculosis(ATCC 27294)的浊度观察见图2，阳性对照管和加入1ng至1pg结核分枝杆菌基因组DNA的LAMP反应管均可见沉淀所致混浊。
M.tuberculosis(ATCC 27294)的荧光观察见图3，阳性对照管和加入1ng至1pg结核分枝杆菌基因组DNA的LAMP反应管均可见荧光。
M.tuberculosis(ATCC 27294)的琼脂糖凝胶电泳图见图4，阳性对照管和加入1ng至100fg结核分枝杆菌基因组DNA的LAMP反应管均可见扩增产物。
3、实时荧光定量PCR
将步骤1得到的基因组DNA分别进行实时荧光定量PCR，作为步骤2的验证。
实时荧光定量PCR所用的引物对如下：
5’-CTGCGCGGGCTGCTCTC-3’；
5’-TAGCCGTTGCGCTGATTGG-3’；
荧光探针：5’-CGCTCATCGCTGCGTTCGCGGT-3’。
结果见表2(反应体系中含有1ng基因组DNA)。
表2 专用引物检测致病性分枝杆菌的特异性检测结果(M.为Mycobacterium的缩写)
将含有LAMP反应体系的反应管在65℃恒温孵育90分钟的结果与孵育60分钟结果一致。
结果表明，采用专用引物的LAMP可用于致病性分枝杆菌的检测，具有良好的灵敏度和特异性。
实施例3、应用专用引物检测肺结核病人痰标本，用于肺结核诊断
待测样本：18例痰涂片抗酸染色阳性的肺结核病人(知情同意的志愿者)的痰液；2例非结核性肺炎病人(知情同意的志愿者)的痰液。
将待测样本分别进行如下实验：
1、提取基因组DNA。
2、环介导基因恒温扩增
LAMP反应体系(25μl)：含12.5μl 2×LAMP reaction buffer(Eiken Chemical，Tochigi，Japan)，1μl Bst DNA聚合酶(Eiken Chemical，Tochigi，Japan)，1μlFluorescent Detection Reagent(Eiken Chemical，Tochigi，Japan)，0.2μmolIS1081-F3、0.2μmol IS1081-B3、1.6μmol IS1081-FIP、1.6μmol IS1081-BIP和1μl基因组DNA，其余为水；采用1μl 10mM Tris-HCl缓冲液作为阴性对照；采用1ng M.tuberculosis(ATCC 27294)的基因组DNA作为阳性对照。
将含有LAMP反应体系的反应管在65℃恒温孵育60分钟后，在日光下观察反应管内液体的浊度，然后在365nm紫外灯下观察反应管内液体的荧光。结果见表3。结果表明：阳性对照和13例肺结核病人的痰液核酸标本的反应管内的液体在日光下均能观察到浑浊，且在紫外灯下均有荧光显示；阴性对照、5例肺结核病人和2例非结核性肺炎病人痰液核酸标本反应管内的液体在日光下均不能观察到浑浊，且在紫外灯下均没有荧光显示。敏感性和特异性分别为72.2％和100％。
将含有LAMP反应体系的反应管在65℃恒温孵育90分钟后，在日光下观察反应管内液体的浊度，然后在365nm紫外灯下观察反应管内液体的荧光。结果见表3。结果表明：阳性对照和18例肺结核病人的痰液核酸标本的反应管内的液体在日光下均能观察到浑浊，且在紫外灯下均有荧光显示；阴性对照和2例非结核性肺炎病人的痰液核酸标本的反应管内的液体在日光下均不能观察到浑浊，且在紫外灯下均没有荧光显示。敏感性和特异性均为100％。
表3 18例肺结核病人及2例非结核性肺炎病人的检测结果
实施例4、应用专用引物检测结核性胸膜炎胸腔积液标本，用于诊断结核性胸膜炎
待测样本：72例结核性胸膜炎病人(知情同意的志愿者)的胸腔积液；24例非结核性胸腔积液病人(10例非结核性胸腔感染病人，13例癌性胸腔积液病人，1例其他病人；均为知情同意的志愿者)的胸腔积液。，
将待测样本分别进行如下实验：
1、提取基因组DNA。
2、环介导基因恒温扩增
LAMP反应体系(25μl)：含12.5μl 2×LAMP reaction buffer(Eiken Chemical，Tochigi，Japan)，1μl Bst DNA聚合酶(Eiken Chemical，Tochigi，Japan)，1μlFluorescent Detection Reagent(Eiken Chemical，Tochigi，Japan)，0.2μmolIS1081-F3、0.2μmol IS1081-B3、1.6μmol IS1081-FIP、1.6μmol IS1081-BIP和1μl基因组DNA，其余为水；采用1μl 10mM Tris-HCl缓冲液作为阴性对照；采用1ng M.tuberculosis(ATCC 27294)的基因组DNA作为阳性对照。
将含有LAMP反应体系的反应管在65℃恒温孵育60分钟后，在日光下观察反应管内液体的浊度，然后在365nm紫外灯下观察反应管内液体的荧光。结果见表4。结果表明：阳性对照和18例结核性胸膜炎病人胸腔积液核酸标本的反应管内的液体，在日光下均能观察到浑浊，且在紫外灯下均有荧光显示；阴性对照、54例结核性胸膜炎病人和24例非结核性胸腔积液病人胸腔积液核酸标本反应管内的液体，在日光下均不能观察到浑浊，且在紫外灯下均没有荧光显示。敏感性和特异性分别为25％和100％。
将含有LAMP反应体系的反应管在65℃恒温孵育90分钟后，在日光下观察反应管内液体的浊度，然后在365nm紫外灯下观察反应管内液体的荧光。结果见表4。结果表明：阳性对照、35例结核性胸膜炎病人、4例非结核性胸腔积液病人胸腔积液核酸标本的反应管内的液体在日光下均能观察到浑浊，且在紫外灯下均有荧光显示；阴性对照、37例结核性胸膜炎病人和20例非结核性胸腔积液病人胸腔积液核酸标本反应管内的液体，在日光下均不能观察到浑浊，且在紫外灯下均没有荧光显示。敏感性和特异性分别为48.6％和83.3％。
表4 胸腔积液标本的检测结果
Claims (3)
1.一种辅助鉴定致病性分枝杆菌的专用引物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成；所述致病性分枝杆菌为Mycobacterium tuberculosis、Mycobacterium bovis、Mycobacterium africanum和Mycobacterium microti中的一种或几种。
2.权利要求1所述的专用引物在制备如下（a）和/或（b）和/或（c）中的应用：
（a）辅助鉴定致病性分枝杆菌的试剂盒；
（b）辅助鉴定肺结核患者的试剂盒；
（c）辅助鉴定结核性胸膜炎患者的试剂盒；
所述致病性分枝杆菌为Mycobacterium tuberculosis、Mycobacterium bovis、Mycobacterium africanum和Mycobacterium microti中的一种或几种。
3.一种试剂盒，含有权利要求1所述的专用引物；所述试剂盒的功能为如下（a）和/或（b）和/或（c）：
（a）辅助鉴定致病性分枝杆菌；
（b）辅助鉴定肺结核患者；
（c）辅助鉴定结核性胸膜炎患者；
所述致病性分枝杆菌为Mycobacterium tuberculosis、Mycobacterium bovis、Mycobacterium africanum和Mycobacterium microti中的一种或几种。
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