CN106939330A - 鸟-胞分枝杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物与探针 - Google Patents

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Abstract

本发明一种鸟-胞分枝杆菌的实时荧光核酸恒温扩增(SAT)检测试剂盒及其专用引物与探针。本发明以16S rRNA的特异性区域作为检测靶标，专用引物对和探针高特异性、高灵敏度，试剂盒能够检测临床样本分离株中的鸟-胞分枝杆菌(MAC)RNA，具有特异性高、灵敏度高、污染低及快速检测的特点，将在鸟-胞分枝杆菌(MAC)的临床诊断中发挥作用。

Description

鸟-胞分枝杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专 用引物与探针
技术领域
本发明属于生物技术领域中细菌的分子生物学检测，特别是涉及一种基于核酸提取技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术(SAT)的鸟-胞分枝杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物与探针。
背景技术
鸟-胞分枝杆菌(MAC)是鸟分枝杆菌-胞内分枝杆菌复合体的简称，是人型结核杆菌的近支抗酸菌，在结核杆菌以外的抗酸菌中，是从人分离频度最高的菌种，属于非结核分枝杆菌。
非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)是指结核分枝杆菌复合群(结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌)和麻风分枝杆菌以外的其它分枝杆菌。原称为非典型分枝杆菌，其特性有别于结核分枝杆菌，如对酸、碱比较敏感，对常用的抗结核菌药物较耐受，为条件致病菌。非结核分枝杆菌的生长温度不如结核分枝杆菌严格，大部分NTM是腐物寄生菌，存在于自然环境中，如水、土壤、灰尘等，常见于潮热地带，人和某些动物均可感染。
MAC因引起结核样病变而受到关注，MAC病具有与结核病临床表现相似的全身中毒和局部损害症状，主要侵犯肺部，在无菌种鉴定的情况下，可被误诊为结核病。
MAC肺病多发生于原有慢性肺部疾病，如支气管扩张症、尘肺、肺结核愈后的患者等。而在HIV/AIDS和免疫受损宿主中，MAC病通常表现为播散性。除MAC外，NTM引起肺部病变的主要菌种还有堪萨斯、脓肿、蟾蜍、偶发、马尔摩分枝杆菌等；MAC和瘰疬分枝杆菌还可引起淋巴结炎，前者更常见，次要菌种有偶发、龟、脓肿和堪萨斯分枝杆菌。引起播散型NTM病变的主要菌种有MAC、堪萨斯、龟、脓肿、嗜血分枝杆菌等。MAC和偶发分枝杆菌还可分别引起泌尿生殖系感染和眼部感染。
目前，MAC的鉴定方法主要有细菌学方法、色谱法和分子生物学方法。
细菌学方法目前仍是我国各大结核病防治院所中MAC菌种鉴定的常规方法。虽然近期有众多报道指出该方法由于局限性较多应被分子生物学等新兴方法所取代，但其也具备成本低、实验较易开展等优点。但是，该鉴定方法灵敏度低、特异性差、耗时长、准确性不尽如人意。
色谱法是鉴别缓慢生长NTM的快速、实用和可靠的方法，可用于直接鉴定Bactec7H12B分枝杆菌菌种及抗酸染色阳性标本中的MAC，其缺点是不能鉴别新的NTM菌种。
分子生物学方法克服以上缺点，已成为MAC快速鉴定的重要手段。DNA测序技术、PCR或多重PCR技术、基因芯片技术是目前最为常用的分子生物学方法。以上方法都是基于DNA水平的检测，易受环境中气溶胶的影响，极易交叉污染，出现假阳性，从而临床相关性差，无法区分潜伏感染与活动性感性，而且PCR为变温检测，对仪器要求高，扩增需Taqman酶，反应容易受抑制。
实时荧光核酸恒温扩增检测技术(Simultaneous Amplification and Testing，简称SAT)是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处，前者检测体系多了一个逆转录反应的步骤，核酸扩增在一个温度下进行(42℃)，无需热循环。采用M-MLV逆转录酶和T7RNA聚合酶进行核酸扩增，相对于其它核酸扩增技术，反应抑制物更少，能有效减少假阴性结果。然而，SAT技术在不同种类病原体的检测中应用所面临的问题各不相同，需要具体分析病原体的特性进行专门设计。目前，尚无针对MAC的实时荧光核酸恒温扩增检测技术的研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、高灵敏度、高特异性、污染易控、设备简单、成本低廉的鸟-胞分枝杆菌(MAC)的实时荧光核酸恒温扩增(SAT)检测试剂盒。
本发明所提供的鸟-胞分枝杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，以鸟-胞分枝杆菌16S rRNA的特异性区域作为检测靶标，包含有一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生鸟-胞分枝杆菌(MAC)靶标核酸(RNA)的DNA拷贝的检测引物T7和nT7，一条用于与在T7RNA聚合酶作用下根据所述鸟分枝杆菌靶标核酸(RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的鸟分枝杆菌检测探针和一条用于与在T7RNA聚合酶作用下根据所述胞内分枝杆菌靶标核酸(RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的胞内分枝杆菌检测探针。
所述鸟分枝杆菌16S rRNA的特异性区域的核苷酸序列如序列表中序列1所示；所述胞内分枝杆菌16S rRNA的特异性区域的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述鸟-胞分枝杆菌检测引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物的核苷酸序列如序列表中序列3所示，nT7引物的核苷酸序列如序列表中序列4所示；所述鸟分枝杆菌检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，所述胞内分枝杆菌检测探针的核苷酸序列如序列表中序列6所示，所述探针的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。
所述试剂盒还包含M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶，所述M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶存在于SAT酶液中，所述T7引物、nT7引物和检测探针存在于扩增检测液中。
更进一步，所述试剂盒还包含鸟-胞分枝杆菌内标和内标检测探针；所述内标为鸟-胞分枝杆菌靶标核苷酸序列的竞争性内标，其核苷酸序列如序列表中序列7所示，可与内标检测探针特异性结合；所述内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列8所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团，内标检测探针存在于扩增检测液中。
具体的，所述试剂盒包含样本保存液、鸟-胞分枝杆菌(MAC)扩增检测液、SAT酶液、MAC阳性对照、MAC阴性对照、MAC内标，其中：
(1)样本保存液：含硫酸铵(NH4)2SO4和HEPES的水溶液；
(2)鸟-胞分枝杆菌(MAC)扩增检测液：含dNTPs、NTPs、T7引物、nT7引物、鸟分枝杆菌检测探针、胞内分枝杆菌检测探针和内标检测探针；
(3)SAT酶液：含M-MLV反转录酶、T7RNA聚合酶；
(4)MAC阳性对照；含灭活的鸟-胞分枝杆菌的稀释物；
(5)MAC阴性对照：不含有任何核酸的溶液；
(6)MAC内标：含鸟-胞分枝杆菌内标RNA(序列如序列表中序列7所示)的稀释物。
更具体的，所述试剂盒的各种试剂组成如下：
(1)样本保存液：含5-50mM(NH4)2SO4和25-250mM HEPES的水溶液；
(2)鸟-胞分枝杆菌(MAC)扩增检测液：dNTPs 0.1-10mM、NTPs 1-20mM、含MAC引物(T7引物、nT7引物)、MAC探针(鸟分枝杆菌检测探针、胞内分枝杆菌检测探针)、MAC内标探针，浓度为2.5-10pmol/反应的水溶液；
(3)SAT酶液：主要含M-MLV反转录酶400-4000U/反应、T7RNA聚合酶200-2000U/反应；
(4)MAC阳性对照；含灭活的鸟-胞分枝杆菌的稀释物；
(5)MAC阴性对照：不含有任何核酸的溶液；
(6)MAC内标：含鸟-胞分枝杆菌内标RNA的稀释物；
最具体的，所述试剂盒中一个反应单位的各种试剂组成如下：
(1)样本保存液：含5-50mM(NH4)2SO4和25-250mM HEPES的水溶液；
(2)鸟-胞分枝杆菌(MAC)扩增检测液：Tris 10-50mM，MgCl210-40mM，dNTPs0.1-10mM，NTPs 1-20mM，PVP401-10％，KCl 5-40mM，引物和探针浓度为2.5-10pmol/反应；将引物和检测探针溶解在TE溶液(10mM Tris和1mM EDTA的混合液)中，其中T7引物浓度优选为5pmol/反应，nT7引物浓度优选为7.5pmol/反应，鸟分枝杆菌检测探针浓度优选为5pmol/反应，胞内分枝杆菌检测探针浓度优选为5pmol/反应，内标检测探针浓度优选为5pmol/反应；
(3)SAT酶液：M-MLV反转录酶400-4000U/反应，T7RNA聚合酶200-2000U/反应，2-10mM HEPES pH7.5，10-100mM N-acetyl-L-cysteine(L-半胱氨酸)，0.04-0.4mM zincacetate(乙酸锌)，10-100mM trehalose(海藻糖)，40-200mM Tris·HCl pH8.0，40-200mMKCl，0.01-0.5mM EDTA，0.1-1％(v/v)Triton X-100和20-50％(v/v)glycerol(丙三醇)；
(4)MAC阳性对照：含105-108cfu/mL灭活的鸟-胞分枝杆菌的稀释物；
(5)MAC阴性对照：不含有任何核酸的溶液；
(6)MAC内标：含104-108拷贝/μL鸟-胞分枝杆菌内标RNA的稀释物。
所述鸟-胞分枝杆菌(MAC)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂中的专用试剂，为以下表示的物质之一或其组合：
(1)用于在M-MLV反转录酶作用下产生鸟-胞分枝杆菌靶标核酸(RNA)的DNA拷贝的检测引物T7和nT7，T7引物的核苷酸序列如序列表中序列3所示，nT7引物的核苷酸序列如序列表中序列4所示；
(2)一条用于与在T7RNA聚合酶作用下根据所述鸟分枝杆菌靶标核酸(RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的鸟分枝杆菌检测探针和一条用于与在T7RNA聚合酶作用下根据所述胞内分枝杆靶标核酸(RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的胞内分枝杆菌检测探针；所述鸟分枝杆菌检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，所述胞内分枝杆菌检测探针的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团；
(3)内标和内标检测探针，内标为鸟-胞分枝杆菌靶标核苷酸序列的竞争性内标，其核苷酸序列如序列表中序列7所示，用于与鸟-胞分枝杆菌靶标核苷酸序列的竞争性内标(RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列8所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。
这些专用试剂，即鸟-胞分枝杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测的专用引物或探针及其组合也属于本发明内容。
所述试剂盒的使用方法，用于鸟-胞分枝杆菌(MAC)的实时荧光核酸恒温扩增检测，包括以下操作步骤：
1)提取鸟-胞分枝杆菌的核酸(RNA)；
2)将鸟-胞分枝杆菌的核酸(RNA)加入鸟-胞分枝杆菌扩增检测液(第一阶段反应物)中，在60℃下温育10分钟后，再在42℃下温育5分钟，然后加入SAT酶液(第二阶段酶反应物)，由此开始在42℃下继续温育40分钟，用检测仪同步记录荧光信号的变化；所述第一阶段反应物与第二阶段酶反应物的体积比为3：1；
3)根据荧光信号产生的时间和强度参照MAC阳性对照、MAC阴性对照和MAC内标检测结果对待测样品进行定性检测。
本发明是由发明人经过长期而深入的研究，经过大量筛选和验证，选择了16SrRNA的特异性区域作为检测靶标，开发出高特异性、高灵敏度的专用引物对和探针。其DNA序列保守性较好，GC含量约为59％，能够有效的避免GC含量过高带来的检测假阳性问题，有效地提高了检测的准确性，对其它非结核分枝杆菌以及其它感染部位相同和症状相似的细菌有较好的区分度。
使用本发明的鸟-胞分枝杆菌(MAC)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒进行检测，与现有的鸟-胞分枝杆菌(MAC)检测方法相比，具有以下优点：
(1)准确度高、特异性高：针对鸟-胞分枝杆菌的16S rRNA基因进行靶标筛选、引物设计，具有准确度高、特异性高的优点，可以实现鸟-胞分枝杆菌的准确检测。
(2)加入内标：可进一步有效监控假阴性的存在，使检测结果更加准确。
(3)快速检测：将核酸的扩增与检测在同一封闭体系中同步进行，而且整个过程中没有温度的升降及循环，因而所需时间大大缩短，扩增检测只需要40分钟。
(4)低污染：由于采取封闭式的恒温放大检测系统，整个过程中无需打开反应体系，因而避免了扩增产物的污染。
(5)污染易控：与实时荧光PCR相比，本发明的扩增产物是RNA，RNA在自然界中极易降解，所以污染控制较容易，交叉影响小。
(6)设备简单，成本低：与实时荧光定量PCR相比，本发明将核酸的扩增与检测在同一封闭体系中同步进行，整个过程没有温度的升降及循环，因而对所用PCR仪的设计和生产成本大幅降低。
综上所述，本发明试剂盒能够检测临床样本分离株中的鸟-胞分枝杆菌(MAC)，具有特异性高、灵敏度高(可达10cfu/反应)、污染低(扩增产物RNA在自然环境下易于降解)及快速检测(40分钟完成扩增检测)的特点，将在鸟-胞分枝杆菌(MAC)的临床诊断中发挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为比对组的引物对和探针的实时荧光核酸恒温扩增检测结果
图2为本发明组的引物对和探针的实时荧光核酸恒温扩增检测结果
图3为特异性样本的靶标实时荧光核酸恒温扩增检测结果
图4为特异性样本的内标实时荧光核酸恒温扩增检测结果
图5为临床样本的靶标实时荧光核酸恒温扩增检测结果
图6为临床样本的内标实时荧光核酸恒温扩增检测结果
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。
所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
所用引物和探针由美国RD Biosciences公司合成。
实施例中所用主要原料SAT酶液、内标的体外转录RNA由美国RD Biosciences公司提供，7500型PCR仪为美国ABI公司产品，NTPs、dNTPs等试剂和其它仪器均为常规可商购产品。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1、设计专用于实时荧光核酸恒温扩增检测鸟-胞分枝杆菌的引物和探针
在鸟-胞分枝杆菌(MAC)的核酸检测中，主要扩增的靶序列包括MPT64、katG基因、插入序列、rpoB基因和16S rRNA等，结合文献报道和本发明检测靶标为RNA的技术特点，发明人分析并确定以16S rRNA作为实时荧光核酸恒温扩增的靶序列。在此基础上，发明人经过大量筛选和验证，获得了高特异性、高灵敏度的专用引物对和相应的检测探针，使用该特定的引物对可对鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的核酸同时进行扩增，具有高特异性、高灵敏度等优点，可以用于准确地检测鸟-胞分枝杆菌。
本发明选择鸟-胞分枝杆菌16S rRNA中高度保守且特异性强的区段作为扩增靶序列(检测靶标，其核苷酸序列如序列表中序列1和序列2所示)，根据引物探针设计原理，使用DNAStar、DNAMAN软件和人工设计用于实时荧光核酸恒温扩增检测鸟-胞分枝杆菌的专用引物和探针，经筛选和验证，最终确定的具体序列如下：
(1)一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生鸟-胞分枝杆菌靶标核酸(RNA)的DNA拷贝的检测引物T7和nT7，T7引物序列为5’-aatttaatacgactcactatagggagatcaccccaccaacaagctgata-3’(序列表中序列3)，nT7引物序列为5’-caatctgccctgcacttcg-3’(序列表中序列4)；
(2)一条用于与在T7RNA聚合酶作用下根据所述鸟分枝杆菌靶标核酸(RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的鸟分枝杆菌检测探针，该鸟检测探针的核苷酸序列为5’-cgcucucaagacgcaugucuugagcg-3’(序列表中序列5)，和一条用于与在T7RNA聚合酶作用下根据所述胞内分枝杆靶标核酸(RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的胞内分枝杆菌检测探针，该胞内检测探针的核苷酸序列为5’-cgcucuuuaggcgcaugucuugagcg-3’(序列表中序列6)，且其5’端用FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光标记。
鸟-胞分枝杆菌检测探针为分子信标，是一类高特异性、高敏感性的分子探针，由两端分别共价标记有荧光染料和淬灭剂的单链核酸分子组成，呈发夹型或茎环结构，分子信标的环部分和靶标互补，两头由于互补而成为茎，分子信标探针与线性的TaqMan探针相比，因其发夹结构的打开需要一定的力，因而特异性要好于线性探针。
将以上确定的引物和探针(本发明组)和对比组引物和探针进行比较。对比组为在引物、探针设计过程中产生的诸多对引物和探针序列，如选自鸟-胞分枝杆菌的23S rRNA基因保守区域进行引物、探针序列筛选获得的：
T7引物序列：5’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGATCATGCCTGCATTCTCACT-3’，
nT7引物序列：5’-ATGTGTAGTCGCAGAGACAA-3’，
检测探针序列为5’-CGCUCAUCUUUACGGUGGAGCG-3’，5’端用FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光标记。
将上述两组各序列用专利200810111479.0中所述的反应体系进行扩增，比对5个梯度的灵敏度并选取较优者。
结果如图1(对比组的引物对和探针序列的荧光检测结果，横坐标为扩增循环数，纵坐标为荧光值)和图2(本发明组的引物对和探针序列的荧光检测结果，横坐标为扩增循环数，纵坐标为荧光信号)所示，从结果可以看出，比对组的灵敏度仅在100cfu/反应时得出检测结果，而本发明组的灵敏度至少提高了一个数量级，可达10cfu/反应或更低。从曲线形状可明显看出，本发明组优于比对组。
通过筛选、比对设计的引物对、探针序列，挑选出检测灵敏度高的最佳引物、探针序列作为本发明的相应序列。
为便于进行结果分析，本发明试剂盒还添加了鸟-胞分枝杆菌内标(其核苷酸序列如序列表中序列7所示)，并设计了内标检测探针，内标不能与鸟-胞分枝杆菌检测探针结合，但能与内标检测探针结合，所述内标检测探针的核苷酸序列为5’-cgcucgccugauuuggugagcg-3’(序列表中序列8)，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。
实施例2、制备专用于实时荧光核酸恒温扩增检测鸟-胞分枝杆菌的试剂盒
本发明的鸟-胞分枝杆菌(MAC)实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒主要包含：T7引物、nT7引物、鸟分枝杆菌检测探针、胞内分枝杆菌检测探针、M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶。
所述T7引物、nT7引物和检测探针存在于MAC扩增检测液中，所述MAC反转录酶和T7RNA聚合酶存在于SAT酶液中。
由于SAT扩增易受多种因素影响而使扩增失败，使试剂使用人员判断失误得出错误的结论，因此，在本发明的试剂中还可以设置对照物，以排除检测结果失真的情况。
本发明中可以设置的参照物包括：阳性对照、阴性对照和内标中的一个或多个对照物。
阳性对照为灭活的鸟-胞分枝杆菌的稀释物。通过检测阳性对照，可证明试剂盒检测方法及材料无误，保证检测的准确性，同时可以监测每次检测的重复性和稳定性及试剂盒批次间的差异。
内标可以是体外转录的RNA，不具有生物学活性。MAC内标作为MAC靶标核酸的竞争性内标，可以作为参照物，用于防止假阴性结果的发生，通过检测加入有内标的样本，可了解整个扩增反应体系是否受抑制，更好的提示假阴性。
阴性对照可排除假阳性，在正确使用试剂盒检测方法和材料情况下，可保证检测的特异性。
所述MAC内标中的体外转录的MAC内标RNA可用下述方法制备：
(1)用化学合成法合成一段除探针检测区域序列不同，其它序列基本同MAC靶标序列区域(MAC内标，其核苷酸序列如序列表中序列7所示)的核苷酸片段；
(2)将片段克隆到载体中，构建MAC内标质粒，命名为
(3)MAC内标质粒转化到大肠杆菌DH5α中，命名为IC菌株，贮存于-70℃；
(4)从IC菌株中提取质粒，将质粒转录成RNA，纯化去除DNA，定量、鉴定内标RNA。
具体的，所述试剂盒包含样本保存液、鸟-胞分枝杆菌(MAC)扩增检测液、SAT酶液、MAC阳性对照、MAC阴性对照、MAC内标，其中：
(1)样本保存液：含硫酸铵(NH4)2SO4和HEPES的水溶液；
(2)鸟-胞分枝杆菌(MAC)扩增检测液：含dNTPs、NTPs、T7引物、nT7引物、鸟分枝杆菌检测探针、胞内分枝杆菌检测探针和内标检测探针；
(3)SAT酶液：含M-MLV反转录酶、T7RNA聚合酶；
(4)MAC阳性对照；含灭活的鸟-胞分枝杆菌的稀释物；
(5)MAC阴性对照：不含有任何核酸的溶液；
(6)MAC内标：含鸟-胞分枝杆菌内标RNA(序列如序列表中序列7所示)的稀释物。
更具体的，所述试剂盒的各种试剂组成如下：
(1)样本保存液：含5-50mM(NH4)2SO4和25-250mM HEPES的水溶液；
(2)鸟-胞分枝杆菌(MAC)扩增检测液：dNTPs 0.1-10mM、NTPs 1-20mM、含MAC引物(T7引物、nT7引物)、MAC探针(鸟分枝杆菌检测探针、胞内分枝杆菌检测探针)、MAC内标探针，浓度为2.5-10pmol/反应的水溶液；
(3)SAT酶液：主要含M-MLV反转录酶400-4000U/反应、T7RNA聚合酶200-2000U/反应；
(4)MAC阳性对照；含灭活的鸟-胞分枝杆菌的稀释物；
(5)MAC阴性对照：不含有任何核酸的溶液；
(6)MAC内标：含鸟-胞分枝杆菌内标RNA的稀释物；
最具体的，所述试剂盒中一个反应单位的各种试剂组成如下：
(1)样本保存液：含5-50mM(NH4)2SO4和25-250mM HEPES的水溶液；
(2)鸟-胞分枝杆菌(MAC)扩增检测液：Tris 10-50mM，MgCl210-40mM，dNTPs0.1-10mM，NTPs 1-20mM，PVP401-10％，KCl 5-40mM，引物和探针浓度为2.5-10pmol/反应；将引物和检测探针溶解在TE溶液(10mM Tris和1mM EDTA的混合液)中，各引物和探针浓度在2.5-10pmol/反应均可，其中T7引物浓度优选为5pmol/反应，nT7引物浓度优选为7.5pmol/反应，鸟分枝杆菌检测探针浓度优选为5pmol/反应，胞内分枝杆菌检测探针浓度优选为5pmol/反应，内标检测探针浓度优选为5pmol/反应；
(3)SAT酶液：M-MLV反转录酶400-4000U/反应，T7RNA聚合酶200-2000U/反应，2-10mM HEPES pH7.5，10-100mM N-acetyl-L-cysteine(L-半胱氨酸)，0.04-0.4mM zincacetate(乙酸锌)，10-100mM trehalose(海藻糖)，40-200mM Tris·HCl pH8.0，40-200mMKCl，0.01-0.5mM EDTA，0.1-1％(v/v)Triton X-100和20-50％(v/v)glycerol(丙三醇)；
(4)MAC阳性对照：含105-108cfu/mL灭活的鸟-胞分枝杆菌的稀释物；
(5)MAC阴性对照：不含有任何核酸的溶液；
(6)MAC内标：含104-108拷贝/μL鸟-胞分枝杆菌内标RNA(序列如序列表中序列7所示)的稀释物。
实施例3、鸟-胞分枝杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒的特异性检测
用本发明的鸟-胞分枝杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒对与结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌分类近似、症状类似、易发生交叉反应的微生物进行特异性检测，1-9号样本分别为结核分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、偶发分枝杆菌、戈登分枝杆菌、耻垢分枝杆菌(所有菌株均由上海肺科医院提供)。
具体检测方法包括以下步骤：
1试剂准备
1.1使用前将所有试剂温度平衡到室温(18℃-26℃)，充分溶解混匀。试剂盒内各试剂在充分溶解后稍事离心。
1.2用无菌生理盐水将样本保存液稀释100倍，作为稀释液使用。
2样品准备
2.1内标：取2μl检测项目内标分别加入198μl稀释液中，混匀备用。
2.2阳性对照：取2μl检测项目阳性对照分别加入198μl稀释液中，混匀备用。
2.3阴性对照：取2μl阴性对照加入198μl稀释液中，混匀备用。
2.4扩增液准备：按照每个样本30μl扩增检测液和1μl内标计算，配制不同检测项目的扩增液，振荡混匀，3000-4000rpm离心10s备用。例如：样本数为n，则反应数即为n+2(待测样本数+阳性对照+阴性对照)，配制扩增液的方法即为：(n+2)×30μl扩增检测液+(n+2)×1μl内标混匀。
2.5将待测样本、阳性对照、阴性对照，放入超声处理器中进行超声处理15min，超声功率为300W，细菌经超声破碎裂解释放出核酸RNA。
2.6超声结束后，将2μl处理物(步骤2.5)加入含30μl扩增检测液(第一阶段反应物)的洁净微量反应管中。稀释后的内标、阳性对照、阴性对照仅可用于一次实验，不能长期重复使用。每次实验时均需用试剂盒里的内标、阳性对照和阴性对照进行稀释使用。
3仪器准备
开启恒温荧光检测仪器，按仪器操作手册设定反应程序，荧光通道设定为F1(FAM)和F2(HEX或者VIC)；42℃1min，40个循环；荧光信号收集每分钟进行一次，共检测40次；反应体系40μl。ABI7300/7500/7500fast需要在新建文档的Assay下拉菜单中选择Isothermal，Passive Reference选择none。
4扩增检测
4.1将微量反应管置干热恒温器上60℃保温10min，然后立即置于42℃保温5min，同时将SAT酶液也预热到42℃。
4.2保持微量反应管于42℃，向微量反应管中加入10μl已预热的SAT酶液(第二阶段酶反应物)，加酶后盖上管盖1200rpm振荡15秒钟混匀，由此开始在42℃下继续温育40分钟，用检测仪同步记录荧光信号的变化。
4.3将微量反应管快速转至合适的荧光检测仪器，立即启动反应程序。
5质量控制程序
5.1应用临界弱阳性对照进行实验室质控
为了防止出现漏检(假阴性)的情况，SAT检测实验室应定期应用临界弱阳性对照进行室内质量控制。
5.2临界弱阳性对照的制备方法
将阳性对照用稀释液作10000倍稀释，即为临界弱阳性对照。
5.3临界弱阳性对照的使用方法：样本处理和检测过程同阳性对照。
6质量控制：所设置阳性对照、临界弱阳性对照和阴性对照的dt值应满足以下条件，否则，实验视为无效需重新进行：
阳性对照F1通道：阳性对照dt≤临界弱阳性对照dt≤35，F2通道有或者无数值。
阴性对照F1通道：dt无数值或为40，同时F2通道：dt≤35。
注：dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数(与一般实时荧光PCR实验结果的ct值类似)。
7阳性判断值
7.1通过对检测下限菌体浓度大量实验和临床实验的数据统计分析，确定：鸟-胞分枝杆菌阳性样本F1通道95％置信区间的dt值范围为：dt≤35，99％置信区间为：dt＜40，F2通道有或无数值。
7.2通过对阴性样本大量数据统计分析，确定：鸟-胞分枝杆菌阴性样本F1通道无数值或为40，F2通道dt值范围为：dt≤35。
8检验结果的解释
8.1阈值设定：以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。
8.2结果判断：
(1)阳性结果判断：
F1通道dt≤35，且F2通道有或者无数值的样本为阳性；
F1通道35＜dt＜40，F2通道有或者无数值的样本建议重新检测，检测结果F1通道dt＜40的样本为阳性；
(2)阴性结果判断：
F1通道dt无数值或为40，且F2通道dt≤35的样本为阴性；
F1通道dt无数值或为40，且F2通道dt无数值或为40的样本，建议将样本稀释100倍后重新检测，检测结果F1通道dt无数值或为40，且F2通道dt≤35的样本为阴性。
结果如图3(横坐标为扩增循环数，纵坐标为荧光信号)、图4(横坐标为扩增循环数，纵坐标为荧光信号)所示，可以看出，除阳性对照外，1-9号、阴性对照的扩增曲线(F1荧光通道)皆为阴性，并且相应内标(F2荧光通道)都出现扩增信号，表明检测样本不受反应体系抑制，结果可靠，可明确与结核分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、偶发分枝杆菌、戈登分枝杆菌、耻垢分枝杆菌区分，说明本发明鸟-胞分枝杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒具有较高的特异性，可特异性的检测出鸟-胞分枝杆菌。
实施例4、临床样本的实时荧光核酸恒温扩增检测
用实施例2中的鸟-胞分枝杆菌实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒检测232例临床样本，同步比对PCR产物测序。
具体检测方法包括以下步骤：
1标本采集
经分离培养的分枝杆菌临床分离株。
2样本预处理
2.1液体培养菌：取20μl的待测菌液于1.5mL离心管中，加入1.2mL的稀释液，混匀后即为待测样本。
2.2固体培养菌：于1.5mL离心管中加入1.2mL的稀释液，用接种环挑取少量菌体(肉眼可见即可)于稀释液中，混匀后即为待测样本。
3.样本保存
3.1液体培养菌：取20μl菌液将其离心后得到的菌体置-20℃冰箱，可保存3个月，检测时加入1.2mL的稀释液即可用；
3.2固体培养菌：固体培养菌可置-80℃培养箱中，长期保存。
4运输：将固体培养菌和液体培养菌密封后用泡沫盒运送，内加冰袋，运送时间不超过7天。
5实时荧光核酸恒温扩增检测
核酸提取、实时荧光核酸恒温扩增及结果判断同实施例3。
根据图5(F1荧光通道，横坐标为扩增循环数，纵坐标为荧光信号)和图6(F2荧光通道，横坐标为扩增循环数，纵坐标为荧光信号)检测结果确定，样本2、4、6、7、8为阳性，样本1、3为阴性，与DNA测序结果一致，表明本发明的试剂盒可用于鸟-胞分枝杆菌的检测，且产品准确性高，上机扩增检测时间仅需40分钟，具有周期短、高灵敏度、高特异性、低污染和反应稳定的特点。
综上，本发明是由发明人经过长期而深入的研究，经过大量筛选和验证，选择了16S rRNA的特异性区域作为检测靶标，开发出高特异性、高灵敏度的专用引物对和探针。其DNA序列保守性较好，GC含量约为59％，能够有效的避免GC含量过高带来的检测假阳性问题，有效地提高了检测的准确性，对其它非结核分枝杆菌以及其它感染部位相同和症状相似的细菌有较好的区分度。本发明试剂盒能够检测临床样本分离株中的鸟-胞分枝杆菌(MAC)RNA，具有特异性高、灵敏度高(可达10cfu/反应)、污染低(扩增产物RNA在自然环境下易于降解)及快速检测(40分钟完成扩增检测)的特点，将在鸟-胞分枝杆菌(MAC)的临床诊断中发挥作用。

Claims (10)

1.一种鸟-胞分枝杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，以鸟-胞分枝杆菌16SrRNA的特异性区域作为检测靶标，包含有一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生鸟-胞分枝杆菌(MAC)靶标核酸(RNA)的DNA拷贝的检测引物T7和nT7，一条用于与在T7 RNA聚合酶作用下根据所述鸟分枝杆菌靶标核酸(RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的鸟分枝杆菌检测探针和一条用于与在T7 RNA聚合酶作用下根据所述胞内分枝杆靶标核酸(RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的胞内分枝杆菌检测探针。
2.根据权利要求1所述的鸟-胞分枝杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述鸟分枝杆菌16S rRNA的特异性区域的核苷酸序列如序列表中序列1所示；所述胞内分枝杆菌16S rRNA的特异性区域的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述鸟-胞分枝杆菌检测引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物的核苷酸序列如序列表中序列3所示，nT7引物的核苷酸序列如序列表中序列4所示；所述鸟分枝杆菌检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，所述胞内分枝杆菌检测探针的核苷酸序列如序列表中序列6所示，所述探针的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。
3.根据权利要求1或2所述的鸟-胞分枝杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶，所述M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶存在于SAT酶液中，所述T7引物、nT7引物和检测探针存在于扩增检测液中。
4.根据权利要求1或2或3所述的鸟-胞分枝杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含鸟-胞分枝杆菌内标和内标检测探针；所述内标为鸟-胞分枝杆菌靶标核苷酸序列的竞争性内标，其核苷酸序列如序列表中序列7所示，可与内标检测探针特异性结合；所述内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列8所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团，内标检测探针存在于扩增检测液中。
5.根据权利要求1-4任一所述的鸟-胞分枝杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含样本保存液、鸟-胞分枝杆菌(MAC)扩增检测液、SAT酶液、MAC阳性对照、MAC阴性对照、MAC内标，其中：
(1)样本保存液：含硫酸铵(NH4)2SO4和HEPES的水溶液；
(2)鸟-胞分枝杆菌(MAC)扩增检测液：含dNTPs、NTPs、T7引物、nT7引物、鸟分枝杆菌检测探针、胞内分枝杆菌检测探针和内标检测探针；
(3)SAT酶液：含M-MLV反转录酶、T7 RNA聚合酶；
(4)MAC阳性对照；含灭活的鸟-胞分枝杆菌的稀释物；
(5)MAC阴性对照：不含有任何核酸的溶液；
(6)MAC内标：含鸟-胞分枝杆菌内标RNA(序列如序列表中序列6所示)的稀释物。
6.根据权利要求5所述的鸟-胞分枝杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的各种试剂组成如下：
(1)样本保存液：含5-50mM(NH4)2SO4和25-250mM HEPES的水溶液；
(2)鸟-胞分枝杆菌(MAC)扩增检测液：dNTPs 0.1-10mM、NTPs 1-20mM、含MAC引物(T7引物、nT7引物)、MAC探针(鸟分枝杆菌检测探针、胞内分枝杆菌检测探针)、MAC内标探针，浓度为2.5-10pmol/反应的水溶液；
(3)SAT酶液：主要含M-MLV反转录酶400-4000U/反应、T7 RNA聚合酶200-2000U/反应；
(4)MAC阳性对照；含灭活的鸟-胞分枝杆菌的稀释物；
(5)MAC阴性对照：不含有任何核酸的溶液；
(6)MAC内标：含鸟-胞分枝杆菌内标RNA的稀释物。
7.根据权利要求6所述的鸟-胞分枝杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中一个反应单位的各种试剂组成如下：
(1)样本保存液：含5-50mM(NH4)2SO4和25-250mM HEPES的水溶液；
(2)鸟-胞分枝杆菌(MAC)扩增检测液：Tris 10-50mM，MgCl2 10-40mM，dNTPs0.1-10mM，NTPs 1-20mM，PVP401-10％，KCl 5-40mM，引物和探针浓度为2.5-10pmol/反应；将引物和检测探针溶解在TE溶液(10mM Tris和1mM EDTA的混合液)中，各引物和探针浓度在2.5-10pmol/反应均可，其中T7引物浓度优选为5pmol/反应，nT7引物浓度优选为7.5pmol/反应，鸟分枝杆菌检测探针浓度优选为5pmol/反应，胞内分枝杆菌检测探针浓度优选为5pmol/反应，内标检测探针浓度优选为5pmol/反应；
(3)SAT酶液：M-MLV反转录酶400-4000U/反应，T7 RNA聚合酶200-2000U/反应，2-10mMHEPES pH7.5，10-100mM N-acetyl-L-cysteine(L-半胱氨酸)，0.04-0.4mM zinc acetate(乙酸锌)，10-100mM trehalose(海藻糖)，40-200mM Tris·HCl pH8.0，40-200mM KCl，0.01-0.5mM EDTA，0.1-1％(v/v)Triton X-100和20-50％(v/v)glycerol(丙三醇)；
(4)MAC阳性对照：含105-108cfu/mL灭活的鸟-胞分枝杆菌的稀释物；
(5)MAC阴性对照：不含有任何核酸的溶液；
(6)MAC内标：含104-108拷贝/μL鸟-胞分枝杆菌内标RNA的稀释物。
8.鸟-胞分枝杆菌的实时荧光核酸恒温扩增(SAT)检测专用引物或探针，为权利要求1-7任一所述的鸟-胞分枝杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒中的专用试剂，包括以下表示的物质之一或组合：
A.用于在M-MLV反转录酶作用下产生鸟-胞分枝杆菌靶标核酸(RNA)的DNA拷贝的检测引物T7和nT7，T7引物的核苷酸序列如序列表中序列3所示，nT7引物的核苷酸序列如序列表中序列4所示；
B.一条用于与在T7 RNA聚合酶作用下根据所述鸟分枝杆菌靶标核酸(RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的鸟分枝杆菌检测探针，其核苷酸序列如序列表中序列5所示；
C.一条用于与在T7 RNA聚合酶作用下根据所述胞内分枝杆靶标核酸(RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的胞内分枝杆菌检测探针，其核苷酸序列如序列表中序列6所示，其5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团；
D.内标和内标检测探针，内标为鸟-胞分枝杆菌靶标核苷酸序列的竞争性内标，其核苷酸序列如序列表中序列7所示；
内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列8所示，其5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。
9.权利要求1-7任一所述的鸟-胞分枝杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒或权利要求8所述的专用引物或探针在制备检测鸟-胞分枝杆菌试剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：鸟-胞分枝杆菌(MAC)的实时荧光核酸恒温扩增检测，包括以下操作步骤：
1)提取鸟-胞分枝杆菌的核酸(RNA)；
2)将鸟-胞分枝杆菌的核酸(RNA)加入鸟-胞分枝杆菌扩增检测液(第一阶段反应物)中，在60℃下温育10分钟后，再在42℃下温育5分钟，然后加入SAT酶液(第二阶段酶反应物)，由此开始在42℃下继续温育40分钟，用检测仪同步记录荧光信号的变化；所述第一阶段反应物与第二阶段酶反应物的体积比为3：1；
3)根据荧光信号产生的时间和强度参照MAC阳性对照、MAC阴性对照和MAC内标检测结果对待测样品进行定性检测。
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