CN103627812B

CN103627812B - 奶牛乳房炎主要致病菌四重pcr快速检测试剂盒

Info

Publication number: CN103627812B
Application number: CN201310673972.2A
Authority: CN
Inventors: 何宝祥; 陈亚明; 杜向宏
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2013-12-11
Filing date: 2013-12-11
Publication date: 2015-08-19
Anticipated expiration: 2033-12-11
Also published as: CN103627812A

Abstract

本发明公开了一种奶牛乳房炎主要致病菌四重PCR快速检测试剂盒，包括由四对特异性引物构成的引物对组。应用本发明结合多重PCR技术可一次性同时扩增致病性无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌的特异性基因sip、nuc、rrnB和HblA，再通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，能对奶样中存在的主要病原菌进行全面、高效、准确的检测与鉴定。本发明克服了常规病原菌检测技术操作繁琐、费时耗力等缺点，增加病原菌检查的种类，提高了检测的特异性和灵敏度，具有比常规检测方法更特异、更敏感的特点，适合在基层兽医站和奶牛养殖场中进行快速检测，具有较好的应用前景。

Description

奶牛乳房炎主要致病菌四重PCR快速检测试剂盒

技术领域

本发明属于奶牛乳房炎病原细菌检测技术领域，尤其涉及一种奶牛乳房炎主要致病菌四重PCR快速检测试剂盒。

背景技术

快速检测与鉴定奶牛乳汁中的病原菌是及时有效地控制与预防病原菌传播的前提，这对奶牛和人类健康都具有重要意义。目前，病原细菌的检测方法主要依靠常规的细菌学培养方法，一般需4～7d，操作繁琐，费时耗力；有关病原细菌检测的乳胶凝集法、免疫磁珠分离法、酶免疫测定方法、核酸杂交技术和PCR技术，因其特异性强、敏感性高、操作简单、检测快速等优点而被广泛应用，但这些方法每次实验通常只能检测一种病原微生物。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种快速、灵敏、准确的奶牛乳房炎主要致病菌四重PCR快速检测试剂盒，适用于被无乳链球菌(S.agalactiae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)污染的奶样样品的分析。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：奶牛乳房炎主要致病菌四重PCR快速检测试剂盒，包括由四对特异性引物构成的引物对组；四对特异性引物分别是鉴定无乳链球菌sip基因的引物对sip-F和sip-B，鉴定金黄色葡萄球菌Nuc基因的引物对Nuc-F和Nuc-B，鉴定大肠杆菌rrnB基因的引物对rrnB-F和rrnB-B，鉴定蜡样芽孢杆菌HblA基因的引物对HblA-F和HblA-B；引物对sip-F和sip-B、引物对Nuc-F和Nuc-B、引物对rrnB-F和rrnB-B、引物对HblA-F和HblA-B的特异性引物分别具有序列表SEQ.ID.No.1和2、4和5、7和8、10和11的碱基序列。

上述奶牛乳房炎主要致病菌四重PCR快速检测试剂盒，包括以下试液：

A试液：含10×PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs和四对特异性引物；

B试液：含无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌的DNA,作为阳性对照；

C试液：去离子水，作为阴性对照。

A试液每管42μl，含10×PCR缓冲液5μl、2.5mM MgCl₂5μl、2.5mmol/L的dNTPs 4μl、四对特异性引物包括：无乳链球菌上游和下游引物各2μl、金黄色葡萄球菌上游和下游引物各2μl、大肠杆菌上游和下游引物各2μl、蜡样芽孢杆菌上游和下游引物各2μl，引物浓度均为10μmol/L，5U/μl Taq酶0.5μl，去离子水11.5μl。

奶牛乳房炎主要致病菌四重PCR快速检测试剂盒的引物对组，包括四对特异性引物，分别是鉴定无乳链球菌sip基因的引物对sip-F和sip-B，鉴定金黄色葡萄球菌Nuc基因的引物对Nuc-F和Nuc-B，鉴定大肠杆菌rrnB基因的引物对rrnB-F和rrnB-B，鉴定蜡样芽孢杆菌HblA基因的引物对HblA-F和HblA-B；引物对sip-F和sip-B、引物对Nuc-F和Nuc-B、引物对rrnB-F和rrnB-B、引物对HblA-F和HblA-B的特异性引物分别具有序列表SEQ.ID.No.1和2、4和5、7和8、10和11的碱基序列。

奶牛乳房炎病因比较复杂，影响因子较多，传统的检测方法无法对乳汁中难培养或不可培养的致病菌进行检测，而且特异性不高、灵敏度低、操作烦琐、耗时，实现有效的监测、预防非常困难。针对这些问题，发明人结合多重PCR扩增技术，研制了本发明的奶牛乳房炎主要致病菌四重PCR快速检测试剂盒，据此建立的多重PCR快速检测方法，可实现一次性、快速检测乳汁中的出多种奶牛乳房炎主要病原菌（包括无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌）的目的。

本发明所筛选的各病原菌基因均具有较强的特异性和灵敏性：无乳链球菌的sip基因（序列表SEQ.ID.No.3）序列具有高度保守性，比其他基因有更高的灵敏度；金黄色葡萄球菌nuc基因（序列表SEQ.ID.No.6）只存在于金黄色葡萄球菌中，在其它葡萄球菌和病原菌中均检测不出；大肠杆菌的rrnB基因（序列表SEQ.ID.No.9）序列也具有高度保守性，比其他基因有更高的敏感性；蜡样芽孢杆菌的hblA基因（序列表SEQ.ID.No.12）也是其基因组中较为保守的序列。依据这些特定基因序列，发明人设计了四对特异性引物，以此为基础的本发明的试剂盒，能对奶样中存在的主要病原菌进行全面、高效、准确的检测与鉴定；所有反应可在同一PCR管中进行，操作简单、快速，具很高的特异性和敏感度，为快速检测与鉴定乳房炎病原菌提供了有效的手段，还可以推广应用于乳样监测、乳制品质量检测等领域；并为其它乳样中不同致病菌检测组合提供技术模式，可以大大提高检测效率、缩短检测周期、降低检测成本，具有显著的经济与社会效益。

附图说明

图1是各菌种的单重PCR检测结果图，图中：M是Marker，1无乳链球菌，2金黄色葡萄球菌，3大肠杆菌，4蜡样芽孢杆菌，5阴性对照。

图2是退火温度优化的PCR电泳图，图中：M是Marker，53-57分别对应退火温度53℃、54℃、55℃、56℃、57℃。

图3是Taq酶优化的PCR电泳图，图中：M是Marker，1-4分别对应Taq酶0.5μl、0.7μl、0.9μl、1.1μl。

图4是多重PCR凝胶电泳结果图，图中：M是Marker，1-4分别对应无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌；5-10为2重PCR，分别对应5蜡样芽孢杆菌与大肠杆菌，6蜡样芽孢杆菌与无乳链球菌，7蜡样芽孢杆菌与金黄色葡萄球菌，8大肠杆菌与金黄色葡萄球菌，9大肠杆菌与无乳链球菌，10无乳链球菌与金黄色葡萄；11-14为3重PCR，分别对应11金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌；12无乳链球菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌；13无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌；14无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌；15为4重PCR，对应无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌。

具体实施方式

1.1 材料与方法

1.1.1 材料

1.1.1.1 菌株

无乳链球菌、金黄色葡萄球将、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌；沙门氏菌、白色念珠菌，肺炎克雷伯氏菌、沙雷氏菌、绿脓杆菌、枯草芽孢杆菌由本实验室保存。

1.1.1.2 主要仪器和试剂

手提式压力蒸汽灭菌器购于上海博讯实业有限公司，超净工作台购于苏州净化设备厂，电热恒温培养箱购于上海精宏实验设备有限公司，光学显微镜购于Motic，电子天平购于岛津，微量移液枪Eppendorf，-80℃超低温冰箱购于海尔集团，离心机购于长沙湘仪离心机仪器有限公司。

1.1.1.3 引物设计

根据GenBank收录的无乳链球菌的sip基因序列、金黄色葡萄球菌的nuc基因、大肠杆菌的rrnB基因和蜡样芽孢杆菌的hblA基因，利用Primer 510软件和Oligo 6.0设计各种乳房炎致病菌特异性PCR引物，引物序列具体如下：

无乳链球菌引物sip-F：5′-TATTCTTCTGCGCCAGCTTTG-3′（序列表SEQ.ID.No.1），

无乳链球菌引物sip-B：5′-GGGCTGCTACAGTTCTTACCG-3′（序列表SEQ.ID.No.2），

金黄色葡萄球菌引物nuc-F：5′-GAAAGGGCAATACGCAAAGAGG-3′（序列表SEQ.ID.No.4），

金黄色葡萄球菌引物nuc-B：5′-CTTTAGCCAAGCCTTGACGAAC-3′（序列表SEQ.ID.No.5），

大肠杆菌引物rrnB-F：5′-ACGGCAAAGTGTGGGTCAAT-3′（序列表SEQ.ID.No.7），

大肠杆菌引物rrnB-B：5′-AGCGTAAGGGTAATGCGAGG-3′（序列表SEQ.ID.No.8），

蜡样芽孢杆菌引物hblA-F：5′-GGACACGATGTTAGAGCATTTGG-3′（序列表SEQ.ID.No.10），

蜡样芽孢杆菌引物hblA-B：5′-GATACAGCGAGTAGTTTATTAGGGATT-3′（序列表SEQ.ID.No.11）。

1.1.2 方法

1.1.2.1 细菌DNA模板的制备

1.1.2.1.1 直接加入法

挑取培养基上的单个菌落置于加有10μl灭菌水的EP管内，反复吹吸后吸取2μl直接作为模板进行DNA反应。

1.1.2.1.2 试剂盒提取法

挑取培养基上的单个菌落37℃培养24h，生理盐水洗脱细菌，用细菌基因组DNA提取试剂盒（Easypure genomic DNA kit，50ⅹ，transgene）抽提细菌DNA，提取方法按说明书进行。

1.1.2.2 基因的扩增、克隆和测序

采用设计的特异性引物对抽提的细菌基因组DNA进行PCR扩增，PCR产物于2%的琼脂糖凝胶电泳后，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。PCR产物分别与载体过夜连接后转化.用小量质粒提取试剂盒（三博远志质粒提取试剂盒，50ⅹ，北京三博远志生物技术公司）提取转化生长的菌落质粒，阳性质粒经PCR和双酶切鉴定后送上海英俊生物技术有限公司测序。

1.1.2.3 4重PCR条件和反应体系的优化

对不同退火温度（53-57℃）和PCR反应液各成分在PCR仪上进行PCR扩增，摸索4重PCR的最佳反应条件和反应体系。

1.1.2.4 4重PCR方法的特异性和敏感性试验

用优化的4重PCR方法对无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌，沙门氏菌、白色念珠菌，肺炎克雷伯氏菌、沙雷氏菌、绿脓杆菌、枯草芽孢杆菌进行检测，评价4重PCR方法的特异性。

将500ng的细菌DNA进行10倍梯度稀释至500fg，用优化的4重PCR方法分别对其进行检测，评价4重PCR方法的敏感性。具体操作按以下操作进行：

<1>制备DNA样本：采用直接加入法

<2>4重PCR反应：取步骤<1>所得DNA样本作为模板进行PCR扩增，并同时分别以标准品DNA和去离子水为阳性对照样本和阴性对照样本进行PCR扩增；PCR反应的反应体系和扩增程序分别为：

反应体系：PCR混合液50μl，其中PCR反应体系中含10×PCR缓冲液5μl、2.5mM MgCl₂4μl、dNTPs 5μl，引物各2μl；

扩增程序：95℃5min；随后进行35个循环，每个循环包括：95℃5min；随后进行35个循环，每个循环包括94℃45s，55℃40s，72℃45s；最后72℃10min，于4℃停止反应。

PCR反应结束后，取5μlPCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，然后EB染色10min，漂洗，在紫外透射仪下观察结果。

1.1.2.5 4重PCR试剂盒的组装

A试液：PCR反应液（42μl），含10×PCR缓冲液5μl、2.5mM MgCl₂5μl、2.5mmol/LdNTPs4μl、四对特异性引物包括：无乳链球菌上游和下游引物各2μl、金黄色葡萄球菌上游和下游引物各2μl、大肠杆菌上游和下游引物各2μl、蜡样芽孢杆菌上游和下游引物各2μl（浓度均为10μmol/L），5U/μl Taq酶0.5μl，去离子水11.5μl。

B试液：含无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌的DNA，作为阳性对照：

C试液：去离子水，作为阴性对照：

PCR反应管

1.1.2.6 检测试剂盒保存期试验

将检测试剂盒共3批次保存-20℃冰箱中。分别于保存后1、3和6个月，用保存的试剂盒分别对10份奶样阳性样品检测，每批检测试剂盒的保存期都重复检测3次，观察检测结果，同时每批检测试剂盒的每个保存期都进行保存后的敏感性测定。

试剂盒的使用方法如下：

<1>样品的处理和模板的制备：在无菌条件下将样品接种在培养基上，37℃培养18小时后取培养基上的单个菌落置于加有10μl灭菌水的离心管内，反复吹吸后吸取2μl直接作为模板进行PCR反应：

<2>PCR反应：在加有试剂A液的反应管中，分别加入8μl预处理过的待检样品、8μl B液和8μl C液，混匀后在PCR仪中进行以下反应：95℃5min；随后进行35个循环，每个循环包括94℃45s，55℃40s，72℃45s；最后72℃10min，于4℃停止反应。

PCR反应结束后，经电泳、染色、漂洗，最后在紫外透射仪下观察结果。

2.结果

2.1 细菌DNA模板制备的比较

直接加入法和试剂盒提取法均能达到预期的扩增效果。在DNA模板制备过程中试剂盒提取法提取细菌DNA需要0.5-1h，而直接加入法无需DNA提取，直接进行PCR即可，缩短了检测时间。

2.2 目的基因的扩增、克隆和测序

采用设计的特异性引物对抽提的4种细菌基因组DNA进行PCR扩增，如图1所示，PCR产物电泳后出现与预期扩增长度相同的片段。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳和回收后，与载体过夜连接并转换。获得的阳性质粒经PCR和双酶切鉴定后送上海英骏生物技术有限公司测序，测序结果与参考序列完全一致，证实引物可特异性扩增出4种相应细菌的基因片段。

2.3 4重PCR条件和反应体系的优化

如图2所示，对PCR退火温度和PCR反应液各成分进行优化，获得了4重PCR最佳反应体系和反应条件。反应条件为：95℃预变性5min；随后进行35个95℃45s，55℃40s，72℃20s的循环；最后72℃延伸3min。

2.4 4重PCR方法的特异性和敏感性试验

用建立的4重PCR方法检测无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、沙门氏菌、白色念珠菌，肺炎克雷伯氏菌、沙雷氏菌、绿脓杆菌、枯草芽孢杆菌进行检测，只能扩增出无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌4种细菌的基因目的片段，没有扩增出其他细菌基因的任何片段，表明建立的方法特异性强。

用优化的4重PCR方法分别对500ng-500fg的细菌DNA进行检测，电泳结果表明方法最低检测极限是50pg的细菌DNA。

2.5 检测试剂盒保存期试验

配制好的5批检测试剂盒在-20℃条件下保存，每3个月取出对样品重复进行3次检测，结果5批检测试剂盒1、3、6、9和12个月后，其敏感性都没有发生变化，均能检测到50pg的4种细菌的DNA模板，对10份阳性样品的检测均为阳性，对10份阴性样品的检测均为阴性，这表明试剂盒在-20℃条件下保存12个月仍具有良好的稳定性和重复性。

本研究利用PCR可以在基因水平上直接进行检测的优点，以4种细菌的特异性基因为靶目标，针对基因特异性区域设计引物进行4种细菌的PCR鉴定。结果表明，本检测方法及试剂盒仅对无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌呈阳性，不能检出其他相关细菌，具有较高的特异性；同时，操作省时简便，敏感性很好，最低可检测出50pg的细菌DNA。

Claims

1.一种奶牛乳房炎主要致病菌四重PCR快速检测试剂盒，其特征在于包括由四对特异性引物构成的引物对组；四对特异性引物分别是鉴定无乳链球菌sip基因的引物对sip-F和sip-B，鉴定金黄色葡萄球菌Nuc基因的引物对Nuc-F和Nuc-B，鉴定大肠杆菌rrnB基因的引物对rrnB-F和rrnB-B，鉴定蜡样芽孢杆菌HblA基因的引物对HblA-F和HblA-B；所述引物对sip-F和sip-B、引物对Nuc-F和Nuc-B、引物对rrnB-F和rrnB-B、引物对HblA-F和HblA-B的特异性引物分别具有序列表SEQ.ID.No.1和2、4和5、7和8、10和11的碱基序列；

该试剂盒包括以下试液：

A试液：含10×PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs和四对特异性引物；

C试液：去离子水，作为阴性对照；

所述A试液每管42μl，含10×PCR缓冲液5μl、2.5mM MgCl₂5μl、2.5mmol/L的dNTPs 4μl、四对特异性引物包括：无乳链球菌上游和下游引物各2μl、金黄色葡萄球菌上游和下游引物各2μl、大肠杆菌上游和下游引物各2μl、蜡样芽孢杆菌上游和下游引物各2μl，引物浓度均为10μmol/L，5U/μl Taq酶0.5μl，去离子水11.5μl。

2.奶牛乳房炎主要致病菌四重PCR快速检测试剂盒的引物对组，其特征在于包括四对特异性引物，分别是鉴定无乳链球菌sip基因的引物对sip-F和sip-B，鉴定金黄色葡萄球菌Nuc基因的引物对Nuc-F和Nuc-B，鉴定大肠杆菌rrnB基因的引物对rrnB-F和rrnB-B，鉴定蜡样芽孢杆菌HblA基因的引物对HblA-F和HblA-B；所述引物对sip-F和sip-B、引物对Nuc-F和Nuc-B、引物对rrnB-F和rrnB-B、引物对HblA-F和HblA-B的特异性引物分别具有序列表SEQ.ID.No.1和2、4和5、7和8、10和11的碱基序列。