CN109706257B - 一种快速检测奶牛子宫内膜炎中病原菌的方法 - Google Patents
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种快速检测奶牛子宫内膜炎中病原菌的方法，包括下列步骤：1)采用试剂盒方法提取培养过夜的子宫分泌物中6种常见病原菌的DNA；2)在含有上述细菌DNA的反应体系中，加入一种可以同时检测6种细菌特异性序列的PCR引物系统进行扩增；3)配制2％琼脂糖凝胶进行凝胶电泳，电压：120V，时间：45min，随后进行电泳紫外成像。该方法基于多重聚合酶链式反应技术，可实现同时检测大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓隐秘杆菌、乳房链球菌、奇异变形杆菌和绿脓杆菌6种细菌，较测序、单重PCR等技术操作更简便、成本更低、且有较高的灵敏度和特异性，极大的缩短了临床细菌检测鉴定周期。
Description
技术领域
本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种快速检测奶牛子宫内膜炎中病原菌的方法。
背景技术
奶牛子宫内膜炎(endometritis)是奶牛由于病原微生物感染等因素引起子宫内膜发生炎症反应，从而造成子宫内膜层出现病理变化的一种疾病。此病大多数发生在奶牛分娩或产后期间，是奶牛最为常见的繁殖障碍性疾病，由子宫内膜炎引起的不孕症可占疾病性不孕的60.0％-70.0％。该病可导致患牛屡配不孕，甚至死亡，对奶牛生殖系统带来长期不可逆转的影响，由此带来的饲养成本增加、泌乳量下降甚至淘汰率升高等问题，给奶牛场带来严重的经济损失。因此实现快速灵敏的分析鉴定,是控制疾病的首要选择。
研究调查表明奶牛子宫内膜炎感染菌株中，细菌占有大部分的比例。在这些病原菌中，大肠埃希菌、化脓隐秘杆菌和链球菌占绝大多数，其次为葡萄球菌、奇异变形杆菌和铜绿假单胞菌。
目前临床上奶牛子宫内膜炎细菌感染状况，主要依靠实验室传统细菌分离方法，通常情况下，进行样品采集后，先将样品转种于血平板，进行细菌分离纯化，然后做鉴定和药敏试验，一般细菌的分离鉴定结果需要一周左右，不能满足临床细菌快速检测需求，不利于指导临床治疗。
综上所述，传统细菌分离鉴定方法耗时长，操作复杂，不能满足临床大规模细菌快速检测。目前很多检测技术应用于细菌检测，但是也存在着局限性。
例如荧光定量PCR利用荧光信号，对PCR进程进行实时检测。完成了从普通PCR的定性检测到定量检测的突破，不需要PCR后续处理，且具有更强的特异性。但荧光定量PCR所用仪器设备以及使用的探针价格较为高昂，不利于生产实践应用。高通量测序可一次性检测几十万到几百万条DNA序列，因此有人称其为下一代测序技术(next generationsequencing)。在奶牛的子宫、瘤胃和肠道等大量微生物种群存在的地方，高通量测序起到至关重要的作用。但在由于目前高通量测序成本高昂，且灵敏度较低。变性梯度凝胶电泳技术(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE)基于DNA在不同浓度变性剂中解链行为的差异，而使得泳迁移率产生显著变化，从而将碱基组成不同但片段大小相同的DNA片段分离。PCR-DGGE技术可同时分析大量样品、快速准确地鉴定微生物个体，具有分辨率高和样本需求量小等优点，但该技术也有一定的局限性：该技术只能检测到500bp以下的DNA片段，且很难检测出含量低于1％的微生物，电泳时易出现共迁移现象。
相比较上述技术，多重PCR技术具有特异、灵敏和快捷的特点，能同时进行多种病原微生物的鉴定，对于流行病的检测与预防，具有不可替代的作用。自1988年首次报道采用多重PCR技术诊断异基因脐带血干细胞移植治疗假肥大型肌营养不良症(DMD)以来，多重PCR方法已被广泛用于对多个目的基因的同时检测。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题与缺陷，本发明的目的在于提供一种快速检测奶牛子宫内膜炎中病原菌的方法，该方法不仅能够实现6种细菌的同时检测，使得奶牛子宫内膜炎的病原菌检测更为快捷、简便，而且操作简单，结果灵敏准确，成本低廉。
实现上述发明目的所采用的技术方案是：一种快速检测奶牛子宫内膜炎中病原菌的方法，具体包括下列步骤：
1)细菌基因组DNA的提取：采用试剂盒方法提取培养过夜的子宫分泌物中的大肠埃希菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、化脓隐秘杆菌(T.pyogenes)、乳房链球菌(S.uberis)、奇异变形杆菌(P.mirabilis)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的DNA；
2)多重PCR：使用特异性的PCR引物，在含有上述细菌DNA的反应体系中，加入6对不同的细菌引物进行扩增；
3)电泳紫外成像：配制2％琼脂糖凝胶进行凝胶电泳，电压：120V，时间：45min，随后进行电泳紫外成像。
根据大肠杆菌的ycjM基因、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因nuc、致病性化脓隐秘杆菌的溶血素plo基因、乳房链球菌的纤溶酶原激酶pauA基因、奇异变形杆菌的尿素酶合成的正向调节因子R基因(ureR)和绿脓杆菌的O抗原乙酰基转移酶基因设计引物。提供一种可以同时检测6种细菌特异性序列的PCR引物系统或引物组。所述PCR引物系统包含选自如下引物：
1)扩增大肠埃希菌(E.coli)特异性序列的引物SEQ ID No：1和SEQ ID No：2；
2)扩增金黄色葡萄球菌(S.aureus)特异性序列的引物SEQ ID No：3和SEQ ID No：4；
3)扩增化脓隐秘杆菌(T.pyogenes)特异性序列的引物SEQ ID No：5和SEQ ID No：6；
4)扩增乳房链球菌(S.uberis)特异性序列的引物SEQ ID No：7和SEQ ID No：8；
5)扩增奇异变形杆菌(P.mirabilis)特异性序列的引物SEQ ID No：9和SEQ IDNo：10；
6)扩增铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)特异性序列的引物SEQ ID No：11和SEQ IDNo：12。
本发明的一种快速检测奶牛子宫内膜炎中病原菌的方法与现有技术相比较，具有以下特点：
1)本发明能够实现6种细菌的同时检测，使得奶牛子宫内膜炎的病原菌检测更为快捷、简便。
2)相比传统的细菌分离鉴定方法，本发明操作简单，结果灵敏准确，成本低廉，可快速检测细菌菌种。
附图说明
图1为单重PCR特异性验证电泳图；
图2为多重PCR特异性验证电泳图；
图3为多重PCR模板浓度梯度图；
图4为多重PCR退火温度梯度图。
具体实施方式
实施例1一种快速检测奶牛子宫内膜炎中病原菌的方法，具体包括下列步骤：
1)细菌基因组DNA的提取：采用试剂盒方法提取培养过夜的子宫分泌物中的大肠埃希菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、化脓隐秘杆菌(T.pyogenes)、乳房链球菌(S.uberis)、奇异变形杆菌(P.mirabilis)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的DNA。
2)多重PCR：在含有上述细菌DNA的反应体系中，加入一种可以同时检测6种细菌特异性序列的PCR引物系统进行扩增。
根据大肠杆菌的ycjM基因、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因nuc、致病性化脓隐秘杆菌的溶血素plo基因、乳房链球菌的纤溶酶原激酶pauA基因、奇异变形杆菌的尿素酶合成的正向调节因子R基因(ureR)和绿脓杆菌的O抗原乙酰基转移酶基因设计引物。
设计的6对特异性引物序列如下：
将6种细菌引物按以下比例加入PCR管中，实验使用25μL 2倍预混酶(PremixTaq)，6μL细菌DNA模板，其余使用无菌超纯水补齐至50μL。具体数据如下表。每次实验应设置阳性对照和阴性对照，阴性对照中细菌模板使用无菌超纯水代替，以检测实验试剂是否污染；阳性对照中六种细菌模板(浓度50ng/μL)各加入1μL，以检测操作是否正确，试剂是否有效。
随后将加好的反应体系按以下程序进行，反应参数如下表。
3)电泳紫外成像：配制2％琼脂糖凝胶进行凝胶电泳，电压：120V，时间：45min，随后进行电泳紫外成像。
紫外凝胶电泳检测：取10μL PCR产物进行2％琼脂糖凝胶120V，40min电泳，1000LDDNALadder作参照，紫外凝胶成像系统观察结果。
图1为单重PCR特异性验证电泳图，图中M：marker；1：化脓隐秘杆菌；2：金黄色葡萄球菌；3：大肠杆菌；4：绿脓杆菌；5：奇异变形杆菌；6：乳房链球菌；7：蜡样芽胞杆菌；8：无乳链球菌；9：阴性对照。结果显示各引物特异性良好，目的条带明显，无非特异性杂带存在，其他菌株对引物无阳性反应。
图2为多重PCR特异性验证电泳图，图中M：marker；1：化脓隐秘杆菌；2：金黄色葡萄球菌；3：大肠杆菌；4：绿脓杆菌；5：奇异变形杆菌；6：乳房链球菌；7：6种目标菌混合；8：化脓隐秘杆菌；9：化脓隐秘杆菌和金黄色葡萄球菌；10：化脓隐秘杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌；11：化脓隐秘杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌；12：化脓隐秘杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和奇异变形杆菌；13：化脓隐秘杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、奇异变形杆菌和乳房链球菌；14：阴性对照。结果显示多重PCR结果良好，各引物之间无交叉反应，引物只与其目的菌株DNA产生反应，对其他引物无影响，目的条带明显，无非特异性杂带存在。
图3为多重PCR模板浓度梯度图，图中M：marker；1：1ng/μL；2：0.1ng/μL；3：10pg/μL；4：1pg/μL；5：0.1pg/μL；6：10fg/μL；7：1fg/μL；8：0.1fg/μL；9：阴性对照。结果表明模板敏感度可达10pg/μL，各条带亮度均一明显。
图4为多重PCR退火温度梯度图，图中M：marker；1：50℃；2：52℃；3：54℃；4：56℃；5：58℃；6：60℃；7：62℃；8：阴性对照。结果表明反应体系在退火温度≤54℃时其目的基因条带清晰，无明显杂带，因此将退火温度设置在54℃以保证其结果清晰，特异性良好。
序列表
<110> 西北农林科技大学
<120> 一种快速检测奶牛子宫内膜炎中病原菌的方法
<141> 2019-03-12
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
Gly Cys Cys Ala Ala Ala Gly Cys Cys Ala Gly Thr Ala Ala Ala Gly
1 5 10 15
Thr Ala Gly
<210> 2
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<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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Ala Ala Gly
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<212> PRT
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Thr
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<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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20
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<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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Cys
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Ala Thr Gly Cys Cys Ala Ala Gly Gly Cys Gly Thr Cys Cys Ala Ala
1 5 10 15
Gly
Claims (2)
1.PCR引物系统在制备检测奶牛子宫内膜炎致病菌试剂中的用途，其特征在于，所述PCR引物系统包括：
1)扩增大肠埃希菌(E.coli)特异性序列的引物SEQ ID No：1和SEQ ID No：2；
2)扩增金黄色葡萄球菌(S.aureus)特异性序列的引物SEQ ID No：3和SEQ ID No：4；
3)扩增化脓隐秘杆菌(T.pyogenes)特异性序列的引物SEQ ID No：5和SEQ ID No：6；
4)扩增乳房链球菌(S.uberis)特异性序列的引物SEQ ID No：7和SEQ ID No：8；
5)扩增奇异变形杆菌(P.mirabilis)特异性序列的引物SEQ ID No：9和SEQ ID No：10；
6)扩增铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)特异性序列的引物SEQ ID No：11和SEQ ID No：12；
检测奶牛子宫内膜炎致病菌的方法步骤为：
1)细菌基因组DNA的提取：采用试剂盒方法提取培养过夜的子宫分泌物中的大肠埃希菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、化脓隐秘杆菌(T.pyogenes)、乳房链球菌(S.uberis)、奇异变形杆菌(P.mirabilis)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的DNA；
2)多重PCR：在含有上述细菌DNA的反应体系中，加入上述的PCR引物系统进行扩增；
3)电泳紫外成像：配制2％琼脂糖凝胶进行凝胶电泳，电压：120V，时间：45min，随后进行电泳紫外成像。
2.根据权利要求1所述的PCR引物系统在制备检测奶牛子宫内膜炎致病菌试剂中的用途，其特征在于，所述PCR引物系统进行扩增的条件为： 94℃5min；94℃30s，54℃30s，72℃80s，30个循环；72℃10min。
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