CN105969765A - 金黄色葡萄球菌基因组dna快速提取试剂盒及提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明金黄色葡萄球菌基因组DNA快速提取试剂盒及提取方法，属于临床检验诊断学领域。所述试剂盒包括：溶液1、20 mg/ml溶菌酶溶液、溶液2、溶液3、异丙醇、70%乙醇、灭菌双蒸水；所述基因组DNA提取方法包括：使用溶菌酶裂解细菌，溶液2进一步裂解细菌释放基因组DNA并灭活细菌自身核酸酶活性，防止降解细菌DNA的，采用异丙醇特异性沉淀基因组DNA以去除细菌多糖成份，最终使用适量灭菌蒸馏水重新溶解基因组DNA。本发明建立了一套简便、快速、廉价的金黄色葡萄球菌基因组DNA提取方法，其提取产物可以用于PCR检测。

Description

金黄色葡萄球菌基因组DNA快速提取试剂盒及提取方法
技术领域
本发明属于临床检验诊断学领域，涉及一种金黄色葡萄球菌基因组DNA快速提取方法及提取试剂盒。
背景技术
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, Sa）是临床重要的致病菌之一，能够产生较多的毒力因子，引起感染者食物中毒、假膜性肠炎、烫伤样皮肤综合症、毒素休克综合症、化脓性炎症和败血症等，给人类健康造成极大的损害。现有的金黄色葡萄球菌分离鉴定方法需3～5天时间，且方法繁琐耗时耗力，已不能满足临床诊断的需要。分子生物学技术（如PCR法）因其具有高灵敏度、高特异性以及操作简便迅速等特点，被认为是最具发展前景的金黄色葡萄球菌鉴定和耐药性检测方法，而细菌基因组DNA质量直接影响PCR法检测结果的灵敏度和可信度。因此，高效而快捷的基因组DNA提取方法有助于提高PCR法检测金黄色葡萄球菌的灵敏度和特异度。
金黄色葡萄球菌是革兰阳性球菌，具有坚固的细胞壁，常规方法难以，革兰阴性杆菌常用的煮沸法难以有效破坏金黄色葡萄球菌坚固的细胞壁，使得基因组DNA提取效率极低，无法用于PCR法检测。虽然目前已有多种金黄色葡萄球菌基因组DNA提取方法，包括、SDS裂解法、溶菌酶裂解法和CTAB法等，但上述方法都存在耗时长、提取效率低等缺点。目前临床检验科多采用革兰阳性球菌基因组DNA抽提试剂盒，其成本较高，增加了病人的经济负担，阻碍了分子生物学技术在金黄色葡萄球菌中的推广使用。因此有必要建立一种廉价快捷的金黄色葡萄球菌基因组DNA提取方法，提高金黄色葡萄球菌基因组DNA提取效率、缩短操作时间，满足临床检验科开展后续分子生物学检测的要求。
发明内容
本发明提供了一种快速简便的金黄色葡萄球菌基因组DNA提取方法，提取产物可以直接做为PCR法扩增模板。
本发明采用常规溶菌酶裂解金黄色葡萄球菌的同时，进一步使用含有氢氧化钠和十二烷基硫酸钠成份的裂解液裂解金黄色葡萄球菌，并灭活细菌自身核酸酶，防止细菌基因组DNA的降解，最后通过异丙醇沉淀细菌DNA，建立一种适合于在临床推广使用的金黄色葡萄球菌基因组DNA快速廉价提取方法。
一种金黄色葡萄球菌基因组DNA快速提取试剂盒，包括下述试剂：
溶液1：分别含有25mol/L三（羟甲基）氨基甲烷，10mmol/L乙二胺四乙酸二钠，50mmol/L葡萄糖；配置完毕后使用5 mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH=8.0，置于4℃中保存备用。
溶液2：分别含有0.2 mol/L 氢氧化钠和10%（w/v）十二烷基硫酸钠。溶液2于使用前现配现用。
溶液3：醋酸钾150 mg，冰醋酸11.5 mL，加超纯水至100 mL，室温下保存备用。
溶液4：20 mg/mL溶菌酶溶液：称取100 mg溶菌酶，充分溶解于5 mL灭菌蒸馏水中。分装为200 μL/管，置于-20℃中保存备用。
本试剂盒中，溶液1为100 mL，溶液3为200 mL，溶液4为5 mL。
利用上述试剂盒提取细菌基因组DNA步骤如下：
（1）水解酪蛋白培养基（Mueller-Hinton，MH）配制：称取牛肉膏300 g，可溶性淀粉1.5g，酪蛋白水解物17.5 g，加入蒸馏水定容至1 L，充分溶解后调节pH值至7.3±0.2。于110℃高压灭菌10 min再冷却至室温备用。
（2） 5 ml离心管中加入1 mL灭菌MH培养基基，接种金黄色葡萄球菌，37℃振摇培养24 h后吸取新鲜饱和菌液200 μL，12 000 rpm离心2 min获得菌体沉淀，在菌体沉淀中加入180 μL溶液1并充分重悬，再加入20 μL溶菌酶溶液（20 mg/mL），37℃孵育0.5 h后备用。
（3）加入新鲜配制的300 μl溶液2，室温中反复上下颠倒10次并静置10 min，再加入300 μL溶液3，上下颠倒5次充分混匀后冰上放置5 min.
（4）上述溶液于12 000 rpm离心5 min，取上清600 μL，加入异丙醇400 μL，室温中上下颠倒5次后静置沉淀基因组DNA，10 min后以12 000 rpm离心5 min，弃去上清。
（5）沉淀中加入1mL 70%乙醇，上下颠倒2次后于12 000rpm离心2 min并弃去上清，该操作重复1次。完全弃去70%乙醇，打开离心管盖，室温下放置10 min以除去残留乙醇。
（6）向离心管底白色沉淀中加50 μL灭菌蒸馏水重新溶解金黄色葡萄球菌基因组DNA，并保存于-20℃中用于后续PCR实验。
（7）提取产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析结果，各孔上样量为3 μL，在0.5×TAE电泳缓冲液中，90V恒压电泳60 min。电泳完毕后以0.5 mg/L溴化乙锭染色10 min，通过凝胶成像分析系统检测基因组DNA质量。
有益效果
金黄色葡萄球菌是临床重要致病菌之一，目前临床该菌的鉴定和耐药性检测已越来越多地开始使用PCR法等分子生物学技术。建立一种适合于临床使用的金黄色葡萄球菌基因组DNA提取方法将会极大地推动各种新型分子生物学技术在金黄色葡萄球菌鉴定和耐药性检测中的应用。
附图说明
图1 4种金黄色葡萄球菌基因组DNA提取方法所获产物琼脂糖凝胶电泳结果图。泳道M为DNA标准分子量标记；泳道1：溶菌酶法，泳道2：CTAB法，泳道3：碱裂解法，泳道4：试剂盒法。
图2 多重PCR实验扩增结果图。泳道M为DNA标准分子量标记；泳道1：溶菌酶法，泳道2：CTAB法，泳道3：碱裂解法，泳道4：试剂盒法，泳道5：阴性对照。
具体实施方式
实施例1：4种方法金黄色葡萄球菌基因组DNA提取
选取耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（来源于江苏大学附属医院），菌株的种类和耐药性均采用法国生物梅里埃公司VITEK 2-Compact全自动细菌鉴定及药敏仪鉴定。
所有用于实验的耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌接种于血琼脂平板，35℃培养16 h形成单个菌落后挑取单个菌落接种于固体MH培养基平板，MH培养基平板组成如下：琼脂粉17 g，牛肉膏300 g，可溶性淀粉1.5 g，酪蛋白水解物17.5 g。细菌接种后于37℃振摇培养24 h，吸取新鲜饱和菌液200 μl，12 000 rpm离心2 min获得菌体沉淀用于细菌基因组DNA提取。
1. 碱裂解法提取金黄色葡萄球菌基因组DNA操作步骤：
（1）在菌体沉淀中加入180 μL溶液1并充分重悬，再加入20 μL溶菌酶溶液（20 mg/mL），37℃孵育0.5 h后备用。
（2）加入现配300 μL溶液2，室温下反复上下颠倒10次并静置10 min，再加入300 μL溶液3，上下颠倒5次充分混匀后冰上放置5 min.
（3）上述溶液于12 000 rpm离心5 min，取上清600 μL，加入异丙醇400 μL，室温下上下颠倒5次后静置沉淀基因组DNA，10 min后以12 000 rpm离心5 min，弃去上清。
（4）沉淀中加入1 mL 70%乙醇，上下颠倒2次后于12 000rpm离心2 min并弃去上清，该操作重复1次。完全弃去乙醇，打开离心管盖，在室温下静置10 min除去残留乙醇。
（5）向离心管底白色沉淀中加50 μL灭菌蒸馏水重新溶解金黄色葡萄球菌基因组DNA，并保存于-20℃中用于后续PCR试验。
（6）提取产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析结果，各孔上样量为3 μL，在0.5×TAE电泳缓冲液中，90V恒压电泳60 min。电泳完毕后以0.5 mg/L溴化乙锭染色10 min，通过凝胶成像分析系统观察电泳检验结果。本实施例结果可见，在琼脂糖凝胶加样孔附近出现明亮条带，且条带下方无弥散性条带（见图1）。
2. 溶菌酶法提取金黄色葡萄球菌基因组DNA操作步骤
（1）在菌体沉淀中加入180 μL TE缓冲液并充分重悬，再加入20 μL溶菌酶溶液（20 mg/mL），37℃孵育2 h后备用。
（2）上述溶液于12 000 rpm离心5 min，取上清200 μL，加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）上下颠倒5次后以12 000 rpm离心5 min。
（3）小心吸取200 μL上清加入另一个干净的EP管中，加入等体积冰预冷无水乙醇200 μL，室温下上下颠倒5次后静置10 min以沉淀基因组DNA，以12 000 rpm离心5 min，弃去上清。
（4）沉淀中加入1 mL 70%乙醇，上下颠倒2次后于12 000rpm离心2 min并弃去上清，该操作重复1次。完全弃去乙醇，打开离心管盖，在室温下静置10 min除去残留乙醇。
（5）向离心管底白色沉淀中加50 μL灭菌蒸馏水重新溶解金黄色葡萄球菌基因组DNA，并保存于-20℃中用于后续PCR试验。
（6）提取产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析结果，各孔上样量为3 μL，在0.5×TAE电泳缓冲液中，90V恒压电泳60 min。电泳完毕后以0.5 mg/L溴化乙锭染色10 min，通过凝胶成像分析系统观察电泳检验结果。本实施例结果可见，在琼脂糖凝胶加样孔附近未见DNA条带，表明基因组DNA已被降解（见图1）。
3. 十六烷基三甲基溴化铵（Cetyltrimethylammonium Ammonium Bromide,CATB）法提取金黄色葡萄球菌基因组DNA操作步骤
（1）在菌体沉淀中加入75 μL灭菌蒸馏水、5 μL 10% SDS、40 μL 5 mol/L NaCl溶液、40μL CTAB缓冲液，充分混匀后于65℃中温育20 min。
（2）加入160 μL的酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）后剧烈振荡混匀，以10 000 rpm离心5 min，将上清液移至新管中。
（3）在上清中加入100μL倍体积异丙醇混匀后静置10 min，以10 000 rpm离心 5min，弃上清液。
（4）沉淀中加入1 mL 70%乙醇洗涤，以12 000 rpm离心2 min，弃上清液。
（5）沉淀中加50 μL灭菌蒸馏水新溶解金黄色葡萄球菌基因组DNA，并保存于-20℃中用于后续PCR试验。
（6）提取产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析结果，各孔上样量为3 μL，在0.5×TAE电泳缓冲液中，90V恒压电泳60 min。电泳完毕后以0.5 mg/L溴化乙锭染色10 min，通过凝胶成像分析系统观察电泳检验结果。本实施例结果可见，在琼脂糖凝胶加样孔附近出现明亮条带，但条带明亮度不及碱裂解法所提取基因组DNA，同时CTAB法使用成本高于碱裂解法（见图1）。
4. 细菌基因组DNA提取试剂提取金黄色葡萄球菌基因组DNA操作步骤（细菌基因组DNA试剂盒，北京天根，批号：DP160512）
（1）在菌体沉淀中加入180 μL缓冲液GA并充分重悬，再加入20 μL溶菌酶溶液（20 mg/mL），37℃孵育0.5 h。
（2）向EP管中加入20 μL蛋白酶K（20 mg/mL）。
（3）加入220 μL缓冲液GB，振荡15 s，于70℃放置10 min消化。
（4）将上述所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，12 000 rpm离心1 min，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
（5）向吸附柱CB3中加入500 μL缓冲液GD，12 000 rpm离心1 min，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
（6）向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液PW，12 000 rpm离心1 min，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。重复上述操作1次。
（7）将吸附柱CB放回收集管中，12 000 rpm离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
（8）将吸附柱CB3转入一个干净的EP管中，向吸附膜的中间部位滴加50 μL洗脱缓冲液TE，室温放置5 min，12 000 rpm离心2 min，将溶液收集到EP管中。
（9）提取产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析结果，各孔上样量为3 μL，在0.5×TAE电泳缓冲液中，90V恒压电泳60 min。电泳完毕后以0.5 mg/L溴化乙锭染色10 min，通过凝胶成像分析系统观察电泳检验结果。本实施例结果可见，在琼脂糖凝胶加样孔附近出现明亮条带，且条带是4种方法中最明亮的，条带下方无弥散性条带，但使用成本最高（见图1）。
实施例2：4种方法提取DNA用于金黄色葡萄球菌spa基因PCR扩增效果比较
选取金黄色葡萄球菌种类鉴定基因spa，使用PCR法从所提取的基因组DNA中扩增细菌spa基因和mecA基因。
合成金黄色葡萄球菌spa基因PCR检测引物，其中针对金黄色葡萄球菌spa基因引物序列为：
spa-MF: 5'-TAAAGACGATCCTTCGGTGAGC-3'
spa-MR: 5'-CAGCAGTAGTGCCGTTTGCTT-3'
PCR产物预测长度为170 bp。
检测金黄色葡萄球菌spa基因PCR实验的步骤包括：12.5 μl的2×PCR Mix预混液、spa基因引物上下游各0.5 μl（10 μM）、基因组DNA 0.5 μl、灭菌双蒸水补充体系至25 μl。
进行PCR反应扩增，反应条件为在94℃下预变性10 s后，进行以下扩增循环：在95℃下变性5 s，在55℃下延伸20 s，72℃下延伸30 s，反应进行30个循环。
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析结果，各孔上样量为5 μL，在0.5×TAE电泳缓冲液中，90V恒压电泳40 min。电泳完毕后以0.5 mg/L溴化乙锭染色10 min，通过凝胶成像分析系统观察电泳检验结果。本实施例结果可见，溶酶菌法提取基因组DNA未见扩增产物；CATB法、碱裂解法和试剂盒法提取的金黄色葡萄球菌基因组DNA均扩增出spa基因产物，其中以CATB法提取DNA扩增产物量最低，碱裂解法和试剂盒法提取DNA扩增产物量差异不大，表明碱裂解法提取的金黄色葡萄球菌基因组DNA质量接近于试剂盒法，可以用于PCR扩增，且成本远低于CTAB法和试剂盒法（见图2）。

Claims (3)

1.一种金黄色葡萄球菌基因组DNA快速提取试剂盒，其特征在于包括下述试剂：
溶液1：分别含有25 mol/L三（羟甲基）氨基甲烷，10 mmol/L乙二胺四乙酸二钠，50mmol/L葡萄糖；配置完毕后使用5 mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH=8.0，置于4℃中保存备用；
溶液2：分别含有0.2 mol/L 氢氧化钠和10%（w/v）十二烷基硫酸钠；溶液2于使用前现配现用；
溶液3：醋酸钾150 mg，冰醋酸11.5 ml，加超纯水至100 ml，室温下保存备用；
溶液4：20 mg/ml溶菌酶溶液：称取100 mg溶菌酶，充分溶解于5 ml灭菌蒸馏水中；分装为200 μl/管，置于-20℃中保存备用；
本试剂盒中，溶液1为100 mL，溶液3为200 mL，溶液4为5 mL。
2.利用权利要求1所述的金黄色葡萄球菌基因组DNA快速提取试剂盒提取细菌基因组DNA的方法，其特征在于步骤如下：
（1） 5 ml离心管中加入1 ml无菌水解酪蛋白培养基，接种金黄色葡萄球菌，37℃振摇培养24 h后吸取新鲜饱和菌液200 μl，12 000 rpm离心2 min获得菌体沉淀，在菌体沉淀中加入180 μl溶液1并充分重悬，再加入20 μl溶菌酶溶液（20 mg/ml），37℃孵育0.5 h后备用；
（2）加入新鲜配制的300 μl溶液2，室温中反复上下颠倒10次并静置10 min，再加入300 μl溶液3，上下颠倒5次充分混匀后冰上放置5 min；
（3）上述溶液于12 000 rpm离心5 min，取上清600 μl，加入异丙醇400 μl，室温中上下颠倒5次后静置沉淀基因组DNA，10 min后以12 000 rpm离心5 min，弃去上清；
（4）沉淀中加入1ml 70%乙醇，上下颠倒2次后于12 000rpm离心2 min并弃去上清，该操作重复1次；
完全弃去70%乙醇，打开离心管盖，室温下放置10 min以除去残留乙醇；
（5）向离心管底白色沉淀中加50 μl灭菌蒸馏水重新溶解金黄色葡萄球菌基因组DNA，并保存于-20℃中用于后续PCR实验；（6）提取产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析结果，各孔上样量为3 μL，在0.5×TAE电泳缓冲液中，90V恒压电泳60 min；
电泳完毕后以0.5 mg/L溴化乙锭染色10 min，通过凝胶成像分析系统检测基因组DNA质量。
3.根据权利要求2所述的金黄色葡萄球菌基因组DNA快速提取试剂盒提取细菌基因组DNA的方法，其中所述的无菌水解酪蛋白培养基（Mueller-Hinton，MH）的组成如下：称取牛肉膏300 g，可溶性淀粉1.5 g，酪蛋白水解物17.5 g，加入蒸馏水定容至1 L，充分溶解后调节pH值至7.3±0.2；于110℃高压灭菌10 min再冷却至室温备用。
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