CN107475411A - 一种检测伯氏疏螺旋体核酸的Taqman实时荧光PCR检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测伯氏疏螺旋体核酸的Taqman实时荧光PCR检测方法，属于生物检测技术领域，本发明应用一对伯氏疏螺旋体特异性引物(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)和一条荧光标记探针(SEQ ID NO.3)进行实时荧光PCR扩增，检测扩增产物荧光信号，来判断样品中是否携带伯氏疏螺旋体病原。检测方法简单、快速、灵敏、准确、特异，与模板互补配对的荧光探针提高了特异性，有效地避免假阳性和假阴性，检测时荧光信号自动收集，避免普通PCR反应后电泳分析中人为因素干扰，检测过程完全闭管，不需电泳等后处理，消除了PCR产物的污染。本发明检测方法具有特异性高、稳定性好的特点。

Description

一种检测伯氏疏螺旋体核酸的Taqman实时荧光PCR检测方法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种检测伯氏疏螺旋体核酸的Taqman实时荧光PCR检测方法。

背景技术

伯氏疏螺旋体属于原核生物界(Kingdom Monera)、螺旋体目(Spirochaetidae)、螺旋体科(Spirochaetaceae)、疏螺旋体属(Borrelia)(也称包柔式螺旋体属)。革兰氏染色阴性，但不易着色，吉姆萨染、荧光染料染色着色良好，显微镜下可看到细长的螺旋体。伯氏疏螺旋体具有多个鞭毛，有大而疏的螺旋3-10个，长10-30μm，宽0.2-0.25μm，由表层、外膜、鞭毛、原生质四部分组成。在液体培养基中数个螺旋体可不规则地缠绕在一起，呈扭曲状态运动。经蜱传播，可感染禽类等动物，可引起禽螺旋体病(Avian Spirochaetosis,AS)。对养殖业及畜禽产品安全存在威胁，然而现在的伯氏疏螺旋体检测时间长，因此亟需一种快速检测伯氏疏螺旋体的方法，用于进出口检疫。

发明内容

鉴于此，本发明的目的是建立一种快速检测伯氏疏螺旋体的方法，可用于食品安全或肉制品的进出口快速检测。

为了实现上述目的本发明采用的技术方案如下：一种检测伯氏疏螺旋体核酸的Taqman实时荧光PCR检测用引物，包括一对特异性引物和一条荧光标记探针，其中上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2，探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。

上述荧光标记探针的5'端含有FAM报告荧光染料，3'端含有不发荧光的淬灭基团。

本发明还提供了一种检测伯氏疏螺旋体核酸的Taqman实时荧光PCR非疾病诊断目的的检测方法，包括以下步骤：

1)用细菌核酸提取试剂盒提取待检样品的核酸，获得核酸模板溶液；

2)实时荧光PCR扩增及荧光信号检测；

扩增体系：每25μL扩增体系中包含2×PremixExTaq^TM缓冲液12.5μL，10μmol/L的上游引物和10μmol/L的下游引物各1μL，10μmol/L的探针2μL，核酸模板溶液1μL，超纯水补体积至25μL；

扩增参数：95℃5min；95℃15s，60℃30s；45个循环，每个循环在60℃阶段采集FAM通道数据；

3)根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。

与现有的传统螺旋体检测方法相比，本发明主要优点在于：

1、特异性高：一对引物对伯氏疏螺旋体的基因组特异性区域识别，与模板互补配对的荧光探针更是提高了方法的特异性，传统方法则需要分离鉴定、通过形态特征和生化试验，进行检测。

2、检测周期短：从采集样本完成起，4个小时即可完成Taqman实时荧光PCR检测和结果的报告，而传统方法完成分离鉴定至少7天以上，且伯氏疏螺旋体需要严格的厌氧培养条件，实现体外分离培养比较困难。

3、稳定性高：同一样品经不同的人完成检测，结果的一致性强，尤其适用于大规模、高通量样品的检测分析，一次可以处理几十个样本。

附图说明

图1为伯氏疏螺旋体实时荧光PCR检测结果示意图；

图2为伯氏疏螺旋体实时荧光PCR检测特异性试验结果示意图。

具体实施方式

下面结合实例对本发明做进一步说明，以下实施例不当作对本发明的限制。

根据伯氏疏螺旋体的基因组中编码鞭毛蛋白的fla基因，第411位至第484位全长74个核苷酸的片段为扩增的特异性靶序列，用Beacon Designer8.0设计了上游引物SEQ IDNO.1、下游引物SEQ ID NO.2和探针SEQ ID NO.3，探针5'端含有FAM报告荧光染料，3'端含有不发荧光的淬灭基团，设计的引物和探针由生工生物工程(上海)公司合成。序列如下：

SEQ ID NO.1：5′-GCTCAAATAAAAGATGCTACA-3′；

SEQ ID NO.2：5′-GCAGATTGTGTTAAAATACTATTAG-3′；

SEQ ID NO.3：5′-FAM-TGCTGCTACAACCTCATCTGTCA-TAMRA-3′。

实施例1 病禽中伯氏疏螺旋体的Taqman实时荧光PCR检测

采集病禽翼静脉的全血，经1000r/min离心10min后，取血清及血细胞交界处淡白色悬液200～500μL置入1.5mL离心管中。对离心管中收集物经12000r/min离心10min后弃上清，收集沉淀用于提取核酸；同时设立伯氏疏螺旋体标准菌株培养物作为阳性对照；SPF鸡血为阴性对照。还可以选择采集禽类小肠、脾、肝、肾、心、肺等组织脏器，用作检测样本。

核酸提取：使用DNA提取试剂盒(购自Qiagen公司)提取DNA，具体操作见试剂盒说明书。

实时荧光PCR扩增及荧光信号检测；

扩增体系：每25μL扩增体系中包含2×PremixExTaq^TM缓冲液12.5μL，10μmol/L上游引物和10μmol/L下游引物各1μL，10μmol/L的探针2μL，核酸模板溶液1μL，超纯水补体积至25μL；

扩增参数：95℃5min；95℃15s，60℃30s；45个循环，每个循环在60℃阶段采集FAM通道数据。

阳性对照：即以伯氏疏螺旋体参考菌株核酸为模板进行的扩增，出现典型的扩增曲线。

阴性对照：35个循环均无典型无典型扩增曲线，如图1所示。

待检样品出现和阳性对照相似的典型扩增曲线，检测结果为阳性，如图1所示。

实施例2 伯氏疏螺旋体的Taqman实时荧光PCR检测方法的特异性试验

取三种感染禽后症状相似的三种病原：衣原体、支原体和泰勒虫，及20株已知细菌做为特异性实验的供试菌株。

表1特异性实验供试菌株

核酸的提取，取以供试病原的纯培养分别提取核酸作为Taqman实时荧光PCR检测的模板，获得核酸溶液备用。

实时荧光PCR体系的配置和扩增参数：

扩增体系：每25μL扩增体系中包含2×PremixExTaq^TM缓冲液12.5μL，10μmol/L上游引物和下游引物各1μL，10μmol/L的探针2μL，核酸模板溶液1μL，超纯水补体积至25μL；

扩增参数：扩增参数：95℃5min；95℃15s，60℃30s；45个循环，每个循环在60℃阶段采集FAM通道数据。

对照23株已知病原的检测结果，在35个循环均未出现典型扩增曲线，说明该方法对检测伯氏疏螺旋体是特异的，结果见图2。

废弃物处理：

依照当地或国家的传染性与潜在传染性废弃物处理规范来处理使用或未经使用过的试剂以及污染的废弃物。

<110> 重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120> 一种检测伯氏疏螺旋体核酸的Taqman实时荧光PCR检测方法

<160> 3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO.1

gctcaaataa aagatgctac a 21

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO.2

gcagattgtg ttaaaatact attag 25

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO.3

FAM-tgctgctaca acctcatctg tca-TAMRA 23

Claims (3)

1.一种检测伯氏疏螺旋体核酸的Taqman实时荧光PCR检测用引物，其特征在于：包括一对特异性引物和一条荧光标记探针，其中上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2，探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。

2.根据权利要求1所述一种检测伯氏疏螺旋体核酸的Taqman实时荧光PCR检测用引物，其特征在于：所述荧光标记探针的5'端含有FAM报告荧光染料，3'端含有不发荧光的淬灭基团。

3.利用权利要求1或2所述引物检测伯氏疏螺旋体核酸的Taqman实时荧光PCR非疾病诊断目的的检测方法，包括以下步骤：

1)用细菌核酸提取试剂盒提取待检样品的核酸，获得核酸模板溶液；

2)实时荧光PCR扩增及荧光信号检测；

扩增体系：每25μL扩增体系中包含2×PremixExTaq^TM缓冲液12.5μL，10μmol/L的上游引物和10μmol/L的下游引物各1μL，10μmol/L的探针2μL，核酸模板溶液1μL，超纯水补体积至25μL；

扩增参数：95℃5min；95℃15s，60℃30s；45个循环，每个循环在60℃阶段采集FAM通道数据；

3)根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。