CN105524989A - 用于检测莱姆病螺旋体的rpa引物和探针及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于检测莱姆病螺旋体的RPA引物和探针，所述RPA引物基于莱姆病螺旋体recA基因设计，引物序列见Seq？ID？No:1和2。所述探针根据RPA引物设计，大小为46-52bp，探针的5’端用FAM标记，3’端进行C3Spacer修饰，且在探针中间距5’端30bp处进行dSpacer或THF修饰。本发明还提供含有所述RPA引物和探针的检测试剂盒。本发明进一步提供基于所述RPA引物和探针建立的检测莱姆病螺旋体的RPA法。本发明将RPA引物恒温扩增技术与侧流层析试纸联用，可从疑似病人血清中快速准确地检测出莱姆病螺旋体。该方法的特异性和灵敏度均较常规PCR更高，可对不同致病基因型的莱姆病螺旋体进行检测，对莱姆病的早期诊断、早期治疗等方面具有重要意义；同时可以免除高昂的仪器投入，便于基层推广使用。

Description

用于检测莱姆病螺旋体的RPA引物和探针及检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，具体地说，涉及一种用于检测莱姆病螺旋体的RPA引物和探针及检测方法。
背景技术
莱姆病(Lymedisease)是由伯氏疏螺旋体(Bolreliaburgdorferi)引起的一种慢性自然疫源性疾病。该病主要是通过节肢动物蜱的叮咬在宿主动物与宿主动物及人之间传播。莱姆病临床表现初期多有典型皮肤损害--慢性游走性红斑(ECM)，同时伴有头痛、发热、寒战、疲乏不适.局部淋巴结肿大等症状，后期表现为神经系统、循环系统、运动系统等呈间歇性、交替性出现的各种损害。具有分布广、病程长、病死率较高等特点。如能早期诊断、早期治疗常可痊愈，否则会出现严重并发症。因此开发莱姆病螺旋体的早期快速检测技术，对莱姆病早期诊断、早期治疗具有重要的意义。
目前莱姆病的主要诊断方法包括病原学检测和特异性抗体检测。病原学检测包括直接镜检法、病原分离培养、多聚酶链反应(PCR)和荧光定量PCR(real-timePCR)；常用的特异性抗体检测包括间接免疫荧光抗体法(IFA)、酶联免疫吸附实验(ELISA)和蛋白免疫印迹法(WB)。
直接镜检法需要操作者具备丰富的检验经验，然而对于混合感染的情况，则无法检测到，而且该法容易漏检，与其他诊断方法相比，直接检查的检出率相对较低。病原分离培养法的分离率低，耗时较长，敏感性差。IFA只能检测到菌体表面的抗原，灵敏度和特异性都比较低，且IFA受实验因素影响大，易造成假阳性或假阴性。ELISA主要对莱姆病特异抗体IgG进行检测，传统ELISA检测方法，存在非特异反应，虽然灵敏度高，但缺乏特异性，易误诊。WB可以判断和验证IFA和ELISA的真假阳性，但由于莱姆病螺旋体有不同的致病基因型，而这几种基因型在世界各地的分布又有所不同，因此各国应根据实际情况，制定出针对本国流行的基因型的WB阳性诊断标准，而且WB的操作比较复杂，不利于推广。PCR技术的不足之处在于：(1)靶基因易被污染；(2)易出现非特异性扩增；(3)扩增反应易受多种因素的影响；(4)需要投入比较昂贵的精密仪器(如PCR仪、凝胶电泳仪及凝胶成像系统)；(5)耗时长，需要2～3h的反应时间和1～2h的电泳时间。这些均不利于现场的快速检测，给技术的基层推广造成了极大障碍。
重组酶聚合酶扩增法(RecombinasePolymeraseAmplification,RPA)是2014年兴起的一种新的恒温扩增方法，其特点是在等温条件下即可高效、快速、高特异、高灵敏地扩增靶基因序列。目前RPA技术主要应用于病原微生物的快速检测，包括病毒、细菌、真菌、支原体、寄生虫等，在临床疾病诊断、食品卫生检验及环境监测方面应用广泛，然而目前未见利用RPA技术进行莱姆病螺旋体检测的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测莱姆病螺旋体的RPA引物和探针以及含有所述引物和探针的检测试剂盒。
本发明的另一目的是提供一种检测莱姆病螺旋体的RPA法。
为了实现本发明目的，本发明的一种用于检测莱姆病螺旋体的RPA引物和探针，所述RPA引物基于莱姆病螺旋体recA基因设计，引物序列如下：
LF-F:5’-ATTGTATTAGATGAAGCTCTTGGCATTGGTGGA-3’
LF-R:5’-AACAGGATCAAGAGCATGTTCAGCATCAATA-3’
所述探针根据RPA引物设计，大小为46-52bp，探针的5’端用FAM标记，3’端进行C3Spacer修饰，且在探针中间距5’端30bp处进行dSpacer或THF修饰。
引物和探针序列分别如下：
LF-F:5’-ATTGTATTAGATGAAGCTCTTGGCATTGGTGGA-3’
LF-R:5’-biotin-AACAGGATCAAGAGCATGTTCAGCATCAATA-3’
LF-P:5’-FAM-ACTTTGATCCTTCAAGCGATTGCTGAAGT-(dSpacer)-CAAAAAGAAGGAGGCAT(C3Spacer)-3’
本发明还提供含有所述引物LF-F、LF-R和探针LF-P的用于RPA法检测莱姆病螺旋体的试剂盒。
优选地，所述试剂盒还包括RPA反应管、反应缓冲液、标准阳性模板等中的至少一种(RPA反应管以及反应缓冲液购自英国TwistDX公司，商品编号TANFO02KIT；其中，BsuDNA聚合酶和重组酶uvaX以干粉状态存在于RPA反应管中，使用时，用1×反应缓冲液溶解，整个RPA反应在RPA反应管中进行)。
本发明还提供所述RPA引物和探针及其检测试剂盒在鉴定莱姆病螺旋体中的应用。
本发明进一步提供一种用于检测莱姆病螺旋体的RPA法，包括以下步骤：
1)提取样品中的DNA；
2)以步骤1)中提取的DNA为模板，使用所述引物LF-F、LF-R和探针LF-P，在RPA反应管中进行RPA扩增反应；
3)分析RPA扩增产物。
其中，RPA反应体系以50μl计为：
RPA反应条件为：30-45℃(优选37℃)，20分钟，冰上终止反应。
步骤3)中采用Hybridetect2T试剂盒(含侧流层析试纸条，购自德国MileniaBiotec公司，商品编号MILENIA01)检测RPA扩增产物。检测方法如下：将扩增产物与Hybridetect2T试剂盒中的缓冲液按1:20的体积比混合，然后将Hybridetect2T试纸条置于上述混合液中，5分钟后判读结果；如果试纸条的检测线上出现条带，而且质控线正常，则表明该样品中含有莱姆病螺旋体，如果仅是质控线上出现条带，则表明该样品中不含莱姆病螺旋体。
本发明将RPA引物恒温扩增技术与侧流层析试纸联用，可从疑似病人血清中快速准确地检测出莱姆病螺旋体。该方法的特异性和灵敏度均较常规PCR更高，可对不同致病基因型的莱姆病螺旋体进行检测，对莱姆病的早期诊断、早期治疗等方面具有重要意义；同时可以免除高昂的仪器投入，便于基层推广使用。
附图说明
图1为本发明实施例2中利用RPA引物恒温扩增不同基因型的莱姆病螺旋体、非莱姆病螺旋体的Hybridetect2T试纸条检测结果；其中，A图为扩增36株莱姆病螺旋体的结果，对应于表1中各菌株，N为阴性对照；B图为扩增非莱姆病螺旋体的结果，B31为阳性对照，1为埃立克体，2为横赛巴尔通体，3为无形体，4为贝氏柯克斯氏体，5为钩端螺旋体，6为大肠埃希菌，7为阴性对照。
图2为本发明实施例3中RPA引物恒温扩增反应体系的灵敏度检测结果；其中，N为阴性对照，模板浓度梯度依次为10pg,1pg,100fg,50fg,10fg。。
图3为本发明实施例3中普通PCR扩增反应体系的灵敏度检测结果；其中，M为100bpLadder，1-5分别代表模板浓度为60ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl，6为阴性对照。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中使用的RPA反应管以及反应缓冲液购自英国TwistDX公司，商品编号TANFO02KIT；其中，BsuDNA聚合酶和重组酶uvaX以干粉状态存在于RPA反应管中，使用时，用1×反应缓冲液溶解，整个RPA反应在RPA反应管中进行。
实施例1用于检测莱姆病螺旋体的RPA引物和探针的合成
将莱姆病螺旋体菌株B31用于检测莱姆病螺旋体的RPA引物和探针的筛选。以recA基因为靶基因，根据TwistDX操作手册要求，利用Primer5设计5对可用于BasicRPA试剂盒的引物。利用BasicRPA试剂盒对这5对引物进行筛选，得到可稳定扩增目的产物，且灵敏度和特异性最好的一对引物。筛选得到的最佳引物序列见SeqIDNo:1和2。然后在此引物的基础上根据TwistDX公司RPAnfo试剂盒操作手册要求对上述引物进行改造，在反向引物5’端加入一个生物素标记位点，另外，根据RPA引物序列设计一条大小为46-52bp的探针，探针的5’端用FAM标记，3’端进行C3Spacer(C3间臂)修饰，且在探针中间距5’端30bp处进行dSpacer(双脱氧间臂)修饰。根据要求设计3-5条探针，用RPAnfo试剂盒进行筛选。最后筛选得到高灵敏度且可特异性扩增靶基因的，用于检测莱姆病螺旋体的引物和探针，它们的序列分别如下：
LF-F:5’-ATTGTATTAGATGAAGCTCTTGGCATTGGTGGA-3’
LF-R:5’-biotin-AACAGGATCAAGAGCATGTTCAGCATCAATA-3’
LF-P:5’-FAM-ACTTTGATCCTTCAAGCGATTGCTGAAGT-(dSpacer)-CAAAAAGAAGGAGGCAT(C3Spacer)-3’
引物合成由上海生物工程有限公司完成。
实施例2利用RPA引物和探针检测莱姆病螺旋体的特异性分析
1.1试剂和设备
小型恒温摇床，TwistnfoRPA试剂盒购自英国TwistDX公司(商品编号：TANFO02KIT)。
1.2样本来源
本实施例中采用的36种莱姆病螺旋体菌株，由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所提供(表1)；7种非莱姆病螺旋体菌株：埃立克体、横赛巴尔通体、无形体、贝氏柯克斯氏体和钩端螺旋体，由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所无形体病室和钩端螺旋体室提供；大肠埃希菌BL21购自康为世纪生物科技有限公司。
表1用于RPA检测的莱姆病螺旋体的背景资料
1.3DNA提取
热裂解法提取莱姆病螺旋体菌株DNA：将适量菌株接种BSKII培养基，33℃培养7天，将培养好的菌株12000rpm离心30分钟收集菌体，去上清；然后用PBS重悬洗涤，12000rpml离心30分钟，PBS洗涤三遍，去上清；然后加适量ddH2O重悬，100℃金属浴煮10分钟后，3500rpm离心5分钟，留取上清，4℃保存备用。对照菌株DNA采用QIAGEN公司的DNA提取试剂盒提取。
1.4在RPA反应管中进行RPA反应
反应体系(50μl)如下：
RPA反应条件为：37℃，20分钟，冰上终止反应。
1.5结果
将扩增产物与Hybridetect2T试剂盒(购自德国MileniaBiotecGmbH公司，内含侧流层析试纸条，商品编号：MILENIA01)中的缓冲液按1:20的体积比混合，然后将Hybridetect2T试纸条置于上述混合液中，5分钟后判读结果。结果如图1A和图1B所示，图1A为36株莱姆病螺旋体扩增结果：N，为阴性对照；其他表示字母为每个条带对应相应的菌株名称；图1B，B31作为莱姆病螺旋体阳性对照，1-7为埃立克体、横赛巴尔通体、无形体、贝氏柯克斯氏体、钩端螺旋体、大肠埃希菌BL21，阴性对照均不产生条带。该结果表明本发明引物和探针的特异性较好。
实施例3利用RPA引物和探针检测莱姆病螺旋体的灵敏度分析
以莱姆病螺旋体B31为模板，利用实施例1的RPA引物LF-F和LF-R进行扩增。其中B31基因组DNA用ddH2O梯度稀释为10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、50fg/μL、10fg/μL。在RPA反应管中进行RPA反应。
反应体系(50μl)：
RPA反应条件为：37℃，20分钟，冰上终止反应。
将扩增产物与Hybridetect2T试剂盒(含侧流层析试纸条，购自德国MileniaBiotec公司，商品编号：MILENIA01)中的缓冲液按1:20的体积比混合，然后将Hybridetect2T试纸条置于上述混合液中，5分钟后判读结果。图2为RPA法灵敏度检测结果。由图2可见，RPA法的检测下限可达到50fg。图3为利用普通PCR反应对不同浓度的recA基因进行扩增(引物见SeqIDNo:1和2)，经琼脂糖凝胶电泳后的结果。可见普通PCR检测下限为100pg，远低于本发明的RPA检测方法。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.用于检测莱姆病螺旋体的RPA引物和探针，其特征在于，所述RPA引物基于莱姆病螺旋体recA基因设计，引物序列如下：
LF-F:5’-ATTGTATTAGATGAAGCTCTTGGCATTGGTGGA-3’
LF-R:5’-AACAGGATCAAGAGCATGTTCAGCATCAATA-3’
所述探针根据RPA引物设计，大小为46-52bp，探针的5’端用FAM标记，3’端进行C3Spacer修饰，且在探针中间距5’端30bp处进行dSpacer或THF修饰。
2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，引物和探针序列分别如下：
LF-F:5’-ATTGTATTAGATGAAGCTCTTGGCATTGGTGGA-3’
LF-R:5’-biotin-AACAGGATCAAGAGCATGTTCAGCATCAATA-3’
LF-P:5’-FAM-ACTTTGATCCTTCAAGCGATTGCTGAAGT-(dSpacer)-CAAAAAGAAGGAGGCAT(C3Spacer)-3’。
3.含有权利要求1或2所述引物和探针的用于RPA法检测莱姆病螺旋体的试剂盒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RPA反应管、反应缓冲液、标准阳性模板中的至少一种。
5.用于检测莱姆病螺旋体的RPA法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取样品中的DNA；
2)以步骤1)中提取的DNA为模板，使用权利要求1或2所述的引物和探针，在RPA反应管中进行RPA扩增反应；
3)分析RPA扩增产物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，RPA反应体系以50μl计为：
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，RPA反应条件为：30-45℃，20分钟，冰上终止反应。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，RPA反应条件为：37℃，20分钟，冰上终止反应。
9.根据权利要求5-8任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)中采用Hybridetect2T试剂盒检测RPA扩增产物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，将扩增产物与Hybridetect2T试剂盒中的缓冲液按1:20的体积比混合，然后将Hybridetect2T试纸条置于上述混合液中，5分钟后判读结果；如果试纸条的检测线上出现条带，而且质控线正常，则表明该样品中含有莱姆病螺旋体，如果仅是质控线上出现条带，则表明该样品中不含莱姆病螺旋体。
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