CN110499357A

CN110499357A - 一种应用rpa技术检测南方根结线虫的引物和探针

Info

Publication number: CN110499357A
Application number: CN201810484444.5A
Authority: CN
Inventors: 迟元凯; 戚仁德; 赵伟; 叶梦迪; 汪涛
Original assignee: Institute of Plant Protection and Agricultural Products Quality Safety of AAAS
Current assignee: Institute of Plant Protection and Agricultural Products Quality Safety of AAAS
Priority date: 2018-05-20
Filing date: 2018-05-20
Publication date: 2019-11-26

Abstract

本发明的目的是提供1套基于RPA技术检测南方根结线的引物和探针，其中1对引物如SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示，探针序列如SEQ ID No:9所示。利用本发明的引物和探针进行RPA反应和侧向流试纸条快速检测，可以摆脱传统分子检测对PCR仪等昂贵仪器和严格反应条件的限制，快速、高效鉴定南方根结线虫，结果肉眼即可观察，在南方根结线虫的早期和田间诊断、辅助鉴定方面有很高的应用价值。

Description

一种应用RPA技术检测南方根结线虫的引物和探针

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及到一种检测南方根结线虫的引物和探针。即应用重组酶聚合酶等温扩增技术(Recombinase Plolymerase Amplification，RPA) 技术进行扩增，扩增产物使用侧向流试纸条(Lateral Flow Strips)快速检测南方根结线虫的引物、探针和检测方法。

背景技术

根结线虫(Meloidogyne spp.)是严重危害农业生产的一类植物寄生线虫，其分布范围广，寄主植物达3000多种，每年在世界范围内造成的经济损失达百亿美元，其中分布范围最广的是南方根结线虫(M.incognita)。近年来，随着我国设施栽培规模的扩大，根结线虫在果树、蔬菜、花卉、中药材等旱地作物上的为害逐年加重，在安徽、山东、江苏、新疆、深圳等地蔬菜产区根结线虫发病率达60％以上，已经严重制约了我国蔬菜等经济作物的安全生产。

目前根结线虫的检测方法主要有形态鉴定、传统PCR检测以及LAMP检测等。其中，形态检测对检测人员的形态学背景要求较高，需要借助高倍的显微镜，且检测速度较慢，而传统PCR检测技术虽然大大加快了检测的速度，但由于其需要PCR仪等高精尖仪器设备，且检测时间较长，其应用也受到限制，主要适用于实验室内检测；LAMP检测技术的出现使分子检测摆脱了对精密仪器的需求，也更利于一些基层技术人员应用。RPA((RecombinasePolymerase amplifcation)是一项利用重组酶聚合酶等温扩增的技术，该技术不仅可以摆脱对高值仪器的需求，而且相比LAMP检测技术，其反应时间更短，且扩增后产生与传统PCR一样的单一条带，通过结合探针和侧向流试纸条(Lateral Flow Strips)，可以实现病原物高特异性、高灵敏度的快速检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种应用RPA技术检测南方根结线虫的特异性引物和探针，摆脱传统分子检测对高值仪器和专业技术人员的依赖，实现对南方根结线虫的快速检测，弥补现有技术的不足。

本发明提供的检测南方根结线虫的引物和探针，其正向引物序列如SEQ ID No:3所示，反向引物如SEQ ID No:4所示，探针序列如SEQ ID No:9所示。

所述反向引物的5’端标记生物素Biotin基团；所述探针5’端标记荧光素 FITC基团，第32位的胞嘧啶被替换为dSpacer，3’端的标记C3Spacer。

本发明还提供了一种基于重组酶聚合酶等温扩增技术(RPA)检测南方根结线虫的方法：RPA反应使用nfo kit，反应总体系为50μl，首先在0.2ml 的PCR管中加入缓冲液29.5μl，10μM的上下游引物各2.1μl，10μM的探针0.6μl， DNA模板1μl，ddH₂O 12.2μl，混匀后，加入到含有RPA冻干酶粉的反应管中混匀，加入280mM的MgAc液2.5μl，将反应管置于金属浴中，39℃反应30分钟，反应产物使用侧向流试纸条进行检测。

本发明根据通过比对不同根结线虫基因组序列设计了多个RPA引物，从中筛选出可快速有效检测南方根结线虫的引物，并进一步设计了适用于PA的探针，利用该套引物和探针，以南方根结线虫DNA为模板进行反应后，使用侧向流试纸条检测，阳性指示条带和质控条带均显色，而以其他种类线虫DNA为模板进行反应后，侧向流试纸条仅质控条带显色，表明本发明提供的RPA检测方法特异性高；同时，本发明提供的RPA检测方法与普通PCR检测方法灵敏度相当。

附图说明

图1为南方根结线虫RPA检测引物和探针的设计和筛选

A为引物的筛选，M：DL2000DNA Marker；1-4：引物Mi1RPAF/Mi1RPAR， Mi2RPAF/Mi2RPAR，Mi3RPAF/Mi3RPAR，Mi4RPAF/Mi4RPAR扩增结果。

B为加入探针后的侧向流试纸条检测结果。CK为清水对照；1-3：南方根结线虫DNA为模板的检测结果。

图2为引物和探针特异性检测。其中CK为清水对照；1-4：南方根结线虫 (Mi1，Mi2，Mi3，Mi4)；5-13：花生根结线虫(Ma1，Ma2)，爪哇根结线虫 (Mj1，Mj2)，禾谷孢囊线虫(Ha1)，菲利普孢囊线虫(Hf1)，大豆孢囊线虫(Hg1)，贝西滑刃线虫(Ab1)，落选短体线虫(Pn1)。

图3为引物灵敏度检测。

A为普通PCR检测结果；M：DL2000DNA Marker；1-7：DNA模板浓度 1ng/μl，100pg/μl，10pg/μl，1pg/μl，100fg/μl，10fg/μl，阴性对照(清水)。

B为RPA检测结果。1-7：DNA模板浓度1ng/μl，100pg/μl，10pg/μl，1pg/μl， 100fg/μl，10fg/μl，阴性对照(清水)。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步阐述本发明，但并不是对本发明的限制，仅作为实例。

实施例1南方根结线虫RPA扩增引物的设计和检测方法的建立

1.1南方根结线虫RPA引物的设计和筛选比对根结南方根结线虫、花生根结线虫、爪哇根结线虫以及北方根结线虫基因组序列，根据序列特异性，设计了若干适用RPA反应，且能够特异性检测南方根结线虫的引物(表1)。

表1：用于RPA检测南方根结线虫引物的筛选

1.2南方根结线虫DNA模板的制备：收集南方根结线虫2龄幼虫入1.5mL离心管中，经5000rpm离心10min后，使用移液器尽量吸去管中的水，将离心管放入液氮中速冻30s后，使用研磨杵进行研磨，研磨后的匀浆使用动物基因组DNA 快速抽提试剂盒(上海生工)提取线虫DNA。

1.3RPA反应体系：反应使用Basic kit，反应总体系为50μl，首先在0.2ml的PCR管中加入缓冲液29.5μl，10μM的上下游引物各2.4μl，南方根结线虫DNA模板1μl，ddH₂O 12.2μl，用移液器吸打混匀后，加入到含有RPA冻干酶粉的反应管中，并用移液器混匀，最后加入280mM的MgAc溶液2.5μl。

1.4RPA扩增反应条件：将上述RPA扩增体系充分混匀，置于39℃的金属浴中孵育30min，得到RPA扩增产物。

1.5RPA扩增产物的电泳检测

RPA反应结束后，使用PCR产物纯化试剂盒(OMEGA)对扩增产物进行简单纯化，取5μl回收产物，使用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，使用凝胶成像仪进行结果观察。

1.6结果

RPA扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图1A所示，以南方根结线虫DNA为模板，引物Mi2RPAF、Mi2RPAR扩增后能得到单一明亮的条带。

实施案2探针的设计和快速检测方法的建立

2.1探针的设计根据引物Mi2RPAF和Mi2RPAR扩增序列的信息，进一步设计适用于侧向流试纸条检测的探针Mi2Probe(SEQ ID No:9)，探针序列为：

CCTTGGAATTGGAACAGGGTCCTTCCGATAT(dSpacer)TAGGGGTGTTTGATATA，其中探针5’端标记荧光素FITC基团，第32位的胞嘧啶被替换为dSpacer，3’端的标记C3Spacer；同时下游引物Mi2RPAR的5'端标记生物素Biotin基团，探针和引物由上海生工合成。

2.2RPA反应体系：RPA反应使用nfo kit，反应总体系为50μl，首先在0.2ml的PCR管中加入缓冲液29.5μl，浓度为10μM的上下游引物各2.1μl，浓度为10μM的探针0.6μl，南方根结线虫DNA模板1μl，ddH₂O 12.2μl，用移液器吸打混匀后，加入到含有RPA冻干酶粉的反应管中，并用移液器混匀，最后加入280mM的MgAc溶液2.5μl，阴性对照模板使用ddH₂O。

2.3RPA反应条件：将上述RPA扩增体系充分混匀，置于39℃的金属浴中孵育 30min，得到RPA扩增产物。

2.4侧向流试纸条检测：检测使用的使用的侧向流试纸条为Milenia Hybridtech 1，将RPA扩增产物使用缓冲液稀释10倍后，取5μl滴至侧向流试纸条的加样区，再在加样区滴加30μl的缓冲液，2min至3min后，观察指示条带显色情况。

2.5结果：结果如图1B所示，以南方根结线虫DNA为模板RPA反应产物使用侧向流试纸条检测，指示条带和质控条带均显色，而阴性对照未显色。

实施例3南方根结线虫RPA特异性检测

收集南方根结线虫、花生根结线虫、爪哇根结线虫、禾谷孢囊线虫、菲利普孢囊线虫，大豆孢囊线虫、贝西滑刃线虫、落选短体线虫共13个种群(表2)，分别提取其DNA作为模板，以ddH₂O为阴性对照，按照2.2、2.3、2.4所述反应体系添加个反应物，进行RPA反应并检测。图2结果表明本发明提供的引物和探针能够特异性的检测南方根结线虫，其他线虫DNA为模板均未能得到阳性结果。

表2供试的其他线虫种群名称及来源

实施例4南方根结线虫RPA灵敏度检测

RPA检测：将1.2所述的线虫DNA模板梯度稀释至1ng/μl，100pg/μl， 10pg/μl，1pg/μl，100fg/μl，10fg/μl，按2.2、2.3、2.4所述反应体系添加个反应物，进行RPA反应并检测；

PCR检测：以上述梯度稀释的DNA模板，扩增体系为25μL，DNA模板 1μL，10×PCR Buffer(Mg²⁺)2.5μL，dNTP Mix(10mM)2μL，浓度为20μM 的引物MiF和MiR各1μL，ExTaq(5U/μL)0.5μL，ddH₂O 33.5μL。扩增程序为：94℃4min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，使用凝胶成像仪进行结果观察。

MiF和MiR引物序列如下：

MiF：GTGAGGATTCAGCTCCCCAG

MiR：ACGAGGAACATACTTCTCCGTCC

结果如图3A和图3B所示，本发明的RPA方法与普通PCR检测的灵敏度相当，均为10pg/μl。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所

<120> 一种应用RPA技术检测南方根结线虫的引物和探针

<130> 1

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 引物

<400> 1

acaacgagga acatacttct ccgtcctgga ac 32

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 引物

<400> 2

ttttttggtg cttcgtcttt tgctttttat attacc 36

<210> 3

<211> 49

<212> DNA

<213> 探针

<400> 3

ccttggaatt ggaacagggt ccttccgata tctaggggtg tttgatata 49

Claims

1.1种用于检测南方根结线虫的特异性引物和探针，引物的正向引物序列为SEQ IDNo:3，反向引物序列为SEQ ID No:4，探针序列为SEQ ID No:9。

2.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述反向引物的5’端标记生物素Biotin基团。

3.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述探针5’端标记荧光素FITC基团。

4.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述探针第32位的胞嘧啶替换为dSpacer。

5.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述探针3’端的鸟嘌呤为Dideoxy-A。

6.权利要求1所述的引物和探针在南方根结线虫早期诊断和辅助鉴定中的应用。

7.一种通过重组酶聚合酶等温扩增技术(RPA)，利用侧向流试纸条检测、鉴定南方根结线虫的方法，提取待检样品中DNA的作为模板，利用权利要求所述的引物和探针进行RPA反应，反应产物使用侧向流试纸条进行检测，如果质控条带和阳性指示条带同时显色，则说明所检测样品中含有南方根结线虫。