CN117210576A - 用于鉴定松材线虫的检测试剂、试剂盒和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于鉴别松材线虫的检测试剂，所述检测试剂中包括用于扩增松材线虫的Bx‑12基因的特异性引物对。应用本发明提供的包括针对Bx‑12基因设计引物的检测试剂对松材线虫进行鉴别时，具有高特异性、高灵敏性、操作简单、快速检测等优异特点。
Description
技术领域
本发明涉及生物学检测技术领域，特别是涉及一种用于鉴定松材线虫的检测试剂、试剂盒和应用。
背景技术
松材线虫病是一种毁灭性的森林灾害，于20世纪80年代初传入我国境内，随后迅速扩散蔓延。截止2023年，松材线虫病已在全国701个县级疫区被发现，对我国的松林生态系统构成了严重的破坏和威胁。
松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)的鉴定主要依靠成虫的形态特征，但是通过形态学准确鉴定松材线虫成虫对于非专业人员相当困难，且无法对幼虫进行准确鉴定。由于形态学的限制，免疫学、生理生化和分子生物学方法被应用到松材线虫的鉴定上。目前，市面上松材线虫的检测与鉴定主要以DNA探针技术的PCR扩增技术为主，虽能有效地鉴定松材线虫，但费用较高，但是检测设备巨大、沉重、不易携带，且检测设备和检测试剂费用昂贵，不利于松材线虫的快速检测。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供一种高灵敏性、高特异性、快速、可视化的鉴定松材线虫的检测试剂及试剂盒。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明第一个目的是提供一种用于鉴别松材线虫的检测试剂，所述检测试剂中包括用于扩增松材线虫的Bx-12基因的特异性引物对。
优选地，所述引物对包括：
Bx-12基因上游引物：序列如SEQ ID NO:2所示；
Bx-12基因下游引物：序列如SEQ ID NO:3所示。
优选地，所述Bx-12基因下游引物的5’端用生物素修饰。
优选地，所述检测试剂还包括：针对松材线虫的Bx-12基因的特异性检测探针；
优选地，所述检测探针的序列如SEQ ID NO:4所示；
优选地，所述检测探针的5’端用FAM标记；
优选地，所述检测探针的3’端用C3 spacer标记；
优选地，从所述检测探针5’端开始计算，第35个碱基‘T’用-THF-替代。
本发明第二个目的是提供一种用于检测松材线虫的冻干微球，所述冻干微球包括用于扩增松材线虫的Bx-12基因的特异性引物对。
优选地，所述引物对包括：
Bx-12基因上游引物：序列如SEQ ID NO:2所示；
Bx-12基因下游引物：序列如SEQ ID NO:3所示；
优选地，所述Bx-12基因下游引物的5’端用生物素修饰；
进一步优选地，所述冻干微球还包括特异性检测探针，序列如SEQ ID NO:4所示；
更进一步优选地，所述检测探针的5’端用FAM标记；
更进一步优选地，所述检测探针的3’端用C3 spacer标记；
更进一步优选地，从所述检测探针5’端开始计算，第35个碱基‘T’用-THF-替代。
本发明第三个目的是提供一种检测松材线虫的检测试剂盒，所述试剂盒包括上述任一项所述的检测试剂或如上述所述的冻干微球。
优选地，所述Bx-12基因上游引物的浓度为8～15μM，优选为8～12μM，更优选为，9～11μM，最优选为10μM；
优选地，所述Bx-12基因下游引物的浓度为8～15μM，优选为8～12μM，更优选为，9～11μM，最优选为10μM；
优选地，检测探针的浓度为8～15μM，优选为8～12μM，更优选为，9～11μM，最优选为10μM。
本发明第四个目的是提供一种利用上述任一项所述检测试剂或上述所述的冻干微球鉴别松材线虫的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
(1)制备松材线虫DNA；
(2)将松材线虫DNA、所述引物对、特异性检测探针加入反应体系中并对所述反应体系进行扩增；或
将松材线虫DNA加入冻干微球中，进行扩增；
(3)利用试纸条夹心检测技术对扩增产物进行检测。
优选地，控制所述扩增的温度为25～40℃，优选为30～40℃，更优选为35～40℃；
优选地，控制所述扩增的时间为5～15min，优选为8～15min，更优选为10～15min。
本发明第五个目的是上述任一项所述的检测试剂、上述所述的冻干微球或上述所述的检测试剂盒在鉴别松材线虫或制备鉴别松材线虫的产品中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和技术效果：
本发明通过针对松材线虫特有的Bx-12基因设计引物，进而提供一种包含其引物的用于鉴定松材线虫的检测试剂，其具有高特异性、高灵敏度、检测效率高、可视化和成本低等优点；本发明提供的检测方法具有操作简单、设备简单、用时短、反应条件温和等优点。
附图说明
图1为不同株系线虫DNA利用RPA等温扩增后试纸检测结果，其中Control组为水。
图2为线虫DNA利用RPA等温扩增在不同温度和反应时间下的测试结果，其中Control组为水在不同温度和反应时间下的测试结果。
图3为本发明构建的含有松材线虫特异性识别引物组Bx-12的RPA反应体系微球。
图4为不同线虫浓度DNA利用RPA等温扩增后试纸检测结果，其中Control组为水。
具体实施方式
为使本发明的技术方案和有益效果能够更加明显易懂，下面通过列举具体实施例的方式进行详细说明。除非另有定义，本文所使用的技术和科学术语与本申请所属的技术领域中的技术和科学术语的含义相同。
重组酶聚合酶扩增(RPA)作为近年来发展最快的等温扩增技术，重组酶先与引物形成聚合体，DNA双链被打开，引物与互补序列进行置换形成D环，引物3’在DNA聚合酶的聚合下进行扩增。为了实现特异性检测结果识别的方便性，RPA检测方法需搭配exo探针或者nfo探针。Cha等(2019)为检测松材线虫，针对ITS区域设计引物和exo探针，用RPA方法等温扩增，利用便携式荧光检测仪测量。周勤政等(2022)针对松材线虫，设计了特异性引物靶标syg-2和nfo探针，用RPA方法等温扩增，利用试纸条进行检测。但是以上方法检测松材线虫的引物组，不同程度的存在着特异性差、灵敏度低的缺陷，有待改进，且荧光检测法需要借助荧光定量PCR仪器，不利于野外的便携性和快速检测性。
鉴于此，本发明人经过深入而广泛的研究，经过对靶序列、引物和探针的大量筛选和验证，首次开发了高特异性、高灵敏的专用于检测松材线虫引物对以及配套使用的特异性检测探针。具体地，发明人针对松材线虫的Bx-12基因SEQ ID NO:1所示序列设计特定的引物序列，用本发明提供的特定的引物序列对Bx-12基因进行扩增时，具有高特异性、高灵敏性等优异特点，可以用于准确快速的鉴别松材线虫。在此基础上完成了本发明。
检测试剂
本发明提供一种用于鉴别松材线虫的检测试剂，所述检测试剂中包括用于扩增松材线虫的Bx-12基因的特异性引物对。Bx-12基因序列如SEQ ID NO:1所示。
SEQ ID NO:1
ATGAATACTCGACTGTTCAGTCAGTTACTGTTGGAAAACTTGTGTAAAGCTTCTGTGAGGCTCTCTGAAGCTTCCGAGATTACTGTGTCTTCGACTCGAATCATGCGGATTACTGTAACATTGATTTTATTGCTGCTAGTGGCGCAATTGGCGACTTGCCATAGGTTTGGCGGCTTCGGTGGCGGCGGATTCCTGATTGGCGGAGGTTTCGTGGGCGGCGGCTACGGCGGTGGCTATGGCGGAGGGTATGGCGGCGGCTACGGTGGATATCCGTACTACAGTTCGGGCTACAGCTACCCGTACTACGGCGGCTACAGCTATCCCTACTACAGCTCCGGCTACAGCTACCCCTACTATGGCGGCGGTTACGGCGGCGGCTATGGCGGCGGCTACGGCTATGGCGGATTCGGCGCCGCTTTCGGATTATATGGCGGCGGCTTTGGCGGACGTGGATGGGGCCATCATCATAGATGGGGCAAGAAGTAG
引物
如本文所用，术语“引物”具有本领域技术人员常规理解的意义。发明人经过大量和细致的工作，针对松材线虫基因组DNA的不同序列设计了大量引物对，但这些引物对的灵敏度和特异性均无法令人满意；发明人进一步针对松材线虫基因组的Bx-12基因的不同区域设计了多对引物对，最后发现如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示序列的引物对能够具备优异的灵敏度和特异性。
本发明的引物序列和探针序列根据引物探针设计原理，使用DNAStar、DNAMAN软件和人工设计用重组酶聚合酶扩增检测松材线虫的专用引物和探针序列。
在某些实施方式中，所述引物对包括：
Bx-12基因上游引物：序列为GAATACTCGACTGTTCAGTCAGTTACTGTTGGA(如SEQ IDNO:2所示)；
Bx-12基因下游引物：序列为GTAGTAGGGATAGCTGTAGCCGCCGTAG(SEQ ID NO:3所示)。
在某些实施方式中，所述Bx-12基因下游引物的5’端用生物素修饰。
在本发明的检测试剂中，除引物外，还可以包括一个或多个探针，如检测探针等。
在某些实施方式中，所述检测试剂还包括：针对松材线虫的Bx-12基因的特异性检测探针；
在某些实施方式中，所述检测探针的序列为TGATTTTATTGCTGCTAGTGGCGCAATTGGCGACTT GCCATAGGTTTGGC(SEQ ID NO:4所示)；
在某些实施方式中，所述检测探针的5’端用FAM标记；
在某些实施方式中，所述检测探针的3’端用C3 spacer标记；
在某些实施方式中，从所述检测探针5’端开始计算，第35个碱基‘T’用-THF-替代。
本发明的引物序列和探针序列根据引物探针设计原理，使用DNAStar、DNAMAN软件和人工设计用重组酶聚合酶扩增检测松材线虫的专用引物和探针序列。
在某些实施方式中，本发明的检测试剂还可以包括缓冲液A液和缓冲液B液，其中缓冲液A液或缓冲液B液中包括扩增反应所需要的一种或多种酶。
所述缓冲液A液和缓冲液B液可以选自安普未来(常州)生物科技有限公司的DNA恒温快速扩增试剂盒(胶体金试纸条型)(货号为：WLN8203KIT)。
冻干微球
本发明提供一种用于检测松材线虫的冻干微球，所述冻干微球包括用于扩增松材线虫的Bx-12基因的特异性引物对。
在某些实施方式中，所述引物对包括：
Bx-12基因上游引物：序列如SEQ ID NO:2所示；
Bx-12基因下游引物：序列如SEQ ID NO:3所示；
在某些实施方式中，所述Bx-12基因下游引物的5’端用生物素修饰；
在某些实施方式中，所述冻干微球还包括特异性检测探针，序列如SEQ ID NO:4所示；
在某些实施方式中，所述检测探针的5’端用FAM标记；
在某些实施方式中，所述检测探针的3’端用C3 spacer标记；
在某些实施方式中，从所述检测探针5’端开始计算，第35个碱基‘T’用-THF-替代。
在某些实施方式中，本发明的检测试剂还包括RPA等温扩增酶体系。
本发明的所述冻干微球由安普未来(常州)生物科技有限公司将Bx-12引物组与RPA反应酶系进行混匀冻干，形成冻干微球。
试剂盒
本发明提供一种检测松材线虫的检测试剂盒，所述试剂盒包括上述任一项所述的检测试剂或如上述所述的冻干微球。
在某些实施方式中，所述Bx-12基因上游引物的浓度为8～15μM，例如8.5μM、9μM、9.5μM、10μM、10.5、11μM、11.5μM、12μM、12.5μM、13μM、13.5μM、14μM、14.5μM等。
在某些实施方式中，所述Bx-12基因上游引物的浓度为8～12μM。
在某些实施方式中，所述Bx-12基因上游引物的浓度为9～11μM。
在某些实施方式中，所述Bx-12基因上游引物的浓度为10μM。
在某些实施方式中，所述Bx-12基因下游引物的浓度为8～15μM，例如8μM、8.5μM、9μM、9.5μM、10μM、10.5、11μM、11.5μM、12μM、12.5μM、13μM、13.5μM、14μM、14.5μM等。
在某些实施方式中，所述Bx-12基因下游引物的浓度为8～12μM。
在某些实施方式中，所述Bx-12基因下游引物的浓度为9～11μM。
在某些实施方式中，所述Bx-12基因下游引物的浓度为10μM。
在某些实施方式中，检测探针的浓度为8～15μM，例如8μM、8.5μM、9μM、9.5μM、10μM、10.5、11μM、11.5μM、12μM、12.5μM、13μM、13.5μM、14μM、14.5μM等。
在某些实施方式中，检测探针浓度为8～12μM。
在某些实施方式中，检测探针浓度为9～11μM。
在某些实施方式中，检测探针的浓度为10μM。
在某些实施方式中，本发明的试剂盒还可以包括缓冲液A液和缓冲液B液，其中缓冲液A液或缓冲液B液中包括扩增反应所需要的一种或多种酶。
所述缓冲液A液和缓冲液B液可以选自安普未来(常州)生物科技有限公司的DNA恒温快速扩增试剂盒(胶体金试纸条型)(货号为：WLN8203KIT)。
本发明的试剂盒还可以包括检测试纸条。
所述检测试纸条选自安普未来(常州)生物科技有限公司的核酸检测试纸条(货号为：WLFS8204)。
检测方法
本发明提供一种利用上述任一项所述检测试剂或上述所述的冻干微球鉴别松材线虫的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
(1)制备松材线虫DNA；
(2)将松材线虫DNA、所述引物对、特异性检测探针加入反应体系中并对所述反应体系进行扩增；或
将松材线虫DNA加入冻干微球中，进行扩增；
(3)利用试纸条夹心检测技术对扩增产物进行检测。
在某些实施方式中，提取不同地区松树上面分离的5株松材线虫、4株拟松材线虫和4株腐生线虫的DNA。
本发明所涉及到的线虫虫株是由云南省的云南松、浙江省的马尾松、辽宁省的红松和樟子松、天津市、山东省和陕西省的油松、山东省的黑松等松树中分离得到的。
在某些实施方式中，控制所述扩增的温度为25～40℃，例如26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃等。
在某些实施方式中，控制所述扩增的温度为30～40℃。
在某些实施方式中，控制所述扩增的温度为35～40℃；
在某些实施方式中，控制所述扩增的时间为5～15min，例如6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min等。
在某些实施方式中，控制所述扩增的时间为8～15min。
在某些实施方式中，控制所述扩增的时间为10～15min。
在本发明中，检测方法为重组酶聚合酶扩增法。重组酶聚合酶扩增(RPA)
在常温恒温下，重组酶和引物形成蛋白/单链核苷酸的复合体Rec/ssDNA，在辅助蛋白和单链结合蛋白SSB的帮助下，侵入双链DNA模板；在侵入位点形成D-loop区域，并开始对DNA双链进行扫描；待找到与引物互补的目的区域后，复合体Rec/ssDNA解体的同时，聚合酶也结合到引物的3’末端，开始链的延伸。依赖nfo酶的作用，加入根据模板设计的特异的分子探针，使用胶体金技术(三明治夹心法)可以对最终结果进行检测。
试纸条夹心检测技术试纸条显色法：对扩增产物用水进行10倍稀释后，将稀释样本转移至试纸条的样本垫上等待3分钟，即可判读是否为松材线虫。若试纸条上面出现上下两条带，则判断为松材线虫阳性；上面一条带判断为阴性；上面无带或者下面一条带判断为无效结果。
本发明以Bx-12基因作为松材线虫RPA检测的靶标基因设计了特异性强、检测效率高RPA检测引物。在此基础上，本发明提供了检测松材线虫的RPA检测方法以及RPA检测试剂盒。本发明提供的RPA检测方法以及检测试剂盒具有操作简便、成本低、稳定性高、特异性强、检测效率高等优点，在松材线虫检测中具有应用前景。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
本发明的实施例中所用主要RPA反应酶系、检测试纸条由安普未来(常州)生物科技有限公司提供，本发明引物和探针由深圳华大基因股份有限公司合成。本发明其他的试剂或设备均为常规可商购产品。
实施例1设计可有效特异性识别松材线虫的Bx-12引物组
通过松材线虫与拟松材线虫基因组比较，针对松材线虫特有的Bx-12基因(序列SEQ ID NO:1所示)设计上游引物Bx-12F(序列SEQ ID NO:2所示)、下游引物Bx-12R(序列SEQ ID NO:3所示)和探针引物Bx-12nfo(序列SEQ ID NO:4所示)。其中，下游引物Bx-12R的5’端包含有生物素修饰，探针引物Bx-12nfo的5’端包含有FAM修饰，中间包含有nfo修饰，3’端包含有C3 Spacer修饰，修饰后的具体引物列表见表1。
表1
检测上述Bx-12引物组可有效特异性识别松材线虫的方法如下：
(1)由深圳华大基因股份有限公司合成上述引物组，合成后将引物加入无菌水稀释至10μM备用。
(2)收集不同地区松树上面分离的5株松材线虫、4株拟松材线虫和4株腐生线虫(来源信息见表2)，提取线虫DNA，将DNA浓度统一稀释至1ng/μL备用。
表2
| 编号 | 种属 | 地区 | 寄主 |
| Bx1 | Bursaphelenchusxylophilus | 山东威海 | 黑松 |
| Bx2 | Bursaphelenchusxylophilus | 浙江松阳 | 马尾松 |
| Bx3 | Bursaphelenchusxylophilus | 陕西柞水 | 油松 |
| Bx4 | Bursaphelenchusxylophilus | 云南麻栗坡 | 云南松 |
| Bx5 | Bursaphelenchusxylophilus | 山东烟台 | 油松 |
| Bm1 | Bursaphelenchusmucronatus | 黑龙江哈尔滨 | 红松 |
| Bm2 | Bursaphelenchusmucronatus | 湖北襄阳 | 马尾松 |
| Bm3 | Bursaphelenchusmucronatus | 浙江杭州 | 马尾松 |
| Bm4 | Bursaphelenchusmucronatus | 云南昆明 | 云南松 |
| Ne1 | Oscheiusdolichura | 云南昆明 | 云南松 |
| Ne2 | Aphelenchoidesstammeri | 云南昆明 | 云南松 |
| Ne3 | Bursaphelenchusdoui | 天津 | 油松 |
| Ne4 | Bursaphelenchusdoui | 辽宁抚顺 | 樟子松 |
(3)将购置的RPA等温扩增酶试剂与线虫DNA置于冰上，RPA反应体系按照表3所示比例混匀：
表3
其具体操作步骤为：向冰浴上的25μL体系酶干粉反应管中加入14.7μL的Abuffer，混匀待其充分溶解；然后在反应管中分别加入1μL游引物Bx-12F、1μL下游引物Bx-12R、0.3μL探针引物Bx-12nfo；向反应管中加入6.25μL的无菌水，再加入0.5μL的模板线虫DNA；最后加入1.25μL的B buffer，重复混匀，离心。
(4)反应体系置于金属浴上37℃加热20分钟，置于冰上。
(5)取5μL反应液加入50μL无菌水上混匀稀释，将55μL稀释液加入试纸条上，室温等待3分钟，观察结果。若试纸条上面出现上下两条带，则判断为松材线虫阳性；上面一条带判断为阴性；上面无带或者下面一条带判断为无效结果。
同时，设置了Control组，Control组的实验步骤如上述步骤基本相同，不同之处在于，Control组为水。
结果如图1所示，结果表明，松材线虫的DNA全部可以被正确识别，而非松材线虫的DNA均不能被识别。因此，本发明明确了Bx-12基因可作为松材线虫RPA检测的靶标基因，并在此基础上本发明设计了Bx-12引物组可有效特异性识别松材线虫。
实施例2检测松材线虫的方法
该方法包括以下步骤：
(1)以提取松材线虫Bx4样品的DNA为例进行测试，浓度为1ng/μL；
(2)将线虫DNA，加入Bx-12引物组和RPA等温扩增酶体系，进行RPA等温扩增反应，RPA等温扩增不同反应温度和反应时间见表4：
表4
其中，该步骤的具体操作方法参考实施例1中检测方法的步骤(3)。
(3)反应结束后将扩增产物取5μL加入50μL无菌水中稀释，然后将55μL稀释液滴入试纸条上，等待3分钟，即可判读是否为松材线虫。若试纸条上面出现上下两条带，则判断为松材线虫阳性；上面一条带判断为阴性；上面无带或者下面一条带判断为无效结果。
同时，设置了Control组，Control组的实验步骤如上述步骤基本相同，不同之处在于，Control组为水。
结果见图2，表明35℃、37℃和40℃反应10分钟和15分钟均有强带，选定40℃反应15分钟，作为松材线虫检测的反应条件，以提高其灵敏度。
实施例3一种检测松材线虫的RPA等温扩增试剂盒。
本实施例的试剂盒包括；反应微球，内含Bx-12引物组、RPA等温扩增酶体系(见图3)。
检测方法如下：
(1)Bx-12F、Bx-12R和Bx-12nfo引物由深圳华大基因股份有限公司合成；
(2)由安普未来(常州)生物科技有限公司将Bx-12引物组与RPA反应酶系进行混匀冻干，形成冻干微球(见图3)，形成一种检测松材线虫的RPA等温扩增试剂盒。其中，RPA等温扩增体系的混合比例按照实施例1的表3进行配制。
(3)以提取松材线虫BxYNS样品的DNA浓度为1ng/μL为例测试试剂盒检测效果。步骤如下：将模板DNA用无菌水稀释至100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL和100fg/μL；取1μL不同浓度模板加入24μL的无菌水中；将25μL的样品加入微球中，40℃反应15分钟。其中反应方法按照实施例2进行。
同时，设置了Control组，Control组的实验步骤如上述步骤基本相同，不同之处在于，Control组为水。
结果如图4所示，结果表明，松材线虫的RPA等温扩增试剂盒可有效检测出低至1pg的松材线虫DNA。
应当理解，以上实施例均为示例性的，不用于包含权利要求所包含的所有可能的实施方式。在不脱离本发明的范围的情况下，还可以在以上实施例的基础上做出各种变形和改变。同样的，也可以对以上实施例的各个技术特征进行任意组合，以形成可能没有被明确描述的本发明的另外的实施例。因此，上述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，不对本发明专利的保护范围进行限制。
Claims (10)
1.一种用于鉴别松材线虫的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂中包括用于扩增松材线虫的Bx-12基因的特异性引物对。
2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述引物对包括：
Bx-12基因上游引物：序列如SEQ ID NO:2所示；
Bx-12基因下游引物：序列如SEQ ID NO:3所示；
优选地，所述Bx-12基因下游引物的5’端用生物素修饰。
3.根据权利要求1或2所述的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂还包括：针对松材线虫的Bx-12基因的特异性检测探针；
优选地，所述检测探针的序列如SEQ ID NO:4所示；
优选地，所述检测探针的5’端用FAM标记；
优选地，所述检测探针的3’端用C3 spacer标记；
优选地，从所述检测探针5’端开始计算，第35个碱基‘T’用-THF-替代。
4.一种用于检测松材线虫的冻干微球，其特征在于，所述冻干微球包括用于扩增松材线虫的Bx-12基因的特异性引物对。
5.根据权利要求4所述的冻干微球，其特征在于，所述引物对包括：
Bx-12基因上游引物：序列如SEQ ID NO:2所示；
Bx-12基因下游引物：序列如SEQ ID NO:3所示；
优选地，所述Bx-12基因下游引物的5’端用生物素修饰；
优选地，所述冻干微球还包括特异性检测探针，序列如SEQ ID NO:4所示；
优选地，所述检测探针的5’端用FAM标记；
优选地，所述检测探针的3’端用C3 spacer标记；
优选地，从所述检测探针5’端开始计算，第35个碱基‘T’用-THF-替代。
6.一种检测松材线虫的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～3中任一项所述的检测试剂或如权利要求4或5所述的冻干微球。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述Bx-12基因上游引物的浓度为8～15μM，优选为8～12μM，更优选为，9～11μM，最优选为10μM；
优选地，所述Bx-12基因下游引物的浓度为8～15μM，优选为8～12μM，更优选为，9～11μM，最优选为10μM；
优选地，检测探针的浓度为8～15μM，优选为8～12μM，更优选为，9～11μM，最优选为10μM。
8.一种利用权利要求1～3中任一项所述检测试剂或权利要求4或5所述的冻干微球鉴别松材线虫的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
(1)制备松材线虫DNA；
(2)将松材线虫DNA、所述引物对、特异性检测探针加入反应体系中并对所述反应体系进行扩增；或
将松材线虫DNA加入冻干微球中，进行扩增；
(3)利用试纸条夹心检测技术对扩增产物进行检测。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，控制所述扩增的温度为25～40℃，优选为30～40℃，更优选为35～40℃；
优选地，控制所述扩增的时间为5～15min，优选为8～15min，更优选为10～15min。
10.权利要求1～3中任一项所述的检测试剂、权利要求4或5所述的冻干微球或权利要求6～7中任一项所述的检测试剂盒在鉴别松材线虫或制备鉴别松材线虫的产品中的应用。
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