CN117660666A - 检测松材线虫的特异性引物探针组、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及核酸检测技术领域，具体涉及检测松材线虫的特异性引物探针组、试剂盒及其应用。本发明提供检测松材线虫的特异性引物探针组，所述引物探针组包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑2所示的特异性引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的探针。该引物探针组能够特异性扩增松材线虫DNA，对于拟松材线虫等近缘种则无法扩增，具有较高的特异性，同时，在检测松材线虫时具有较高的灵敏度。本发明提供的松材线虫的RAA‑LFA检测方法可对木屑等样品中的松材线虫进行快速、准确的检测，不仅特异性高、灵敏度高，而且操作简单，结果直观，为松材线虫病的现场检测和早期诊断提供了有效的技术手段。
Description
技术领域
本发明涉及核酸检测技术领域，尤其涉及检测松材线虫的特异性引物探针组、试剂盒及其应用。
背景技术
由松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）引起的松材线虫病（Pine wiltdisease, PWD）是一种对东亚和西欧的松林而言最具毁灭性灾害的病害。这种松树上的“癌症”为林业生产和经济发展都带来了严重的影响，并且当发现松树表现出较为明显的感病症状再采取防治方法时，已经很难挽回病害所造成的损失。
松材线虫的种类鉴定和检测方法主要包括传统的形态学鉴定和以PCR为基础的分子检测方法。由于松材线虫和拟松材线虫二者在形态学上的特征非常相似，仅能通过雌成虫形态上的差别进行区分，因此通过单一的形态学特征很难准确鉴定，并且该方法耗时、费力，需要专业的技能和丰富的线虫形态学鉴定经验，难以达到快速诊断和检测的目的。虽然PCR检测方法在一定程度上克服了形态学鉴定上的缺陷，但是需要昂贵的仪器设备，检测过程复杂，时间较长，不利于现场快速检测及基层普及应用。
重组酶介导等温核酸扩增技术（Recombinase Aided Amplification, RAA）是一种新型体外恒温核酸扩增技术，该技术依赖于一对30-35bp长度的引物和三种酶（重组酶、单链结合蛋白和链置换聚合酶），在37~42℃恒温条件下反应5~40min，即可快速完成核酸的大量扩增。RAA扩增产物结合侧流层析试纸条（Lateral flow dipstick assay, LFA）技术可以在40min内完成可视化检测。由于RAA检测不需要专业的仪器设备，在普通的水浴锅或者简单的恒温设备中都可完成，具有操作简单、快速、特异性强、灵敏度高、检测方便等优点，已广泛应用于真菌、细菌、病毒等方面的快速检测。然而，目前尚无高灵敏度实现松材线虫的特异性检测的RAA-LFA方法。
发明内容
本发明提供一种检测松材线虫的特异性引物探针组、试剂盒及其应用。
具体地，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供检测松材线虫的特异性引物探针组，所述引物探针组包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的特异性引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的探针。
上述特异性引物对中，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的引物为正向引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的引物为反向引物。
上述特异性引物探针组为基于RAA技术的引物探针组。
在本发明的一些实施方式中，所述特异性引物探针组为基于RAA-LFA技术的引物探针组。
本发明以松材线虫DNA为模板，设计了多对RAA引物进行扩增，经比较筛选后得到扩增效率最优的松材线虫RAA检测引物（核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示），该引物对具有较高的特异性和灵敏度。
优选地，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的引物的5’端包含生物素（biotin）修饰。
优选地，所述探针为nfo探针，其5’端包含荧光基团修饰，3’端包含用于阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团，探针的内部包含dSpacer修饰。
nfo探针的结合位置位于正向引物和反向引物之间，在5’端标记荧光基团，中部标记有dSpacer位点，在3’端标记扩增位阻基团。当dSpacer位点两侧碱基与目标模板配对时，nfo酶被激活从而切割dSpacer位点，扩增位阻基团从探针上被切除，最后形成的扩增产物5’端连接荧光基团，3’端连接生物素。
本发明中若无特殊说明，5’端是指5’末端，3’端是指3’末端。
对于荧光基团的选择，本发明没有特殊限制。
以上所述的荧光基团可选自FAM、HEX、Texas Red、CY5、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX、LC RED640、LC RED705中的任一种。
在本发明的一些实施方式中，所述荧光基团为FAM。
以上所述的用于阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团优选为C3 Spacer。
优选地，将距探针5’端的第31个碱基用dSpacer替换。
以上所述的引物探针组能够高效区分松材线虫与拟松材线虫等非松材线虫，具有较高的特异性，同时，在检测松材线虫时具有较高的灵敏度。
第二方面，本发明提供一种松材线虫的检测试剂盒，所述试剂盒包含以上所述的特异性引物探针组。
为便于检测，除包含以上所述的特异性引物探针组外，所述试剂盒还包含选自RAA缓冲液（buffer）、RAA扩增反应干粉、醋酸镁、通用核酸检测试纸条中的一种或多种。
优选地，所述RAA扩增反应干粉包含重组酶、单链结合蛋白和链置换聚合酶。
优选地，所述通用核酸检测试纸条为胶体金试纸条。
所述胶体金试纸条在结合垫上预埋抗荧光素抗体并与胶体金相连；在检测线上预埋链霉亲和素（与生物素特异性结合）；在质控线上预埋二抗，该二抗与抗荧光素抗体特异性结合。当扩增产物添加到样品垫后，向结合垫移动，到达检测线时，生物素与链霉亲和素结合，使检测线显示为红色，当样品到达质控线时，与胶体金相连的抗荧光素抗体与二抗结合，使质控线显示为红色；当质控线显示为红色时表示检测结果可信，质控线不显示红色则为无效结果。
第三方面，本发明提供以上所述的特异性引物探针组或所述检测试剂盒在检测松材线虫或制备松材线虫的检测试剂或试剂盒中的应用。
优选地，所述应用中，检测松材线虫为检测木屑样品或线虫样品中是否含有松材线虫。
第四方面，本发明提供一种松材线虫的RAA-LFA检测方法，所述方法包括：以待检测样品的DNA为模板，使用以上所述的特异性引物探针组或所述检测试剂盒进行扩增反应，得到扩增产物。
优选地，所述扩增反应包括在37℃-40℃条件下反应15-30min。
进一步优选地，所述扩增反应包括在37℃-39℃（更优选为37℃）条件下反应15-30min（更优选为20-30min）。
优选地，所述扩增反应的体系为20-50μL。
以上所述的方法还包括：采用通用核酸检测试纸条对所述扩增产物进行检测，根据检测结果判断所述待检测样品中是否含有松材线虫。
优选地，所述待检测样品为线虫样品或木屑样品。
以上所述的检测方法仅需要使用恒温水浴在短时间内即可完成检测，通过肉眼观察即可准确、高效、简单地判定样品中是否含有松材线虫。
在本发明的一些实施方式中，所述松材线虫的RAA-LFA检测方法包括如下步骤：
（1）提取待检测样品的DNA；
（2）以提取的样品DNA为模板，使用所述特异性引物探针组建立RAA扩增体系并进行扩增反应，得到扩增产物；
（3）将扩增产物用试纸条缓冲液稀释后，将试纸条结合垫端插入到装有稀释的扩增产物的反应管中，液面不超过结合垫最上端，待判读区全部浸润（约1-2min），待质控线（C线）显色后，取出试纸条，直接读取检测结果；
当检测线与质控线均显示红色时，表明待检测样品中含有松材线虫；当检测线不显示红色，质控线显示红色时，表明待检测样品中不含有松材线虫；当质控线不显示红色时，检测结果无效。
本发明的有益效果至少包括：本发明提供了基于RAA技术的检测松材线虫的特异性引物探针组，该引物探针组能够特异性扩增松材线虫DNA，对于拟松材线虫等近缘种则无法扩增，能够区分松材线虫与其近缘种（拟松材线虫等），具有较高的特异性，同时，在检测松材线虫时具有较高的灵敏度。
本发明基于上述引物探针组进一步建立了一种松材线虫的RAA-LFA检测方法，该方法能够对木屑等样品中的松材线虫进行快速、准确的检测，不仅特异性高、灵敏度高，而且操作简单，结果直观，为松材线虫病的现场检测和早期诊断提供了有效的技术手段。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中松材线虫RAA检测引物的筛选结果，其中，Bx代表松材线虫DNA为模板，Bm代表拟松材线虫DNA为模板。
图2为本发明实施例1中松材线虫RAA-LFA检测的特异性检测结果，其中，N代表阴性对照，Bx代表松材线虫DNA为模板，Bm代表拟松材线虫DNA为模板。
图3为本发明实施例2中松材线虫RAA-LFA检测的扩增时间筛选结果，其中，15、20、25、30分别代表扩增时间为15min、20min、25min、30min，N代表阴性对照。
图4为本发明实施例3中松材线虫RAA-LFA检测的灵敏度检测结果，其中，N代表阴性对照，1ng等代表作为模板的松材线虫DNA的质量。
图5为本发明实施例4中木屑样本中松材线虫的RAA-LFA检测结果，其中，P代表阳性对照，N代表阴性对照，1-6分别为编号1-6的木屑样品。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 松材线虫的RAA-LFA检测引物和探针的筛选
1、设计松材线虫的RAA-LFA检测引物和探针
针对松材线虫5S rDNA基因设计RAA引物和探针，将通过筛选得到的反向引物5’端进行生物素化修饰；并以筛选得到的引物为基础设计探针，探针序列中5’端由羧基荧光素FAM修饰，相关G碱基被dSpacer残基取代，3’端由C3 Spacer修饰。
作为示例，表1中列举了筛选过程中涉及的3条正向引物（Bx-RAA-F）、3条反向引物（Bx-RAA-R）和1条探针（Bx-RAA-Probe）。
表1
2、松材线虫RAA-LFA检测引物的筛选
利用RAA扩增技术，以松材线虫5S rDNA质粒为模板，将表1中的3条正向引物和3条反向引物两两组合进行扩增，通过比较筛选扩增效率最优的引物，扩增体系如表2所示。
表2
RAA扩增使用的试剂盒为B00000试剂盒（江苏奇天基因RAA核酸扩增试剂盒），具体操作步骤如下：
（1）按照上述反应体系（表2中的50μL反应体积是1个反应所需的试剂的用量）配制所需样品数混合物，混匀后分装到含有RAA干粉试剂的管中，在每管管盖上加入5μL醋酸镁，然后向每个反应管中加入2μL模板，盖好管盖，轻弹混匀后离心；
（2）37℃水浴加热30min；
（3）扩增产物经过氯仿纯化后，进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果进行判读。
反应结果通过琼脂糖凝胶电泳后的结果来判定（图1），其中Bx-RAA-F1/Bx-RAA-R3引物对的扩增效率最高。
3、松材线虫的RAA-LFA检测探针的筛选
以松材线虫5S rDNA质粒为模板，拟松材线虫5S rDNA质粒为对照；将上述筛选得到的扩增效率最高的引物对Bx-RAA-F1/Bx-RAA-R3进行修饰，即在Bx-RAA-R3的5’端连接生物素；在探针Bx-RAA-Probe中，5’端连接荧光基团FAM，3’端连接扩增位阻基团C3 Spacer，将距探针5’端的第31个碱基（胞嘧啶）用dSpacer替换（如表1所示，用下划线标识）。利用标记后的引物对Bx-RAA-F1/Bx-RAA-R3和探针Bx-RAA-Probe进行RAA-LFA检测，扩增体系如表3所示。
表3
RAA扩增使用的试剂盒为T00001试剂盒（江苏奇天基因RAA核酸扩增试剂盒），具体操作步骤如下：
（1）按照上述反应体系配制所需样品数混合物，混匀后分装到含有RAA干粉试剂的管中，在每管管盖上加入5μL醋酸镁，然后向每个反应管中加入2μL模板，盖好管盖，轻弹混匀后离心；
（2）37℃水浴加热30min；
（3）将扩增产物用试纸条缓冲液稀释后，将试纸条结合垫端插入到装有稀释的扩增产物的反应管中，液面不超过结合垫最上端，待判读区全部浸润（约1-2min），待质控线（C线）显色后，取出试纸条，直接读取检测结果。
检测结果如图2所示，引物对Bx-RAA-F1/Bx-RAA-R3和探针Bx-RAA-Probe所组成的引物探针组仅在含松材线虫样本的试纸条上同时出现质控线和检测线，含拟松材线虫样本的试纸条仅出现质控线，表明松材线虫的RAA-LFA检测引物探针组的特异性良好，可以明显区分松材线虫与其近缘种拟松材线虫。
实施例2 RAA-LFA检测松材线虫的扩增条件优化
为了更加快速地检测样品中是否含松材线虫，缩短检测时间，以松材线虫5S rDNA质粒（1ng/μL）作为模板，进行扩增时间梯度筛选。
RAA扩增使用的试剂盒为T00001试剂盒，具体操作步骤如实施例1中所示。
RAA扩增时间分别为15min、20min、25min、30min，阴性对照为无模板样品。
根据图3的扩增时间测试结果可知，当RAA扩增时间为15min时，即可检测到1ng/μL的松材线虫DNA。
实施例3 RAA-LFA检测松材线虫的灵敏度分析
将提取的松材线虫DNA用无菌水稀释至1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL，以上述稀释的松材线虫DNA作为模板，进行灵敏度效果检测。
RAA扩增使用的试剂盒为T00001试剂盒，具体操作步骤如实施例1中所示。
RAA扩增时间分别为15min、20min，阴性对照为无模板样品。
根据图4的不同时间的灵敏度测试结果可知，当RAA扩增时间为15min时，可检测到1pg的松材线虫DNA；当RAA扩增时间为20min时，可检测到10fg的松材线虫DNA。
实施例4 利用RAA-LFA检测木屑样品中的松材线虫
使用实施例1中筛选得到的松材线虫特异性RAA-LFA引物探针组（引物对Bx-RAA-F1/Bx-RAA-R3和探针Bx-RAA-Probe）对感染松材线虫病的松木木屑样品进行检测，具体操作步骤如下：
1、对收集的木屑样本进行DNA提取；
2、RAA扩增使用的试剂盒为T00001试剂盒，按照实施例1的3中所述步骤依次进行，其中，RAA-LFA检测所用到的引物探针组为Bx-RAA-F1/Bx-RAA-R3和Bx-RAA-Probe；阳性对照为松材线虫5S rDNA质粒，阴性对照为无模板样品；
3、37℃水浴加热20min；
4、将扩增产物用试纸条缓冲液稀释后，将试纸条结合垫端插入到装有稀释的扩增产物的反应管中，待判读区全部浸润（约1-2min），待质控线（C线）显色后，取出试纸条，直接读取检测结果。
检测结果如图5所示。编号1-6的木屑样品对应的检测线和质控线均显示红色，表示检测结果为阳性；阳性对照显示出检测线和质控线，表示阳性结果的准确性，阴性对照仅出现质控线，表示结果为阴性。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.检测松材线虫的特异性引物探针组，其特征在于，所述引物探针组包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的特异性引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的探针。
2.根据权利要求1所述的特异性引物探针组，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的引物的5’端包含生物素修饰。
3.根据权利要求1或2所述的特异性引物探针组，其特征在于，所述探针为nfo探针，其5’端包含荧光基团修饰，3’端包含用于阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团，探针的内部包含dSpacer修饰。
4.根据权利要求3所述的特异性引物探针组，其特征在于，所述荧光基团为选自FAM、HEX、Texas Red、CY5、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX、LC RED640、LC RED705中的任一种；
和/或，所述用于阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团为C3 Spacer；
和/或，将距探针5’端的第31个碱基用dSpacer替换。
5.一种松材线虫的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1~4任一项所述的特异性引物探针组。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含选自RAA缓冲液、RAA扩增反应干粉、醋酸镁、通用核酸检测试纸条中的一种或多种。
7.权利要求1~4任一项所述的特异性引物探针组或权利要求5或6所述的检测试剂盒在检测松材线虫或制备松材线虫的检测试剂或试剂盒中的应用。
8.一种松材线虫的RAA-LFA检测方法，其特征在于，所述方法包括：以待检测样品的DNA为模板，使用权利要求1~4任一项所述的特异性引物探针组或权利要求5或6所述的检测试剂盒进行扩增反应，得到扩增产物。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述扩增反应包括在37℃-40℃条件下反应15-30min。
10.根据权利要求8或9所述的检测方法，其特征在于，所述方法还包括：采用通用核酸检测试纸条对所述扩增产物进行检测，根据检测结果判断所述待检测样品中是否含有松材线虫。
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