CN111321239B - 一种用于检测根串珠霉菌的lamp引物组及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测根串珠霉菌的LAMP引物组及检测方法,该LAMP引物组包括一对内引物和一对外引物。本发明还公开了一种利用该引物组检测根串珠霉菌的检测方法。以本发明所设计的引物采用LAMP方法检测根串珠霉菌,不仅易于操作,对设备的要求低,而且具有良好的特异性、灵敏度,能快速、方便、高效的检测根串珠霉菌,能满足对根串珠霉菌快速准确检测的需要。
Description
技术领域
本发明属于植物保护领域,涉及常温扩增技术在农业部门病菌检测方面的应用,具体涉及一种用于检测根串珠霉菌的LAMP引物组及检测方法。
背景技术
由根串珠霉菌(Thielaviopsis basicola(Berk.et Br.)Ferr.)引起的烟草根黑腐病是危害烟草根部的主要病害之一。该病害在全球范围内都有分布,20世纪60年代主要发生在河南、山东、安徽、云南等地,70年代以后随着烟区的扩大,病害逐渐蔓延,近年来该病害在我国危害逐渐加重,其不仅影响了烟草的品质而且造成了严重减产。同时该病害在田间常与烟草黑胫病和其他根部病害混合发生,加重了其危害,也为病害的早期识别和诊断带来了困难,从而错过了最佳的防控时间和正确的防控措施。传统的植物病害检测方法因检测周期长、操作复杂、灵敏度低,且需要昂贵的仪器设备,难以快速、准确地做出鉴定。因此建立快速、简便、准确的检测方法,可对病害的早期诊断和及时防控提供科学依据。
根串珠霉菌的检测方法包括光学显微镜下观察菌丝、分生孢子梗、分生孢子、厚垣孢子的形态特征及测量其大小;基于ITS序列设计特异性引物的常规PCR检测、以β-微管蛋白为靶基因设计特异性引物的常规PCR、实时荧光定量PCR以及双重PCR测定。上述测定方法中,光学显微镜镜检结果相对不准确,PCR检测需要PCR仪昂贵的仪器、耗时,且在鉴定过程中还需要使用大量有毒、有害化学试剂,对实验操作人员的健康有一定的威胁。环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)的出现弥补了这一缺陷,其原理是针对靶序列6个区域设计4条引物,利用链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase),恒温条件下准确高效扩增靶序列。LAMP较普通的PCR有特异性强、灵敏度高,成本低、时间短、结果可视化等优点,已经应用于细菌、真菌、病毒及寄生虫等多种致病微生物的检测。目前,LAMP检测技术已经用于烟草多种病害的检测中,其中包括青枯菌、烟草环斑病毒等,但是没有烟草根黑腐病菌LAMP检测体系的相关报道。
发明内容
本发明提供一种用于检测根串珠霉菌的LAMP引物组及检测方法,旨在应用LAMP法将恒温扩增技术运用于根串珠霉菌的快速检测,以期获得一种特异性好、灵敏度高、检测仪器简单且便于基层推广使用的根串珠霉菌检测技术。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下:一种用于检测根串珠霉菌的LAMP引物组,其包括一对外引物F3/B3和一对内引物FIP/BIP,其DNA序列依次为:SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4,具体如下:
F3(SEQ ID NO.1):5’-GGCCAGCATCAGTTTGTTGT-3’
B3(SEQ ID NO.2):5’-CACCCAAACACTCGCACAT-3’
FIP(SEQ ID NO.3):
5’-GGTCCTCAGTCTGCCGAAAGGCAGGGAGAAAGGCTTAGGGA-3’
BIP(SEQ ID NO.4):
5’-GCAAGGATGCTGGCGTAATGGTAGGTTGACTCCTTGGTCCG-3’
本发明还提供了一种利用上述引物组检测根串珠霉菌的检测方法,其包括如下步骤:
1)DNA模板提取:从待测样品中提取DNA作为DNA模板;
2)LAMP扩增:利用权利要求1的引物组对1)中的DNA模板进行LAMP扩增;
3)检测:根据扩增结果判断待测样品中是否含有根串珠霉菌。
在上述检测方法的基础上,本发明还具有如下进一步的具体选择:
具体的,步骤2)中进行LAMP扩增的扩增体系为25μL反应体系,包括10×ThermopolBuffer 2.5μL;浓度为100mM的MgSO4 1μL;浓度为10mM的dNTP Mixture 1.5μL;F3、B3、FIP和BIP各1μL;Bst DNA聚合酶0.25μL;步骤1)中获得的DNA模板1μL;无菌双蒸水11.75μL;其中F3和B3的浓度为5μM、FIP和BIP的浓度为40μM。
具体的,步骤2)进行LAMP扩增的反应条件为:将配制好反应体系的PCR管置于62℃水浴锅恒温反应60min;然后80℃,20min终止反应。
具体的,步骤3)中采用电泳法对扩增结果进行检测判断,若产生特异梯状条带且加入SYBR Green I后显绿色,则待测样品中含有根串珠霉菌;若未产生特异梯状条带且加入SYBR Green I后显橘黄色,则待测样品中不含有根串珠霉菌。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
检测时间短,效率更高,灵敏度更高,检测仪器简单,只需要简单的水浴锅,无需昂贵的PCR仪,降低了实验室投入,适合农业部门基层实验室的推广。
附图说明
图1为本发明实施例2中特异性验证的结果(其中M为DL 2000DNA Marker,1-8为根串珠霉菌,9为烟草茎点霉菌,10为烟草拟盘多毛孢,11为烟草白星病菌,12为烟草碎叶病菌,13为烟草赤星病菌,14为腐霉菌,15为根霉菌,16为毛霉菌,17为意大利青霉菌,18为黄曲霉菌,19为烟草炭疽病菌,20为灰霉病菌,21为去离子水高温高压灭菌后作对照,图中上部的PCR管是相应样品中加入SYBR Green I后显色情况,下部的为电泳结果);
图2为本发明实施例3中灵敏度验证时对应常规PCR法的结果(1-9为10倍稀释梯度浓度,依次为162ng/μL,16.2ng/μL,1.62ng/μL,162pg/μL,16.2pg/μL,1.62pg/μL,162fg/μL,16.2fg/μL,1.62fg/μL,10为阴性对照);
图3为本发明实施例3中灵敏度验证时对应本发明检测方法的结果(1-9为10倍稀释梯度浓度,依次为162ng/μL,16.2ng/μL,1.62ng/μL,162pg/μL,16.2pg/μL,1.62pg/μL,162fg/μL,16.2fg/μL,1.62fg/μL,10为阴性对照);
图4为本发明实施例4中实际样品的检测结果(图4A为选取的六株烟草植株的实物图,其中1-3为根部感染根串珠霉菌的植株,4-6为根部健康的植株,图4B为根部感染根串珠霉菌的植株1的根部显微切片,图4C为以本发明的检测方法进行根串珠霉菌检测的结果,图4C上部加入SYBR Green I后显色情况,下部的为电泳结果)。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明作进一步的详细描述,所举实例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。
为免赘述,以下实施例中用到的方法若无特别说明则均为常规方法,用到的药品若无特别说明,则均为市售产品。
实施例1
引物的设计与合成
以Gene Bank中得到的28srDNA-ITS序列(GenBank:MF948659.1)的部分基因序列为靶基因,根据引物设计规则,多方面考虑后设计一批引物,合成并从中筛选出扩增速率最高、特异性好的一组LAMP引物,其序列分别为:
F3:5’-GGCCAGCATCAGTTTGTTGT-3’
B3:5’-CACCCAAACACTCGCACAT-3’
FIP:5’-GGTCCTCAGTCTGCCGAAAGGCAGGGAGAAAGGCTTAGGGA-3’
BIP:5’-GCAAGGATGCTGGCGTAATGGTAGGTTGACTCCTTGGTCCG-3’
实施例2
特异性验证
采用液氮研磨真菌细胞壁的方法,按照核酸提取试剂盒说明书步骤提取各供试样品的DNA(用真菌DNA小量提取试剂盒),作为DNA模板;
供试样品如下:1-8为根串珠霉菌,9为烟草茎点霉菌,10为烟草拟盘多毛孢,11为烟草白星病菌,12为烟草碎叶病菌,13为烟草赤星病菌,14为腐霉菌,15为根霉菌,16为毛霉菌,17为意大利青霉菌,18为黄曲霉菌,19为烟草炭疽病菌,20为灰霉病菌,21为双蒸水作对照。
制作DNA模板后,利用实施例1的引物组在LAMP扩增体系中对DNA模板进行扩增,LAMP扩增体系如下表所示:
将各配制好反应体系的PCR管(0.2mL)置于62℃水浴锅恒温反应60min;然后80℃,20min终止反应。
利用电泳对各PCR管的LAMP扩增产物进行检测并向各PCR管中加入SYBR Green I以观察颜色,若产生特异梯状条带且加入SYBR Green I后显绿色,则待测样品中含有根串珠霉菌;若未产生特异梯状条带且加入SYBR Green I后显橘黄色,则待测样品中不含有根串珠霉菌,具体结果如图1所示。
由图1可知,1-8对应的PCR管有特异梯状条带且加入SYBR Green I后显嫩绿色,其余无特异北状条带且加入SYBR Green I后显橘黄色,表明本发明提供的LAMP引物组对根串珠霉菌特异性好。
实施例3
灵敏度验证
以10倍稀释梯度浓度配制根串珠霉菌DNA供测样品,标号1至9依次为162ng/μL,16.2ng/μL,1.62ng/μL,162pg/μL,16.2pg/μL,1.62pg/μL,162fg/μL,16.2fg/μL,1.62fg/μL,标号10为阴性对照(双蒸水)。
对上述10个样品进行检测,利用常规PCR法检测的结果如图2所示,基本可检出前5个样品,利用本发明提供的方法进行检测的结果如图3所示,可检出前7个样品,显然本发明提供的方法灵敏度更高。
实施例4
实物检测
选取三株根部已感染根串珠霉菌的烟草植株,标号为1-3,同时另选取三株根部健康的烟草植株,标号为4-6,六株植株如图4A所示,其中感染的根部显微切片如图4B所示,取1-6号植珠的根部组织,利用植物提取核酸试剂盒,提取DNA作为模板,然后利用本发明提供的方法进行检测,结果如图4C所示。从图4可知,本发明提供的检测方法,实际检测结果准确无误(前三株有特异梯状条带且加入SYBR Green I后显嫩绿色,后三株无特异梯状条带且加入SYBR Green I后显橘黄色)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 西南大学
重庆海关技术中心
<120> 一种用于检测根串珠霉菌的LAMP引物组及检测方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggccagcatc agtttgttgt 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cacccaaaca ctcgcacat 19
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtcctcagt ctgccgaaag gcagggagaa aggcttaggg a 41
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcaaggatgc tggcgtaatg gtaggttgac tccttggtcc g 41
Claims (5)
1.一种用于检测根串珠霉菌的LAMP引物组,其特征在于,包括一对外引物F3/B3和一对内引物FIP/BIP,其DNA序列依次为:SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4。
2.一种用于检测根串珠霉菌的检测方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)DNA模板提取:从待测样品中提取DNA作为DNA模板;
2)LAMP扩增:利用权利要求1的引物组对1)中的DNA模板进行LAMP扩增;
3)检测:根据扩增结果判断待测样品中是否含有根串珠霉菌。
3.根据权利要求2所述的一种用于检测根串珠霉菌的检测方法,其特征在于,步骤2)中进行LAMP扩增的扩增体系为25μL反应体系,包括10×Thermopol Buffer 2.5µL ;浓度为100mM的MgSO4 1µL; 浓度为10mM的dNTP Mixture 1.5µL;F3、B3、FIP和BIP各1μL;Bst DNA聚合酶0.25μL;步骤1)中获得的DNA 模板1μL;无菌双蒸水 11.75μL;其中F3和B3的浓度为5μM 、FIP和BIP的浓度为40μM。
4.根据权利要求2所述的一种用于检测根串珠霉菌的检测方法,其特征在于,步骤2)进行LAMP扩增的反应条件为:将配制好反应体系的PCR管置于62℃水浴锅恒温反应60min;然后80℃,20min终止反应。
5.根据权利要求2至4任一项所述的一种用于检测根串珠霉菌的检测方法,其特征在于,步骤3)中采用电泳法对扩增结果进行检测判断,若产生梯状条带且加入SYBR Green I后显绿色,则待测样品中含有根串珠霉菌;若未产生梯状条带且加入SYBR Green I后显橘黄色,则待测样品中不含有根串珠霉菌。
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Detection of Thielaviopsis basicola in soil with real-time quantitative PCR assays;Huang,J.L.等;《Microbiological Research》;20101231;411-417 * |
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