CN108728579B - 一种采用植物微组织直接rt-pcr检测多种植物病毒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种采用植物微组织直接RT‑PCR检测多种植物病毒的方法，依次包括以下步骤：(1)模板RNA提取和逆转录：在实体显微镜下，用无菌注射器针刺入待检植物组织样品的某一部位(茎、叶柄或根)，并停留2‑3秒，然后将带有植物微组织的无菌注射器针尖直接浸入逆转录混合物中进行反应，以便进行逆转录，得到cDNA；(2)PCR反应：将步骤(1)得到的cDNA进行PCR反应，得到反应产物；(3)结果判断：将步骤(2)所得的反应产物进行电泳分析，得到检测结果；本发明方法不需要单独步骤来分离提取待检测样品的RNA，能在较短的时间内制备用于PCR反应的RNA模板，方便快捷，且不需要仪器设备；广谱性高，可检测多种植物病毒，大大提高植物病毒检测的效率和准确性。
Description
技术领域
本发明涉及植物病毒检测技术领域，尤其涉及一种采用植物微组织直接逆转录聚合酶链反应快速检测多种植物病毒的方法。
背景技术
为了防止植物病毒在国家和地区之间的移动，控制植物病毒性疾病，植物病毒检测在检疫检查中是必要的。长期以来，人们一直致力于开发简单有效的植物病毒检测方法，包括酶联免疫吸附试验(ELISA)，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)(James et al.,2006)、real-time RT-PCR(Mirmajless et al.,2015)和逆转录环介导等温扩增(RT-loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP，Lu et al.,2018)，微阵列(Liu et al.,2017)和下一代测序(Jones et al.,2017)。其中，由于其灵敏度高且操作较简便，RT-PCR的方法已广泛应用于病毒检测(James et al.,2006；Jan et al.,2011)。
现有的RT-PCR检测植物病毒的过程中，RNA模板的制备需要RNA的分离和纯化。RNA的分离是一项技术性强、耗时长的工作，需要一定量的植物材料和离心步骤。RNA提取后，必须对RNA提取液进行纯化，以获得高质量的RNA。在这些步骤中，操作人员的技术错误可能导致RNA污染或降解，从而导致错误的检测结果(James et al.,2006；Jan et al.,2011)。即目前的RT-PCR检测植物病毒存在模板RNA制备较困难、检测速度较慢、检测效率较低、准确度较差、成本高等缺点。
发明内容
本发明的目的就在于提供一种采用植物微组织直接逆转录聚合酶链反应快速检测多种植物病毒的方法，以解决上述问题。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是这样的：一种采用植物微组织直接RT-PCR检测多种植物病毒的方法，依次包括以下步骤：
(1)模板RNA的制备和逆转录：在实体显微镜下，用无菌注射器针刺入待检植物组织样品的某一部位，并停留2-3秒，然后将带有植物微组织的无菌注射器针尖直接浸入逆转录混合物中进行反应，以便进行逆转录，得到cDNA；
(2)PCR反应：将步骤(1)得到的cDNA进行PCR反应，得到反应产物；
(3)结果判断：将步骤(2)所得的反应产物进行电泳分析，得到检测结果。
本申请的发明人通过大量实验发现，采用无菌注射器针取样所粘附的植物汁液中含有微量植物病毒RNA，这些植物病毒RNA在RT反应液即逆转录反应液中被逆转录酶通过随机引物逆转录为cDNA(这时的cDNA有植物病毒的，也有植物组织的)，然后在PCR反应液中加入针对待检测植物病毒靶基因序列的引物，在该对引物的引导下，DNA聚合酶只扩增植物病毒RNA靶基因序列，从而可以排除样品中其他DNA和蛋白等的干扰，即可以免去RNA样本的分离提取步骤，也能消除DNA等对于RT-PCR的影响，从而大大提高检测效率和准确性。
本申请的方法，又称为植物微组织直接逆转录聚合酶链反应(microtissuedirect reverse transcription-polymerase chain reaction)，即MD RT-PCR法。
作为优选的技术方案：步骤(1)所述待检植物组织样品为已鉴定为含有葡萄卷叶病毒3(即GLRaV-3)或苹果茎沟病毒(即ASGV)或马铃薯卷叶病毒(即PLRV)或黄瓜花叶病毒(即CMV)其中一种的样品。
作为优选的技术方案：步骤(1)所述的某一部位为茎、叶柄或根。即植物的茎、叶柄和根均可作为本方法合适的取样检测器官。
作为优选的技术方案：步骤(1)所述无菌注射器针大小为26G、25G或23G。
作为进一步优选的技术方案：步骤(1)所述无菌注射器针最适大小为26G。
实验显示，用25G和23G无菌注射器针提取样品组织直接RT-PCR反应的灵敏度分别为50％和25％,而用26G无菌注射器针提取样品组织直接RT-PCR反应的灵敏度最高，为100％
作为优选的技术方案：步骤(1)所述逆转录混合物包含5μL 5X TRUE RTMasterMix和20μL RNase-free ddH20。
作为优选的技术方案：步骤(1)所述在逆转录混合物中进行反应的调节为室温中反应15分钟。
作为优选的技术方案：步骤(2)所述PCR反应方法为：在25μL PCR管配制反应体系，0.5μM引物混合液2μL，2x Taq DNA polymerase Mix 12.5μL，模板cDNA 2μL，RNase-freeddH20补齐到25μL。
作为进一步优选的技术方案：步骤(2)中：
葡萄卷叶病毒3检测的PCR反应程序:94℃保持30s,52℃保持30s,72℃保持60s，最后的扩增步骤是72℃保持7min,重复这样的循环35次，然后在4℃冷藏；
苹果茎沟病毒检测的PCR反应程序:94℃保持30s,54℃保持45s,72℃保持60s，最后的扩增步骤是72℃保持5min,重复这样的循环35次，然后在4℃冷藏；
马铃薯卷叶病毒检测的PCR反应程序:94℃保持30s,50℃保持30s，72℃保持30s，最后的扩增步骤是72℃保持10min,重复这样的循环35次，然后在4℃冷藏；
黄瓜花叶病毒检测的PCR反应程序:94℃保持15s,54℃保持30s,72℃保持30s，最后的扩增步骤是72℃保持5min,重复这样的循环30次，然后在4℃冷藏。
作为优选的技术方案：步骤(3)中，所述电泳分析为2％琼脂糖凝胶电泳分析。
与目前现有技术相比，本发明的优点在于：本发明方法不需要对待检测样品的RNA进行分离提取，能在较短的时间内制备用于PCR反应的RNA模板，节约了时间(至少2个小时)和成本(分离提取RNA的试剂和耗材费用)，操作方便快捷；广谱性高，适用于多种植物病毒检测，大大提高植物病毒检测的效率和准确性。
附图说明
图1为采用3种不同规格的无菌注射器针(26G、25G和23G)对葡萄“赤霞珠”试管苗取样后采用本发明的MD RT-PCR法进行检测的电泳图；
图2为分别对葡萄“赤霞珠”试管苗的茎、叶柄和根进行取样后采用本发明的MDRT-PCR法进行检测的电泳图；
图3为分别采用本发明的MD RT-PCR法与传统的RT-PCR法对葡萄“赤霞珠”试管苗中的GLRaV-3进行检测的电泳图；
图4为分别采用本发明的MD RT-PCR法与传统的RT-PCR法对苹果“Gala”试管苗中的ASGV进行检测的电泳图。
图5为分别采用本发明的MD RT-PCR法与传统的RT-PCR法对马铃薯“紫花白”试管苗中的PLRV进行检测的电泳图；
图6为分别采用本发明的MD RT-PCR法与传统的RT-PCR法对东方百合“西伯利亚”试管苗中的CMV进行检测的电泳图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明作进一步说明。
实施例1：
Microtissue direct RT-PCR反应体系的准备：
(1)RT反应液：TRUE RT MasterMix(北京艾德莱生物科技有限公司)；
(2)PCR反应液：Taq DNA polymerase Mix(北京艾德莱生物科技有限公司)；
(3)四个植物病毒检测时PCR反应的引物对分别为：
(4)电泳液：Tris-acetate(TAE)buffer(40mM Tris-acetate,1mM E DTA,pH8.0)。
用上述反应体系按以下方法对感染植物病毒的植株与健康植株进行鉴定，步骤为：
1、模板RNA制备：
1)在实体显微镜下，分别用一种大小(26G、25G、23G)的无菌注射器针刺入待检植物组织样品的某一部位(茎、叶柄或根)，并停留2-3秒；
2)将带有植物微组织的针尖直接浸入25μL逆转录(RT)混合物(包含5μL
5X TRUE RT MasterMix和20μL RNase-free ddH20)中；
2、PCR反应：在25μL PCR管配制反应体系：0.5μM引物混合液2μL，2x Taq DNApolymerase Mix(北京艾德莱生物科技有限公司)12.5μL，模板cDNA 2μL，RNase-freeddH20补齐到25μL。
葡萄卷叶病毒3检测的PCR反应程序:94℃保持30s,52℃保持30s,72℃保持60s，最后的扩增步骤是72℃保持7min,重复这样的循环35次，然后在4℃冷藏；
苹果茎沟病毒检测的PCR反应程序:94℃保持30s,54℃保持45s,72℃保持60s，最后的扩增步骤是72℃保持5min,重复这样的循环35次，然后在4℃冷藏；
马铃薯卷叶病毒检测的PCR反应程序:94℃保持30s,50℃保持30s，72℃保持30s，最后的扩增步骤是72℃保持10min,重复这样的循环35次，然后在4℃冷藏；
黄瓜花叶病毒检测的PCR反应程序:94℃保持15s,54℃保持30s,72℃保持30s，最后的扩增步骤是72℃保持5min,重复这样的循环30次，然后在4℃冷藏。
3、结果判断：将上述反应物用2％琼脂糖凝胶电泳分析。GLRaV-3病毒的条带大小为546bp,ASGV病毒的条带大小为524bp,PLRV病毒的条带大小为600bp，CMV病毒的条带大小为657bp。
实施例2
本实施例中，用25G和23G无菌注射器针提取样品组织直接RT-PCR反应的灵敏度分别为50％和25％,而用26G无菌注射器针提取样品组织直接RT-PCR反应的灵敏度最高，为100％，如图1所示；图1中M＝分子标记；N＝阴性对照；P＝阳性对照；泳道1-3＝感染GLRaV-3样本的RNA模板；泳道4＝健康样本的RNA模板。
实施例3
为了证明植物的茎、叶柄和根可作为MD RT-PCR检测病毒的合适器官，本实施例分别对葡萄“赤霞珠”试管苗的茎、叶柄和根进行取样，采用前述的方法进行检测，结果如图2所示，图2中，M＝分子标记；N＝阴性对照；P＝阳性对照；泳道1＝感染GLRaV-3的葡萄“赤霞珠”试管苗的茎；泳道2＝感染GLRaV-3的葡萄“赤霞珠”试管苗的叶柄；泳道3＝感染GLRaV-3的葡萄“赤霞珠”试管苗的根；泳道4＝健康的葡萄“赤霞珠”试管苗的茎。
实施例4
本实施例采用本发明的MD RT-PCR法与传统RT-PCR法检测葡萄“赤霞珠”试管苗中的GLRaV-3、苹果“Gala”试管苗中的ASGV、对马铃薯“紫花白”试管苗中的PLRV和东方百合“西伯利亚”试管苗中的CMV进行对比，其结果如图3-6所示。图3中，M＝分子标记；P＝阳性对照；N＝阴性对照；泳道1-2＝传统RT-PCR法检测结果；泳道3-4＝MD RT-PCR法检测结果。
从图3可以看出，本发明的MD RT-PCR法检测的灵敏度能满足检测要求，但是该方法直接跳过了RNA提取纯化的步骤，操作更简便，更快速，且成本更低。后面的图4-6的结果显示也是如此，本方法的灵敏度能满足检测要求。
图4中，M＝分子标记；P＝阳性对照；N＝阴性对照；泳道1-4＝传统RT-PCR法检测结果(其中泳道1-2＝感染ASGV的样本；泳道3-4＝健康的样本)；泳道5-8＝MD RT-PCR法检测结果(其中泳道5-6＝感染ASGV的样本；泳道7-8＝健康的样本)；
图5中，M＝分子标记；P＝阳性对照；N＝阴性对照；泳道1-2＝传统RT-PCR法检测感染PLRV的样本的结果；泳道3-4＝MD RT-PCR法检测感染PLRV的样本的结果；
图6中，M＝分子标记；P＝阳性对照；N＝阴性对照；泳道1-2＝传统RT-PCR法检测感染CMV的样本的结果；泳道3-4＝MD RT-PCR法检测感染CMV的样本的结果。
从图3-6可以看出，用26G无菌注射器针提取样品组织直接RT-PCR反应能有效地检测出GLRaV-3病毒感染的葡萄植株，ASGV病毒感染的苹果植株，PLRV病毒感染的马铃薯植株和CMV病毒感染的百合植株。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种采用植物微组织直接 RT-PCR 检测多种植物病毒的方法，其特征在于，依次包括以下步骤：
(1)模板 RNA 的提取和逆转录：在实体显微镜下，用无菌注射器针刺入待检植物组织样品的某一部位，并停留 2-3 秒，然后将带有植物微组织的无菌注射器针尖直接浸入逆转录混合物中进行反应，以便进行逆转录，得到 cDNA；
(2)PCR 反应：将步骤(1)得到的 cDNA 进行 PCR 反应，得到反应产物；
(3)结果判断：将步骤(2)所得的反应产物进行电泳分析，得到检测结果；
步骤(1)所述无菌注射器针最适大小为 26G；
步骤(1)所述待检植物组织样品为已鉴定为感染葡萄卷叶病毒 3 即 GLRav-3、苹果茎沟病毒即 ASGV、马铃薯卷叶病毒即 PLRV 或黄瓜花叶病毒即 CMV 其中一种的样品；
步骤(1)所述的某一部位为茎、叶柄或根。
2.根据权利要求 1 所述的采用植物微组织直接 RT-PCR 检测多种植物病毒的方法，其特征在于：步骤(1)所述逆转录混合物包含 5μL 5× TRUE RT MasterMix和 20μLRNase-free ddH2O 。
3.根据权利要求 1 所述的采用植物微组织直接 RT-PCR 检测多种植物病毒的方法，其特征在于：步骤(1)所述在逆转录混合物中进行反应的条件 为室温中反应 15 分钟。
4.根据权利要求 1 所述的采用植物微组织直接 RT-PCR 检测多种植物病毒的方法，其特征在于：步骤(2)所述 PCR 反应方法为：在 25μL PCR 管配制反应体系，0.5μM 引物混合液 2μL，2× Taq DNA polymerase Mix 12.5μL，模板cDNA 2μL，RNase-free ddH2O 补齐到 25μL。
5.根据权利要求 4 所述的采用植物微组织直接 RT-PCR 检测多种植物病毒的方法，其特征在于：步骤(2)中：
葡萄卷叶病毒 3 检测的 PCR 反应程序： 94℃保持 30s， 52℃保持 30s， 72℃保持60s，最后的扩增步骤是 72℃保持 7min， 重复这样的循环 35 次，然后在 4℃冷藏；
苹果茎沟病毒检测的 PCR 反应程序： 94℃保持 30s， 54℃保持 45s， 72℃保持60s，最后的扩增步骤是 72℃保持 5min， 重复这样的循环 35 次，然后在 4℃冷藏；
马铃薯卷叶病毒检测的 PCR 反应程序： 94℃保持 30s， 50℃保持 30s，72℃保持30s，最后的扩增步骤是 72℃保持 10min， 重复这样的循环 35 次，然后在 4℃冷藏；
黄瓜花叶病毒检测的 PCR 反应程序： 94℃保持 15s， 54℃保持 30s， 72℃保持30s，最后的扩增步骤是 72℃保持 5min， 重复这样的循环 30 次，然后在 4℃冷藏。
6.根据权利要求 1 所述的采用植物微组织直接 RT-PCR 检测多种植物病毒的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述电泳分析为 2％琼脂糖凝胶电泳分析。
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| Direct RT-PCR method for detecting two chrysanthemum viroids using minimal amounts of plant tissue;M. Hosokawa等;《Journal of Virological Methods》;20050815;第131卷;摘要，第2.2-2.3节 * |
| 微量植物组织直接ＲT-PCＲ反应检测4种植物病毒的方法建立与优化;李姣等;《四川师范大学学报(自然科学版)》;20210131;第44卷(第1期);第111-117页 * |
| 牦牛病毒性腹泻病PCR诊断方法的建立;蔡其刚等;《青海畜牧兽医杂志》;20120815(第04期);第3-5页 * |
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