CN107142334B - 桑脉带病毒的rt-lamp检测方法及其引物组、试剂盒以及应用 - Google Patents

桑脉带病毒的rt-lamp检测方法及其引物组、试剂盒以及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了桑脉带病毒的RT‑LAMP检测引物组，包括外侧引物对MVBV‑F3和MVBV‑B3、内侧引物对MVBV‑FIP和MVBV‑BIP。由此发明了桑脉带病毒的RT‑LAMP检测方法及试剂盒。本发明用于检测桑脉带病毒具有特异性强、操作简单和灵敏度高的特点，不需要专门仪器，能通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，无需电泳和紫外观察等步骤，适用于桑苗繁育和田间桑树上MVBV的检测，不仅可应用于桑脉带病毒病的早期诊断、流行学等研究，而且适合于在基层单位开展MVBV检测。

Description

桑脉带病毒的RT-LAMP检测方法及其引物组、试剂盒以及应用
技术领域
本发明属于桑脉带病毒检测领域，尤其涉及一种桑脉带病毒的RT-LAMP检测方法及其引物组、试剂盒以及应用。
背景技术
在国家实施“东桑西移”产业结构调整战略和东部地区产业转移等因素推动下，广西桑蚕产业自“十五”以来迅猛发展，从2005年以来，广西蚕茧产量已连续12年居全国第一。桑蚕业的迅猛发展为广西农民增收、农业增效、县域经济大发展和新农村建设作出了重要贡献，也已成为广西的新兴优势产业，更是部分地区的主要支柱产业。然而，桑树病毒病在广西桑蚕区发生严重，发生率为40％左右，个别桑园发病率甚至达到80％，已成为广西桑树的主要病害之一，严重影响了广西桑蚕业的发展。
桑脉带病毒(Mulberry vein banding virus,MVBV)是广西桑树病毒病主要病原，该病毒是番茄斑萎病毒属(Tospovirus)新成员，与西瓜银色斑驳病毒血清型病毒具有较近的亲缘关系。然而，由于桑脉带病毒是近年新发现的侵染桑树的病毒，尚未建立系统的检测方法，有必要开发一种快速、准确的MVBV检测方法，以满足桑蚕产业需求。
目前检测植物病毒的方法主要是反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和酶联免疫吸附法(ELISA)，这两种方法均存在不足：RT-PCR需要购买专业的PCR仪，且反应时间较长；ELISA需要制备高质量的病毒血清，检测时间亦长，且灵敏度相对分子生物学方法低。此外，番茄斑萎病毒属(Tospovirus)成员中，如果其N蛋白的同源性高，氨基酸水平一致性达到50％，采用ELISA检测还会出现交叉反应，产生假阳性的结果。
环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是日本学者Notomi在2000年建立的一种核酸扩增方法，该方法具有检测速度快、灵敏度高、无需专业仪器等优点。RT-LAMP检测是在LAMP检测的基础上加入反转录酶，把反转录与靶基因扩增结合，在60-65℃温度进行反应，反应结束后通过加入荧光染料即可观察到结果。目前RT-LAMP已经广泛运用到人类、动/植物病毒的检测和快速诊断。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种快速、灵敏、简便的桑脉带病毒的RT-LAMP检测方法及其引物组、试剂盒以及应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
桑脉带病毒的RT-LAMP检测引物组，包括外侧引物对MVBV-F3和MVBV-B3、内侧引物对MVBV-FIP和MVBV-BIP，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列。
上述桑脉带病毒的RT-LAMP检测引物组在检测桑脉带病毒方面的应用。
桑脉带病毒的RT-LAMP检测试剂盒，包括RT-LAMP检测引物组、RT-LAMP反应液、酶溶液和核酸荧光染料；RT-LAMP检测引物组包括外侧引物对MVBV-F3和MVBV-B3、内侧引物对MVBV-FIP和MVBV-BIP，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列。
RT-LAMP反应液含有20mM Tris-HCl，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100(pH8.8)，1M Betaine，10mM dNTPs。
酶溶液含有Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶。
核酸荧光染料为SYBR GreenⅠ(10 000×)。
上述桑脉带病毒的RT-LAMP检测试剂盒，还包括阳性对照和阴性对照；阳性对照为感染MVBV的桑叶组织，阴性对照为健康桑叶组织。
上述桑脉带病毒的RT-LAMP检测试剂盒在检测桑脉带病毒方面的应用。
桑脉带病毒的RT-LAMP检测方法，以待测样品的总RNA为模板，利用RT-LAMP检测引物组进行RT-LAMP扩增反应，以检测待测样品是否感染桑脉带病毒；RT-LAMP检测引物组包括外侧引物对MVBV-F3和MVBV-B3、内侧引物对MVBV-FIP和MVBV-BIP，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列。
RT-LAMP扩增反应的反应体系和反应条件分别为：
反应体系：共25μL，包含以下组分：RT-LAMP反应液12.5μL，酶溶液1μL，浓度20μM的MVBV-FIP、MVBV-BIP各2μL，浓度20μM的MVBV-F3、MVBV-B3各0.5μL，模板2μL，加RNase FreeH2O至25μL，反应结束加入1μL核酸荧光染料(稀释10倍)；
反应条件：在63℃恒温下，扩增60min，80℃，反应5min使酶失活
本发明采用环介导等温扩增(LAMP)技术，并根据桑脉带病毒的基因序列设计了相应的RT-LAMP检测引物组，包括外侧引物对MVBV-F3和MVBV-B3、内侧引物对MVBV-FIP和MVBV-BIP。由此发明了桑脉带病毒的RT-LAMP检测方法及试剂盒。本发明是检测桑脉带病毒的首个RT-LAMP检测方法，应用本发明的检测方法及试剂盒，仅需通过对疑似感染的待测样品进行RNA提取并进行环介导等温扩增，一步完成逆转录和扩增步骤，反应结束后加入核酸荧光染料，直观地根据反应液颜色变化判断，若反应液显绿色，则判断为阳性；若反应液为橙色，则判断为阴性；因而可能快速、准确、高效地检测出是否感染桑脉带病毒。总之，本发明用于检测桑脉带病毒具有特异性强、操作简单和灵敏度高的特点，不需要专门仪器，能通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，无需电泳和紫外观察等步骤，适用于桑苗繁育和田间桑树上MVBV的检测，不仅可应用于桑脉带病毒病的早期诊断、流行学等研究，而且适合于在基层单位开展MVBV检测。
附图说明
图1是RT-LAMP产物可视化图分析图，图中：1携带MVBV桑叶样品(RT-PCR检测确定含有MVBV的样品，阳性对照)，2健康桑叶样品(RT-PCR检测确定不含有MVBV的样品，阴性对照)。
图2是RT-LAMP特异性分析图，图中：1表现为典型脉带症状的桑叶样品，2番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot virus,TZSV)样品，3朱顶红褪绿环斑病毒(Hippeastrumchlorotic ringspot virus，HCRV)样品。
图3是RT-LAMP灵敏度可视化结果分析图，图中：1、10ng，2、1ng，3、100pg，4、10pg，5、1pg，6、100fg，7、10fg，8、阴性对照(健康桑叶样品)。
图4是RT-LAMP灵敏度电泳结果分析图，图中：M：Gene Ruler 1kb plus Ladder；1、10ng，2、1ng，3、100pg，4、10pg，5、1pg，6、100fg，7、10fg，8、阴性对照(健康桑叶样品)。
图5是RT-PCR灵敏度电泳结果分析图，图中：M：Gene Ruler 1kb plus Ladder；1、10ng，2、1ng，3、100pg，4、10pg，5、1pg，6、100fg，7、10fg，8、阴性对照(健康桑叶样品)。
图6是RT-LAMP检测田间桑病样检测结果分析图，图中：1阴性对照；2阳性对照；3-8田间样品。
具体实施方式
实施例1 MVBV RT-LAMP检测试剂盒的制备
1.1试剂
引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成；植物总RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；Bst DNA聚合酶及其反应缓冲液购自New England Biolabs(NEB)公司，AMV逆转录酶购自Promega公司，核酸荧光染料为SYBR GreenⅠ(10 000×)购自上海索莱宝生物科技有限公司，Betaine购自生工生物工程(上海)股份有限公司，dNTPs购自宝生物工程(大连)有限公司(Takara)。引物组保存于-20℃冰箱，其他试剂按照对应产品说明书描述的条件进行保存条件。
1.2试剂盒的组装
试剂盒包含RT-LAMP引物组、RT-LAMP反应液、酶溶液和核酸荧光染料。
RT-LAMP引物组：包括外侧引物对MVBV-F3(SEQ.ID.No.1)和MVBV-B3(SEQ.ID.No.2)、内侧引物对MVBV-FIP(SEQ.ID.No.3)和MVBV-BIP(SEQ.ID.No.4)。
RT-LAMP反应液含有20mM Tris-HCl，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100(pH8.8)，1M Betaine，10mM dNTPs。
酶溶液：8单位(U)的Bst DNA聚合酶和2单位的AMV逆转录酶
核酸荧光染料：SYBR GreenⅠ(10 000×)。
阳性对照：含有MVBV的显症桑叶。
阴性对照：不含有MVBV的健康桑叶(经RT-PCR方法检测确认)。
实施例2 RT-LAMP检测方法检测MVBV及其特异性
检测样品3份，其中显症桑叶1份、被番茄环纹斑点病毒(TZSV)侵染的烟草样品1份和被朱顶红褪绿环斑病毒感染的水鬼蕉1份。
采用实施例1的试剂盒进行检测，检测方法包括以下步骤：
(1)提取待测样品总RNA：利用天根生化科技(北京)有限公司总RNA提取试剂盒提取待测样品总RNA。
(2)建立RT-LAMP反应体系：在薄壁PCR管中建立25μL的反应体系：RT-LAMP反应液12.5μL，酶溶液1μL，外侧引物MVBV-F3、MVBV-B3各0.5μL(20μM)，内侧引物MVBV-FIP、MVBV-BIP各2.0μL(20μM)，步骤1获得的总RNA模板2μL，加RNase Free H2O至25.0μL；含有MVBV的桑叶的总RNA为对照，健康桑叶的总RNA为阴性对照。
(3)RT-LAMP反应的条件：在63℃恒温条件下，扩增60min，在80℃条件下反应5min使酶失活；
(4)分析判断反应结果：反应结束，在步骤“(3)”获得的反应液中加入1μL核酸荧光染料SYBR GreenⅠ(10 000×)(稀释10倍)，若为反应液颜色为绿色则判定为阳性反应，为橙色则判定为阴性反应。
如图1所示，RT-LAMP反应的结果显示，阳性对照的反应液变为绿色，而阴性对照的反应液保持橙色不变，表明检测能正常检测出目标病毒MVBV。图2显示，待测显症桑叶样品的反应液变为绿色，而烟草番茄环纹斑点病毒(TZSV)样品和朱顶红褪绿环斑病毒的反应液保持橙色不变，说明RT-LAMP仅检测出目标MVBV，不能检测出同一血清型的番茄环纹斑点病毒(TZSV)和同属的朱顶红褪绿环斑病毒，表明引物具有较强的特异性。
实施例3 MVBV RT-LAMP检测方法的敏感性试验
按照实施例2提取的含有MVBV的桑病叶组织的总RNA，利用微量分光光度计测其浓度，取总RNA浓度为10ng/μL的核酸模板进行检测。按照10倍比例进行稀释后用作模板，共设10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL和10fg/μL共7个梯度。分别进行RT-LAMP检测和常规RT-PCR检测，RT-LAMP检测步骤同实施例2中的(2)-(4)。
RT-PCR检测：采用对应的总RNA作为模板，RT-PCR反应扩增体系按诺唯赞生物科技有限公司的一步法RT-PCR试剂盒说明进行，反应体系组成为：2×One Step Mix 25μL，OneStep Enzyme Mix 2.5μL，上游引物MVBV-N-F(10μM)1μL、下游引物MVBV-N-R(10μM)1μL，模板1μL，加水至50μL。反应条件为：50℃反转录30min；94℃预变性3min；94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸55s，35个循环；72℃终延伸7min。反应条件为：50℃反转录30min；94℃预变性3min；94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸55s，35个循环；72℃终延伸7min；4℃保存。取1.0μLPCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测。
RT-PCR的引物序列如下：
MVBV-N-F：5'-ATGTCTACCGTCCGTCAGCTG-3'(SEQ.ID.No.5)，
MVBV-N-R：5'-ACTTCTATAGAATTAGAAGTG CTTGG-3'(SEQ.ID.No.6)。
结果显示，使用RT-LAMP方法检测，当模板含量为100fg时，反应液呈绿色(阳性反应)，电泳时条带清晰可见(图3、图4)；使用RT-PCR方法检测，采用1％的琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR扩增产物，当模板含量为1pg时，扩增条带较弱；当模板含量为100fg时，已无明显的可见特性条带(图5)。本发明的RT-LAMP检测方法比常规RT-PCR检测方法的灵敏度高10倍。
实施例4 MVBV RT-LAMP的检测试剂盒的应用
采集桑树样品，包含显症样品、可能携带MVBV隐症样品和健康无MVBV样品为试验材料，桑脉带病毒RT-LAMP检测试剂盒及检测方法同实施例1和案例2。将所提取的桑叶组织总RNA作为模板，进行RT-LAMP检测。RT-LAMP检测结果如图6所示，6份待测桑叶样品中，3、5、7、8号样品显示为绿色，表明这4个样品中含有病毒，4、6号样品显示为橙色，表明这2个样品中没有病毒样品。其中3号样品为无症状的隐症样品，说明RT-LAMP方法检测到隐症样品中的目标病毒。
SEQUENCE LISTING
<110> 广西大学
<120> 桑脉带病毒的RT-LAMP检测方法及其引物组、试剂盒以及应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<400> 1
agagacagag gtcctccaat g 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<400> 2
caatgccggg attgatgatt g 21
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(46)
<400> 3
cctttggtgt ctgcttatgg tctatagcat cagcctcaat gcacaa 46
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(43)
<400> 4
atttggattc gttgcttgct gcactgaggc actcatcaga gtt 43
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<400> 5
atgtctaccg tccgtcagct g 21
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(26)
<400> 6
acttctatag aattagaagt gcttgg 26

Claims (8)

1.桑脉带病毒的RT-LAMP检测引物组，其特征在于包括外侧引物对MVBV-F3和MVBV-B3、内侧引物对MVBV-FIP和MVBV-BIP，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列。
2.权利要求1所述桑脉带病毒的RT-LAMP检测引物组在检测桑脉带病毒方面的应用。
3.一种桑脉带病毒的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于包括RT-LAMP检测引物组、RT-LAMP反应液、酶溶液和核酸荧光染料；所述RT-LAMP检测引物组包括外侧引物对MVBV-F3和MVBV-B3、内侧引物对MVBV-FIP和MVBV-BIP，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列；所述RT-LAMP反应液含有20mM Tris-HCl，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100pH8.8，1M Betaine，10mM dNTPs。
4.根据权利要求3所述的桑脉带病毒的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述酶溶液含有Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶。
5.根据权利要求3所述的桑脉带病毒的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述核酸荧光染料为SYBR GreenⅠ10 000×。
6.根据权利要求3所述的桑脉带病毒的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于还包括阳性对照和阴性对照；所述阳性对照为感染桑脉带病毒的桑叶组织，阴性对照为健康桑叶组织。
7.权利要求3所述桑脉带病毒的RT-LAMP检测试剂盒在检测桑脉带病毒方面的应用。
8.一种桑脉带病毒的RT-LAMP检测方法，其特征在于：以待测样品的总RNA为模板，利用RT-LAMP检测引物组进行RT-LAMP扩增反应，以检测待测样品是否感染桑脉带病毒；所述RT-LAMP检测引物组包括外侧引物对MVBV-F3和MVBV-B3、内侧引物对MVBV-FIP和MVBV-BIP，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列；所述RT-LAMP扩增反应的反应体系和反应条件分别为：
反应体系：共25μL，包含以下组分：RT-LAMP反应液12.5μL，酶溶液1μL，浓度20μM的MVBV-FIP、MVBV-BIP各2μL，浓度20μM的MVBV-F3、MVBV-B3各0.5μL，模板2μL，加RNase FreeH2O至25μL，反应结束加入1μL稀释10倍的核酸荧光染料；
反应条件：在63℃恒温下，扩增60min；80℃，反应5min使酶失活。
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