CN112501350B - 检测三种无花果病毒的引物组合、试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了同时检测三种无花果病毒的引物组合、试剂盒及其应用。本发明首先公开了本发明检测或辅助检测三种无花果病毒中至少一种病毒的引物组合，包括用于检测或辅助检测无花果斑点相关病毒的引物对1、用于检测或辅助检测无花果叶斑相关病毒的引物对2和用于检测或辅助检测无花果花叶病毒的引物对3。本发明进一步公开了检测或辅助检测待测样品中是否含有三种无花果病毒的方法。本发明首次建立了检测FFkaV、FLMaV和FMV的多重RT‑PCR方法，突破了同时检测侵染无花果的FFkaV、FLMaV和FMV三种病毒的技术瓶颈，可以用于无花果病毒病害的监测预警。

Description

检测三种无花果病毒的引物组合、试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及检测三种无花果病毒的引物组合、试剂盒及其应用。
背景技术
无花果(Ficus carica)是桑科(Moraceae)榕属(Ficus)的一种多年生亚热带落叶果树，是人类最早驯化的古老果树之一。作为一种特殊的果品和天然植物药物，无花果有广泛的营养和药用价值。其果实柔软味甜、营养丰富、性味甘平，是中国的重要经济果树之一，分布于全国各地如新疆、山东、福建、江苏、四川、上海、江西、河南和广东等地。在无花果栽培中，病毒病成为制约产业发展的重要因子之一。近年来，无花果病毒病在新疆普遍发生，每年造成严重的产量损失。
目前，已报道的无花果病毒至少有15种，田间栽培中正常看到叶斑、畸形、果斑等症状。此前，调查及鉴定了新疆、北京和江苏等地的无花果产区的病毒发生情况和病毒种类，发现在中国普遍存在的无花果病毒主要有3种，并且具有复合侵染的现象，不但影响果实品质，也会影响果实外观。这三种病毒分别是布尼亚病毒科(Bunyaviridae)欧洲花楸环斑病毒属(Emaravirus)的无花果花叶病毒(fig mosaic virus,FMV)、芜菁黄花叶病毒科(Tymoviridae)芜菁黄花叶病毒属(Tymovirus)的无花果斑点相关病毒(fig fleck-associated virus,FFkaV)以及长线形病毒科(Closteroviridae)葡萄卷叶病毒属(Ampelovirus)的无花果叶斑相关病毒(fig leaf mottle-associated virus,FLMaV)。
建立经济、快速、准确、灵敏的检测方法可以有效控制无花果病毒的扩散及蔓延，为降低其危害提供支撑。目前，尚未研制出上述3种病毒的抗体，血清学检测技术不适用于它们。因此，通常使用RT-PCR检测这3种病毒。但是，单重的RT-PCR操作繁琐其成本较高。为此，建立一种能够同时检测FFkaV、FMV和FLMaV的多重RT-PCR检测方法在田间预防和防止病害的蔓延具有极为重要的作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何建立能够准确、高效、灵敏且检测无花果斑点相关病毒(fig fleck-associated virus,FFkaV)、无花果叶斑相关病毒(fig leafmottle-associated virus,FLMaV)和无花果花叶病毒(fig mosaic virus,FMV)的多重RT-PCR检测方法，以降低检测成本、提高检测的效率，达到节时节费的目的。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了检测或辅助检测三种无花果病毒的引物组合。
本发明检测或辅助检测三种无花果病毒中至少一种(如三种、某两种或某一种)的引物组合，包括用于检测或辅助检测无花果斑点相关病毒的引物对1、用于检测或辅助检测无花果叶斑相关病毒的引物对2和用于检测或辅助检测无花果花叶病毒的引物对3；
所述引物对1由引物FFkaV-F和引物FFkaV-R组成：
所述引物FFkaV-F为SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子；所述引物FFkaV-R为SEQ IDNO.2所示的单链DNA分子；
所述引物对2由引物FLMaV-F和引物FLMaV-R组成：
所述引物FLMaV-F为SEQ ID NO.3所示的单链DNA分子；所述引物FLMaV-R为SEQ IDNO.4所示的单链DNA分子；
所述引物对3由引物FMV-F和引物FMV-R组成：
所述引物FMV-F为SEQ ID NO.5所示的单链DNA分子；所述引物FMV-R为SEQID NO.6所示的单链DNA分子；
所述三种无花果病毒为无花果斑点相关病毒、无花果叶斑相关病毒和无花果花叶病毒。
上述引物组合中，所述引物对1、引物对2和引物对3的摩尔比为10:10:3，其中，所述引物对1中引物FFkaV-F和引物FFkaV-R的摩尔比为1:1；所述引物对2中引物FLMaV-F和引物FLMaV-R的摩尔比为1:1；所述引物对3中引物FMV-F和引物FMV-R的摩尔比为1:1。
包含上述引物组合的试剂盒也在本发明的保护范围之内，所述试剂盒为检测或辅助检测三种无花果病毒中至少一种病毒(如三种、某两种或某一种)的试剂盒。
本发明所述试剂盒的制备方法，包括将上述引物组合中各引物对的各条引物分别单独包装的步骤。
本发明进一步提供了上述引物组合或试剂盒在如下任一中的应用：
A1)制备用于检测或辅助检测三种无花果病毒的产品；
A2)检测或辅助检测三种无花果病毒；
A3)制备用于检测或辅助检测待测样品中是否含有三种无花果病毒的产品；
A4)检测或辅助检测待测样品中是否含有三种无花果病毒；
A5)制备用于鉴定或辅助鉴定三种无花果病毒的产品；
A6)鉴定或辅助鉴定三种无花果病毒；
A7)制备用于鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为三种无花果病毒的产品；
A8)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为三种无花果病毒；
所述三种无花果病毒为无花果斑点相关病毒、无花果叶斑相关病毒和无花果花叶病毒。
本发明进一步提供了检测或辅助检测待测样品中是否含有三种无花果病毒的方法。
本发明检测或辅助检测待测样品中是否含有三种无花果病毒的方法，包括如下步骤：
以待测样品的cDNA为模板，采用上述引物组合或试剂盒对进行RT-PCR扩增，得到RT-PCR扩增产物；
若所述RT-PCR扩增产物中含有大小为626bp的条带，则所述待测样品含有或候选含有无花果斑点相关病毒；反之则所述待测样品不含有或候选不含有无花果斑点相关病毒；
若所述RT-PCR扩增产物中含有大小为417bp的条带，则所述待测样品含有或候选含有无花果叶斑相关病毒；反之则所述待测样品不含有或候选不含有无花果叶斑相关病毒；
若所述RT-PCR扩增产物中含有大小为219bp的条带，则所述待测样品含有或候选含有无花果花叶病毒；反之则所述待测样品不含有或候选不含有无花果花叶病毒；
所述三种无花果病毒为无花果斑点相关病毒、无花果叶斑相关病毒和无花果花叶病毒。
本发明进一步提供了鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为三种无花果病毒的方法。
本发明鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为三种无花果病毒的方法，包括如下步骤：
以待测病毒的cDNA为模板，采用上述引物组合或试剂盒对进行RT-PCR扩增，得到RT-PCR扩增产物；
若所述RT-PCR扩增产物中含有大小为626bp的条带，则所述待测病毒为或候选为无花果斑点相关病毒；反之则所述待测样品不为或候选不为无花果斑点相关病毒；
若所述RT-PCR扩增产物中含有大小为417bp的条带，则所述待测病毒为或候选为无花果叶斑相关病毒；反之则所述待测样品不为或候选不为无花果叶斑相关病毒；
若所述RT-PCR扩增产物中含有大小为219bp的条带，则所述待测病毒为或候选为无花果花叶病毒；反之则所述待测样品不为或候选不为无花果花叶病毒；
所述三种无花果病毒为无花果斑点相关病毒、无花果叶斑相关病毒和无花果花叶病毒。
上述方法中，所述cDNA是以待测病毒或待测样品的RNA为模板进行反转录得到的。
本发明提供的FFkaV、FLMaV和FMV三种病毒的特异性引物对，通过RT-PCR分别可以获得626bp、417bp和219bp的单一的特异性条带。通过对PCR反应体系和反应条件的优化，建立了同时检测FFkaV、FLMaV和FMV的多重RT-PCR方法，突破了同时检测侵染无花果的FFkaV、FLMaV和FMV三种病毒的技术瓶颈。其中，优化后得到的RT-PCR扩增的反应体系如下：cDNA1.0μL，2.5mM dNTPs 2.0μL，10×Easypfu Buffer(含Mg2+)2.5μL，50mM MgSO4 0.6μL，2.5U/μL Easypfu DNA聚合酶0.5μL，10μmol/L引物FFkaV-F 1μL、10μmol/L引物FFkaV-R 1μL、10μmol/L引物FLMaV-F 1μL、10μmol/L引物FLMaV-R 1μL、10μmol/L引物FMV-F 0.3μL、10μmol/L引物FMV-R 0.3μL。
RT-PCR扩增的反应条件如下：95℃预变性5min；94℃预变性30s，56.5℃退火45s,72℃延伸75s，40个循环；最后72℃延伸10min。
由上述引物对1、上述引物对2和上述引物对3中某两种引物对组成的引物组合或其中一种引物对及包含上述引物组合或引物对的试剂盒也在本发明的保护范围之内。
上述引物组合或引物对或上述试剂盒的应用在如下中任一中的应用也属于本发明的保护范围：
B1)上述引物对1在检测或辅助检测无花果斑点相关病毒中的应用；
B2)上述引物对1在检测或辅助检测待测样品中是否含无花果斑点相关病毒中的应用；
B3)上述引物对1在鉴定或辅助鉴定无花果斑点相关病毒中的应用；
B4)上述引物对1在鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为无花果斑点相关病毒中的应用；
C1)上述引物对2在检测或辅助检测无花果叶斑相关病毒中的应用；
C2)上述引物对2在检测或辅助检测待测样品中是否含无花果叶斑相关病毒中的应用；
C3)上述引物对2在鉴定或辅助鉴定无花果叶斑相关病毒中的应用；
C4)上述引物对2在鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为无花果叶斑相关病毒中的应用；
D1)上述引物对3在检测或辅助检测无花果花叶病毒中的应用；
D2)上述引物对3在检测或辅助检测待测样品中是否含无花果花叶病毒中的应用；
D3)上述引物对3在鉴定或辅助鉴定无花果花叶病毒中的应用；
D4)上述引物对3在鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为无花果花叶病毒中的应用。
本发明相比于现有技术，具有以下优点：
1、本发明首次建立了同时检测FFkaV、FLMaV和FMV的多重RT-PCR方法，突破了同时检测侵染无花果的FFkaV、FLMaV和FMV三种病毒的技术瓶颈。
2、本发明引物对具有特异性和兼容性，可以同时检测复合侵染植株中三种病毒FFkaV、FLMaV和FMV。
3、本发明优化了RT-PCR扩增的反应体系和反应条件，在保证检测结果准确的前提下，极大地缩短了检测时间，提高了检测效率。
4、本发明RT-PCR扩增的反应体系灵敏性好，检测底线是10-2cDNA，可以用于无花果病毒病害的监测预警。
5、本发明是在同一个PCR体系中经过一次反应完成，既节约了病毒RNA和PCR扩增体系中的各种试剂，最大程度的降低了检测成本，也节约了时间和人力。
附图说明
图1为三种病毒特异性引物的PCR扩增的电泳结果；其中，泳道M代表核酸标准分子量(DL2000 DNA Marker)，从上到下分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp；泳道1为水的扩增结果(阴性对照)，未扩增到特异性条带；泳道2、3、4分别为无花果样本中的FFkaV、FLMaV和FMV特异性条带。
图2为多重RT-PCR反应体系的优化后的电泳结果；其中，泳道M代表核酸标准分子量(DL2000 DNA Marker)，从上到下分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp；A：DNA聚合酶用量的优化，泳道1～6分别为0.1μL、0.3μL、0.5μL、0.7μL、0.9μL和1.1μL；B：cDNA用量的优化，泳道1～6分别为0.5μL、1.0μL、1.5μL、2.0μL、2.5μL和3.0μL；C：dNTPs用量的优化，泳道1～6分别为1.0μL、1.5μL、2.0μL、2.5μL、3.0μL和3.5μL；D：MgSO4用量的优化，泳道1～6分别为0.6μL、0.9μL、1.2μL、1.5μL、1.8μL和2.1μL；E：引物摩尔比的优化，泳道1～6分别为2:2:1、3:3:1、10:10:3、13:13:4、10:15:3和4:5:1；F：退火温度的优化，泳道1～6分别为51℃、52℃、53℃、54.2℃、55.3℃和56.5℃。
图3为将FLMaV的特异性引物替换后的电泳结果；其中，泳道M代表核酸标准分子量(DL2000 DNA Marker)，从上到下分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp；泳道1、2、3分别为无花果样本中的FFkaV、FLMaV和FMV特异性条带。
图4为单重和多重RT-PCR的灵敏度测定；其中，泳道M代表核酸标准分子量(DL2000DNA Marker)，从上到下分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp；A：FFkaV的单重RT-PCR灵敏度测定；B：单重FLMaV的RT-PCR灵敏度测定；C：FMV的单重RT-PCR灵敏度测定；D：三种病毒的多重RT-PCR灵敏度测定；泳道1～7的cDNA量依次为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7。
图5为应用多重RT-PCR体系检测供试样品；其中，泳道M代表核酸标准分子量(DL2000 DNA Marker)，从上到下分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp；泳道1～8分别为供试样品；泳道9为阴性对照。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1无花果叶组织总RNA的提取
获取被三种病毒FFkaV、FLMaV和FMV感染的无花果叶组织(麦合木提江·米吉提.中国无花果病毒的鉴定及其分子特征研究.中国农业科学院学位论文.2015年)。
采用天根生化科技有限公司的RNAprep pure Plant Kit试剂盒提取无花果叶组织的总RNA。具体步骤参照说明书。用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，并测定RNA的浓度。合格的样品置于-70℃冰箱保存备用或直接使用。
实施例2三种病毒特异性引物对的设计
根据GenBank上登录的FFkaV外壳蛋白(CP)、FMV糖蛋白(GP)和FLMaV热激蛋白(HSP70)基因保守区域，应用Primer Premier 6.0引物设计软件分别设计特异性引物(表1)，引物由昆泰锐生物技术有限公司合成。
表1无花果病毒的特异性扩增引物
实施例3三种无花果病毒的单重RT-PCR体系的建立
一、cDNA合成：采用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit合成cDNA第1条链，具体步骤如下：
RNA与试剂都在冰上解冻，向PCR管中加入1μL gDNA Eraser，2μL 5×gDNA EraserBuffer，1μL RNA，6μL RNase Free ddH2O，将溶液混匀并短暂离心，72℃孵育3min，在冰上冷却，PCR管中加入1μL PrimeScript RT Enzyme Mix I，1μL RT Primer Mix，4μL 5×PrimeScript Buffer，4μL Rnase-Free ddH2O，总体积为20μL。轻轻混匀并短暂离心，37℃孵育15min，85℃加热5s终止反应。将cDNA保存-20℃冰箱。
二、单重RT-PCR反应：以cDNA为模板，分别利用FFkaV、FLMaV和FMV的特异性引物对(即FFkaV-F和FFkaV-R、FLMaV-F和FLMaV-R、FMV-F和FMV-R)进行PCR扩增，获得RT-PCR产物。
总25μL的单重RT-PCR反应体系为：2.5μL 10×Easypfu Buffer(含Mg2+)，2.5μLdNTPs(2.5mM)，0.5μL Easypfu DNA聚合酶(2.5U/μL)，1.5μL MgSO4(50mM)，1μL上游引物(10μM)，1μL下游引物(10μM)，1μL模板cDNA，ddH2O补足至25μL。
单重RT-PCR反应程序为：95℃预变性5min；94℃预变性30s，56℃退火45s，72℃延伸75s，40个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
RT-PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，使用Bio-Rad凝胶成像系统成像并记录结果。电泳结果如图1所示，结果显示：用FFkaV、FLMaV和FMV各自的特异性引物分别扩增获得了626bp、417bp和219bp的单一条带(图1中泳道2、3、4)。
目的片段克隆及测序：采用北京全式金生物技术有限公司的EasyPure Quick GelExtraction Kit纯化PCR产物，用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测回收PCR产物。纯化的产物与T5Zero载体连接，连接产物转入Trans1-T1感受态细胞中。通过菌液PCR鉴定出阳性克隆。采用北京全式金生物技术有限公司的EasyPure Plasmid MiniPrep Kit提取阳性克隆的质粒，送昆泰锐生物技术有限公司进行测序。使用NCBI的BLAST工具和DNAMAN软件对获得的序列进行比对分析。结果表明：利用FFkaV、FLMaV和FMV各自的特异性引物扩增得到的片段分别与FFkaV中国分离物(KT438719.1)的相似性为96.9％，与FLMaV中国分离物(序列未公布)的相似性为97.88％，与FMV塞尔维亚分离物(AB697829.1)的相似性为97.58％，表明扩增出的片段的确来自于这3种病毒所对应的基因。
实施例4三种无花果病毒的多重RT-PCR体系的建立
多重PCR反应是在一个PCR反应体系中同时检测多种病毒，因此多重PCR反应体系中的RNA和引物均为多种病毒RNA和检测病毒的特异性引物对的混合物，其他设计如反转录酶、RNA聚合酶、MgSO4和dNTPs等与单重PCR的浓度相同。
以含FFkaV、FLMaV和FMV三种病毒复合侵染的无花果总RNA为模板合成的cDNA(640ng/μL)为模板进行PCR反应体系和反应条件的优化，设置25uL的反应体系为2.5μL 10×Easypfu Buffer(含Mg2+)，2.5μL dNTPs(2.5mM)，0.5μL EasypfuDNA聚合酶(2.5U/μL)，1.5μL MgSO4(50mM)，4.6μL引物混合物(10μmol/L引物FFkaV-F 1μL、10μmol/L引物FFkaV-R1μL、10μmol/L引物FLMaV-F 1μL、10μmol/L引物FLMaV-R 1μL、10μmol/L引物FMV-F 0.3μL、10μmol/L引物FMV-R0.3μL)，1μL模板cDNA，ddH2O补足至25μL。反应条件为95℃预变性5min；94℃预变性30s，56℃退火45s，72℃延伸75s，40个循环；72℃延伸10min；4℃保存。对参数cDNA、dNTPs、Easypfu DNA聚合酶和MgSO4用量、引物比例和退火温度进行优化，具体如下：
在25μL的反应体系中，将上述cDNA用量设置有0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0μL的6个梯度，其它保持不变。
在25μL的反应体系中，将上述2.5mM dNTPs用量设置有1.0、1.5、2.0、2.5、3.0和3.5μL的6个梯度，其它保持不变。
在25μL的反应体系中，将上述2.5U/μL Easypfu DNA聚合酶用量设置有0.1、0.3、0.5、0.7、0.9和1.1μL的6个梯度，其它保持不变。
在25μL的反应体系中，将上述50mM MgSO4用量设置有0.6、0.9、1.2、1.5、1.8和2.1μL的6个梯度，其它保持不变。
在25μL的反应体系中，将上述FFkaV、FLMaV和FMV的特异性引物对的摩尔比(其中引物对中上下游引物的摩尔比为1:1)设置有2:2:1、3:3:1、10:10:3、13:13:4、10:15:3和4:5:1的6个梯度，其它保持不变。
反应条件中退火温度设置有51、52、53、54.2、55.3和56.5℃的6个梯度，其它保持不变。
结果如图2所示，结果表明：最佳的反应体系为：引物比例为10:10:3(图2中E)，2.5mM dNTPs 2.0μL(图2中C)，50mM MgSO4 0.6μL(图2中D)，2.5U/μL EasypfuDNA聚合酶0.5μL(图2中A)，cDNA1.0μL(图2中B)及最佳退火温度为56.5℃(图2中F)。
利用FFkaV、FLMaV和FMV的特异性引物对的引物混合物，以含FFkaV、FLMaV和FMV三种病毒复合侵染的无花果总RNA为模板合成的cDNA(640ng/μL)为模板，以最佳的反应体系：引物混合物(FFkaV、FLMaV和FMV的特异性引物对的摩尔比＝10:10:3，即10μmol/L引物FFkaV-F 1μL、10μmol/L引物FFkaV-R 1μL、10μmol/L引物FLMaV-F 1μL、10μmol/L引物FLMaV-R 1μL、10μmol/L引物FMV-F0.3μL、10μmol/L引物FMV-R 0.3μL)4.6μL，2.5mM dNTPs2.0μL，50mM MgSO40.6μL，2.5U/μL Easypfu DNA聚合酶0.5μL及cDNA1.0μL，最佳反应条件：95℃预变性5min；94℃预变性30s，56.5℃退火45s,72℃延伸75s，40个循环；最后72℃延伸10min，进行PCR扩增，得到产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，使用Bio-Rad凝胶成像系统成像并记录结果。结果与图1结果一致显示：用FFkaV、FLMaV和FMV的特异性引物对的引物混合物进行扩增获得了626bp、417bp和219bp的单一条带。
将FLMaV-F替换为FL751-F(TTCTAGTCCTCTTGGTACACATCT)和将FLMaV-R替换为FL1194-R(CACATCCTAACAGCATAGCACAT)进行上述试验，结果如图3所示，结果表明：FLMaV的扩增条带变浅。
实施例5单重和多重RT-PCR灵敏度测定
为确定单重和多重RT-PCR灵敏，将含FFkaV、FLMaV和FMV三种病毒复合侵染的无花果总RNA为模板合成cDNA(640ng/μL)，按10倍梯度(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7)稀释成7个浓度。每个浓度取1μL cDNA为模板分别利用实施例3和实施例4建立的三种无花果病毒的单重和多重RT-PCR体系进行单重和多重RT-PCR扩增，用1.0％琼脂糖凝胶电泳观察结果。电泳结果如图4所示，结果表明：FFkaV、FLMaV和FMV的单重RT-PCR最低检测cDNA浓度分别为10-4、10-3和10-5，而多重RT-PCR最低检测cDNA浓度分别为10-3、10-2和10-5。因此，该多重RT-PCR体系的检测底线为10-2cDNA。
实施例6多重RT-PCR体系应用
应用实施例4建立的多重RT-PCR检测体系对2019年采集新疆乌鲁木齐市花卉市场的8个样品进行检测，结果如图5所示，表明：从2、6、7、8号样品中检测到了FFkaV、FLMaV和FMV病毒，占检测样品数的50％；2、3、4、6、7、8号样品中检测出FLMaV和FMV病毒，占检测样品数的75％；1号样品中只检测出FMV，其中FMV在8份材料中都有，占检测样品数的100％。
同样利用实施例3建立的单重RT-PCR检测体系进行检测，结果与多重RT-PCR检测体系的检测结果相一致，说明建立的多重RT-PCR检测技术体系可以用于无花果田间样品的病毒检测。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 新疆农业大学
<120> 检测三种无花果病毒的引物组合、试剂盒及其应用
<130> GNCFY192654
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgccatcata cttcttatcg tcac 24
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttgtaggtgg tggaatcctt gat 23
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtaaggcagc ggttgtatta gatt 24
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tagattcgtc actcagcact ctc 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccaatcttgt gcctactatc agt 23
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaactcatta tcatctgcct ttgc 24

Claims (7)

1.检测三种无花果病毒的引物组合，其特征在于：所述引物组合包括用于检测无花果斑点相关病毒的引物对1、用于检测无花果叶斑相关病毒的引物对2和用于检测无花果花叶病毒的引物对3；
所述引物对1由引物FFkaV-F和引物FFkaV-R组成：
所述引物FFkaV-F为SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子；所述引物FFkaV-R为SEQ IDNO.2所示的单链DNA分子；
所述引物对2由引物FLMaV-F和引物FLMaV-R组成：
所述引物FLMaV-F为SEQ ID NO.3所示的单链DNA分子；所述引物FLMaV-R为SEQ IDNO.4所示的单链DNA分子；
所述引物对3由引物FMV-F和引物FMV-R组成：
所述引物FMV-F为SEQ ID NO.5所示的单链DNA分子；所述引物FMV-R为SEQ ID NO.6所示的单链DNA分子；
所述三种无花果病毒为无花果斑点相关病毒、无花果叶斑相关病毒和无花果花叶病毒。
2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于：所述引物对1、引物对2和引物对3的摩尔比为10:10:3，其中，所述引物对1中引物FFkaV-F和引物FFkaV-R的摩尔比为1:1；所述引物对2中引物FLMaV-F和引物FLMaV-R的摩尔比为1:1；所述引物对3中引物FMV-F和引物FMV-R的摩尔比为1:1。
3.检测三种无花果病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含权利要求1或2所述的引物组合。
4.权利要求3所述的试剂盒的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括将权利要求1或2中引物组合中各引物对的各条引物分别单独包装的步骤。
5.权利要求1或2所述的引物组合或权利要求3所述的试剂盒在如下任一中的应用：
A1)制备用于检测待测样品中是否含有三种无花果病毒的产品；
A2)检测待测样品中是否含有三种无花果病毒；
A3)制备用于鉴定三种无花果病毒的产品；
A4)鉴定三种无花果病毒；
所述三种无花果病毒为无花果斑点相关病毒、无花果叶斑相关病毒和无花果花叶病毒。
6.检测待测样品中是否含有三种无花果病毒的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
以待测样品的cDNA为模板，采用权利要求1或2所述的引物组合或权利要求3所述的试剂盒进行RT-PCR扩增，得到RT-PCR扩增产物；
若所述RT-PCR扩增产物中含有大小为626bp的条带，则所述待测样品含有无花果斑点相关病毒；反之则所述待测样品不含有无花果斑点相关病毒；
若所述RT-PCR扩增产物中含有大小为417bp的条带，则所述待测样品含有无花果叶斑相关病毒；反之则所述待测样品不含有无花果叶斑相关病毒；
若所述RT-PCR扩增产物中含有大小为219bp的条带，则所述待测样品含有无花果花叶病毒；反之则所述待测样品不含有无花果花叶病毒；
所述三种无花果病毒为无花果斑点相关病毒、无花果叶斑相关病毒和无花果花叶病毒。
7.鉴定待测病毒是否为三种无花果病毒的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
以待测病毒的cDNA为模板，采用权利要求1或2所述的引物组合或权利要求3所述的试剂盒进行RT-PCR扩增：
若所述RT-PCR扩增产物中含有大小为626bp的条带，则所述待测病毒为无花果斑点相关病毒；反之则所述待测样品不为无花果斑点相关病毒；
若所述RT-PCR扩增产物中含有大小为417bp的条带，则所述待测病毒为无花果叶斑相关病毒；反之则所述待测样品不为无花果叶斑相关病毒；
若所述RT-PCR扩增产物中含有大小为219bp的条带，则所述待测病毒为无花果花叶病毒；反之则所述待测样品不为无花果花叶病毒；
所述三种无花果病毒为无花果斑点相关病毒、无花果叶斑相关病毒和无花果花叶病毒。
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