CN108559793A - 一种夜来香花叶病毒的TC-RT-nested-PCR检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种夜来香花叶病毒TC‑RT‑nested‑PCR检测试剂盒及其检测方法。本发明的夜来香花叶病毒检测试剂盒包括病毒抽提缓冲液、PBST缓冲液、外侧正向引物、外侧反向引物、内侧正向引物、内侧反向引物、RT Buffer、RNA酶抑制因子、反转录酶、dNTPs、PCR Mix、阳性对照和阴性对照。本发明根据夜来香花叶病毒外壳蛋白基因设计2对特异性引物，采用TC‑RT‑nested PCR技术对夜来香花叶病毒进行检测。本发明的检测方法无需RNA提取步骤，具有操作简便、成本低、特异性强、灵敏度高和准确性好的优点，适用于农业生产及进出境口岸上夜来香花叶病毒的快速检测和监测。
Description
技术领域
本发明涉及一种夜来香花叶病毒的TC-RT-nested-PCR检测试剂盒及其检测方法，属于植物检疫技术领域，适用于农业生产及进出境口岸上夜来香花叶病毒的快速检测和监测。
背景技术
西番莲(Passiflora edulia Sims)是西番莲科(Passifloraceae)西番莲属(passiflora)多年生草质藤本植物，原产南美的巴西、阿根廷，广泛分布于热带、亚热带地区，我国主要分布在台湾、广东、福建、广西、浙江、四川等地区。西番莲作为一种高级天然饮料作物，在栽培生产过程中，常常受到病虫害的危害，其中病毒病是西番莲生产上的第二大病害，严重影响西番莲的产量和品质，在巴西、澳大利亚、秘鲁、肯尼亚及我国台湾地区已成为限制西番莲生产发展的重要因素。迄今为止，国内外报道能够侵染西番莲的病毒主要包括西番莲病毒科(Potyviridae)西番莲Y病毒属(Potyvirus)、雀麦花叶病毒科(Bramovirida)黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)、双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金黄花叶病毒属(Begomovirus)、芜菁黄花叶病毒科(Tymoviridae)芜菁黄花叶病毒属(Tymovirus)、柑橘粗糙病毒属(Cilevirus)、乙型线状病毒科(Betaflexiviridae)香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)、帚状病毒科(Virgaviridae)烟草花叶病毒属(Tobamovirus)、豇豆花叶病毒科(Comovirinae)线虫传多面体病毒属(Nepovirus)病毒等。其中，夜来香花叶病毒(Telosma mosaic virus，TeMV)是近年来西番莲上新报道的一种马铃薯Y病毒属病毒，基因组具有典型的Potyvirus结构特征，正义ssRNA，全长9689nts，编码一个长的聚合蛋白。夜来香花叶病毒的病毒粒体呈线状，长约750nm，宽约12nm。夜来香花叶病毒侵染寄主植物主要引起花叶症状，在越南夜来香、泰国西番莲、印度尼西亚广霍香上已有发生危害的报道，该病毒可通过机械接种传播，但是否通过蚜虫传播尚未明确。由于西番莲在生产上常采用扦插、嫁接育苗，因此夜来香花叶病毒可能通过上述途径大面积或远距离传播。
近年来，随着国内外对西番莲需求的不断增长，我国的西番莲种植面积逐渐增大，病毒病随之发生、传播和扩散的风险也越来越高。为预防与控制西番莲病毒病，加强病毒的早期检测，明确病毒发生的种类，对于及时制定有效的防治措施，保护西番莲生产安全具有重要意义。鉴别寄主鉴定、电子显微镜观察、血清学检测、RT-PCR是植物病毒检测诊断的常用方法。利用鉴别寄主鉴定方法需要隔离种植的指示植物，结果虽直观，但易受环境条件的影响；电子显微镜观察需要昂贵的仪器，并对操作的专业技术人员具有较高的要求；血清学酶联免疫吸附测定方法的灵敏度相对较低，检测结果容易出现假阴性。基于核酸水平的分子生物学方法检测植物病毒，具有特异性强、灵敏度高和时间快的显著优点，但该方法在夜来香花叶病毒上应用的研究报道极少。关于TC-RT-nested PCR(试管捕捉巢式RT-PCR)技术检测夜来香花叶病毒，国内外至今尚未有报道，更未见专门用于夜来香花叶病毒检测的TC-RT-nested PCR检测试剂盒。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何快速、准确地检测农业生产及进出境口岸上的夜来香花叶病毒。为了解决上述技术问题，本发明克服了现有技术中存在的缺陷和不足，提供了一种夜来香花叶病毒的TC-RT-nested PCR检测试剂盒及其检测方法，以满足农业生产及进出境口岸检疫的需要。
第一方面，本发明保护用于检测或辅助检测夜来香花叶病毒的成套引物对。
本发明提供的用于检测或辅助检测夜来香花叶病毒的成套引物对由特异引物对甲和特异引物对乙组成；
所述特异引物对甲由外侧正向引物和外侧反向引物组成；
所述特异引物对乙由内侧正向引物和内侧反向引物组成；
所述外侧正向引物为如下a1)或a2)：
a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；
a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；
所述外侧反向引物为如下a3)或a4)：
a3)序列表中序列2所示的单链DNA分子；
a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子；
所述内侧正向引物为如下b1)或b2)：
b1)序列表中序列3所示的单链DNA分子；
b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；
所述内侧反向引物为如下b3)或b4)：
b3)序列表中序列4所示的单链DNA分子；
b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子。
进一步的，所述外侧正向引物、所述外侧反向引物、所述内侧正向引物和所述内侧反向引物的摩尔比为1:1:1:1。
第二方面，本发明保护上述成套引物对的新用途。
本发明提供了上述成套引物对在如下c1)-c8)中任一所述的应用：
c1)制备用于检测或辅助检测夜来香花叶病毒的产品；
c2)检测或辅助检测夜来香花叶病毒；
c3)制备用于鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为夜来香花叶病毒的产品；
c4)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为夜来香花叶病毒；
c5)制备用于检测或辅助检测待测样品是否感染夜来香花叶病毒的产品；
c6)检测或辅助检测待测样品是否感染夜来香花叶病毒；
c7)制备鉴别或辅助鉴别夜来香花叶病毒与其他病毒的产品；
c8)鉴别或辅助鉴别夜来香花叶病毒与其他病毒。
第三方面，本发明保护含有上述成套引物对的试剂盒；
所述试剂盒的功能为如下d1)-d4)中任一种：
d1)检测或辅助检测夜来香花叶病毒；
d2)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为夜来香花叶病毒；
d3)检测或辅助检测待测样品是否感染夜来香花叶病毒；
d4)鉴别或辅助鉴别夜来香花叶病毒与其他病毒。
进一步的，本发明的试剂盒包括含有夜来香花叶病毒的阳性对照样品和不含有夜来香花叶病毒的阴性对照样品。
更进一步的，本发明的试剂盒由如下试剂组成：病毒抽提缓冲液(1×)、PBST缓冲液(1×)、外侧正向引物(10μmol/L)、外侧反向引物(10μmol/L)、内侧正向引物(10μmol/L)、内侧反向引物(10μmol/L)、RT Buffer(5×)、RNA酶抑制因子(40U/μL)、反转录酶(200U/μL)、dNTPs(10mmol/L)、PCR Mix(2×)、含有夜来香花叶病毒的阳性对照样品、不含有夜来香花叶病毒的阴性对照样品和RNase-free ddH2O。
上述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。
所述试剂盒的制备方法为如下(Ⅰ)或(Ⅱ)：
(Ⅰ)上述成套引物对中各引物对的各条引物分别单独包装；
(Ⅱ)上述成套引物对中各引物对的各条引物按比例混合在一起。
第四方面，本发明保护一种鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为夜来香花叶病毒的方法。
本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为夜来香花叶病毒的方法包括如下步骤：
e1)以待测病毒的cDNA为模板，采用上述特异引物对甲进行第1轮PCR扩增，得到第1轮PCR扩增产物；
e2)以所述第1轮PCR扩增产物为模板，采用上述特异引物对乙进行第2轮PCR扩增，得到第2轮PCR扩增产物；
根据所述第2轮PCR扩增产物判定待测病毒是否为夜来香花叶病毒：
若所述第2轮PCR扩增产物中含有大小为504bp的条带，则所述待测病毒为夜来香花叶病毒；
若所述第2轮PCR扩增产物中不含有大小为504bp的条带，则所述待测病毒不为夜来香花叶病毒。
第五方面，本发明保护一种检测或辅助检测待测样品是否感染夜来香花叶病毒的方法。
本发明提供的检测或辅助检测待测样品是否感染夜来香花叶病毒的方法包括如下步骤：
f1)以待测样品的cDNA为模板，采用上述特异引物对甲进行第1轮PCR扩增，得到第1轮PCR扩增产物；
f2)以所述第1轮PCR扩增产物为模板，采用上述特异引物对乙进行第2轮PCR扩增，得到第2轮PCR扩增产物；
根据所述第2轮PCR扩增产物判定待测样品是否感染夜来香花叶病毒：
若所述第2轮PCR扩增产物中含有大小为504bp的条带，则所述待测样品感染夜来香花叶病毒；
若所述第2轮PCR扩增产物中不含有大小为504bp的条带，则所述待测样品未感染夜来香花叶病毒。
第六方面，本发明保护一种鉴别或辅助鉴别夜来香花叶病毒与其他病毒的方法。
本发明提供的鉴别或辅助鉴别夜来香花叶病毒与其他病毒的方法包括如下步骤：
g1)以待测病毒的cDNA为模板，采用上述特异引物对甲进行第1轮PCR扩增，得到第1轮PCR扩增产物；
g2)以所述第1轮PCR扩增产物为模板，采用上述特异引物对乙进行第2轮PCR扩增，得到第2轮PCR扩增产物；
根据所述第2轮PCR扩增产物判定待测病毒为夜来香花叶病毒还是其他病毒：
若所述第2轮PCR扩增产物中含有大小为504bp的条带，则所述待测病毒为夜来香花叶病毒；
若所述第2轮PCR扩增产物中不含有大小为504bp的条带，则所述待测病毒为其他病毒；
所述其他病毒可为黄瓜花叶病毒(CMV)、甜菜花叶病毒(BtMV)、大豆花叶病毒(SMV)、虎眼万年青花叶病毒(OrMV)、东亚西番莲病毒(EAPV)和西番莲潜隐病毒(PLV)中的至少一种。
上述方法中，所述待测病毒或所述待测样品的cDNA的制备方法如下：将病毒抽提缓冲液与待测病毒或待测样品充分研磨混匀，得到混合液；将所述混合液进行离心，收集上清液，得到样品提取液；将所述样品提取液进行反转录反应，得到所述待测病毒或所述待测样品的cDNA。
上述方法中，所述大小为504bp的条带为夜来香花叶病毒外壳蛋白基因第253-756位所示的核酸分子，其核苷酸序列具体如序列表中序列5所示。
进一步的，所述待测病毒或所述待测样品与所述病毒抽提缓冲液的配比为1g:10mL。
更进一步的，所述离心的条件可为4℃，10000g离心10min。
上述方法中，所述反转录反应前还包括如下步骤：将所述样品提取液加入PCR管中，37℃孵育4h；倒去样品提取液，用PBST缓冲液洗管3次，再用RNase-free ddH2O洗管1次。
进一步的，所述反转录的具体步骤如下：先向PCR管中加入RNase-free ddH2O 10μL和浓度为10μmol/L的外侧反向引物1μL，72℃水浴10min后立即冰浴5min，再加入下列试剂：5×RT Buffer 5μL、浓度为10mmol/L的dNTPs 2μL、浓度为40U/μL的RNA酶抑制因子1μL、浓度为200U/μL的反转录酶1μL，42℃水浴60min，72℃水浴10min，合成cDNA。
上述方法中，所述第1轮PCR扩增反应体系如下：cDNA 2μL、2×PCR Mix 12.5μL、浓度为10μmol/L的外侧正向引物1μL、浓度为10μmol/L的外侧反向引物1μL、RNase-freeddH2O 8.5μL。所述第1轮PCR扩增反应程序如下：94℃预变性3min，然后94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，如此共35个循环，最后一个循环结束后于72℃继续延伸10min，反应结束。
上述方法中，所述第2轮PCR扩增反应体系如下：第1轮PCR扩增产物0.5μL、2×PCRMix 12.5μL、浓度为10μmol/L的内侧正向引物1μL、浓度为10μmol/L的内侧反向引物1μL、RNase-free ddH2O 10μL。所述第2轮PCR扩增反应程序如下：94℃预变性3min，然后94℃变性30s，57℃退火1min，72℃延伸1min，如此共30个循环，最后一个循环结束后于72℃继续延伸10min，反应结束。
本发明最后保护上述特异引物对甲或上述特异引物对乙或夜来香花叶病毒外壳蛋白基因第253-756位所示的核酸分子。
上述特异引物对甲或特异引物对乙或夜来香花叶病毒外壳蛋白基因第253-756位所示的核酸分子在如下c1)-c8)中任一所述的应用也属于本发明的保护范围：
c1)制备用于检测或辅助检测夜来香花叶病毒的产品；
c2)检测或辅助检测夜来香花叶病毒；
c3)制备用于鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为夜来香花叶病毒的产品；
c4)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为夜来香花叶病毒；
c5)制备用于检测或辅助检测待测样品是否感染夜来香花叶病毒的产品；
c6)检测或辅助检测待测样品是否感染夜来香花叶病毒；
c7)制备鉴别或辅助鉴别夜来香花叶病毒与其他病毒的产品；
c8)鉴别或辅助鉴别夜来香花叶病毒与其他病毒。
本发明根据夜来香花叶病毒外壳蛋白基因设计2对特异性引物，采用TC-RT-nested PCR技术，将试管捕捉和巢式RT-PCR两种技术相结合来检测夜来香花叶病毒。该方法首先利用试管非特异性捕捉病毒粒体，然后在PCR管中直接进行反转录，合成cDNA，再利用cDNA为模板进行第1轮PCR扩增，最后以第1轮PCR扩增产物作为模板进行第2轮PCR扩增。较之现有技术而言，本发明所提供的夜来香花叶病毒TC-RT-nested PCR检测试剂盒及其检测方法有益效果在于：1)操作简便、成本低：本发明无需复杂的RNA提取步骤，不仅避免了受植物成分影响造成无法提取高质量的RNA，而且有效去除了样品中PCR抑制因子，同时操作人员避免了接触用于RNA提取的有毒化学试剂；与血清学检测方法相比，无需病毒抗体，检测成本大大降低；2)特异性强：根据夜来香花叶病毒外壳蛋白基因设计的外侧、内侧2对引物，其中内侧引物对的扩增区域位于外侧引物对的扩增区域内部，有效避免了非特异性扩增的发生，确保扩增的特异性。本发明仅从感染夜来香花叶病毒的样品上扩增到预期大小的特异性目的片段(504bp)，而从其他病毒样品及健康样品上均未扩增到大小为504bp的特异性目的片段，证实本发明方法具有很强的特异性；3)灵敏度高：本发明通过2轮PCR扩增，使灵敏度呈数量级增长，能够对病毒含量极低的样品进行检测，因此在西番莲种苗早期病毒检测上具有很好的应用价值。
附图说明
图1为实施例2的夜来香花叶病毒检测结果。其中M：DNA分子量标准(100bp)；1：阳性对照样品；2：夜来香花叶病毒病叶；3：阴性对照样品；4：空白对照。
图2为实施例3的特异性测定结果。其中M：DNA分子量标准(100bp)；1：夜来香花叶病毒(TeMV)样品；2：黄瓜花叶病毒(CMV)样品；3：甜菜花叶病毒(BtMV)样品；4：大豆花叶病毒(SMV)样品；5：虎眼万年青花叶病毒(OrMV)样品；6：东亚西番莲病毒(EAPV)样品；7：西番莲潜隐病毒(PLV)；8：阴性对照。
图3为实施例4的第1轮PCR扩增的灵敏度测定结果。其中M：DNA分子量标准(100bp)；1：夜来香花叶病毒样品提取液原液；2：10-1倍稀释；3：10-2倍稀释；4：10-3倍稀释；5：10-4倍稀释；6：10-5倍稀释；7：10-6倍稀释；8：10-7倍稀释；9：10-8倍稀释；10：10-9倍稀释；11：10-10倍稀释；12：阴性对照。
图4为实施例4的第2轮PCR扩增的灵敏度测定结果。其中M：DNA分子量标准(100bp)；1：夜来香花叶病毒样品提取液原液；2：10-1倍稀释；3：10-2倍稀释；4：10-3倍稀释；5：10-4倍稀释；6：10-5倍稀释；7：10-6倍稀释；8：10-7倍稀释；9：10-8倍稀释；10：10-9倍稀释；11：10-10倍稀释；12：阴性对照。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的病毒抽提缓冲液是将PVP(聚乙烯吡咯烷酮)和PBST缓冲液(pH7.4)混匀得到的。其中PVP(聚乙烯吡咯烷酮)浓度为2％；PBST缓冲液(pH 7.4)是将KH2PO4、Na2HPO4、NaCl、KCl、Tween-20和蒸馏水混匀得到的，各个溶质的浓度如下：1.5mM KH2PO4、8.1mM Na2HPO4、137mM NaCl、2.7mM KCl、0.05％Tween-20。
实施例1、夜来香花叶病毒的成套特异性引物及TC-RT-nested PCR检测试剂盒
一、用于检测夜来香花叶病毒的成套特异性引物
本发明根据夜来香花叶病毒外壳蛋白基因设计了外侧、内侧共2对特异性引物，其中内侧特异引物的扩增区域位于外侧特异引物的扩增区域内部。引物序列如下：
外侧正向引物：5’-TACAAGCCTAACCAAACGGAT-3’(序列1)；
外侧反向引物：5’-TGATTTACATCTCGTGCAGT-3’(序列2)；
内侧正向引物：5’-TTCAACACAAGGGCAACCAA-3’(序列3)；
内侧反向引物：5’-CCTTTCAGTATCTTCGCCAGT-3’(序列4)。
二、用于检测夜来香花叶病毒的TC-RT-nested PCR试剂盒(10次检测量)
本发明的用于检测夜来香花叶病毒的TC-RT-nested PCR试剂盒由如下1)-14)所示的试剂组成：
1)病毒抽提缓冲液：1×，1瓶(100mL)；
2)PBST缓冲液：1×，1瓶(100mL)；
3)外侧正向引物：10μmol/L，1管(100μL)；
4)外侧反向引物：10μmol/L，1管(100μL)；
5)内侧正向引物：10μmol/L，1管(100μL)；
6)内侧反向引物：10μmol/L，1管(100μL)；
7)RT Buffer：5×，1管(100μL)；
8)RNA酶抑制因子：40U/μL，1管(20μL)；
9)反转录酶：200U/μL，1管(20μL)；
10)dNTPs：10mmol/L，1管(20μL)；
11)PCR Mix：2×，1管(100μL)；
12)含有夜来香花叶病毒的阳性对照样品，1管(1mL)；
13)不含有夜来香花叶病毒的阴性对照样品，1管(1mL)；
14)RNase-free ddH2O，1管(5mL)。
实施例2、夜来香花叶病毒的TC-RT-nested PCR检测试剂盒的检测方法
一、夜来香花叶病毒的TC-RT-nested PCR检测体系的建立及反应条件的优化
1、样品提取液制备：以含有夜来香花叶病毒的样品作为待测样品，按照样品与病毒抽提缓冲液的质量体积比为1g:10mL的比例加入病毒抽提缓冲液，充分研磨，4℃，10000g离心10min，收集上清液作为样品提取液。
2、反转录：将50μL样品提取液加入PCR管中，37℃孵育4h；倒去样品提取液，用PBST缓冲液洗管3次，再用RNase-free ddH2O洗管1次，在PCR管中直接进行反转录；先向PCR管中加入RNase-free ddH2O 10μL和浓度为10μmol/L的外侧反向引物1μL，72℃水浴10min后立即冰浴5min，再加入下列试剂：5×RT Buffer 5μL、浓度为10mmol/L的dNTPs 2μL、浓度为40U/μL的RNA酶抑制因子1μL、浓度为200U/μL的反转录酶1μL，42℃水浴60min，72℃水浴10min，合成cDNA。
3、第1轮PCR扩增：取步骤2合成的cDNA 2μL，每管加入2×PCR Mix 12.5μL、不同浓度的外侧正向引物1μL、不同浓度的外侧反向引物1μL、RNase-free ddH2O 8.5μL，混匀，得到反应液，反应液总体积为25μL；将反应液在下述条件下反应：94℃预变性3min，然后94℃变性30s，不同温度下退火1min，72℃延伸1min，如此共35个循环，最后一个循环结束后于72℃继续延伸10min，反应结束。
4、第2轮PCR扩增：取第1轮PCR扩增产物0.5μL，每管加入2×PCR Mix 12.5μL、不同浓度的内侧正向引物1μL、不同浓度的内侧反向引物1μL、RNase-free ddH2O10μL，混匀，得到反应液，反应液总体积为25μL；将反应液在下述条件下反应：94℃预变性3min，然后94℃变性30s，不同温度下退火1min，72℃延伸1min，如此进行不同个数的循环，最后一个循环结束后于72℃继续延伸10min，反应结束。
5、PCR扩增产物电泳检测：第2轮PCR扩增结束后，取PCR产物10μL用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，溴化乙锭染色后在凝胶成像系统上观察并记录实验结果。
上述步骤3中的“不同浓度”分别为20μmol/L、15μmol/L、10μmol/L、9μmol/L、8μmol/L、7μmol/L、6μmol/L、5μmol/L、4μmol/L、3μmol/L、2μmol/L、1μmol/L、0.5μmol/L、0.25μmol/L或0.125μmol/L。外侧正向引物和外侧反向引物之间做了不同浓度之间的排列组合，如外侧正向引物为20μmol/L时，外侧反向引物分别为20μmol/L、15μmol/L、10μmol/L、9μmol/L、8μmol/L、7μmol/L、6μmol/L、5μmol/L、4μmol/L、3μmol/L、2μmol/L、1μmol/L、0.5μmol/L、0.25μmol/L或0.125μmol/L。
上述步骤3)中的“不同温度”分别为58℃、57.5℃、57℃、56.5℃、56℃、55.5℃、55℃、54.5℃、54℃、53.5℃、53℃、52.5℃、52℃、51.5℃、51℃、50.5℃或50℃。
上述步骤4)中的“不同浓度”分别为20μmol/L、15μmol/L、10μmol/L、9μmol/L、8μmol/L、7μmol/L、6μmol/L、5μmol/L、4μmol/L、3μmol/L、2μmol/L、1μmol/L、0.5μmol/L、0.25μmol/L或0.125μmol/L。内侧正向引物和内侧反向引物之间做了不同浓度之间的排列组合，如内侧正向引物为20μmol/L时，内侧反向引物分别为20μmol/L、15μmol/L、10μmol/L、9μmol/L、8μmol/L、7μmol/L、6μmol/L、5μmol/L、4μmol/L、3μmol/L、2μmol/L、1μmol/L、0.5μmol/L、0.25μmol/L或0.125μmol/L。
上述步骤4)中的“不同温度”分别为58℃、57.5℃、57℃、56.5℃、56℃、55.5℃、55℃、54.5℃、54℃、53.5℃、53℃、52.5℃、52℃、51.5℃、51℃、50.5℃或50℃。
上述步骤4)中的“不同个数”分别为5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个或40个。
TC-RT-nested PCR检测结果表明，第1轮PCR最佳反应体系为：cDNA 2μL、2×PCRMix 12.5μL、浓度为10μmol/L的外侧正向引物1μL、浓度为10μmol/L的外侧反向引物1μL和RNase-free ddH2O 8.5μL；第1轮PCR最佳反应条件为：94℃预变性3min，然后94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，如此共35个循环，最后一个循环结束后于72℃继续延伸10min，反应结束。
第2轮PCR最佳反应体系为：第1轮PCR扩增产物0.5μL、2×PCR Mix 12.5μL、浓度为10μmol/L的内侧正向引物1μL、浓度为10μmol/L的内侧反向引物1μL、RNase-free ddH2O 10μL；第2轮PCR最佳反应条件为：94℃预变性3min，然后94℃变性30s，57℃退火1min，72℃延伸1min，如此共30个循环，最后一个循环结束后于72℃继续延伸10min，反应结束。
二、夜来香花叶病毒的TC-RT-nested PCR检测试剂盒的检测方法
以夜来香花叶病毒(TeMV)的病叶样品作为待测样品。采用实施例1中的夜来香花叶病毒的TC-RT-nested PCR检测试剂盒检测夜来香花叶病毒。具体步骤如下：
1、样品提取液的制备：将待测样品与病毒抽提缓冲液按照待测样品与病毒抽提缓冲液的质量体积比为1g:10mL的比例混匀，充分研磨，4℃，10000g离心10min，收集上清液作为样品提取液。
2、反转录：将50μL样品提取液加入PCR管中，37℃孵育4h；倒去样品提取液，用PBST缓冲液洗管3次，再用RNase-free ddH2O洗管1次，在PCR管中直接进行反转录；先向PCR管中加入RNase-free ddH2O 10μL和外侧反向引物1μL，72℃水浴10min后立即冰浴5min，再加入下列试剂：5×RT Buffer 5μL、浓度为10mmol/L的dNTPs 2μL、浓度为40U/μL的RNA酶抑制因子1μL、浓度为200U/μL的反转录酶1μL，42℃水浴60min，72℃水浴10min，合成cDNA。
3、第1轮PCR扩增：取步骤2合成的cDNA 2μL，每管加入2×PCR Mix 12.5μL、浓度为10μmol/L的外侧正向引物1μL、浓度为10μmol/L的外侧反向引物1μL、RNase-free ddH2O8.5μL，混匀，得到反应液，反应液总体积为25μL；将反应液在下述条件下反应：94℃预变性3min，然后94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，如此共35个循环，最后一个循环结束后于72℃继续延伸10min，反应结束。
4、第2轮PCR扩增：取第1轮PCR扩增产物0.5μL，每管加入2×PCR Mix 12.5μL、浓度为10μmol/L的内侧正向引物1μL、浓度为10μmol/L的内侧反向引物1μL、RNase-free ddH2O10μL，混匀，得到反应液，反应液总体积为25μL；将反应液在下述条件下反应：94℃预变性3min，然后94℃变性30s，57℃退火1min，72℃延伸1min，如此共30个循环，最后一个循环结束后于72℃继续延伸10min，反应结束。
5、PCR扩增产物电泳检测：取PCR反应产物10μL用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，在凝胶成像系统上观察并记录实验结果。
6、结果判定：若扩增得到大小为504bp的条带，则待测样品含有夜来香花叶病毒；若扩增未得到大小为504bp的条带，则待测样品不含有夜来香花叶病毒。
待测样品电泳检测结果如图1所示，从图中可以看出：感染夜来香花叶病毒的病叶样品在504bp处出现明亮的DNA条带。
实施例3、夜来香花叶病毒的TC-RT-nested PCR检测试剂盒的特异性测定
分别以健康西番莲叶片、黄瓜花叶病毒(CMV)样品、甜菜花叶病毒(BtMV)样品、大豆花叶病毒(SMV)样品、虎眼万年青花叶病毒(OrMV)样品、东亚西番莲病毒(EAPV)样品、西番莲潜隐病毒(PLV)样品、夜来香花叶病毒(TeMV)样品作为待测样品。采用实施例1中的夜来香花叶病毒的TC-RT-nested PCR检测试剂盒检测各个待测样品中的夜来香花叶病毒。试验同时以不含有夜来香花叶病毒(TeMV)的样品作为阴性对照。具体步骤如下：
1、样品提取液的制备：将如下待测样品：健康西番莲叶片、黄瓜花叶病毒(CMV)样品、甜菜花叶病毒(BtMV)样品、大豆花叶病毒(SMV)样品、虎眼万年青花叶病毒(OrMV)样品、东亚西番莲病毒(EAPV)样品、西番莲潜隐病毒(PLV)样品、夜来香花叶病毒(TeMV)样品分别与病毒抽提缓冲液按照待测样品与病毒抽提缓冲液的质量体积比为1g:10mL的比例混匀，充分研磨，4℃，10000g离心10min，收集上清液作为样品提取液。
2、反转录：将50μL样品提取液加入PCR管中，37℃孵育4h；倒去样品提取液，用PBST缓冲液洗管3次，再用RNase-free ddH2O洗管1次，在PCR管中直接进行反转录；先向PCR管中加入RNase-free ddH2O 10μL和外侧反向引物1μL，72℃水浴10min后立即冰浴5min，再加入下列试剂：5×RT Buffer 5μL、浓度为10mmol/L的dNTPs 2μL、浓度为40U/μL的RNA酶抑制因子1μL、浓度为200U/μL的反转录酶1μL，42℃水浴60min，72℃水浴10min，合成cDNA。
3、第1轮PCR扩增：取步骤2合成的cDNA 2μL，每管加入2×PCR Mix 12.5μL、浓度为10μmol/L的外侧正向引物1μL、浓度为10μmol/L的外侧反向引物1μL、RNase-free ddH2O8.5μL，混匀，得到反应液，反应液总体积为25μL；将反应液在下述条件下反应：94℃预变性3min，然后94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，如此共35个循环，最后一个循环结束后于72℃继续延伸10min，反应结束。
4、第2轮PCR扩增：取第1轮PCR扩增产物0.5μL，每管加入2×PCR Mix 12.5μL、浓度为10μmol/L的内侧正向引物1μL、浓度为10μmol/L的内侧反向引物1μL、RNase-free ddH2O10μL，混匀，得到反应液，反应液总体积为25μL；将反应液在下述条件下反应：94℃预变性3min，然后94℃变性30s，57℃退火1min，72℃延伸1min，如此共30个循环，最后一个循环结束后于72℃继续延伸10min，反应结束。
5、PCR扩增产物电泳检测：取PCR反应产物10μL用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，在凝胶成像系统上观察并记录实验结果。
结果如图2所示，从图2中可以看出：仅从夜来香花叶病毒(TeMV)样品上扩增到大小为504bp的目的片段，而从黄瓜花叶病毒(CMV)、甜菜花叶病毒(BtMV)、大豆花叶病毒(SMV)、虎眼万年青花叶病毒(OrMV)、东亚西番莲病毒(EAPV)、西番莲潜隐病毒(PLV)等病毒和阴性对照(健康西番莲)样品上均未扩增到目的片段，说明本发明试剂盒具有很强的特异性。
实施例4、夜来香花叶病毒的TC-RT-nested PCR检测试剂盒的灵敏度测定
用健康西番莲叶片提取液将实施例2步骤1中制备的夜来香花叶病毒提取液进行10倍梯度稀释，依次稀释为原液的10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10倍作为待测样品。采用实施例1中的夜来香花叶病毒的TC-RT-nested PCR检测试剂盒按照实施例2中的方法检测待测样品中的夜来香花叶病毒。试验同时以不含有夜来香花叶病毒(TeMV)的样品作为阴性对照。
结果如图3和图4所示(图3为第1轮PCR扩增测定结果，图4为第2轮PCR扩增测定结果)，从图中可以看出：经过第2轮PCR扩增，可将灵敏度提高103倍，即巢式可以检测稀释到10-5倍的夜来香花叶病毒样品提取液原液。说明本发明试剂盒具有很高的灵敏度。
实施例5、夜来香花叶病毒的TC-RT-nested PCR检测试剂盒的应用
选取300份西番莲样品，采用实施例1中的夜来香花叶病毒的TC-RT-nested PCR检测试剂盒按照实施例2中的方法检测待测样品中的夜来香花叶病毒。试验同时采用普通RT-PCR方法进行检测作为对照。
普通RT-PCR方法的具体检测步骤：
1、RNA提取：取0.1g西番莲样品组织置于研钵中，加入液氮研磨至粉末状后迅速移入1.5mL离心管，再加入1mL TrizoL试剂，剧烈震荡摇匀3min；4℃，12000g离心10min，取上清；加入氯仿300μL，剧烈震荡15s，室温静置5min，4℃，12000g离心15min，取上层水相；加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后室温下静置15min，4℃，12000g离心10min，弃上清；加入1mL75％的乙醇洗涤沉淀2次，每次4℃，7500g离心3min，弃上清；RNA沉淀干燥后，用20μLRNase-free ddH2O溶解。
2、RT-PCR：取西番莲样品RNA 3μL、RNase-free ddH2O 7μL和外侧反向引物1μL至PCR管中，72℃水浴10min后立即冰浴5min，再加入下列试剂：5×RT Buffer 5μL、浓度为10mmol/L的dNTPs 2μL、浓度为40U/μL的RNA酶抑制因子1μL、浓度为200U/μL的反转录酶1μL，42℃水浴60min，72℃水浴10min，合成cDNA；取合成的cDNA 2μL，每管加入2×PCR Mix12.5μL、浓度为10μmol/L的外侧正向引物1μL、浓度为10μmol/L的外侧反向引物1μL、RNase-free ddH2O 8.5μL，混匀，得到反应液，反应液总体积为25μL；将反应液在下述条件下反应：94℃预变性3min，然后94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，如此共35个循环，最后一个循环结束后于72℃继续延伸10min，反应结束。
3、PCR扩增产物电泳检测：取PCR反应产物10μL用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，在凝胶成像系统上观察并记录实验结果。
4、结果判定：若扩增得到大小为551bp的条带，则待测样品含有夜来香花叶病毒；若扩增未得到大小为551bp的条带，则待测样品不含有夜来香花叶病毒。
结果如表1所示，从表中可以看出：采用本发明的试剂盒和检测方法能够从300份西番莲样品中检测出144份样品感染夜来香花叶病毒，检出率为48％，而普通PCR方法能够从300份西番莲样品中检测出128份样品感染夜来香花叶病毒，检出率为42.7％，比本发明方法的检出率低5.3％。上述结果证实本发明的方法检测结果更加准确可靠。
表1西番莲样品的检测结果
序列表
<110>福建省农业科学院果树研究所
<120>一种夜来香花叶病毒的TC-RT-nested-PCR检测试剂盒及其检测方法
<160>5
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>1
tacaagccta accaaacgga t 21
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>2
tgatttacat ctcgtgcagt 20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>3
ttcaacacaa gggcaaccaa 20
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>4
cctttcagta tcttcgccag t 21
<210>5
<211>504
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>5
ttcaacacaa gggcaaccaa gaaccaattc gactcatggt acaatgccat caagattgag 60
tatgaattga acgacgttca aatgaatgtc gtcatgaatg gtttcatggt gtggtgtatt 120
gaaaatggca cttcaccaga tgtcaatggc gtgtgggtga tgatggacgg agatgaacaa 180
attgagtacc cactcaagcc aatggttgaa aatgctaagc cgacactgag acaaatcatg 240
catcactttt cagatgcggc ggaagcatac attgagatga ggaattctga gggattgtac 300
atgcctaggt atggtcttct tagaaacctg agggataaaa gtctggcgcg atatgcattc 360
gatttctatg aggtcacctc taagacgtca gatagagcta aagaagctgt gacacaaatg 420
aaagcagccg ccctcgttgg cactacaaat aagatgtttg gactggatgg tagtgccagc 480
acaactggcg aagatactga aagg 504
Claims (10)
1.用于检测或辅助检测夜来香花叶病毒的成套引物对，由特异引物对甲和特异引物对乙组成；
所述特异引物对甲由外侧正向引物和外侧反向引物组成；
所述特异引物对乙由内侧正向引物和内侧反向引物组成；
所述外侧正向引物为如下a1)或a2)：
a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；
a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；
所述外侧反向引物为如下a3)或a4)：
a3)序列表中序列2所示的单链DNA分子；
a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子；
所述内侧正向引物为如下b1)或b2)：
b1)序列表中序列3所示的单链DNA分子；
b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；
所述内侧反向引物为如下b3)或b4)：
b3)序列表中序列4所示的单链DNA分子；
b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子。
2.如权利要求1所述的成套引物对，其特征在于：所述外侧正向引物、所述外侧反向引物、所述内侧正向引物和所述内侧反向引物的摩尔比为1:1:1:1。
3.权利要求1或2所述的成套引物对在如下c1)-c8)中任一所述的应用：
c1)制备用于检测或辅助检测夜来香花叶病毒的产品；
c2)检测或辅助检测夜来香花叶病毒；
c3)制备用于鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为夜来香花叶病毒的产品；
c4)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为夜来香花叶病毒；
c5)制备用于检测或辅助检测待测样品是否感染夜来香花叶病毒的产品；
c6)检测或辅助检测待测样品是否感染夜来香花叶病毒；
c7)制备鉴别或辅助鉴别夜来香花叶病毒与其他病毒的产品；
c8)鉴别或辅助鉴别夜来香花叶病毒与其他病毒。
4.含有权利要求1或2所述成套引物对的试剂盒；
所述试剂盒的功能为如下d1)-d4)中任一种：
d1)检测或辅助检测夜来香花叶病毒；
d2)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为夜来香花叶病毒；
d3)检测或辅助检测待测样品是否感染夜来香花叶病毒；
d4)鉴别或辅助鉴别夜来香花叶病毒与其他病毒。
5.权利要求4所述试剂盒的制备方法，为如下(Ⅰ)或(Ⅱ)：
(Ⅰ)权利要求1或2所述的成套引物对中各引物对的各条引物分别单独包装；
(Ⅱ)权利要求1或2所述的成套引物对中各引物对的各条引物按比例混合在一起。
6.一种鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为夜来香花叶病毒的方法，包括如下步骤：
e1)以待测病毒的cDNA为模板，采用权利要求1中所述的特异引物对甲进行第1轮PCR扩增，得到第1轮PCR扩增产物；
e2)以所述第1轮PCR扩增产物为模板，采用权利要求1中所述的特异引物对乙进行第2轮PCR扩增，得到第2轮PCR扩增产物；
根据所述第2轮PCR扩增产物判定待测病毒是否为夜来香花叶病毒：
若所述第2轮PCR扩增产物中含有大小为504bp的条带，则所述待测病毒为夜来香花叶病毒；
若所述第2轮PCR扩增产物中不含有大小为504bp的条带，则所述待测病毒不为夜来香花叶病毒。
7.一种检测或辅助检测待测样品是否感染夜来香花叶病毒的方法，包括如下步骤：
f1)以待测样品的cDNA为模板，采用权利要求1中所述的特异引物对甲进行第1轮PCR扩增，得到第1轮PCR扩增产物；
f2)以所述第1轮PCR扩增产物为模板，采用权利要求1中所述的特异引物对乙进行第2轮PCR扩增，得到第2轮PCR扩增产物；
根据所述第2轮PCR扩增产物判定待测样品是否感染夜来香花叶病毒：
若所述第2轮PCR扩增产物中含有大小为504bp的条带，则所述待测样品感染夜来香花叶病毒；
若所述第2轮PCR扩增产物中不含有大小为504bp的条带，则所述待测样品未感染夜来香花叶病毒。
8.一种鉴别或辅助鉴别夜来香花叶病毒与其他病毒的方法，包括如下步骤：
g1)以待测病毒的cDNA为模板，采用权利要求1中所述的特异引物对甲进行第1轮PCR扩增，得到第1轮PCR扩增产物；
g2)以所述第1轮PCR扩增产物为模板，采用权利要求1中所述的特异引物对乙进行第2轮PCR扩增，得到第2轮PCR扩增产物；
根据所述第2轮PCR扩增产物判定待测病毒为夜来香花叶病毒还是其他病毒：
若所述第2轮PCR扩增产物中含有大小为504bp的条带，则所述待测病毒为夜来香花叶病毒；
若所述第2轮PCR扩增产物中不含有大小为504bp的条带，则所述待测病毒为其他病毒。
9.权利要求1中所述的特异引物对甲或权利要求1中所述的特异引物对乙；
或夜来香花叶病毒外壳蛋白基因第253-756位所示的核酸分子。
10.权利要求1中所述的特异引物对甲或权利要求1中所述的特异引物对乙或夜来香花叶病毒外壳蛋白基因第253-756位所示的核酸分子在如下c1)-c8)中任一所述的应用：
c1)制备用于检测或辅助检测夜来香花叶病毒的产品；
c2)检测或辅助检测夜来香花叶病毒；
c3)制备用于鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为夜来香花叶病毒的产品；
c4)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为夜来香花叶病毒；
c5)制备用于检测或辅助检测待测样品是否感染夜来香花叶病毒的产品；
c6)检测或辅助检测待测样品是否感染夜来香花叶病毒；
c7)制备鉴别或辅助鉴别夜来香花叶病毒与其他病毒的产品；
c8)鉴别或辅助鉴别夜来香花叶病毒与其他病毒。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112501350A (zh) * | 2019-12-23 | 2021-03-16 | 新疆农业大学 | 检测三种无花果病毒的引物组合、试剂盒及其应用 |
| CN113303332A (zh) * | 2021-04-13 | 2021-08-27 | 广东省科学院生物工程研究所 | 一种抗夜来香花叶病毒的药物制剂和方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101307365A (zh) * | 2008-07-01 | 2008-11-19 | 云南出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 快速检测百合中南芥菜花叶病毒的方法 |
| CN104120192A (zh) * | 2014-06-26 | 2014-10-29 | 福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 水仙退化病毒巢式rt-pcr检测试剂盒及其检测方法 |
| KR20150022322A (ko) * | 2013-08-22 | 2015-03-04 | 대한민국(관리부서 : 농림축산식품부 농림축산검역본부) | 밀줄무늬모자이크 바이러스 특이적 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도 |
| CN106868208A (zh) * | 2017-02-23 | 2017-06-20 | 中国检验检疫科学研究院 | 利用数字pcr检测马铃薯y病毒的方法及其专用成套试剂 |
-
2018
- 2018-06-19 CN CN201810627542.XA patent/CN108559793A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101307365A (zh) * | 2008-07-01 | 2008-11-19 | 云南出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 快速检测百合中南芥菜花叶病毒的方法 |
| KR20150022322A (ko) * | 2013-08-22 | 2015-03-04 | 대한민국(관리부서 : 농림축산식품부 농림축산검역본부) | 밀줄무늬모자이크 바이러스 특이적 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도 |
| CN104120192A (zh) * | 2014-06-26 | 2014-10-29 | 福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 水仙退化病毒巢式rt-pcr检测试剂盒及其检测方法 |
| CN106868208A (zh) * | 2017-02-23 | 2017-06-20 | 中国检验检疫科学研究院 | 利用数字pcr检测马铃薯y病毒的方法及其专用成套试剂 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 林万明等: "《PCR技术操作和应用指南》", 30 September 1993, 人民军医出版社 * |
| 谢丽雪等: "侵染西番莲的夜来香花叶病毒的分子鉴定及特异性检测", 《中国农业科学》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112501350A (zh) * | 2019-12-23 | 2021-03-16 | 新疆农业大学 | 检测三种无花果病毒的引物组合、试剂盒及其应用 |
| CN112501350B (zh) * | 2019-12-23 | 2023-08-01 | 新疆农业大学 | 检测三种无花果病毒的引物组合、试剂盒及其应用 |
| CN113303332A (zh) * | 2021-04-13 | 2021-08-27 | 广东省科学院生物工程研究所 | 一种抗夜来香花叶病毒的药物制剂和方法 |
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