CN104099427B - 实时荧光定量pcr检测ca6病毒的方法 - Google Patents

实时荧光定量pcr检测ca6病毒的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属核酸检测领域，涉及一种实时荧光定量PCR检测CA6病毒的方法；该方法基于CA6 VP1序列设计了特异性的引物和Taqman探针，用于快速、特异和高灵敏度地检测CA6病毒，本发明方法能稳定和有效地扩增CA6基因片段，最高检测灵敏度能达到10copies/μl；且该方法的特异性高，未观察到假阳性的结果；本发明方法检测CA6快速，灵敏，可靠。可进一步用于大规模标本的实验室检测，及用于CA6的流行病学的监测工作，有助于临床实践中的早期快速诊断。

Description

实时荧光定量PCR检测CA6病毒的方法
技术领域
本发明属检测领域，涉及核酸检测方法，具体涉及一种实时荧光定量PCR检测CA6病毒的方法。
背景技术
现有技术公开了手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）是由人肠道病毒(human enterovirus，HEV)引起的常见传染病；有统计显示，该病一年四季均可发病，5～7月为高发期，5岁以下儿童多见，其中的大多数临床症状轻微，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主，少数患者可出现无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹（AFP）、神经源性肺水肿和心肌炎等，个别重症患儿病情进展快，可导致死亡。自1997年至今，在马来西亚，新加坡，澳大利亚，中国等多个国家已经有数次HFMD暴发流行；HFMD已经成为亚太地区严重的公共卫生问题并引起多个国家的关注。尽管引起HFMD的主要病原是EV71和CA16，但是近年来多个国家报道了以CA6为主要病原导致的HFMD暴发流行；2008年秋冬季，芬兰报道了以脱甲病为主要临床表现的HFMD的暴发，主要病原是CA6；同样，从2009至2011年在台湾，日本和新加坡等地区相继暴发了以CA6为主要病原的HFMD。在2012年冬季中国上海地区对肠道病毒监测中，发现了CA6取代了EV71为导致HFMD的主要肠道病毒。上述统计结果表明，CA6有可能成为新发的HFMD暴发流行的主要病原，因此，在HFMD的防控工作中，对于CA6的日常监测显得非常必要。
传统的HEV鉴定分型主要基于病毒分离和抗血清中和实验；但该方法鉴定周期长且抗血清容易和其他HEV产生交叉反应，随着分子生物学的发展，基于病毒核苷酸序列分析的分型方法越来越多地被应用。Nix等人研究的snPCR方法，结合sanger测序的方法可快速灵敏用于HEV分型鉴定。上述分子分型方法虽可对HEV分型鉴定，但通常需要测序和序列比对来确定病原，尤其在HEV暴发流行时，所述方法往往不适用于临床大规模标本中病原检测。迄今为止，世界范围内已经有数次CA6导致的HFMD暴发，但用于CA6特异性检测快速灵敏的方法尚鲜见有报道，尤其是未见有关特异性实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测CA6病毒的方法的报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供用于CA6特异性检测快速灵敏的方法，具体涉及一种实时荧光定量PCR检测CA6病毒的方法。
本发明方法基于CA6 VP1序列设计了特异性的引物和Taqman探针，可用于快速、特异和高灵敏度地检测疑似患者标本，进一步为HFMD的临床诊断和治疗及疫情防控提供参考依据。
具体的，本发明的实时荧光定量PCR检测CA6病毒的方法，其特征在于，其包括步骤：
（1）临床采集标本
收集手足口病患者的咽拭子、粪便标本；
（2）设计引物
根据Genbank库中收录的CA6的衣壳蛋白（VP1）编码序列并结合CA6流行地区的VP1序列，本发明的实施例中采用上海地区CA6流行的VP1序列，采用Primer Express 3.0设计合成CA6特异性real-time PCR的引物和探针；采用NCBI网站上的BLAST工具盒BioEdit软件（version 7.0.9）分析所设计的引物和探针的保守性；
所述引物和探针由上海Invitrogen公司合成；
（3）提取核酸，Real-time PCR和T-A克隆
采用High Pure Viral Nucleic Acid Kit（Roche 11858874001）提取病毒基因组RNA；将样本加入含poly(A)的Binding Buffer中，再加入蛋白酶K混匀，72 ℃裂解10 min，用柱子吸附RNA，加入Inhibitor Removal Buffer洗1次；再用Wash Buffer洗2次，最后用50µl Elution Buffer洗脱RNA；
PCR采用试剂盒（Takara DRR064A）进行，反应液中包含2× Buffer Mix 12.5μl, TaKaRa Ex Taq HS（5 U/ μl）0.5μl, PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.5μl, 上游引物CA6F 10pmol,下游引物CA6R 10pmol，探针3pmol,RNA模板2.5μl；
其中，PCR反应条件：42℃反转录，10min；95℃10s，60℃40s，运行45个循环，在60℃进行荧光采集；反应在实时荧光定量PCR仪（Applied Biosystems, ViiA™ 7系统）上进行，本发明所涉及的引物和探针序列如表1所示，
表 1 引物和探针序列
*参考的CA6病毒株为TW/399/10（Genbank No. JQ946054）；
取一份Real-time RT-PCR阳性产物25μl进行1.5%琼脂糖凝胶电泳；采用割胶纯化试剂盒（Invitrogen, K2100-12）回收107bp 大小的PCR产物，通过T-A克隆试剂盒（Takara，D101A）将PCR产物克隆进pMD18-T载体；通过测序获得克隆片段序列，然后使用BLAST工具对克隆片段进行比对分析；
（4）评估Real-time RT-PCR的灵敏度和特异性
评估该PCR方法的灵敏度,采用T-A克隆质粒制作标准品进行Standard curve实验的方法；首先微量紫外分光光度计（Thermo， NanoDrop ND-2000C）对克隆质粒进行核酸定量，然后进行10倍模板稀释，制作107～102copies/μl的标准品；以所述标准品为模板进行Real-time RT-PCR，获得Standard curve；
选取18种HEV血清型（包括EV71，EV68，CVA2，CVA4，CVA5，CVA10，CVA12，CVA21，CVB1，CVB2，CVB4，CVB5，Echo 3, Echo 9, Echo 19, Echo 25, Echo 30）验证该PCR方法的特异性：首先采用High Pure Viral Nucleic Acid Kit（Roche 11858874001）提取上述病毒株的基因组RNA，再以上述基因组RNA为模板并选择克隆质粒为阳性对照品进行real-time RT-PCR，观察扩增曲线；
（5）Real-time RT-PCR检测临床标本
对上述手足口病例标本，进行核酸提取；然后参考中国卫生部颁布的《手足口病预防控制指南（2009版）》，采用指南中推荐的RT-PCR进行肠道病毒属特异性筛选；筛选出的肠道病毒阳性标本再采用RT-PCR的方法进行EV71和CA16的筛选；肠道病毒属检测阳性而EV71和CA16检测阴性的标本，采用新建立的Real-time RT-PCR方法检测CA6，同时，采用RT-snPCR方法对上述标本进行平行检测分型，验证新荧光定量PCR方法的准确性。
本发明中，通过灵敏度和特异性实验，结果显示，所述的实时荧光定量PCR检测CA6病毒的方法，能稳定和有效地扩增CA6基因片段，最高检测灵敏度能达到10copies/μl；且该方法的特异性高，未观察到假阳性的结果；表明本发明所述的方法检测CA6快速，灵敏，可靠。本方法可进一步用于大规模标本的实验室检测，及用于CA6的流行病学的监测工作，有助于临床实践中的早期快速诊断。
附图说明
图1显示了 Bioedit分析引物和探针序列的保守性，其中，
A：上游引物CA6F和26株来自于2008年至2012年芬兰、西班牙、法国、日本、台湾、中国深圳以及上海地区流行的CA6的VP1序列的比对结果；
B：下游引物CA6R和26株来自于2008年至2012年芬兰、西班牙、法国、日本、台湾、中国深圳以及上海地区流行的CA6的VP1序列的比对结果；
C：探针CA6Pb和26株来自于2008年至2012年芬兰、西班牙、法国、日本、台湾、中国深圳以及上海地区暴发或正常流行的CA6的VP1序列的比对结果。
图2显示了Real-time RT-PCR方法的灵敏度和特异性实验结果，其中，
A：使用克隆质粒标准品（107～102copies/μl）进行PCR扩增获得的荧光曲线；
B：使用克隆质粒标准品（107～102copies/μl）进行PCR扩增获得的标准曲线（其中X代表样品中RNA的拷贝数的log10值，Y代表扩增的Ct值）；
C：使用18种其他肠道病毒血清型进行PCR，获得的荧光曲线；
D：30份临床HFMD咽拭子标本检测获得的荧光曲线（其中阳性对照为克隆质粒Ct值为18.79，阴性对照正常为水平曲线）。
具体实施方式
实施例1
1、实时荧光定量PCR检测CA6病毒的方法，步骤为：
（1）临床采集标本
2012年1至12月期间，从上海市公共卫生临床中心，上海交通大学医学院附属新华医院，上海市东方医院和上海市长宁区中心医院这四家医院的住院和门诊共收集605例HFMD患者共682份临床标本，其中咽拭子601份、粪便81份；手足口诊断依据中国卫生部《手足口病诊疗指南2010年版》；
（2）设计引物
根据Genbank库中收录的CA6的衣壳蛋白（VP1）编码序列并结合上海地区CA6流行的VP1序列，使用Primer Express 3.0设计合成CA6特异性real-time PCR的引物和探针；使用NCBI网站上的BLAST工具盒BioEdit软件（version 7.0.9）分析新设计引物和探针的保守性；引物和探针由上海Invitrogen公司合成；
（3）提取核酸，Real-time PCR和T-A克隆
采用High Pure Viral Nucleic Acid Kit（Roche 11858874001）提取病毒基因组RNA；将200 µl样本加入200 µl含poly(A)的Binding Buffer中，再加入50 µl蛋白酶K混匀，72 ℃裂解10 min，用柱子吸附RNA，加入Inhibitor Removal Buffer洗1次；再用WashBuffer洗2次，最后用50 µl Elution Buffer洗脱RNA；
PCR采用试剂盒（Takara DRR064A）进行，25μl反应液中包含2× Buffer Mix 12.5μl, TaKaRa Ex Taq HS（5 U/ μl）0.5μl, PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.5μl, 上游引物CA6F 10pmol,下游引物CA6R 10pmol，探针3pmol，RNA模板2.5μl；其中，PCR反应条件：42℃反转录，10min；95℃10s，60℃40s，运行45个循环，在60℃进行荧光采集；反应在实时荧光定量PCR仪（Applied Biosystems, ViiA™ 7系统）上进行，引物和探针序列如表1所示，
表 1 引物和探针序列
*参考的CA6病毒株为TW/399/10（Genbank No. JQ946054）；
取一份Real-time RT-PCR阳性产物25μl进行1.5%琼脂糖凝胶电泳；采用割胶纯化试剂盒（Invitrogen, K2100-12）回收107bp 大小的PCR产物；通过T-A克隆试剂盒（Takara，D101A）将PCR产物克隆进pMD18-T载体；通过测序获得克隆片段序列，然后使用BLAST工具对克隆片段进行比对分析；
（4）Real-time RT-PCR的灵敏度和特异性实验
评估该PCR方法的灵敏度,采用T-A克隆质粒制作标准品进行Standard curve实验的方法；首先，微量紫外分光光度计（Thermo， NanoDrop ND-2000C）对克隆质粒进行核酸定量，然后进行10倍模板稀释，制作107～102copies/μl的标准品；以上述标准品为模板进行Real-time RT-PCR，获得Standard curve；
选取18种HEV血清型（包括EV71，EV68，CVA2，CVA4，CVA5，CVA10，CVA12，CVA21，CVB1，CVB2，CVB4，CVB5，Echo 3, Echo 9, Echo 19, Echo 25, Echo 30）验证该PCR方法的特异性；
首先，采用High Pure Viral Nucleic Acid Kit（Roche 11858874001）提取这些病毒株的基因组RNA；然后，以上述基因组RNA为模板并选择克隆质粒为阳性对照品进行real-time RT-PCR，观察扩增曲线；
（5）Real-time RT-PCR检测临床标本
对2012年收集的682份手足口病例标本，进行核酸提取；然后参考中国卫生部颁布的《手足口病预防控制指南（2009版）》，采用指南中推荐的RT-PCR进行肠道病毒属特异性筛选；筛选出的肠道病毒阳性标本再采用RT-PCR的方法进行EV71和CA16的筛选；肠道病毒属检测阳性而EV71和CA16检测阴性的标本，采用新建立的Real-time RT-PCR方法检测CA6；同时，采用Nix等人研究的RT-snPCR方法对上述标本进行平行检测分型，验证新荧光定量PCR方法的准确性。
2、结果
（1）引物和探针序列保守性分析
从Genbank数据库中，选取26株CA6的VP1核酸序列，分别来自于2008年至2012年芬兰、西班牙、法国、日本、台湾、中国深圳以及上海地区暴发或正常流行的CA6序列（GenbankNO. GU248455,GU248433,GU248435,GU248427 ,JQ946054,JQ946053,HE572931,HE572927,HE572925,HE572938,AB649289,AB649287,AB678778,AB649291,AB649288,FR797984,FR797986,FR797987,JX154933,JX154927,JX473382,JX473378,JX495135,JX495148,KC414731,KC414755）；使用Bioedit软件中ClustalW程序将上下游引物以及探针分别与选取的CA6核酸序列进行alignment分析；
结果如图1所示，上游引物CA6F和台湾，法国，日本的流行株的序列完全匹配；虽然与上海的序列以及08年西班牙流行株序列有一个碱基错配，但理论上不会影响PCR的扩增（如图1A所示）；下游引物CA6R只在引物5’端最后一个碱基存在部分错配，理论上也不会影响PCR反应（如图1B所示）；从探针序列可看出CA6Pb和近年来暴发流行的CA6序列完全匹配（如图1C所示）；上述结果表明，本发明新合成的引物和探针序列相对适用于近年来多个国家地区（包括中国）流行的CA6株；
（2）Real-time RT-PCR灵敏度和特异性
采用克隆质粒标准品（107～102copies/μl），进行Real-time RT-PCR，获得标准曲线（如图2A和B所示）；PCR扩增曲线显示各个标准品之间能保持一致的水平间距，其线性相关系数R2较高（=0.997），表明所述的PCR方法能稳定有效的扩增CA6 VP1基因片段；该PCR方法最高能检测到10 copies/μl，能有力的说明该PCR方法的灵敏度；
本发明通过下述两方面评估建立的PCR方法的特异性，首先，在设计完成引物和探针后，使用BLAST工具在Genbank数据库中进行了比对分析, 结果未发现上下游引物或探针和数据库中其他物种有PCR扩增的模板匹配可能性；其次，使用18种非CA6的其他肠道病毒血清型进行该PCR实验，扩增结果均为阴性（如图2C所示），表明所述引物和探针与其他型别肠道病毒存在交叉反应的可能性较小；
（3）检测临床标本结果
通过对682份临床标本核酸抽提，然后分别依次进行肠道病毒属特异性Real-timeRT-PCR检测，EV71，CA16的RT-PCR检测，CA6的Real-time RT-PCR检测（图2D图中显示了一次30份临床标本检测结果，其他数据未提供），结果显示，共检出366份肠道病毒阳性标本，其中包括137份EV71阳性标本，99份CA16阳性标本，84份CA6阳性标本，还有38份为未分型的肠道病毒；通过RT-snPCR结合DNA测序方法（参比方法）对122份肠道病毒阳性进行平行分型鉴定，结果表明，本发明所述的CA6 real time RT-PCR检测方法与参比方法的符合率为100%。
上述实施例结果表明，本发明的实时荧光定量PCR检测CA6病毒的方法，能稳定和有效地扩增CA6基因片段，最高检测灵敏度能达到10copies/μl；且该方法的特异性高，未观察到假阳性的结果；结果表明，本发明所述的方法检测CA6快速，灵敏，可靠。本方法可进一步用于大规模标本的实验室检测，及用于CA6的流行病学的监测工作，有助于临床实践中的早期快速诊断。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海市公共卫生临床中心
<120> 实时荧光定量PCR检测CA6病毒的方法
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> CA6F
<400> 1
caagcygcag aaacgggagc 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> CA6R
<400> 2
gaagtgytcc acactcgcct c 21
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> CA6P
<400> 3
ccgtttcgat tcatcacaca rcgagt 26

Claims (9)

1.实时荧光定量PCR检测CA6病毒的引物和探针，其特征在于，其序列为，
CA6F：CAAGCYGCAGAAACGGGAGC，CA6R：GAAGTGYTCCACACTCGCCTC，CA6P ：FAM-CCGTTTCGATTCATCACACARCGAGT-BHQ1。
2.权利要求1的实时荧光定量PCR检测CA6病毒的引物和探针在制备CA6病毒检测试剂中的用途。
3.按权利要求2所述的用途，其特征在于，检测CA6病毒的方法中包括步骤：
（1）采集标本
收集获得手足口病患者离体的咽拭子、粪便标本；
（2）设计引物
根据Genbank库中收录的CA6的衣壳蛋白VP1编码序列并结合CA6流行地区的VP1序列，设计合成CA6特异性real-time PCR的引物和探针，然后分析上述引物和探针的保守性；
（3）提取核酸，Real-time PCR和T-A克隆
提取病毒基因组RNA；将样本加入含polyA的Binding Buffer中，再加入蛋白酶K混匀，72 ℃裂解，用柱子吸附RNA，加入Inhibitor Removal Buffer洗1次；再用Wash Buffer洗2次，最后用Elution Buffer洗脱RNA；
PCR采用试剂盒进行，25μl反应液中包含2× Buffer Mix 12.5μl, TaKaRa Ex TaqHS 0.5μl, PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.5μl, 上游引物CA6F 10pmol,下游引物CA6R10pmol，探针3pmol,RNA模板2.5μl；
其中，PCR反应条件：42℃反转录，10min；95℃10s，60℃40s，运行45个循环，在60℃进行荧光采集；反应在实时荧光定量PCR仪上进行，引物和探针序列为，
*参考的CA6病毒株为TW/399/10；
取Real-time RT-PCR阳性产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳；采用割胶纯化试剂盒回收PCR产物，通过T-A克隆试剂盒将PCR产物克隆进pMD18-T载体；通过测序获得克隆片段序列，然后用BLAST工具对克隆片段进行比对分析；
（4）评估Real-time RT-PCR的灵敏度和特异性
采用T-A克隆质粒制作标准品进行Standard curve实验的方法：首先微量紫外分光光度计对克隆质粒进行核酸定量，然后进行10倍模板稀释，制作107～102copies/μl的标准品；以所述标准品为模板进行Real-time RT-PCR，获得Standard curve；
选取18种HEV血清型，包括EV71，EV68，CVA2，CVA4，CVA5，CVA10，CVA12，CVA21，CVB1，CVB2，CVB4，CVB5，Echo 3, Echo 9, Echo 19, Echo 25, Echo 30验证该PCR方法的特异性：首先采用High Pure Viral Nucleic Acid Kit提取上述病毒株的基因组RNA，再以上述基因组RNA为模板并选择克隆质粒为阳性对照品进行real-time RT-PCR，观察扩增曲线；
（5）Real-time RT-PCR检测临床标本
对采集的标本，进行核酸提取；然后采用RT-PCR进行肠道病毒属特异性筛选；筛选出的肠道病毒阳性标本再采用RT-PCR的方法进行EV71和CA16的筛选；肠道病毒属检测阳性而EV71和CA16检测阴性的标本，采用Real-time RT-PCR方法检测CA6，同时，采用RT-snPCR方法对上述标本进行平行检测分型，验证新荧光定量PCR方法的准确性。
4.按权利要求3所述的用途，其特征在于，所述步骤（2）中，采用Primer Express 3.0设计合成CA6特异性real-time PCR的引物和探针；采用NCBI网站上的BLAST工具盒BioEdit软件分析上述引物和探针的保守性。
5.按权利要求3所述的用途，其特征在于，所述步骤（3）中，采用High Pure ViralNucleic Acid Kit Roche 11858874001 提取病毒基因组RNA。
6.按权利要求3所述的用途，其特征在于，所述步骤（3）中，PCR采用试剂盒TakaraDRR064A 进行；实时荧光定量PCR仪为Applied Biosystems, ViiA™ 7系统。
7.按权利要求3所述的用途，其特征在于，所述步骤（3）中，采用割胶纯化试剂盒Invitrogen, K2100-12 回收PCR产物，通过T-A克隆试剂盒Takara，D101A将PCR产物克隆进pMD18-T载体。
8.按权利要求3所述的用途，其特征在于，所述步骤（4）中，微量紫外分光光度计为Thermo， NanoDrop ND-2000C。
9.按权利要求3所述的用途，其特征在于，其特征在于，所述步骤（4）中，High PureViral Nucleic Acid Kit为Roche 11858874001。
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