CN104561369A - 一种手足口病肠道病毒巢式pcr检测试剂盒及非诊断性分型方法 - Google Patents

一种手足口病肠道病毒巢式pcr检测试剂盒及非诊断性分型方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种手足口病肠道病毒巢式PCR检测试剂盒及其非诊断性分型方法，其引物序列如下：SEQ？ID？No.1：5’-CCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAAT-3’，SEQ？ID？No.2：5’-ATTGTCACTGGATGGCCAAT-3’SEQ？ID？No.3：5’-ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3’SEQ？ID？No.4：5’-CAAGCACTTCTGTTTCCCCGG-3’本发明提供的试剂盒能检测疑似手足口病患者咽拭子样品中是否受肠道病毒感染，不仅能够检测EV71、CVA16等常见病毒型，同时也能检出了包括CVA4、CVA6、CVA10、CVA12、CVB3、ECHO30等少见病毒株。本发明的也能够提供一种非诊断性病毒株分型方法，根据巢式PCR的特异基因序列进行分析可以对手足口病患者感染的病毒株进行非诊断性分型，且操作简单，不需特殊仪器，适合于各级医疗机构和疾病控制中心使用。

Description

一种手足口病肠道病毒巢式PCR检测试剂盒及非诊断性分型方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及一种利用巢式PCR扩增技术快速检测肠道病毒的试剂盒，并涉及一种使用该种试剂盒检测结果进行病毒非诊断性分型的方法。
背景技术
手足口病是一种常见于婴儿和年幼儿童的急性传染病，以手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要特征，患者通常有发热症状，一些还伴随有咽痛、咳嗽和腹泻等症状。尽管大多数手足口病患者症状轻微并具有自限性，但少数患者可出现包括疱疹性咽峡炎、心肌炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、神经源性肺水肿等严重并发症，甚至危及生命。
近年来，我国手足口病发病率显著上升，多次出现大范围的暴发。根据中国政府部门统计，仅2010年上半年就有约一百万儿童感染手足口病，导致至少537例患者死亡，15501例患者生命垂危。手足口病是由多种肠道病毒引起，引发手足口病的肠道病毒多达20多种(型)，主要以肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CAV16)为主，其他种(型)包括CVA2、CVA4、CVA5、CVA10、CVA12、柯萨奇病毒B组(CVB)和埃可病毒(ECHO virus)也有报道。通常情况下，大多数肠道病毒感染引起的手足口病在临床症状等方面难以区别。CA16感染所致的患者可引发心肌炎、心包炎等并发症，而EV71感染容易引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎及由此引发急性驰缓性瘫痪、肺水肿和出血等严重并发症，死亡率较高，但其他种的变异毒株也会导致手足口病患者重症甚至死亡，或成为手足口病流行的优势病毒株。
为了能对手足口病做到及早发现、并及时对病毒株进行分型诊断、积极预防并发症，建立手足口病病毒株快速检测及分型方法尤为重要，卫生部已把肠道病毒特异性核酸检测列为手足口病确诊的依据之一。因此，特异性的手足口病病毒核酸检测技术在临床和疾病预防中的价值越来越大。目前较常用的仍为利用病毒培养分离及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)进行病株的鉴定及分型，这两种方法需要昂贵的设备和严格的实验室条件，不利于临床及时诊断和治疗，目前这两种方法仅限在疾病控制中心和少数研究机构，大多数医院均无条件开展。
巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，利用普通的PCR仪即可进行，使用两对(而非一对)PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物(因为他们在第一次PCR扩增片段的内部)结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异快速。
发明内容
为克服现有技术上的不足，本发明提供一种手足口病肠道病毒巢PCR扩增检测试剂盒及分型方法。本发明提供的试剂盒能检测疑似手足口病患者咽拭子样品中是否受肠道病毒感染，不仅能够检测EV71、CVA16等常见病毒株，同时也能检出了包括CVA4、CVA6、CVA10、CVA12、CVB3、ECHO30等少见病毒株。本发明的另一发明目的是提供一种非诊断性病毒株分型方法，根据巢式PCR的特异基因序列进行分析可以对手足口病患者感染的病毒株进行分型，且操作简单，不需特殊仪器，适合于各级医疗机构和疾病控制中心使用。
为了实现上述目的，本发明提供一种手足口病肠道病毒巢式PCR检测试剂盒及其非诊断性分型方法，
一种手足口病肠道病毒巢式PCR检测试剂盒及其非诊断性分型方法，包括以下成分：
(1)病毒RNA提取试剂
病毒RNA的抽提，采用常规TrizoL法，或者各生物公司生产的病毒RNA提取试剂盒
(2)巢式PCR检测反应液及引物
10×扩增缓冲液(150mmoL/L Tris-HC，25mmoL/L MgSO4，1.5％Tritonx-100)；100mmoL MgSO4；50mmoL/L dNTP；20μmoL/L引物SEQ ID No.1；20μmoL/L引物SEQ ID No.2；20μmoL/L引物SEQ IDNo.3；DEPC处理水。
其中引物序列为：
SEQ ID No.1：MD915’-CCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAAT-3，
SEQ ID No.2：ENTD5’-ATTGTCACTGGATGGCCAAT-3’
SEQ ID No.3：MD905’-ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3’
(3)UTR检测反应液
10×扩增缓冲液(150mmoL/L Tris-HCL，25mmoL/L MgSO4，1.5％Tritonx-100)；100mmoL MgSO4；50mmoL/L dNTP；20μmoL/L SEQ IDNo.2；20μmoL/L引物SEQ ID No.4；DEPC处理水。
SEQ ID No.4：5’-CAAGCACTTCTGTTTCCCCGG-3’
(4)酶液：pfu聚合酶(20U/μL)
具体技术方案为：
步骤一、手足口病肠道病毒巢式PCR检测
1)提取待测样品RNA
样本采集和处理参照卫生部《手足口病实验室检测方案》的方法。样本中RNA病毒的抽提采用常规的TrizoL法或使用病毒RNA抽提试剂盒。
2)手足口病病原体巢式PCR扩增
取两只200uL PCR管，按照权利要求3中的试剂盒成分，配置20uL的病毒检测反应液。每管加入0.5μL待检测样品RNA。利用所述引物序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3通过巢式PCR技术进行PCR扩增反应。
SEQ ID No.1：MD915’-CCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAAT-3，
SEQ ID No.2：ENTD5’-ATTGTCACTGGATGGCCAAT-3’
SEQ ID No.3：MD905’-ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3’
3)扩增产物的检测
取出PCR反应管，进行2.5％的琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像系统观察是否出现154b的基因条带。在阳性对照管有出现目的条带，阴性对照罐无目的条带条件下可判断检测样品中有154bp基因条带的结果为阳性，可以判断疑似手足口病患者存在肠道病毒感染；无154bp基因条带的为阴性，可以判断疑似手足口病患者出现的症状不是由肠道病毒感染引起。若对照反应管结果与上述情况不符，检测结果无效。
步骤二、肠道病毒非诊断性分析方法。
1)病毒株UTR基因序列引物的设计
根据手足口病致病病毒株的UTR基因序列，设计引物序列SEQID No.2和SEQ ID No.4：5’-CAAGCACTTCTGTTTCCCCGG-3’
2)病毒株UTR基因序列的扩增
对巢式PCR检测为阳性的样本进行肠道病毒UTR长约475bp基因序列的扩增。
取两只200uL PCR管，按照权利要求3中的试剂盒成分，配置20μL的反应液。每管加入0.5μL待检测样品RNA。利用所述引物序列引物为SEQ ID No.2和SEQ ID No.4通过普通的PCR技术进行目的基因的扩增。
3)目的基因序列的回收及测定
利用玻璃珠胶回收试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司SK1111)回收目的基因，送于(上海生工生物工程技术服务有限公司)进行序列测定。
4)阳性样本非诊断性分型方法
将阳性样本的基因序列在NationaL Center for BiotechnoLogyInformation(NCBI nr/nt)库中进行BLAST比对，以超过98％以上的最高一致性分数的基因型作为病毒株的分型结果。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下优点：本发明建立了手足口病病原体巢式PCR检测试剂盒及其检测方法，根据多种肠道病毒的基因保守区的设计了四个特异性引物，利用采用巢式PCR技术，特异性强，且比RT-PCR检测方法有更高的灵敏度，不仅能够检测EV71/CVA16等常见病毒型，同时也适用于其他肠道病毒包括CVA4、CVA6、CVA10、CVA12、CVB3、ECHO30等少见病毒株，再根据病毒UTR区域序列，通过NCBI数据库BLAST比对可以进行病毒株非诊断性分型，还可以分析患者是否存在多病毒感染的可能性。
本发明解决了现有技术中检测手足口病病原体的方法所需周期长、灵敏度较低、成本高、现场应用困难等缺陷，特别适合于基层现场应用，现场应用方便，可广泛应用临床检验。
附图说明
图1：肠道病毒样品的PCR检测结果，M泳道为DL500Mark，1号为肠道病毒EV71型病毒株，2号为柯萨奇病毒Cox A16型病毒株，3号为手足口病患者咽拭子标本，4号为阴性样本。
图2：肠道病毒UTR基因的PCR扩增结果，M泳道为DL500Mark，1号、2号泳道为手足口病患者咽拭子样本的病毒株UTR目的基因。
图3：UTR基因的NCBI数据库BLAST比对结果。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:CoLdSpring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：一种手足口病肠道病毒巢式PCR检测试剂盒的使用及非诊断性分型方法
本发明的关键步骤之一就是引物的设计，从NCBI-Genebank获取所有肠道病毒的基因序列，经相关生物信息学软件反复比对设计，最终确定了该类病毒基因的UTR相关保守区域设计引物，而且在试验中我们也选取了多套自己设计的引物序列实验比对，最终确定了一套最佳检测用引物序列。
本发明一种手足口病肠道病毒巢式PCR检测试剂盒及非诊断性分型方法，该试剂盒的引物序列如下:
SEQ ID No.1：5’-CCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAAT-3’，
SEQ ID No.2：5’-ATTGTCACTGGATGGCCAAT-3’
SEQ ID No.3：5’-ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3’
SEQ ID No.4：5’-CAAGCACTTCTGTTTCCCCGG-3’
本试剂盒中还包括dNTP，MgSO4，pfu酶，DNA胶回收试剂盒等，这些组分对于本领域技术人员来说属于公知常识，可根据需要选用。
本发明一种手足口病肠道病毒巢式PCR检测试剂盒及非诊断性分型方法，具体为：
步骤一、手足口病肠道病毒巢式PCR检测
(1)病毒RNA的提取
阳性标本：肠道病毒EV71型和柯萨奇病毒Cox A16型病毒株为武汉生物制品研究所基因工程室提供；待测样本：手足口病患者咽拭子标本来自浙江省奉化市人民医院手足口病患者；本阴性标本：正常人咽拭子标本来自浙江省奉化市人民医院正常儿童人群。核酸提取试剂盒为德国Qiagen公司ViraL RNA Mini Kit。
病毒RNA的提取采用QIAGEN病毒RNA提取试剂盒，将560μ1准备好的含有Carrier RNA的AVL缓冲液加入1.5mL离心管；取咽拭子浸泡液140μL加入AVL/Carrier RNA缓冲液的离心管，震荡混匀15秒；室温(15-25℃)孵育10分钟；将1.5mL离心管短暂离心，消除管盖内的液滴；加入560μL乙醇(96-100％)，震荡混匀15秒；震荡混匀后，将离心管短暂离心，消除管盖内的液滴；将630μL上一步骤中的溶液小心转入QIAamp RNA提取柱(放置于2mL收集管里)，注意不要碰湿柱子边缘。盖上盖子，8000rpm离心1分钟。将柱子移入一新的2mL收集管(提供)，丢弃剩有滤液的收集管；小心打开柱子的盖子，重复该步骤一次；小心打开柱子的盖子，加入500μL AW1液，盖上盖子，8000rpm)离心1分钟。将柱子放入一新的2mL收集管，丢弃剩有滤液的收集管；小心打开柱子的盖子，加入500μL AW2液，盖上盖子，14000rpm离心3分钟；将柱子放入一新的1.5mL离心管(自备)，丢弃剩有滤液的收集管。小心打开柱子的盖子，加入60μL已平衡至室温的AVE缓冲液，盖上盖子，室温孵育1分钟后，8000rpm离心1分钟。收集核酸4-8度保存备用(最好2小时内使用，以免RNA降解)。
(2)手足口病病原体巢式PCR扩增及检测
在首轮PCR使用0.5μL样本RNA、引物SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2进行巢式PCR的第一轮扩增。
第一轮PCR扩增体系配置：
10×扩增缓冲液2.0μL；100mmoL MgSO41.5μL；50mmoL/L dNTP1.5μL；20μmoL/L引物SEQ ID No.1和20μmoL/L引物SEQ ID No.2各1μL；0.5μL样本RNA；pfu酶液2μL；DEPC处理水10.5μL。
扩增程序为：95℃变性4min，94℃变性45s；60℃退火20S；72℃延伸50S；25个循环，72℃延伸7min。
第二轮PCR使用SEQ ID No.2和SEQ ID No.3，将1μL首轮PCR产物作为模板进行扩增。
第二轮PCR扩增体系配置：
10×扩增缓冲液2.0μL；100mmoL MgSO41.5μL；50mmoL/L dNTP1.5μL；20μmoL/L引物SEQ ID No.2和20μmoL/L引物SEQ ID No.3各1μL；1μL第一轮PCR产物；pfu酶液2μL；DEPC处理水10μL。
扩增程序为：95℃变性4min，94℃变性45s；60℃退火20S；72℃延伸60S；25个循环，72℃延伸7min。
PCR产物进行2.5％琼脂糖凝胶电泳，在154bp处特异条带为肠道病毒阳性结果，所有检测至少重复3次，结果如图1所示，2个阳性标本1号和2号泳道、手足口病患者咽拭子标本3号泳道均出现154bp的基因条带，阴性标本4号泳道则无154bp基因条带。
步骤二、肠道病毒非诊断性分析方法。
(1)病毒株UTR基因序列的扩增
对巢式PCR检测为阳性的手足口病患者咽拭子样本的RNA进行长约475bp基因序列的扩增。
PCR扩增体系配置：
10×扩增缓冲液4.0μL；100mmoL MgSO43μL；50mmoL/L dNTP3μL；20μmoL/L引物SEQ ID No.3和20μmoL/L引物SEQ ID No.4各2μL；1μL样本RNA；pfu酶液4μL；DEPC处理水21μL。
扩增程序为：95℃变性5min，94℃变性50s；60℃退火60S；72℃延伸75S；25个循环，72℃延伸7min。
3)目的基因序列的回收及测定
目的基因的回收采用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司，产品编号SK8131)回收目的基因，将PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，切割大小约为475bp的目的胶块，加入500μL的Buffer B2，50℃水浴5分钟，将溶胶液移入吸附柱中，8000rpm离心30秒，倒掉收集管中液体，加入500μLWash Solution，9000rpm离心30秒，倒掉收集管中液体，空吸附柱于9000rpm离心2分钟，将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入30μL DEPC处理水，室温静置2分钟后，9000rpm离心1分钟，得到目的DNA，将获得的目的DNA送于上海生工生物工程技术服务有限公司进行基因测序。
手足口病患者咽拭子样本的UTR基因序列测定结果如下：
CAAGCACTTCTGTTTCCCCGGTCTGAGTATCAATAGACTGCTTGCGCGGTTGAAGGAGAAAACGTTCGTTACCCGGCTAACTACTTCGGAAAACCTAGTAACACCATGAAAGTTGCGGAGAGCTTCGTTCAGCACTCCCGCAGTGTAGATCAGGTCGATGAGTCACCGCATTCCCCACGGGCGACCGTGGCGGTGGCTGCGTTGGCGGACTGCCCATGGGGTAACCCATGGGGCGCTCTAATACGGACATGGTGTGATGAGTCTACTGAGCTAGTTGGTAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCCAACTGCGGAGCACACGCCCACAAGCCAGCGGGTAGTGTGTCGTAACGGGTAACTCTGCAGCGGAACCGACTAATTTGGGTGTCCGTGTTTCCTTTTATCTTTATATTGGCTGCTTATGGTGACAATTAAAGAATTGTTACCATATAGCTATTGGATTGGCCATCC
4)手足口病患者咽拭子样本非诊断性分型方法
将阳性样本获得基因序列在NationaL Center for BiotechnoLogyInformation(NCBI nr/nt)库中进行BLAST比对，比对的网址为：http://bLast.st-va.ncbi.nLm.nih.gov/BLast.cgi，手足口病患者咽拭子样本的比对结果如图3所示，BLAST比对结果表明本咽拭子样本的病毒株测序基因与NCBI上基因序列号为JF830007的EV71病毒株最为相似，同源性达99％，通常把超过98％以上的最高一致性分数的基因型作为病毒株的分型结果，将本手足口病患者咽拭子样本的病毒株分型为EV71病毒株。

Claims (3)

1.一种手足口病肠道病毒巢式PCR检测及非诊断性分型方法，其特征在于，该试剂盒包括用于检测病毒的引物，其中引物序列如下：
SEQ ID No.1：5’-CCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAAT-3’，
SEQ ID No.2：5’-ATTGTCACTGGATGGCCAAT-3’
SEQ ID No.3：5’-ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3’
SEQ ID No.4：5’-CAAGCACTTCTGTTTCCCCGG-3’。
2.一种手足口病肠道病毒巢式PCR检测及非诊断性分型方法，其特征在于，该方法具体为：
(1)提取待测样品RNA；
(2)以待测样品RNA为模板，在包括步骤1所述引物的巢式PCR反应体系中进行PCR反应；
(3)根据巢式PCR反应产物在2.5％琼脂糖凝胶电泳图判定结果，PCR产物电泳图出现大小为156bp目的条带的咽拭子标本为阳性，则待测样品中含有肠道病毒；
(4)以咽拭子阳性标本RNA为模板，在包括步骤2所述引物的普通PCR反应体系中进行PCR反应；
(5)根据咽拭子阳性标本的测序结果，通过NCBI数据库比对结果判定病毒株所属分型。
3.如权利要求2所述的一种手足口病肠道病毒巢式PCR检测及非诊断性分型方法，其特征在于，所属的巢式PCR反应第一轮体系：10×扩增缓冲液(150mmoL/L Tris-HC，25mmoL/L MgSO4，1.5％ Tritonx-100)；100mmoLMgSO4；50mmoL/L dNTP；20umoL/L引物SEQ ID No.1；20umoL/L引物SEQ IDNo.2；20umoL/L引物SEQ ID No.3；DEPC处理水；第二轮PCR反应体系为：10×扩增缓冲液2.0μL；100mmoL MgSO4 1.5μL；50mmoL/L dNTP 1.5μL；20μmoL/L引物SEQ ID No.2和20μmoL/L引物SEQ ID No.3各1μL；1μL第一轮PCR产物；pfu酶液2μL；DEPC处理水10μL。
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