CN102154519A

CN102154519A - 型通用登革病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测试剂盒

Info

Publication number: CN102154519A
Application number: CN2011100751295A
Authority: CN
Inventors: 江丽芳; 罗雅艳; 刘岩
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2011-03-28
Filing date: 2011-03-28
Publication date: 2011-08-17

Abstract

本发明公开了型通用登革病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测试剂盒，通用引物序列包括正向引物序列GCATATTGACGCTGGGAGAGA和反向引物序列GCGTTCTGTGCCTGGAATG，探针序列为AGATCCTGCTGTCTCTACA，探针3’端标记为MGB基团。试剂盒采用二步法进行TaqMan实时荧光定量PCR检测；该试剂盒包括上述登革病毒检测通用引物和探针，还包括登革病毒基因逆转录PCR反应试剂、TaqMan实时荧光定量PCR反应试剂和登革病毒标准品。本发明的方法具有灵敏度高、特异性强、操作简单、快速等优点，可以同时检测Ⅰ～Ⅳ型登革病毒，对于登革病毒的临床早期诊断具有重要的实际应用价值。

Description

型通用登革病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种登革病毒的检测引物、探针及实时荧光定量PCR检测试剂盒。

背景技术

登革病毒（dengue virus, DENV）是黄病毒科黄病毒属（Flaviviridae）的单股正链RNA病毒，全长约11kb，只含有一个长的开放性读码框，编码3种结构蛋白和7种非结构蛋白。根据E蛋白的抗原性不同，分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型四个血清型。登革病毒传播媒介主要是埃及伊蚊和白纹伊蚊，可引起登革热（dengue fever，DF）、登革出血热（dengue hemorrhagic fever，DHF）和登革休克症（dengue shock syndrome，DSS），其中DHF和DSS是疾病的严重形式，常可引起死亡。

登革病毒感染广泛存在于全球热带、亚热带的90多个国家和地区。近年来，由于全球气候变暖和国际人口大量流动等原因，登革热的流行范围有明显扩大的趋势，并频频发生流行或暴发流行。据WHO统计，约25亿人生活在登革流行病区，全球每年登革热病例5000万～1亿，死亡在2万人以上。登革热已成为世界上分布最广、发病最多的虫媒病毒病，对人类健康造成严重的威胁，登革热已成为全球最大的公共卫生问题。我国自1978年在广东佛山暴发登革热以来，流行一直未间断，而且有不断扩大趋势，主要分布于广东、海南、广西、福建、台湾等地区。目前登革病毒感染的致病机制还未完全阐明，且登革热缺乏典型的临床表现，没有特异性的治疗方法，也没有有效的疫苗进行预防，因而及时诊断疾病、及时处理疫情就变得十分重要，这就需要有一种既准确又快速的实验室检测方法来确定病原，这也是临床诊断与流行病学研究的一个必不可少的环节。

对登革病毒感染进行实验室诊断的传统方法是用血清学方法检测病毒的特异性抗体或从患者血清中分离病毒。由于抗体从出现到可检测水平，通常需要5～7天，同时登革热抗体与其他黄病毒存在交叉反应而特异性低，故血清学检测作为早期的诊断方法仍有一定的局限性；登革病毒分离是较可靠的方法，但登革病毒分离鉴定实验耗时较长，敏感性低，不利于疾病的早期诊断。近10多年发展起来的登革病毒核酸检测技术，为登革热的早期诊断提供了可能，如RT-PCR可在患者发病1天内进行登革病毒的鉴定和分型诊断，但该方法也有它自身的缺陷，容易造成标本间的交叉污染而存在严重的假阳性问题。最近一种基于TaqMan荧光探针的荧光实时定量PCR检测技术成功应用到登革病毒检测上，相对于常规的PCR技术而言，具有更高的敏感性、特异性和重复性，并具有快速、高通量、污染少等特点。TaqMan MGB探针是在TaqMan原理基础上提出的，与一般的TaqMan探针相比，它有着更多的优点：首先，由于这种探针的3’端荧光淬灭基团是一种基本无荧光本底的小沟结合物，取代了常规可发光的TaqMan荧光标记，使得反应的荧光本底大大降低，从而提高分辨率；再者，由于淬灭基团与报告基团在空间位置上更加接近，从而使实验的检测结果可以更精确；另外，探针结合MGB基团后，使得探针的Tm值有近10℃的提高，从而使探针的杂交稳定性和特异性显著增强；同时，随着探针长度的缩短，增大了可检测的靶基因范围，从而提高了方法的可行性。

发明内容

本发明的具体原理是利用检测登革病毒的通用引物、荧光探针等成分进行TaqMan实时荧光定量PCR扩增。在PCR扩增过程中，通过检测PCR反应液中的荧光强度，可以达到监测PCR产物扩增量的目的。当探针完整时，5’端的荧光物质受到3’端MGB基团的制约，不能发出荧光。在PCR反应的退火过程中，荧光探针会和模板杂交。在PCR反应的延伸过程中，TaqDNA聚合酶的5’→ 3’的核酸外切酶可以分解与模板杂交的探针，而当TaqMam探针被分解后，5’端的荧光物质便会游离出来，发出荧光。

本发明的第一个目的是提供登革病毒检测的通用引物。

本发明所提供的通用引物由正向引物和反向引物组成，所述正向引物序列为GCATATTGACGCTGGGAGAGA（SEQ NO.1），所述反向引物序列为GCGTTCTGTGCCTGGAATG（SEQ NO.2），

本发明的第二个目的是提供登革病毒检测的探针。

所述探针序列为AGATCCTGCTGTCTCTACA（SEQ NO.3）。

所述探针的5’端带有一个荧光集团，3’端标记为MGB基团。

本发明的第三个目的是提供一种登革病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测试剂盒。

本发明所提供的试剂盒采用二步法进行TaqMan实时荧光定量PCR检测。

本发明所提供的登革病毒检测试剂盒包括上述检测登革病毒的通用引物、荧光探针。

本发明所提供的登革病毒检测试剂盒还包括登革病毒基因PCR扩增试剂。

所述登革病毒基因PCR扩增试剂包括逆转录PCR反应试剂、TaqMan实时荧光定量PCR反应试剂。

所述登革病毒基因逆转录PCR反应试剂为大连宝生物公司PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time逆转率PCR反应试剂盒。

所述TaqMan实时荧光定量PCR反应试剂为大连宝生物公司Premix Ex Taq^TM

Perfect Real Time实时荧光定量PCR反应试剂盒。

本发明所提供的登革病毒检测试剂盒还包括登革病毒标准品。

所述登革病毒标准品为Ⅱ型登革病毒标准株(DVⅡNGC株) 3’末端的一段349bp的片段，该片段克隆于pGEM-T质粒载体。

本发明所提供的登革病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测试剂盒，是提取待检样品血清或血浆的总RNA,并以其为模板，逆转录合成cDNA，再以该cDNA为模板，用上述检测登革病毒的试剂盒进行TaqMan实时荧光定量PCR检测。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

（1）本发明提供的引物和探针是经过Ⅰ～Ⅳ型登革病毒全基因组序列比对分析，选择高度保守的区段进行设计的，具有强特异性和高灵敏性。尤其是本发明提供的探针为MGB探针，使探针的杂交稳定性和特异性显著增强，使实验的检测结果更精确，增大了可检测的靶基因范围，从而提高了方法的可行性。

（2）本发明提供的登革病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测试剂盒的检测灵敏度可达每个反应2 DNA拷贝量，表明其具有高的灵敏度。

（3）本发明提供的登革病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测试剂盒对于不含有登革病毒的检测样本均无阳性扩增信号，表明其具有良好的特异性。

（4）本发明提供的登革病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测试剂盒能有效检测发热1～2天患者血清的登革病毒，表明其适合于登革病毒的临床早期诊断。

总的来说，本发明提供的检测登革病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测试剂盒克服了现有登革病毒检测方法费时、费力、敏感性低、特异性不强等缺点，提供了一种快速、特异性强、敏感性高的检测登革病毒方法，可以同时检测Ⅰ～Ⅳ型登革病毒，对于登革病毒的临床早期诊断具有重要的实际应用价值。

具体实施方式

1．反应试剂

1.1 逆转录PCR反应试剂

逆转录PCR反应试剂为大连宝生物公司PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time逆转率PCR反应试剂盒。根据10μl反应体积标准，本试剂盒提供的每份反应液为5μl，每份反应液中含有下列组分：1×PrimeScript Buffer，0.5μl PrimeScrip RT Enzyme Mix 1，2.5μM Oligo dT Primer，20μM Random 6mers，使用时再加入一定量RNA（最大可使用1μg的RNA）和RNase Free ddH₂O 至10μl体积。

1.2 TaqMan实时荧光定量PCR反应试剂

TaqMan实时荧光定量PCR反应试剂为大连宝生物公司Premix Ex Taq ^TMPerfect Real Time实时荧光定量PCR反应试剂盒。根据20μl反应体积标准，本试剂盒提供的每份反应液为18μl，每份反应液中含有下列组分：1×Premix Ex Taq ^TM，0.2μM PCR Forward Primer，0.2μM PCR Reverse Primer，0.2μM TaqMan MGB Probe，6.4μl ddH₂O，使用时再加入2μl DNA 模板。

注：a.使用的仪器不同，应将反应参数作适当调整。

b.根据检测样品来源不同，应适当调整模板加量。

2．标准品的制备

选择位于Ⅱ型登革病毒标准株(DVⅡNGC株) 3’末端的一段349bp的片段制备标准品。设计特异性引物进行PCR扩增此片段，所得的产物经纯化回收后，克隆于pGEM-T质粒载体，再用上述特异性引物对重组质粒进行PCR鉴定正确后准确，在Invitrogen公司完成插入片段序列的测定，用E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit质粒提取试剂盒纯化质粒DNA，用Thermo超微量紫外、可见光分光光度计准确定量所提取的质粒DNA（连续测定4次，取均值），将所得的质粒DNA浓度单位ng/μl换算成copies/ml，并进行10倍梯度稀释，得到浓度分别为1.0×10⁸copies /ml、1.0×10⁷copies/m、1.0×10⁶copies/ml、1.0×10⁵copies/ml、1.0×10⁴copies/ml、1.0×10³copies/ml的6个标准品。

在本发明中，标准品的设置以及标准品的种类和梯度可以根据具体的实际情况进行调整，如果只是对是否感染登革病毒进行定性检测，也可以考虑不用标准品。

3. 登革病毒RNA提取

本试剂盒采用QIAGEN公司的QIAamp RNA Blood Mini Kit提取样品RNA

（1）取500μl～1.5 ml 血清或血浆和5倍体积Buffer EL于合适灭菌离心管；

（2）冰上静置10～15min，此期间涡旋混匀2次；

（3）400×g，4℃离心10min，弃上清；

（4）加入2倍体积Buffer EL（相对于第一步的样品）,涡旋混匀溶液；

（5）400×g，4℃离心10min，弃上清；

（6）加入350μl（血样≤500μl）或600μl（500μl≤血样≤1500μl） Buffer RLT，涡旋混匀溶液；

（7）吸取上述溶液于QIAshredder 吸附柱（已置于2ml收集管），最大速度离心2min，弃QIAshredder 吸附柱；

（8）加入一倍体积70%乙醇（350μl或600μl）于上述溶液，吹打混匀；

（9）吸入上述溶液（≤700μl）于QIAamp 吸附柱（已置于2ml收集管），离心15s（≥8000×g）；

（10）把QIAamp 吸附柱置于新的2ml收集管，加入700μl Buffer RW1，离心15s（≥8000×g）；

（11）把QIAamp 吸附柱置于新的2ml收集管，加入500μl Buffer RPE，离心15s（≥8000×g）；

（12）把QIAamp 吸附柱置于新的2ml收集管，加入500μl Buffer RPE，10,000×g离心3min；

（13）把QIAamp 吸附柱置于新的2ml收集管，最大速度离心1min；

（14）把QIAamp 吸附柱置于1.5ml离心管，加入30～50μl RNase-free water，离心1min（≥8000×g）。

4．用本发明的试剂盒对待测样品进行荧光定量检测

4.1 TaqMan实时荧光定量PCR检测过程

利用本发明试剂盒进行的检测过程可以用BIO-RAD iQ5荧光定量PCR仪来完成，具体操作过程如下：

取所提取的RNA2μl加入步骤1.1的5μl逆转录反应液，再加入RNase Free ddH₂O 至10μl体积于PCR仪进行逆转录反应，得到cDNA模板。具体反应程序为：37℃ 15min，85℃ 5s。

取逆转录所得cDNA模板2μl加入步骤1.2的18μl实时荧光定量PCR反应液构成20μl反应体系，再把20μl反应液吸入PCR反应管，将加好样的PCR管放入荧光PCR仪。激活protocol窗口后设置设置PCR热循环程序：95℃ 30s，1个循环；95℃ 5s，60℃ 20s，40个循环，并给所设定程序命名；激活plate窗口后设置：反应体系体积、所用盖类型、管型、反应管在96孔板中的放置位置、样品类型（标准品或未知品）、荧光集团类型、标准品相关参数（拷贝数、稀释倍数等），并给所设定程序命名；然后点击run，并给本次的数据记录文件命名，点击begin run开始PCR扩增。

在实验结束后，系统自动进入Date Analysis模式，激活PCR Quant，进入数据分析窗口；或在实验结束后保存本次检测数据文件，之后激活PCR Quant，进入数据分析窗口。PCR Quant界面由荧光扩增曲线图、标准曲线图、定量结果列表三部分组成。在定量结果列表中显示着与荧光扩增曲线图和标准曲线图相关的数据，内容包括样品序号(Sequence Number)、样品类型（Type）、Ct值（Threshold Cycle）、起始模板量(Starting Quanity)等。在标准曲线的下方显示着r值、E值等。用通用引物和荧光探针去检测样品时，若待检样品中含有登革病毒则显示阳性扩增曲线，增长曲线呈S型曲线，若待检样品中不含有登革病毒则无扩增信号。

结果判断：

a．阴性对照Ct值显示为空白；

b. 构建标准曲线的阳性对照标准品Ct值最好在15～30之间，且|r|＞0.990或r²＞0.980，扩增效率为90%～105%；

c．阴性样品的Ct值显示为空白；

d．样品的Ct值＜35判断为阳性。

为了验证本发明试剂盒检测结果的可靠性，对荧光PCR反应产物进行琼脂糖电泳，检测结果与目的片段大小一致；对PCR反应产物测序，经NCBI-Blast分析，结果表明，产物序列为登革病毒基因序列。

4.2 本发明提供的登革病毒检测试剂盒的有效性检验

分别提取Ⅰ～Ⅳ型登革病毒标准株（DVⅠHawaii株、DVⅡNGC株、DVⅢH87株、DVⅣH241株）的RNA后，按4.1所述步骤对其进行TaqMan实时荧光定量PCR检测，Ⅰ～Ⅳ型登革病毒标准株均可见到阳性扩增曲线，增长曲线呈S型曲线，表明本发明提供的引物和探针及其反应试剂和体系是有效的。

4.3 本发明提供的登革病毒检测试剂盒的临床样品检测

提取10份发热1～2天患者血清RNA，按4.1所述步骤对其进行TaqMan实时荧光定量PCR检测，有6例出现阳性扩增曲线，增长曲线呈S型曲线，表明本发明提供的引物和探针及其反应试剂和体系在临床上的有效性，适合于登革病毒的临床早期诊断。

5．本发明试剂盒灵敏度、重复性、特异性和线性范围的确定

5.1本发明试剂盒灵敏度和重复性确定

对标准品RNA，经10倍比例稀释（1.0×10¹ copies/ml～1.0×10¹⁰ copies/ml），总共检测10个稀释梯度，每个梯度做3个复孔，经荧光实时定量PCR检测，1.0×10³copies/ml浓度以上的可以检测到荧光信号，因此确定本试剂盒的灵敏度可达到1.0×10³copies/ml，每次反应加2μl cDNA模板，大约相当于检测最低限度为每个反应2 DNA拷贝量，说明上述通用引物和探针及其反应试剂和体系具有良好的灵敏度；每个稀释度重复检测3次所得Ct值标准差在0.099～0.244之间，说明本发明提供的引物和探针及其反应试剂和体系具有良好的重复性。

5.2 本发明试剂盒特异性确定

分别提取Ⅰ～Ⅳ型登革病毒标准株（DVⅠHawaii株、DVⅡNGC株、DVⅢH87株、DVⅣH241株）、西尼罗病毒、日本脑炎病毒、黄热病毒的RNA后，用上述的登革病毒通用引物和荧光探针进行实时荧光定量PCR检测，只有Ⅰ～Ⅳ型登革病毒标准株观察到荧光信号，西尼罗病毒、日本脑炎病毒和黄热病毒均无荧光信号，说明本发明提供的引物和探针及其反应试剂和体系具有良好的特异性，与其他病毒间无交叉反应。

5.3本发明试剂盒线性范围确定

对RNA浓度为1.0×10¹ copies/ml～1.0×10¹⁰ copies/ml的标准品进行检测，发现浓度小于1.0×10³ copies/ml和大于1.0×10⁸ copies/ml的增长曲线不呈S型曲线，不在检测范围之类，可见，本发明试剂盒的线性范围为1.0×10³ copies/ml～1.0×10⁸ copies/ml。

用作标准曲线的标准品浓度范围必需涵盖全部待测样品浓度。使得待测样品的扩增结果在实验动态范围内，如果待测样品反应结果在标准曲线的动态范围之外，必须进行下面三步调整：

a．构建覆盖待测样品浓度的标准曲线，分析并确保在新的动态范围内的线性；

b．如果待测样品的Ct值低于标准曲线上最高浓度的标准品的Ct值，稀释待测样品后重做实验；

c．如果待测样品的Ct值高于标准曲线上最低浓度的标准品的Ct值，增加待测样品后重做实验。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学

<120> 型通用登革病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测试剂盒

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人供序列

<400> 1

gcatattgac gctgggagag a 21

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcgttctgtg cctggaatg 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agatcctgct gtctctaca 19

Claims

1.一种检测登革病毒的通用引物，由正向引物和反向引物组成，其特征在于所述正向引物序列为GCATATTGACGCTGGGAGAGA，所述反向引物序列为GCGTTCTGTGCCTGGAATG。

2.一种检测登革病毒的探针，其序列为AGATCCTGCTGTCTCTACA。

3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于：所述探针的5’端带有一个荧光集团，3’端标记为MGB基团。

4.一种检测登革病毒TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于包括权利要求1所述的通用引物和权利要求2或3所述的探针。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括登革病毒基因PCR扩增试剂。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述的PCR扩增试剂，包括逆转录PCR反应试剂和TaqMan实时荧光定量PCR反应试剂。

7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括登革病毒标准品。