CN105838713A

CN105838713A - 检测寨卡病毒的荧光定量pcr方法、引物及试剂盒

Info

Publication number: CN105838713A
Application number: CN201610340665.6A
Authority: CN
Inventors: 刘映霞; 高福; 杨扬; 毕玉海; 王强; 郑海霞
Original assignee: Third Peoples Hospital of Shenzhen
Current assignee: Third Peoples Hospital of Shenzhen
Priority date: 2016-05-20
Filing date: 2016-05-20
Publication date: 2016-08-10

Abstract

检测寨卡病毒的荧光定量PCR方法、引物及试剂盒。本发明提供了一组引物和探针，其中一条引物包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，另一条引物包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，本发明还提供了所述引物和探针在制备检测寨卡病毒的产品中的应用，同时本发明还提供了含有该引物、探针的试剂盒及应用。经实验证明，本发明的引物、探针特异性好、灵敏度高、检测时间短和适用范围广，且基于该引物、探针建立的寨卡病毒的检测方法，可灵敏、准确、简便和快速的检测寨卡病毒的存在和/或含量。

Description

检测寨卡病毒的荧光定量PCR方法、引物及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别涉及检测寨卡病毒的荧光定量PCR方法、引物及试剂盒。

背景技术

寨卡病毒病是由寨卡病毒(Zika Virus,ZIKV)引起并通过蚊媒传播的一种急性自限性疾病。ZIKV于1947年首次在乌干达从恒河猴体内被发现，1952年在乌干达和坦桑尼亚的人体中分离到病毒。ZIKV主要依赖感染病毒的伊蚊类蚊媒通过叮咬传播，也可通过母婴传播以及血液和性传播。2007年以前，全球仅报告14例ZIKV病散发病例，2007年首次在太平洋岛国密克罗尼西亚的雅普岛发现寨卡病毒暴发疫情之后，出现ZIKV感染病例和暴发疫情的国家及地区增加明显，已经在非洲、东南亚和美洲等地造成多次暴发流行。2015年5月，巴西报告首例寨卡病毒病病例；同年10月，巴西报告新生儿小头畸形明显上升，时空分布与寨卡病毒流行区相吻合。截至2016年1月2日，巴西卫生部官方统计数据显示，巴西因寨卡病毒所致的疑似新生儿小头畸形病例已达3174例，其中已有38例死亡，而2月初该数字已达4783例。研究表明除了引起小头畸形以外，寨卡病毒感染还和格林-巴利综合征有也有着密切的联系。

目前针对寨卡病毒的实验室诊断方法有病原学方法、血清学方法和针对病毒核酸检测技术。传统的病原学方法主要通过细胞进行病毒的分离，耗时、耗力，而且寨卡病毒的病毒血症持续时间短，较难采集到合适的样品。血清学试验，包括ELISA、免疫荧光、中和试验等，也被广泛应用于寨卡病毒的实验室检测。但是病毒特异性IgM和中和抗体出现较晚，约发病后1周末期才可检出，同时黄病毒间交叉反应常见，难以鉴别。荧光定量以特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快的诸多优点成为寨卡病毒感染实验室确诊的重要工具。

寨卡病毒属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)，病毒颗粒呈球形，直径约为40～70nm。寨卡病毒为单股正链RNA病毒，其基因组全长约10.8Kb，分子生物学和生物信息学分析表明，寨卡病毒主要存在非洲型和亚洲型两个亚型，在系统发生树上与同为黄病毒属的登革病毒、日本脑炎病毒及西尼罗病毒相近。寨卡病毒基因组只有一个单一的开放读码框(open reading frame)，所编码的病毒蛋白经宿主蛋白酶和病毒蛋白酶切割成不同的功能蛋白，包括3个结构蛋白(C、prM/M和E)以及7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。自2016年2月9日我国确认第一例输入性寨卡病例以来，截止到2016年5月18日已经确诊17例寨卡病毒感染病例，均为输入性病例，入境口岸大多在广东地区。根据广东地区的伊蚊分布、人口密度和出入境流动情况，以及疫区疾病流行趋势分析，推测广东地区输入性病例还会有所增加；针对伊蚊分布广泛的地区进行风险评估和预警分析，结果显示寨卡病毒在广东地区发生地方性流行的风险指数较高。因此，建立一种快速、准确、敏感的荧光定量PCR检测方法对我国的寨卡病毒防控工作具有重要的意义。现有技术中还没有对寨卡病毒进行荧光定量PCR检测的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏、准确、稳定、简便和快速的检测寨卡病毒的荧光定量PCR方法，本发明还提供了用于该方法的特异性好、灵敏度高、检测时间短、稳定性高和适用范围广的引物、探针和含有该引物、探针的试剂盒及应用。

本发明第一方面提供了一组引物和探针，其中一条引物包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，另一条引物包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

在一优选例中，所述探针为包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

在一优选例中，所述探针所用的淬灭基团为TRAMA、荧光基团为HEX。

本发明第二方面提供了所述的引物和探针在制备检测寨卡病毒的产品中的应用。

在一优选例中，所述检测寨卡病毒的产品还包括PCR扩增试剂；

在一优选例中，所述PCR扩增试剂为荧光定量PCR试剂。

本发明第三方面提供了一种试剂盒，包括所述的引物和探针。在一优选例中，还包括PCR扩增试剂。

在一优选例中，所述PCR扩增试剂为荧光定量PCR试剂。

在一优选例中，所述荧光定量PCR试剂包括来自Takara公司的货号为RR064A的OneStep PrimeScript^TM RT-PCR Kit试剂盒所包含的试剂。

在一优选例中，所述来自Takara公司的货号为RR064A的One Step PrimeScript^TMRT-PCR Kit试剂盒所包含的试剂为2×One Step RT-PCR Buffer III、Takara Ex Taq HS、PrimeScript RT Enzyme Mix和ROX Reference Dye or Dye II中的至少一种。

在一优选例中，还包括阳性对照和阴性对照。

在一优选例中，还包括RNA提取试剂。

在一优选例中，所述RNA提取试剂包括来自QIAGEN公司的货号为52904的QIAampViral RNA Mini Kit RNA提取试剂盒所包含的试剂。

在一优选例中，还包括逆转录试剂。

在一优选例中，所述逆转录试剂包括来自Takara公司的货号为RR064A的One StepPrimeScript^TM RT-PCR Kit逆转录试剂盒所包含的试剂。

本发明第四方面提供了所述的试剂盒在制备检测寨卡病毒的产品中的应用。

本发明第五方面提供了一种筛选易患寨卡病毒病的生物样品的系统，包括：

核酸提取装置，所述核酸提取装置用于提取所述生物样品中的核酸样本；

荧光定量PCR装置，所述荧光定量PCR装置与所述核酸提取装置相连，适用于采用权利要求1或2所述的引物和探针对所述核酸样本进行荧光定量PCR反应；以及

判断装置，所述判断装置与所述荧光定量PCR装置相连，以便基于荧光定量PCR反应的结果，判断所述生物样品是否易患寨卡病毒病。

在一优选例中，所述核酸提取装置还用于提取已知浓度/拷贝数的标准品质粒。

在一优选例中，所述荧光定量PCR装置还用于采用权利要求1或2所述的引物和探针对所述已知浓度/拷贝数的标准品质粒进行荧光定量PCR反应。

在一优选例中，所述核酸提取装置进一步包括：标准曲线测定装置，所述标准曲线测定装置分别与所述荧光定量PCR装置和判断装置相连，所述标准曲线测定装置先将所述标准品质粒在荧光定量PCR装置产生的Ct值与标准品质粒的浓度进行关联并绘制标准曲线，所述判断装置将标准曲线测定装置产生的标准曲线与核酸样本在荧光定量PCR装置产生的结果进行比对，判断生物样品中的寨卡病毒的含量或拷贝数。

在一优选例中，所述核酸提取装置进一步包括：

RNA提取单元，所述RNA提取单元用于从生物样品中提取RNA 样本；以及

逆转录单元，所述逆转录单元与所述RNA提取单元相连，用于对所述RNA样本进行逆转录反应，以便获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样本。

在一优选例中，所述生物样品为包含有DNA和/或RNA的血液、细胞或组织，或为质粒，或为DNA、cDNA、mRNA或cDNA片段，或为含有DNA、cDNA、mRNA或cDNA片段的试剂；

在一优选例中，当生物样品为DNA、cDNA或cDNA片段，或为含有DNA、cDNA或cDNA片段的试剂，或为质粒时，将其直接作为核酸样本与所述引物和探针对进行实时荧光PCR反应；

在一优选例中，当生物样品为含有DNA和/或RNA的血液、细胞或组织，或为mRNA，或为含有mRNA的试剂时，将其转化为DNA、cDNA或cDNA片段的核酸样本再与所述引物和探针进行实时荧光PCR反应。

在一优选例中，所述实时荧光PCR反应的反应体系如下：

所述2×One Step RT-PCR Buffer III、Takara Ex Taq HS、PrimeScript RTEnzyme Mix和ROX Reference Dye or Dye II均来自Takara公司的货号为RR064A的OneStep PrimeScript^TM RT-PCR Kit试剂盒。

在一优选例中，所述实时荧光PCR反应的程序如下：50℃ 2min；95℃ 10min；95℃15s,55℃ 1min,40个循环。

本发明具有如下有益效果：

(1)本发明针对寨卡病毒设计的引物、探针特异性好、灵敏度高、检测时间短和适用范围广。

(2)本发明建立的寨卡病毒的荧光定量PCR检测方法，可对寨卡病毒进行定性检测。

(3)本发明以已知浓度的标准品质粒作为模板进行荧光定量反应，作出标准曲线，通过对比待测生物样品检测结果与标准曲线，用于测算出待测生物样品中的寨卡病毒含量，因此其可对寨卡病毒进行定量检测，同时也可以作为实验室检测增殖曲线的一种手段。

(4)本发明建立的寨卡病毒的荧光定量PCR检测方法特别适用于临床样品的检测，其检测的灵敏度可达到10个拷贝的病毒分子，操作简易，结果稳定，对我国的寨卡病毒防控工作具有重要的意义。

附图说明

图1为本发明引物、探针以及检测方法对寨卡病毒的灵敏性分析结果示意图，其中横坐标为循环数，纵坐标为荧光值。其中1-8分别代表拷贝数为10^8/μl-10¹/μl的样品扩增曲线。

图2为本发明利用构建的质粒所绘制的荧光定量PCR标准曲线示意图，其中横坐标为拷贝数对数，纵坐标为循环数。

图3为本发明引物、探针以及检测方法对寨卡病毒的特异性分析结果示意图，其中横坐标为循环数，纵坐标为荧光值。

具体实施方式

除非特殊说明，本发明所用术语具有本发明所属领域中的一般含义。

下面参考具体实施例和附图，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

本实施例提供了一种检测寨卡病毒的引物、探针及其应用。

引物、探针的设计：通过对寨卡病毒E基因进行比对，寻找保守区域，设计能够覆盖所有毒株的特异性引物和探针。

引物和探针具体序列如下：

上游引物(ZIKV-F)：5’-TGACAAGCARTCAGACAC-3’(SE Q ID NO.1)(R代表A或G)

下游引物(ZIKV-R)：5’-TCACCAGRCTCCCTTTGC-3’(SEQ ID NO.2)(R代表A或G)

探针(ZIKV-P)：5’-HEX-AGAGGCTGGGGAAATGGATGTGGACT-TRAMA-3’(SEQ ID NO.3)

引物和探针均由上海生工生物工程有限公司合成，扩增的目的片段大小为98bp。靶序列为：tgacaagcaatcagacactcaatatgtctgcaaaagaacgttagtggacagaggctggggaaatggatgtggactttttggcaaagggagcctggtga(SEQ ID NO：4)。

上述引物和探针可应用于在制备检测寨卡病毒的产品，所述检测寨卡病毒的产品还包括荧光定量PCR试剂。

实施例2

本实施例提供了一种试剂盒及其应用，所述试剂盒包括：

(1)实施例1的引物和探针；

(2)荧光定量PCR扩增试剂。

所述荧光定量PCR试剂包括来自Takara公司的货号为RR064A的One StepPrimeScript^TM RT-PCR Kit试剂盒所包含的试剂。

实验证明，上述荧光定量PCR扩增试剂与引物和探针的联合使用，效果更加优越，具体表现在可重复性好、特异性强，灵敏度高的特点。

所述试剂盒还可以进一步包括：

(3)阳性对照和阴性对照；

(4)RNA提取试剂；

(5)逆转录试剂。

所述阳性对照是采用扩增、克隆所获得标准品质粒，所述的扩增、克隆是指采用上述寨卡病毒的引物进行扩增目的片段,鉴定为阳性的产物，克隆到pGEM-T载体并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选挑取阳性克隆。

所述RNA提取试剂包括来自QIAGEN公司的货号为52904的QIAamp Viral RNA MiniKit RNA提取试剂盒所包含的试剂；所述逆转录试剂包括来自Takara公司的货号为RR064A的One Step PrimeScript^TM RT-PCR Kit逆转录试剂盒所包含的试剂。

上述试剂盒可应用于检测寨卡病毒上。

实施例3

本实施例提供了一种检测寨卡病毒的方法，例如检测生物样品中寨卡病毒的存在和/或含量，该方法使用了实施例1的引物、探针以及实施例2的试剂盒。

上述生物样品为包含有DNA和/或RNA的血液、细胞或组织，或为质粒，或为DNA、cDNA、mRNA或cDNA片段，或为含有DNA、cDNA、mRNA或cDNA片段的试剂。

当生物样品为DNA、cDNA或cDNA片段，或为含有DNA、cDNA或cDNA片段的试剂，或为质粒时，将其直接作为模板与所述引物和探针对进行实时荧光PCR反应。

当生物样品为含有DNA和/或RNA的血液、细胞或组织，或为 mRNA，或为含有mRNA的试剂时，将其转化为DNA、cDNA或cDNA片段再与所述引物和探针进行实时荧光PCR反应。

检测寨卡病毒的方法包括如下步骤：

1.实时荧光PCR反应

采用Takara公司的货号为RR064A的One Step PrimeScript ^TM RT-PCR Kit试剂盒的试剂按照试剂盒说明书配制反应液：取2×One Step RT-PCR Buffer III12.5μl，TakaraEx Taq HS 0.5μl，PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5μl，ROX Reference Dye or Dye II0.5μl，20μM的实施例1的上游引物和下游引物各0.5μl，20μM的实施例1的探针0.5μl，2μLDNA或cDNA或cDNA片段(拷贝数为10¹/μL至10⁸/μL)，以及DEPC水8μl，加入至0.2mL PCR反应管中，以超纯水为阴性对照样品，振荡混匀后瞬时离心数秒。将反应管置于ABI公司的7500Fast荧光定量PCR仪上进行实时荧光PCR扩增和检测，所述实时荧光PCR扩增的程序如下：50℃ 2min；95℃ 10min；95℃ 15s,55℃ 1min,40个循环。

2.判断生物样品中寨卡病毒的存在和/或含量

在每一循环的延伸温度结束时采集荧光信号并进行熔融曲线的分析，当Ct≤35时代表生物样品中含有寨卡病毒，为阳性；当Ct＞35且Ct＜40时则代表生物样品中疑含寨卡病毒，需要重复实验以确认，如果重复实验的Ct值仍在上述范围内，则判断为阳性；当Ct≥40时代表生物样品中未含有寨卡病毒，为阴性。

当需要判断生物样品中寨卡病毒的含量或拷贝数时，则在上述步骤1中还需设定已知浓度/拷贝数的阳性对照，例如实施例4的标准品质粒。

实施例4

本实施例对实施例1的引物和探针、实施例2的试剂盒以及实施例3的检测方法进行了灵敏性验证，具体包括如下步骤：

1.构建标准品质粒

利用Vero细胞(购自ATCC)采用DMEM培养基(购自Gibco公司)培养寨卡病毒(常规方法分离获取，保存于深圳市第三人民医院)，待Vero细胞长到单层约80％密度时，将DMEM培养基弃去并用PBS溶液(配制1/15mol/L KH₂PO4，即每升水中溶解9.078克KH₂PO4，下同)漂洗3次,按照MOI为0.5的病毒量将病毒液加入6孔板中，并补充一定量的无血清培养基至0.5ml。将培养瓶放入37℃培养箱中孵育1h，在孵育过程中每隔15min轻轻晃动培养瓶，待孵育结束后弃去孵育液，PBS溶液洗两次，然后加上2ml细胞维持液(含2％血清的DMEM，DMEM即dulbecco's modified eagle medium)后继续培养，每天观测细胞病变情况，待80％的细胞出现细胞病变效应(CPE)后，将培养瓶放入﹣80℃冰箱，反复冻融次后，将病毒液取出，以3000rpm离心5min，取病毒液上清﹣80℃保存备用，然后按照QIAGEN公司的货号为52904的QIAamp Viral RNA Mini Kit RNA提取试剂盒的说明书，将病毒液上清进行病毒RNA提取。

采用Promega公司货号为A5001的GoScript Reverse Transcription System试剂盒的试剂并按照试剂盒说明书对上述提取的RNA进行cDNA合成。上述合成的cDNA采用北京康为世纪公司的货号CW0690A的2×Es Taq Master Mix进行PCR扩增，退火温度为58℃，扩增30个循环，引物为实施例1的ZIKV-F和ZIKV-R，浓度20μM，上下游各0.5μl，其它条件按照说明书进行，扩增完成后，取产物用2％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定为阳性的产物片段用Thermo公司的Gene JET PCR purification进行纯化回收，并将产物片段克隆到Promega公司货号为A1360的pGEM-T载体中构建标准品质粒。

2.样品制备

采用北京康为世纪公司的货号为CW0500A的质粒小量提取试剂盒的试剂并按照试剂盒说明书提取标准品质粒，用Nano Drop 2000超微量分光光度计测定质粒的浓度，通过其分子量计算出拷贝数，然后依次制备10倍梯度稀释至个位拷贝数的样品，共计8个梯度，拷贝数为：1x10⁸至1x10¹/μL。

3.实时荧光PCR反应

采用Takara公司的货号为RR064A的One Step PrimeScript ^TM RT-PCR Kit试剂盒的试剂按照试剂盒说明书配制反应液：取2×One Step RT-PCR Buffer III12.5μl，TakaraEx Taq HS 0.5μl，PrimeScript RT Enzyme Mix0.5μl，ROX Reference Dye or Dye II0.5μl，20μM的实施例1的上游引物和下游引物各0.5μl，20μM的实施例1的探针0.5μl，2μL上述样品，以及DEPC水8μl，加入至0.2mL PCR反应管中，以超纯水为阴性对照样品，振荡混匀后瞬时离心数秒。将反应管置于ABI公司的7500Fast荧光定量PCR仪上进行实时荧光 PCR扩增和检测，所述实时荧光PCR扩增的程序如下：50℃ 2min；95℃ 10min；95℃ 15s,55℃1min,40个循环。

检测结果如图1和3所示，上述引物、探针的qPCR检测寨卡病毒的检测下限为10¹(约为10²PFU)，而阴性对照检测不到Ct值，且Ct值与寨卡病毒拷贝数之间具有非常强的线性关系(P<0.0001，r＝0.998，图2)，表明用本发明的引物、探针的qPCR检测寨卡病毒的灵敏性非常强。

实施例5

本实施例对实施例1的引物和探针、实施例2的试剂盒以及实施例3的检测方法进行了特异性验证。

1.样品制备

所用的供试材料如下：寨卡病毒、黄热病毒、登革热病毒和流感病毒的cDNA(均保存于深圳市第三人民医院，拷贝数均为10⁷/μL)

同时设置阳性对照和阴性对照，阳性对照为寨卡病毒RNA(保存于深圳市第三人民医院，浓度是10⁷拷贝/μL)，阴性对照为去离子水。

2.实时荧光PCR反应

以上述样品为模板，进行实时荧光PCR反应，实时荧光PCR反应的方法和条件同实施例4。

检测结果如图3所示，从图中可以看出，只有寨卡病毒的的cDNA样品的Ct值为16，呈阳性；黄热病毒、登革热病毒和流感病毒则检测不到Ct值，均呈阴性；阳性对照有扩增曲线，阴性对照无扩增曲线。由此证明本发明实施例1的引物、探针和实施例2的试剂盒均具有高特异性；进一步的，本发明基于实施例1的引物、探针和实施例2的试剂盒建立的检测方法能够准确的对寨卡病毒进行检测。

Claims

1.一组引物和探针，其特征在于，其中一条引物包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，另一条引物包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述探针为包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；

任选的，所述探针所用的淬灭基团为TRAMA、荧光基团为HEX。

3.根据权利要求1或2所述的引物和探针在制备检测寨卡病毒的产品中的应用；

任选的，所述检测寨卡病毒的产品还包括PCR扩增试剂；

任选的，所述PCR扩增试剂为荧光定量PCR试剂。

4.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物和探针。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：还包括PCR扩增试剂；

任选的，所述PCR扩增试剂为荧光定量PCR试剂；

任选的，所述荧光定量PCR试剂包括来自Takara公司的货号为RR064A的One StepPrimeScript^TM RT-PCR Kit试剂盒所包含的试剂；

任选的，所述来自Takara公司的货号为RR064A的One Step PrimeScript^TM RT-PCR Kit试剂盒所包含的试剂为2×One Step RT-PCR Buffer III、Takara Ex Taq HS、PrimeScript RT Enzyme Mix和ROX Reference Dye or Dye II中的至少一种；

任选的，还包括阳性对照和阴性对照；

任选的，还包括RNA提取试剂；

任选的，所述RNA提取试剂包括来自QIAGEN公司的货号为52904的QIAamp Viral RNAMini Kit RNA提取试剂盒所包含的试剂；

任选的，还包括逆转录试剂；

任选的，所述逆转录试剂包括来自Takara公司的货号为RR064A的One StepPrimeScript^TM RT-PCR Kit逆转录试剂盒所包含的试剂。

6.权利要求5所述的试剂盒在制备检测寨卡病毒的产品中的应用。

7.一种筛选易患寨卡病毒病的生物样品的系统，其特征在于，包括：

8.根据权利要求7所述的系统，其特征在于，

所述核酸提取装置还用于提取已知浓度/拷贝数的标准品质粒；

所述荧光定量PCR装置还用于采用权利要求1或2所述的引物和探针对所述已知浓度/拷贝数的标准品质粒进行荧光定量PCR反应；

所述核酸提取装置进一步包括：标准曲线测定装置，所述标准曲线测定装置分别与所述荧光定量PCR装置和判断装置相连，所述标准曲线测定装置先将所述标准品质粒在荧光定量PCR装置产生的Ct值与标准品质粒的浓度进行关联并绘制标准曲线，所述判断装置将标准曲线测定装置产生的标准曲线与核酸样本在荧光定量PCR装置产生的结果进行比对，判断生物样品中的寨卡病毒的含量或拷贝数；

任选的，所述核酸提取装置进一步包括：

RNA提取单元，所述RNA提取单元用于从生物样品中提取RNA样本；以及

9.根据权利要求8所述的系统，其特征在于，所述生物样品为包含有DNA和/或RNA的血液、细胞或组织，或为质粒，或为DNA、cDNA、mRNA或cDNA片段，或为含有DNA、cDNA、mRNA或cDNA片段的试剂；

任选的，当生物样品为DNA、cDNA或cDNA片段，或为含有DNA、cDNA或cDNA片段的试剂，或为质粒时，将其直接作为核酸样本与所述引物和探针对进行实时荧光PCR反应；

任选的，当生物样品为含有DNA和/或RNA的血液、细胞或组织，或为mRNA，或为含有mRNA的试剂时，将其转化为DNA、cDNA或cDNA片段的核酸样本再与所述引物和探针进行实时荧光PCR反应。

10.根据权利要求9所述的系统，其特征在于：

所述实时荧光PCR反应的反应体系如下：

所述2×One Step RT-PCR Buffer III、Takara Ex Taq HS、PrimeScript RT EnzymeMix和ROX Reference Dye or Dye II均来自Takara公司的货号为RR064A的One StepPrimeScript^TM RT-PCR Kit试剂盒；

任选的，所述实时荧光PCR反应的程序如下：50℃2min；95℃10min；95℃15s,55℃1min,40个循环。