CN110699491A

CN110699491A - 寨卡病毒实时荧光定量rt-rpa检测引物和探针及检测试剂盒

Info

Publication number: CN110699491A
Application number: CN201911106140.6A
Authority: CN
Inventors: 李阿茜; 梁米芳; 李建东; 李德新; 刘洋; 芜为; 李川
Original assignee: National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2019-11-13
Filing date: 2019-11-13
Publication date: 2020-01-17
Anticipated expiration: 2039-11-13
Also published as: CN110699491B

Abstract

本发明提供寨卡病毒实时荧光定量RT‑RPA检测引物和探针及检测试剂盒。所述试剂盒中包含基于RPA技术检测寨卡病毒的引物及探针，上、下游引物和探针序列分别如SEQ ID NO:1‑3所示。本发明首次采用实时荧光定量RT‑RPA技术建立快速检测寨卡病毒的方法，并通过特异性、灵敏度及稳定性评价，可用于临床现场检测，为寨卡病毒的现场检测提供一种灵敏、可靠的新方法。

Description

寨卡病毒实时荧光定量RT-RPA检测引物和探针及检测试剂盒

技术领域

本发明涉及核酸检测技术领域，具体地说，涉及寨卡病毒实时荧光定量RT-RPA检测引物和探针及检测试剂盒。

背景技术

近期以来，可能与寨卡病毒(Zika Virus)感染有关的先天性小头症患者和其他神经障碍病例不断增加，导致对发现和诊断寨卡病毒感染的需求增加。病毒核酸检测技术可以特异性的检测病毒靶基因，更敏感、快速，极大避免了使用传染性病毒的生物安全风险，在寨卡病毒早期感染的检测与诊断方面具有独特优势，适用于寨卡病毒病急性期标本的检测。

分子扩增是核酸分子检测中重要一环，PCR技术依赖温度变化实现变性、复性、延伸等扩增反应，完成扩增技术需依赖于精密而复杂的大型仪器，例如温控调节仪器和复杂的样本处理步骤，这些设备体积大、价格贵并且操作复杂，不适合用于疫情爆发时现场应急检测任务。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)是一种新型等温扩增技术，通过一对引物与模板同源区域特异性结合形成重组酶引物复合体，实现链置换作用，并在DNA聚合酶作用下实现延伸。该技术在一定温度条件下可实现对目标产物的扩增从而达到检测目的，无需经历热循环过程，大大简化了对大型仪器的需求，缩短了反应时间，操作简单方便，可满足现场应急对病原体快速诊断的需求，近年来成为分子诊断行业的研究热点。

发明内容

本发明的目的是提供寨卡病毒实时荧光定量RT-RPA检测引物和探针及检测试剂盒。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供寨卡病毒实时荧光定量RT-RPA检测引物和探针，上、下游引物和探针序列分别如下(SEQ ID NO:1-3)：

上游引物：5′-TACAAGTACCATCCTGACTCCCCCCGTAGA-3′

下游引物：5′-ACTCCATTCTCTTCCAGGATTGCATTGAGCT-3′

探针：5′-CCTCTGTTTCAAGAATGGAAAACATCA[FAM-dT][dSpacer][IntBHQ1-dT]GGAGATCAGTAGAAG[C3spacer]-3′

所述引物和探针是根据寨卡病毒NS1基因序列(SEQ ID NO:4)设计的。

第二方面，本发明提供含有所述引物和探针的检测试剂或试剂盒。

第三方面，本发明提供一种寨卡病毒实时荧光定量RT-RPA检测试剂盒，所述试剂盒包括所述引物和探针，还含有逆转录酶、结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)、链置换DNA聚合酶、RNA酶抑制剂、标准阳性模板、再水化缓冲液、醋酸镁溶液、酶扩增八联管等中的至少一种。

第四方面，本发明提供所述引物和探针、含有所述引物和探针的检测试剂或试剂盒在寨卡病毒检测中的应用。

第五方面，本发明提供一种非诊断目的实时荧光定量RT-RPA检测寨卡病毒的方法，包括以下步骤：

1)提取待测样本的总RNA；

2)配制含有所述引物和探针的RT-RPA反应体系，向反应体系中加入上述提取的总RNA，进行反转录和RPA扩增反应；

3)分析扩增产物。

步骤2)包括：向离心管中加入再水化缓冲液29.2～29.5μL(优选29.5μL)，10μM上、下游引物各2.5μL，10μM探针0.65μL、AMV逆转录酶0.6μL至终浓度6U/μL，40U/μl RNA酶抑制剂0.5μL和ddH₂O 5.85μL，混匀后，将上述混合液加入含有冻干酶球的RPA反应管中，混匀，最后将280mM醋酸镁溶液2.9～3.2μL(优选2.9μL)加至上述反应管中，混匀后将反应管置于等温扩增仪中，于40℃反应120秒。

优选地，本发明使用TwistAmp exo RT试剂盒实现对寨卡病毒核酸的检测。

步骤3)包括：根据是否出现扩增曲线，分析待测样本中是否含有寨卡病毒核酸；出现相应的扩增曲线表示待测样本含有寨卡病毒核酸，表现为阳性结果；不出现扩增曲线或扩增曲线低于检测阈值表示待测样本中未检测到寨卡病毒核酸，表现为阴性结果。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)本发明首次采用实时荧光定量RT-RPA技术建立快速检测寨卡病毒的方法，并通过特异性、灵敏度及稳定性评价，可用于临床现场检测，为寨卡病毒的现场检测提供一种灵敏、可靠的新方法。

(二)本发明的引物和探针组合是根据靶标序列设计多对RPA引物、探针，并经大量实验筛选、反复优化获得的，特异性好，与其他病毒无交叉反应，能将寨卡病毒与黄病毒科中的其它毒种，布尼亚病毒，披膜病毒科病毒，副黏液病毒科病毒以及杯状病毒科病毒有效鉴别开来。

(三)通过RPA反应能够将痕量的核酸模板扩增到可以检出的水平，本发明所建立的检测方法可检测出7.1×10²PFU/mL的核酸。

(四)检测速度快，与常规PCR相比，不经过变温历程，5min内即可完成反应，尤其适于基层实验室和现场快速核酸检测。

附图说明

图1为基于RPA扩增反应的探针设计原理图。

图2为本发明实施例1中使用JEV、DENV、WNV、SLEV、HTNV、SFTS、SEOV、CHIKV、SFV、RV、PIV、MuV和NV等13种病毒核酸对实时荧光定量RT-RPA检测技术的特异性进行评价。

图3为本发明实施例1中RT-RPA检测技术的灵敏度评价。

图4为本发明实施例1中寨卡病毒核酸对RT-RPA灵敏性评价。

图5为本发明实施例2中实时荧光RT-RPA探针的筛选结果。

图6为本发明实施例2中实时荧光RT-RPA上游引物的第一轮筛选结果。

图7为本发明实施例2中实时荧光RT-RPA下游引物的第一轮筛选结果。

图8A～图8D为本发明实施例2中实时荧光RT-RPA上下游引物第二轮初步筛选结果。其中，图8A：R1-3与上游引物的筛选；图8B：R2-3-1与上游引物的筛选；图8C：R2-3-3与上游引物的筛选；图8D：R2-3-4与上游引物的筛选。

图9为本发明实施例2中编号为2-1、4-1、1-2、2-2、4-2、4-4、2-5引物探针组合再次进行扩增比较结果。

图10为本发明实施例2中第一轮筛选2.1μl-3.6μl醋酸镁(280mM)对RT-RPA反应的影响。其中，A：不同量醋酸镁的RT-RPA扩增曲线，B：不同量醋酸镁与反应快慢趋势图。

图11为本发明实施例2中第二轮筛选2.7μl-3.3μl醋酸镁(280mM)对RT-RPA反应的影响。其中，A：不同量醋酸镁的RT-RPA扩增曲线，B：不同量醋酸镁与反应快慢趋势图。

图12为本发明实施例2中第一轮筛选0.75μl-3.2μl引物浓度(10μM)对RT-RPA反应的影响。其中，A：不同浓度引物的扩增曲线，B：不同浓度引物与反应快慢趋势图。

图13为本发明实施例2中第二轮筛选1.8μl-2.5μl引物浓度(10μM)对RT-RPA反应的影响。其中，A：不同浓度引物的扩增曲线，B：不同浓度引物与反应快慢趋势图。

图14为本发明实施例2中筛选0.6μl-0.75μl探针浓度(10μM)对RT-RPA反应的影响。其中，A：不同浓度探针的扩增曲线，B：不同浓度探针与反应快慢趋势图。

图15为本发明实施例2中AMV逆转录酶浓度对RT-RPA反应的影响。其中，A：不同逆转录酶浓度的扩增曲线，1：0μl AMV，2：0.6μl AMV，3：0.9μl AMV，4：1.2μl AMV，5：1.9μlAMV，6：0.25μl Bst3.0，7：0.85μl Bst3.0，8：1.45μl Bst3.0；B：不同逆转录酶浓度反应快慢趋势图。

图16为本发明实施例2中RNase抑制剂种类以及反应体系体积的选择。其中，1：2.5μl SUPERase RNase Inhibitor，2：0.5μl Recombinant RNase Inhibitor，3：加入2.5μlSUPERase RNase Inhibitor后取一半总体系体积反应，4：加入0.5μl Recombinant RNaseInhibitor后取一半总体系体积反应。

具体实施方式

本发明利用1对引物和1条探针并建立实时荧光定量RT-RPA检测方法用于扩增寨卡病毒NS1基因，通过实时荧光定量PCR技术实现对寨卡病毒核酸的检测。具体地说，本发明的技术方案包括：使用TwistAmp exo RT试剂盒对ZIKV-NS1体外转录RNA进行扩增，体系如下：再水化缓冲液(Rehydration Buffer)29.5μl，上、下游引物(10μM)各2.5μl，探针(10μM)0.65μl，AMV逆转录酶0.6μl(终浓度6U/μl)，40U/μl RNA酶抑制剂0.5μl，ddH₂O 5.85μl混合而成的42.1μl的工作缓冲液，然后加入5μl RNA模板与上述工作缓冲液混合，并将其加入装有干粉状的酶体系的酶扩增八联管中，将其溶解并混匀，最后将2.9μl 280mM醋酸镁溶液加至八联管盖子上，小心盖上盖子，反应前利用涡旋震荡仪混匀并离心，使镁离子启动反应发生，并立即放置AGS等温仪器中，在40℃进行条件下进行扩增，待反应进行120秒时，暂停仪器运行，利用涡旋震荡仪进行涡旋并离心，立即置入仪器中，并启动仪器进行产物扩增，观察扩增曲线。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1实时荧光定量RT-RPA检测寨卡病毒方法的建立

1、体外转录RNA的制备

利用PCR的方法将T7启动子引入正链病毒阅读框的上游、负链病毒阅读框的下游，以达到经过体外转录后，获得与病毒基因组序列一致的RNA。以病毒RNA逆转录合成的cDNA或含有人工合成靶基因的质粒为模板，使用FastStart High Fidelity PCR system，配制如下体系：

正、反向引物的序列如下：

正向引物：5′-TAATACGACTCACTATAGGATGTGGGGTGCTCGG-3′

反向引物：5′-TGCAGTCACCACTGACCTTACTAAGTT-3′

扩增得到ZIKA NS1基因全长，其序列如SEQ ID NO:4所示。

反应条件为：94℃3分钟；94℃30秒，55℃1分钟，72℃2分钟，40个循环；72℃10分钟。

2、PCR产物回收

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，使用

II Gel Extraction Kit进行切胶回收，操作步骤如下：

1)从琼脂糖凝胶中切下目的条带，称重；

2)加入5倍于胶体积的QG缓冲液；

3)置于50℃水浴中10分钟融化凝胶，每隔2-3分钟轻柔振摇；

4)将样品移入QIAquick柱，10,000rpm离心15秒，弃滤液；

5)加入750μL PE缓冲液，室温静置5分钟，10,000rpm离心15秒，弃滤液；

6)加入750μL PE缓冲液，10,000rpm离心15秒，弃滤液；

7)10,000rpm离心2分钟；

8)将QIAquick柱置于新的1.5mL EP管中，向柱的中心加入40μL不含RNase的水，室温静置2分钟，10,000rpm离心1分钟，收集洗脱液。

3、体外转录

使用RiboMAX^TM Large Scale RNA Production Systems—SP6和T7进行体外转录，获得靶基因的RNA模板，配制如下体系：

30℃反应2～4小时后，加入10μL RQ1无RNase的DNnase(1U/μL)，37℃反应15分钟。

4、体外转录RNA产物的回收与定量

使用RNeasy Mini Kit对体外转录的RNA产物进行纯化，操作步骤如下：

1)用DEPC水将上述体外转录反应产物的体积调整至100μL，加入350μL RLT缓冲液，混匀，再加入250μL无水乙醇，混匀；

2)将上述混合液加入到RNeasy Mini Spin柱中，10,000rpm离心15秒，弃滤液；

3)加入700μL RW1缓冲液，10,000rpm离心15秒，弃滤液；

4)加入500μL RPE缓冲液，10,000rpm离心15秒，弃滤液，重复该步骤一次；

5)将RNeasy Mini Spin柱置于新的2mL收集管中，13,000rpm离心1分钟；

6)将RNeasy Mini Spin柱置于新的1.5mL EP管中，向柱中心加入100μL不含RNase的水，室温静置2分钟，13,000rpm离心1分钟，收集洗脱液。

琼脂糖凝胶电泳分析体外转录获得的RNA模板的纯度后，使用DEPC水进行稀释后，采用Nanodrop分光光度计进行3次测量，保证测量的值在100-300ng/μL之间，取测量的平均值计算各纯化后RNA产物的质量浓度后，采用下列公式，计算各自的拷贝数浓度：

Y(拷贝/μL)＝[X(g/μL)/体外转录RNA的核苷酸长度×340]×6.02×10²³

5、引物、探针设计

根据RPA扩增反应原理进行探针设计，设计原则如下：

(1)探针长度一般在46-52bp之间。

(2)探针一般由荧光基团、淬灭基团、四氢呋喃(THF)以及3’端有一个block。

(3)THF 5’端至少需要有30个碱基，3’端需要有15个碱基，THF位于荧光基团和淬灭基团之间，一般荧光基团和淬灭基团间相隔2-4个碱基。探针设计原理图见图1。

(4)合成探针时，THF可以用“dSpacer”代替，3’端block可以用“C3Spacer”或3’端磷酸化修饰。

(5)引物设计所在的目标区域序列应较保守，GC含量应介于40％-60％之间，且避免大量的长片段重复序列。

(6)设计的引物探针序列如下(SEQ ID NO:1-3)：

注：上述起止位置参考GenBank:MH882542.1。

6、实时荧光定量RT-RPA扩增

使用TwistAmp exo RT试剂盒对ZIKV-NS1体外转录RNA进行扩增，体系如下：再水化缓冲液(Rehydration Buffer)29.5μl，上、下游引物(10μM)各2.5μl，探针(10μM)0.65μl，AMV逆转录酶0.6μl(终浓度6U/μl)，40U/μl RNA酶抑制剂0.5μl，ddH₂O 5.85μl混合而成的工作缓冲液42.1μl，然后加入5μl RNA模板与上述工作缓冲液混合，并将其加入装有干粉状的酶体系的酶扩增八联管中，将其溶解并混匀，最后将2.9μl 280mM醋酸镁溶液加至八联管盖子上，小心盖上盖子，反应前利用涡旋震荡仪混匀并离心，使镁离子启动反应发生，并立即放置AGS等温仪器中，在40℃进行条件下进行扩增，待反应进行120秒时，暂停仪器运行，利用涡旋震荡仪进行涡旋并离心，立即置入仪器中，并启动仪器进行产物扩增，观察扩增曲线。

7、特异性评价

(1)核酸提取：依据寨卡病毒的传播媒介、疫情流行区域以及临床发病症状等特点，选取黄病毒科中4种病毒，分别为JEV(Japanese Encephalitis Virus)、DENV(DengueVirus)、WNV(West Nile Virus)和SLEV(Saint Louis Encephalitis Virus)；布尼亚病毒目中3种病毒，即HTNV(Hantavirus)、SFTS(Severe Fever With ThrombocytopeniaSyndrome Virus)和SEOV(Seoul Virus)；选取披膜病毒科中CHIKV(Chikungunya Virus)、SFV(Semliki Forest Virus)和RV(Rubella Virus)；副黏液病毒科中PIV(ParainfluenzaVirus)、MuV(Mumps Virus)；杯状病毒科NV(Norovirus)。取以上13种病毒细胞培养物上清进行核酸提取。

(2)RT-RPA扩增：13种病毒核酸各取5μl作为模板加入到RPA反应体系中进行扩增，以寨卡病毒核酸为模板设置阳性对照。

(3)通过AGS等温扩增仪收集荧光信号判断其他病毒是否有扩增。

图2实验结果显示，病毒核酸均无扩增，RT-RPA技术具有良好的特异性。

8、灵敏性评价

8.1体外转录RNA对RT-RPA灵敏性评价

(1)通过体外转录获得ZIKV NS1片段的2.8×10¹¹拷贝/μL的体外转录RNA。

(2)取2μl体外转录RNA加入26μl H₂O中，获得2×10¹⁰拷贝/μL的体外转录RNA，并将其10倍梯度稀释，共设9个梯度，获得2×10¹⁰拷贝/μL至2×10¹拷贝/μL的ZIKV体外转录模板。

(3)以2×10⁷拷贝/μL至2×10¹拷贝/μL的体外转录RNA进行RT-RPA扩增实验和实时荧光定量PCR反应，并设置1个空白对照，进行梯度实验，独立重复10次。

(4)计算得到寨卡体外转录RNA的最低检出限，以评价RT-RPA技术的灵敏性，并与实时荧光定量PCR进行比较。

从图3可以看出RT-RPA对体外转录可检测到2×10²拷贝/μl。体外转录RNA梯度扩增曲线①:2×10⁷拷贝/μl，②:2×10⁶拷贝/μl，③:2×10⁵拷贝/μl，④:2×10⁴拷贝/μl，⑤:2×10³拷贝/μl，⑥:2×10²拷贝/μl，⑦:2×10¹拷贝/μl，⑧:空白对照。

8.2寨卡病毒核酸对RT-RPA灵敏性评价

(1)通过空斑实验测得寨卡病毒细胞培养物滴度为7.1×10⁸PFU/ml，并对寨卡病毒细胞培养物提取核酸。

(2)7.1×10⁸PFU/ml寨卡病毒核酸进行10倍稀释，共设7个梯度和1个空白对照。

(3)以稀释所得7.1×10⁸PFU/mL至7.1×10²PFU/mL核酸为模板进行RT-RPA扩增以及PCR反应。

(4)比较RT-RPA与实时荧光定量PCR的检测灵敏性。结果见表1：

表1 RT-RPA与实时荧光定量PCR技术比较

由表1可知，体外转录RNA，RT-RPA可以检测到Ct值在31～32之间，可检出1000拷贝/反应。

寨卡病毒核酸对RT-RPA灵敏性评价结果见表2、图4。结果显示，与体外转录RNA检测水平一致，即RT-RPA可检测到Ct值在31～32之间的寨卡病毒核酸，可检测出7.1×10²PFU/mL的核酸。

表2 RT-RPA与实时荧光定量PCR技术比较

结果显示，RT-RPA可检测到Ct值在31至32间的寨卡病毒核酸，具有较好的灵敏性。

9、模拟临床标本验证

(1)将16份模拟寨卡病毒临床标本(向寨卡病毒细胞培养物中加入正常人血清模拟临床病人标本)以及10份正常人血清用QIAamp Viral RNA Mini Kit进行核酸提取，寨卡病毒细胞培养物作为阳性对照参与核酸提取过程。

(2)取5μL模拟标本以及正常人血清核酸为模板加入实时荧光定量PCR体系和RT-RPA体系中进行扩增。

(3)比较RT-RPA与实时荧光定量PCR对标本检测结果。

实时荧光定量PCR测得模拟标本Ct值介于16.07～27.05之间。RT-RPA法可以100％检测到16份模拟标本，10份正常人血清为阴性，具有良好的特异性。

实施例2 RPA引物、探针的优化

1、引物/探针设计

通过引物探针设计软件比对分析，依据设计原则，选取ZIKV NS1片段保守区分别设计5条上、下游引物，以及3条探针，序列如表3所示。

表3 ZIKV NS1 exo-RT扩增引物序列

2、探针筛选

通过5条上游引物与1条下游引物进行一一组合，组合如表4所示，分别对3条探针进行筛选。根据图5结果显示，5种上下游引物组合均与探针ZIKV-EXO-P1-4(2662-2706)具有较好的扩增反应，且所需反应时间较短，故探针ZIKV-EXO-P1-4优于ZIKV-EXO-P1-3和ZIKV-EXO-P1-6。

表4 5种引物组合对探针的筛选

3、实时荧光RT-RPA引物的筛选

3.1第一轮引物的筛选

3.1.1上游引物的筛选

选取下游引物ZIKV-EXO-R1-1和已筛选探针ZIKV-EXO-P1-4对5条上游引物进行筛选，组合如表5所示。根据表5及图6结果显示，1f4r1p4、1f5r1p4组合效果较好，故上游引物ZIKV-EXO-F1-4和ZIKV-EXO-F1-5扩增相对较好。

表5上游引物筛选组合及反应时间结果

3.1.2下游引物的筛选

将已筛选的2条上游引物ZIKV-EXO-F1-4和ZIKV-EXO-F1-5和1条探针ZIKV-EXO-P1-4对5条下游引物进行筛选，组合如表6所示，由表6及图7可以看出下游引物ZIKV-EXO-R1-3和ZIKV-EXO-R1-4相对具有较好的扩增反应。

表6下游引物筛选组合及反应时间结果

通过第一轮筛选可以初步得出，探针ZIKV-EXO-P1-4、上游引物ZIKV-EXO-F1-4和ZIKV-EXO-F1-5、下游引物ZIKV-EXO-R1-3相对具有良好的扩增效果，但仍需进一步调整。

3.2第二轮引物的筛选

为进一步提高RPA扩增效率，依据引物筛选策略，探针ZIKV-EXO-P1-4保持不变，在第一轮筛选结果的基础上将待选引物碱基位置及数量做进一步调整。经设计软件比对分析，新设计5条上游引物以及3条下游引物，序列如表7所示。

表7第二轮筛选涉及的引物序列

将第一轮筛选结果所得上游引物ZIKV-EXO-F1-4和ZIKV-EXO-F1-5、下游引物ZIKV-EXO-R1-3与新合成的上、下游引物分别一一组合，最后形成28组引物对，并将其编号，如表8所示。并依据编号一一进行RT-RPA扩增，筛选出待选引物对，结果如图8A～图8D所示。

表8第二轮筛选涉及的引物组合

ZIKV/编号	F1-4	F1-5	F2-4-1	F2-4-2	F2-4-3	F2-4-4	F2-5-1
								R1-3	1-1	1-2	1-3	1-4	1-5	1-6	1-7
R2-3-1	2-1	2-2	2-3	2-4	2-5	2-6	2-7
								R2-3-3	3-1	3-2	3-3	3-4	3-5	3-6	3-7
R2-3-4	4-1	4-2	4-3	4-4	4-5	4-6	4-7

结果显示，编号为2-1、4-1、1-2、2-2、4-2、4-4、2-5组合均具有相对较好的扩增曲线。将7对较好扩增引物探针组合再次进行扩增比较，图9可以得出组合2-1扩增较好，因此上游引物最佳为ZIKV-EXO-F1-4，下游引物最佳为ZIKV-EXO-R2-3-1，探针最佳为ZIKV-EXO-P1-4，序列组合如下：

实施例3反应体系的优化

1、实时荧光RT-RPA检测体系中醋酸镁含量的优化

醋酸镁是启动整个RT-RPA反应发生的关键，不同含量的醋酸镁对反应时间也有不同的影响。参考相关文献，醋酸镁反应条件较好在12mM-20mM之间，因此，第一轮筛选将终浓度为280mM醋酸镁分别用终浓度为11.76mM(2.1μl)、13.44mM(2.4μl)、15.12mM(2.7μl)、16.8mM(3.0μl)、18.48mM(3.3μl)、20.16mM(3.6μl)共6个梯度进行实验，并重复2次。

图10中(A和B)显示，15.12mM(2.7μl)-20.16mM(3.6μl)之间反应所需时间最少，最佳反应浓度可能位于该区间。第二轮筛选以此区间进行梯度设置，分别为15.12mM(2.7μl)、15.68mM(2.8μl)、(2.9μl)、16.8mM(3μl)、17.36mM(3.1μl)、17.92mM(3.2μl)、18.48mM(3.3μl)共7个梯度，重复2次。图11中(A和B)显示，该区间反应时间差别不大，其中16.24mM(2.9μl)与17.92mM(3.2μl)扩增曲线较好。综合考虑，将2.9μl作为反应体系中醋酸镁的体积，即醋酸镁的最佳反应量为16.24mM。

2、引物(10μM)最佳体积及终浓度的确定

RPA反应中引物终浓度需要150nM-600nM，故第一轮筛选使用10μM浓度的引物，设置150nM(0.75μl)、220nM(1.1μl)、290nM(1.45μl)、360nM(1.8μl)、430nM(2.15μl)、500nM(2.5μl)、570nM(2.85μl)、640nM(3.2μl)八个梯度，重复2次。图12中(A和B)显示，最佳反应体积范围为：360nM(1.8μl)～500nM(2.5μl)。

为探究引物最佳浓度，在第一轮筛选结果的基础上，进一步探究360nM(1.8μl)、380nM(1.9μl)、400nM(2.0μl)、420nM(2.1μl)、440nM(2.2μl)、460nM(2.3μl)、480nM(2.4μl)、500nM(2.5μl)不同引物浓度对扩增的影响。图13中(A和B)显示2.5μl体积的引物使反应较好，故2.5μl作为引物的最佳体积，此时体系引物浓度为500nM。

3、探针(10μM)最佳体积及终浓度的确定

RPA技术反应所需探针浓度为50nM-150nM，因此将10μM浓度的探针设置8个梯度，分别为50nM(0.25μl)、60nM(0.3μl)、70nM(0.35μl)、90nM(0.45μl)、110nM(0.55μl)、120nM(0.6μl)、130nM(0.65μl)、150nM(0.75μl)，重复2次。图14中(A和B)结果显示，0.65μl时，所需反应时间做短，此时探针浓度为130nM。

4、AMV逆转录酶浓度的确定

为提高RT-RPA技术检出灵敏性，故对exo-RT试剂盒RNA逆转录过程的扩增效率进行优化，根据相关文献报道，AMV逆转录酶与Bst3.0逆转录酶均有可能在40℃左右的进行反应，故依据说明书，设置AMV逆转录酶体积分别为0U(0μl)、6U(0.6μl)、9U(0.9μl)、12U(1.2μl)、19U(1.9μl)共5个梯度以及Bst3.0逆转录酶体积为0.25μl、0.85μl、1.45μl共3个梯度，重复2次实验。图15中(A和B)结果显示，0.6μl AMV逆转录酶反应最佳，此时浓度为6U/μl，Bst3.0不适于RPA扩增反应。

5、RNase抑制剂浓度的确定及反应体积减半探究

依据SUPERase RNase Inhibitor(20U/μl)说明书，取其最佳浓度1U/μl，向体系中加入2.5μl，依据Recombinant RNase Inhibitor(40U/μl说明书)取其最佳反应浓度0.5U/μl reaction，即向体系中加入0.5μl。图16结果显示Recombinant RNase抑制剂优于SUPERase RNase抑制剂，当体系由原来50μl变为25μl时，反应受到影响。

由以上实验结果可以得出，反应体系中10μM引物2.5μl，10μM探针0.65μl，280mM醋酸镁溶液2.9μl，当AMV为0.6μl时，反应结果最佳，体系中加入Recombinant RNaseInhibitor均对反应体系有优化效果。当体系由原来50μl变为25μl时，反应受到影响。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

<120> 寨卡病毒实时荧光定量RT-RPA检测引物和探针及检测试剂盒

<130> KHP191114838.6

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tacaagtacc atcctgactc cccccgtaga 30

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

actccattct cttccaggat tgcattgagc t 31

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cctctgtttc aagaatggaa aacatcatgt ggagatcagt agaag 45

<210> 4

<211> 1056

<212> DNA

<213> 寨卡病毒(Zika virus)

<400> 4

gatgtggggt gctcggtgga cttctcaaag aaggagacga gatgcggtac aggggtgttc 60

gtctataacg acgttgaagc ctggagggac aggtacaagt accatcctga ctccccccgt 120

agattggcag cagcagtcaa gcaagcctgg gaagatggta tctgcgggat ctcctctgtt 180

tcaagaatgg aaaacatcat gtggagatca gtagaagggg agctcaatgc aatcctggaa 240

gagaatggag ttcaactgac ggtcgttgtg ggatctgtaa aaaaccccat gtggagaggt 300

ccacagagat tgcccgtgcc tgtgaacgag ctgccccacg gctggaaggc ttgggggaaa 360

tcgtacttcg tcagagcagc aaagacaaat aacagctttg tcgtggatgg tgacacactg 420

aaggaatgcc cactcaaaca tagagcatgg aacagctttc ttgtggagga tcatgggttc 480

ggggtatttc acactagtgt ctggctcaag gttagagaag attattcatt agagtgtgat 540

ccagccgtta ttggaacagc tgttaaggga aaggaggctg tacacagtga tctaggctac 600

tggattgaga gtgagaagaa tgacacatgg aggctgaaga gggcccatct gatcgagatg 660

aaaacatgtg aatggccaaa gtcccacaca ttgtggacag atggaataga agagagtgat 720

ctgatcatac ccaagtcttt agctgggcca ctcagccatc acaataccag agagggctac 780

aggacccaaa tgaaagggcc atggcacagt gaagagcttg aaattcggtt tgaggaatgc 840

ccaggcacta aggtccacgt ggaggaaaca tgtggaacaa gaggaccatc tctgagatca 900

accactgcaa gcggaagggt gatcgaggaa tggtgctgca gagagtgcac aatgccccca 960

ctgtcgttcc gggctaaaga tggctgttgg tatggaatgg agataaggcc caggaaagaa 1020

ccagaaagca acttagtaag gtcagtggtg actgca 1056

Claims

1.寨卡病毒实时荧光定量RT-RPA检测引物和探针，其特征在于，上、下游引物和探针序列分别如下：

上游引物：5′-TACAAGTACCATCCTGACTCCCCCCGTAGA-3′

下游引物：5′-ACTCCATTCTCTTCCAGGATTGCATTGAGCT-3′

探针：5′-CCTCTGTTTCAAGAATGGAAAACATCA[FAM-dT][dSpacer][IntBHQ1-dT]GGAGATCAGTAGAAG[C3spacer]-3′。

2.含有权利要求1所述引物和探针的检测试剂或试剂盒。

3.寨卡病毒实时荧光定量RT-RPA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述引物和探针，还含有逆转录酶、结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶、RNA酶抑制剂、标准阳性模板、再水化缓冲液、醋酸镁溶液、酶扩增八联管中的至少一种。

4.非诊断目的实时荧光定量RT-RPA检测寨卡病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测样本的总RNA；

2)配制含有权利要求1所述引物和探针的RT-RPA反应体系，向反应体系中加入上述提取的总RNA，进行反转录和RPA扩增反应；

3)分析扩增产物。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)包括：向离心管中加入再水化缓冲液29.2～29.5μL，10μM上、下游引物各2.5μL，10μM探针0.65μL、AMV逆转录酶0.6μL至终浓度6U/μL，40U/μl RNA酶抑制剂0.5μL和ddH₂O 5.85μL，混匀后，将上述混合液加入含有冻干酶球的RPA反应管中，混匀，最后将280mM醋酸镁溶液2.9～3.2μL加至上述反应管中，混匀后将反应管置于等温扩增仪中，于40℃反应120秒。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，步骤3)包括：根据是否出现扩增曲线，分析待测样本中是否含有寨卡病毒核酸；出现相应的扩增曲线表示待测样本含有寨卡病毒核酸，表现为阳性结果；不出现扩增曲线或扩增曲线低于检测阈值表示待测样本中未检测到寨卡病毒核酸，表现为阴性结果。