CN110387435A - 利用rpa技术检测寨卡病毒的方法及其专用成套试剂 - Google Patents

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CN110387435A CN201810341971.0A CN201810341971A CN110387435A CN 110387435 A CN110387435 A CN 110387435A CN 201810341971 A CN201810341971 A CN 201810341971A CN 110387435 A CN110387435 A CN 110387435A
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秦成峰
姜涛
李裕昌
邓永强
吴晓燕
户义
李靖
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

本发明公开了利用RPA技术检测寨卡病毒的方法及其专用成套试剂。该成套试剂由引物对X和探针X组成，引物对X由序列表中序列3所示的引物F和序列表中序列2所示的引物R组成，探针X从5’至3’依次包括DNA片段甲、四氢呋喃和DNA片段乙，DNA片段甲和DNA片段乙分别为序列表中序列4和序列5所示的单链DNA分子。实验证明，采用本发明提供的成套试剂进行RPA可以检测寨卡病毒，特异性好且灵敏度高。本发明具有重大的实用价值。

Description

利用RPA技术检测寨卡病毒的方法及其专用成套试剂
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及利用RPA技术检测寨卡病毒的方法及其专用成套试剂。
背景技术
寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)属于黄病毒科黄病毒属，由蚊虫叮咬传播。1947年首次从乌干达的寨卡森林的恒河猴血液中发现寨卡病毒。寨卡病毒感染后症状通常都很轻微，很长一段时间，寨卡病毒感染一直都不被重视。从2015年开始，寨卡病毒引起了世界范围内的流行，在巴西有超过100万以上的寨卡病毒感染病例。在中国，也发现了多起寨卡病毒感染的病例。研究表明，寨卡病毒感染可引起新生儿小头症，并且还与其它新生儿缺陷有关。研制寨卡病毒的快速检测试剂，对于控制寨卡病毒的传播，并及时采取有效的防控策略至关重要。
人类目前针对寨卡病毒的检测主要依靠荧光定量PCR技术。荧光定量PCR技术具有较高的灵敏性，但需要昂贵的温控设备、特定的实验室场地和专业技术人员操作，且检测时间长，仪器体积大，不适用于突发传染病的现场快速检测。因此，建立一种快速简便的核酸检测技术，该技术对寨卡病毒的现场快速筛查和检测具有重要价值。
重组酶聚合酶等温核酸扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)技术是由Piepenburg等人建立的一种新型核酸等温扩增技术，该技术依赖于三种酶(结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白和DNA聚合酶)对DNA模板进行扩增。在37℃-42℃之间，核酸模板无需变性，20min之内即可完成整个扩增过程。RPA技术操作简单，设备要求低，具有灵敏度高、特异性高等特点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是快速、准确的检测寨卡病毒。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种检测寨卡病毒的成套试剂，可由引物对X和探针X组成；
所述引物对X可由引物F和引物R组成；所述引物对X的靶序列可含有特异DNA片段；所述特异DNA片段可为如下y1)或y2)：
y1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；
y2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述探针X可为46-52个核苷酸组成的单链DNA分子，从5’至3’依次可包括DNA片段甲、外切酶exo的切断位点和DNA片段乙；
所述DNA片段甲可为30-35个核苷酸组成的单链DNA分子，与所述特异DNA片段上的区段甲部分相同；
所述DNA片段乙与所述特异DNA片段上的区段乙部分相同；
所述区段甲和所述区段乙在所述特异DNA片段上无重叠。
所述区段甲和所述区段乙均为所述特异DNA片段上连续的DNA片段。
上述成套试剂中，所述探针X从5’至3’具体可由DNA片段甲、外切酶exo的切断位点和DNA片段乙组成。
所述外切酶exo的切断位点具体可为四氢呋喃。
所述引物F可为如下a1)或a2)：
a1)序列表中序列3所示的单链DNA分子；
a2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子。
所述引物R可为如下b1)或b2)：
b1)序列表中序列2所示的单链DNA分子；
b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子。
所述DNA片段甲可为如下c1)或c2)：
c1)序列4所示的单链DNA分子；
c2)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子。
所述DNA片段乙可为如下d1)或d2)：
d1)序列5所示的单链DNA分子；
d2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的单链DNA分子。
上述任一所述成套试剂中，所述DNA片段甲的末端可具有荧光标记。具体的，所述DNA片段甲的3’末端可具有荧光标记。更为具体的，所述DNA片段甲的3’末端可具有FAM荧光标记(即序列4中3’末端的第一位胸腺嘧啶脱氧核苷酸具有FAM荧光标记)。
上述任一所述成套试剂中，所述DNA片段乙的一个末端可具有荧光淬灭基团，另一个末端可具有封闭基团。具体的，所述DNA片段乙的5’末端可具有荧光淬灭基团，3’末端可具有封闭基团。更为具体的，所述DNA片段乙的5’末端可具有BHQ1荧光淬灭基团，3’末端可具有封闭基团C3(即序列5中5’末端的第一位胸腺嘧啶脱氧核苷酸具有BHQ1荧光淬灭基团，3’末端用封闭基团C3封闭以阻断探针X延伸)。
上述任一所述成套试剂中的引物对X也属于本发明的保护范围。
本发明还保护c1)或c2)：
c1)上述任一所述成套试剂的制备方法，为将上述任一所述成套试剂中的所述引物F、所述引物R和所述探针X分别单独包装；
c2)所述引物对X的制备方法，为将所述引物对X中各引物分别单独包装。
上述任一所述成套试剂或所述引物对X的应用也属于本发明的保护范围。上述任一所述成套试剂或所述引物对X的应用可为如下d1)或d2)或d3)或d4)：
d1)制备用于检测或辅助检测寨卡病毒的试剂盒；
d2)检测或辅助检测待测样品中是否含有或疑似含有寨卡病毒；
d3)制备用于鉴定或辅助鉴定寨卡病毒的试剂盒；
d4)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为候选的寨卡病毒。
本发明还保护含有上述任一所述成套试剂或上述任一所述引物对X的试剂盒。
所述试剂盒的应用也属于本发明的保护范围。所述试剂盒的应用可为如下d2)或d4)：
d2)检测或辅助检测待测样品中是否含有或疑似含有寨卡病毒；
d4)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为候选的寨卡病毒。
本发明还保护检测待测样品是否含有寨卡病毒的方法。
本发明保护的检测待测样品是否含有寨卡病毒的方法，具体可为方法A1)：以待测样品的核酸为模板，以上述任一所述成套试剂进行RPA，然后进行如下评判：如果所述成套试剂可以检测出RPA阳性信号，则待测样品中含有或疑似含有寨卡病毒；如果所述成套试剂不能检测出RPA阳性信号，则待测样品不含有或疑似不含有寨卡病毒。
本发明保护的检测待测样品是否含有寨卡病毒的方法，具体可为方法A2)：以待测样品的cDNA为模板，以上述任一所述引物对X进行PCR扩增，然后进行如下评判：如果所述引物对X可以实现对所述cDNA的PCR扩增，则待测样品中含有或疑似含有寨卡病毒；如果所述引物对X不能实现对所述cDNA的PCR扩增，则待测样品不含有或疑似不含有寨卡病毒。
本发明保护的检测待测样品是否含有寨卡病毒的方法，具体可为方法A3)：检测待测样品的cDNA中是否含有特异DNA片段，然后进行如下评判：如果待测样品的cDNA中含有特异DNA片段，则待测样品中含有或疑似含有寨卡病毒；如果待测样品的cDNA中不含有特异DNA片段，则待测样品不含有或疑似不含有寨卡病毒；
所述特异DNA片段为如下y1)或y2)：
y1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
y2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子。
本发明还保护鉴定待测病毒是否为候选的寨卡病毒的方法。
本发明保护的鉴定待测病毒是否为候选的寨卡病毒的方法，具体可为方法B1)：以待测病毒的核酸为模板，以上述任一所述成套试剂进行RPA，然后进行如下评判：如果所述成套试剂可以检测出RPA阳性信号，则待测病毒为候选的寨卡病毒；如果所述成套试剂不能检测出RPA阳性信号，则待测病毒为候选的非寨卡病毒。
本发明保护的鉴定待测病毒是否为候选的寨卡病毒的方法，具体可为方法B2)：以待测病毒的cDNA为模板，以上述任一所述引物对X进行PCR扩增，然后进行如下评判：如果所述引物对X可以实现对所述cDNA的PCR扩增，则待测病毒为候选的寨卡病毒；如果所述引物对X1不能实现对所述cDNA的PCR扩增，则待测病毒为候选的非寨卡病毒。
本发明保护的鉴定待测病毒是否为候选的寨卡病毒的方法，具体可为方法B3)：检测待测病毒的cDNA中是否含有特异DNA片段，然后进行如下评判：如果待测病毒的cDNA中含有特异DNA片段，则待测病毒为候选的寨卡病毒；如果待测病毒的cDNA中不含有特异DNA片段，则待测病毒为候选的非寨卡病毒；
所述特异DNA片段为如下y1)或y2)：
y1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
y2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子。
上文中，检测出RPA阳性信号可为15min内荧光信号值超过阈值且出现拐点。不能检测出RPA阳性信号可为15min内荧光信号值不超过阈值和/或不出现拐点。阈值具体可为以扩增起始2min内的荧光信号值的平均值加上3倍的标准差。是否检测出RPA阳性信号具体可由便携式荧光扩增检测仪自带的软件Tubescanner进行自动分析。
实验证明，采用本发明提供的成套试剂进行RPA可以检测寨卡病毒，特异性好且灵敏度高。本发明具有重大的实用价值。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
便携式荧光扩增检测仪是英国TwistDx公司的产品。DNA/RNA核酸提取试剂盒为Invitrogen公司的产品。C6/36细胞和BHK21细胞均为ATCC的产品。Rehydration buffer和装有冻干粉的RPA反应管均为RT-exo kit中的组件。RT-exo kit为英国Twist公司的产品。
寨卡病毒SAM/2016株记载于如下文献中：Ling Yuan，Xing-yao Huang，Zhong-yuLiu，et al.a single mutation in the prM protein of Zika virus contributes tofetal microcephaly.Science，2017，14，7120.寨卡病毒SAM/2016株在下文中简称寨卡病毒。
实施例1、检测寨卡病毒的成套试剂的制备
一、引物和探针的合成
从NCBI中下载寨卡病毒的全基因组序列，使用MEGA5.0软件进行比对分析。经分析，选取NS1基因(Genebank号为：KU509998.1)作为靶基因。根据NS1基因的核苷酸序列设计基于RPA技术的引物和探针，设计原则如下：(1)引物的长度为30-35bp；(2)探针长度为46-52bp，从5’至3’依次包括DNA片段甲、四氢呋喃(Tetrahydrofuran，THF)(四氢呋喃为外切酶exo的切断位点)和DNA片段乙；DNA片段甲为30-35个核苷酸组成的单链DNA分子；DNA片段甲和DNA片段乙分别与NS1基因上的两个区段部分相同且两个区段在NS1基因上无重叠；四氢呋喃上游紧挨的脱氧核糖核苷酸具有FAM荧光标记，四氢呋喃下游紧挨的脱氧核糖核苷酸具有荧光淬灭基团BHQ1；探针3’末端的脱氧核糖核苷酸具有封闭基团C3标记(目的为阻断探针延伸)；(3)引物和探针的序列尽可能不重叠，以避免出现引物和探针的二聚体结构和二级结构，扩增产物长度在100-200bp之间，以达到最佳扩增效率。
根据上述设计原则，设计的引物和探针的核苷酸序列如下：
引物F1：5’-AGGCATCAATATCAGACATGGCTTCGGACAG-3’；
引物R1：5’-TCCATTTCCCCAGCCTCTGTCCACTAACGTTCT-3’(序列表中序列2)；
引物F2：5’-AGGTAAGATCCTACTGCTATGAGGCATCAA-3’(序列表中序列3)；
引物R2：5’-TAGCGCATGTCACCAGGCTCCCTTTGCCAA-3’；
探针X：5’-CGCTGCCCAACACAAGGTGAAGCCTACCTT(序列4)-THF-TCAAGCAATCAGACACTCAA(序列5)(C3-Block)-3’。
上述探针X，序列4中3’末端的第一位胸腺嘧啶脱氧核苷酸具有FAM荧光标记，序列5中5’末端的第一位胸腺嘧啶脱氧核苷酸具有BHQ1荧光淬灭基团；C3-Block为序列5中3’末端用封闭基团C3封闭以阻断探针X延伸。
人工合成引物F1、引物R1、引物F2、引物R2和探针X。
二、检测寨卡病毒的成套试剂的制备
检测寨卡病毒的成套试剂由引物对和探针X组成。引物对为引物对1(由引物F1和引物R1组成)、引物对2(由引物F1和引物R2组成)、引物对3(由引物F2和引物R1组成)或引物对4(由引物F2和引物R2组成)。
检测寨卡病毒的成套试剂中，引物和探针X分别独立包装。
实施例2、灵敏度
下述实施例中的PBS缓冲液均为pH7.2、0.01mM的PBS缓冲液。
一、检测病毒滴度
1、将寨卡病毒接种于铺有C6/36细胞的培养瓶，置于33℃、5％CO2培养箱中培养。待培养瓶中的细胞病变的比例达到75％，将该培养瓶置于-70℃冻融一次，然后收集细胞培养上清。
2、取步骤1收集的细胞培养上清，用PBS缓冲液进行10倍系列稀释，得到上清稀释液。
3、取装有生长至对数期的C6/36细胞的96孔板(每孔含104个C6/36细胞)，每孔加入100μL步骤2得到的上清稀释液(每个浓度重复4个孔)，置于33℃、5％CO2培养箱中培养5d。
取装有生长至对数期的C6/36细胞的96孔板(每孔含104个C6/36细胞)，每孔加入100μL PBS缓冲液(每个浓度设置4个复孔)，置于33℃、5％CO2培养箱中培养5d。作为对照。
观察各孔中细胞病变情况，确定步骤1收集的细胞培养上清的病毒滴度(4个复孔中，2个孔内出现明显病变的病毒量定义为1TCID50)。
结果表明，步骤1收集的细胞培养上清中，寨卡病毒滴度为106TCID50/mL。
二、灵敏度
1、取200μL步骤一中1收集的细胞培养上清，采用DNA/RNA核酸提取试剂盒提取核酸，然后用无菌水进行10倍系列稀释，得到各个稀释液。
2、以步骤1得到的稀释液为模板，采用实施例1制备的成套试剂和RT-exo kit进行RPA。具体步骤如下：
(1)配制反应体系。反应体系为47.5μL，由29.5μL Rehydration buffer、2.1μL上游引物(即名称中含有“F”的引物)、2.1μL下游引物(即名称中含有“R”的引物)、0.6μL探针X、2μL稀释液(2μL稀释液中含有的寨卡病毒基因组拷贝数为106个、105个、104个、103个、102个、101个或100个)和13.2μL ddH2O组成。反应体系中，上游引物、下游引物和探针X的浓度均为10μM。
(2)完成步骤(1)后，将所述反应体系移至装有冻干粉的RPA反应管，干粉融化后再次混匀，最后在每个RPA反应管中加入2.5μL醋酸镁水溶液(浓度为280nM)，混匀。
(3)完成步骤(2)后，将所述RPA反应管置于便携式荧光扩增检测仪，39℃恒温20min。
反应过程中检测荧光信号值。以时间为横坐标，荧光信号值为纵坐标，绘制扩增曲线。
便携式荧光扩增检测仪自带的软件Tubescanner可对扩增结果进行自动分析，以扩增起始2min内的荧光信号值的平均值加上3倍的标准差作为检测阈值，然后进行如下判断：如果15min内荧光信号值超过阈值且出现拐点，表明反应体系中的相应寨卡病毒基因组含量可以被检测出来；否则表明反应体系中的相应寨卡病毒基因组含量不能被检测出来。
引物对1和探针X组成的成套试剂检测寨卡病毒的灵敏度为103个拷贝数/反应体系。
引物对2和探针X组成的成套试剂检测寨卡病毒的灵敏度为104个拷贝数/反应体系。
引物对3和探针X组成的成套试剂检测寨卡病毒的灵敏度为102个拷贝数/反应体系。
引物对4和探针X组成的成套试剂检测寨卡病毒的灵敏度为103个拷贝数/反应体系。
实施例3、特异性
乙型脑炎病毒SC04-17株记载于如下文献中：郑旸，康晓平，李裕昌，吴晓燕，张晓松，杨银辉，乙型脑炎病毒EDⅢ蛋白的表达纯化及在Array-ELISA方法中的应用，中华微生物学和免疫学杂志，2013，33，954-959.乙型脑炎病毒SC04-17株下文中简称乙型脑炎病毒。
登革病毒记载于如下文献中Microarray hybridization for assessment ofthe genetic stability of chimeric West Nile/dengue 4virus，Laassri M，BidzhievaB，Speicher J，Pletnev AG，Chumakov L.，J.Med.Vorol.，2011May；83(5)；910-920.
蜱传脑炎病毒MDJ01株记载于如下文献中：霍耐凡，康晓平，户义，李裕昌，李靖，张雨，冉鑫，贾佳，曹雪峰，杨银辉，蜱传脑炎病毒包膜糖蛋白胞外区的真核表达优化及其在血清学检测中的效果评价，生物技术通讯，2016，27，38-42.蜱传脑炎病毒MDJ01株在下文中简称蜱传脑炎病毒。
一、检测病毒滴度
(1)按照实施例2中步骤一的方法，将寨卡病毒替换为乙型脑炎病毒，其它步骤均不变。细胞培养上清中，乙型脑炎病毒滴度为106TCID50/mL。
(2)按照实施例2中步骤一的方法，将寨卡病毒替换为登革病毒，其它步骤均不变。细胞培养上清中，登革病毒滴度为105TCID50/mL。
(3)按照实施例2中步骤一的方法，将寨卡病毒替换为蜱传脑炎病毒，将C6/36细胞替换为BHK21细胞，其它步骤均不变。细胞培养上清中，蜱传脑炎病毒滴度为105TCID50/mL。
二、特异性
待测病毒为寨卡病毒、乙型脑炎病毒、登革病毒或蜱传脑炎病毒。
1、采用DNA/RNA核酸提取试剂盒提取待测病毒的核酸。
2、以步骤1提取的核酸为模板，采用实施例1制备的成套试剂和RT-exokit进行RPA。具体步骤如下：
(1)配制反应体系。反应体系为47.5μL，由29.5μL Rehydration buffer、2.1μL上游引物(即名称中含有“F”的引物)、2.1μL下游引物(即名称中含有“R”的引物)、0.6μL探针X、2μL稀释液(2μL稀释液中含有的待测病毒基因组拷贝数为106个、105个、104个、103个、102个、101个或100个)和13.2μL ddH2O组成。反应体系中，上游引物、下游引物和探针X的浓度均为10μM。
(2)完成步骤(1)后，将所述反应体系移至装有冻干粉的RPA反应管，干粉融化后再次混匀，最后在每个RPA反应管中加入2.5μL醋酸镁水溶液(浓度为280nM)，混匀。
(3)完成步骤(2)后，将所述RPA反应管置于便携式荧光扩增检测仪，39℃恒温20min。
反应过程中检测荧光信号值。以时间为横坐标，荧光信号值为纵坐标，绘制扩增曲线。
按照上述方法，将待测病毒的核酸替换为灭菌超纯水，其它步骤均不变，作为阴性对照。
检测结果表明，只有当待测病毒为寨卡病毒的时候，15min内荧光信号值超过阈值且出现拐点。与乙型脑炎病毒、登革病毒或蜱传脑炎病毒的核酸均无交叉反应。由此可见，实施例1制备的成套试剂对寨卡病毒均具有很高的特异性。
上述结果表明，采用引物对3(由引物F2和引物R1组成)和探针X组成的成套试剂检测寨卡病毒的特异性好且灵敏度最高。
以寨卡病毒的核酸为模板，采用引物F2和引物R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。将该PCR扩增产物进行测序。测序结果表明，PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 利用RPA技术检测寨卡病毒的方法及其专用成套试剂
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 149
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
aggtaagatc ctactgctat gaggcatcaa tatcagacat ggcttcggac agccgctgcc 60
caacacaagg tgaagcctac cttgacaagc aatcagacac tcaatatgtc tgcaaaagaa 120
cgttagtgga cagaggctgg ggaaatgga 149
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
tccatttccc cagcctctgt ccactaacgt tct 33
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
aggtaagatc ctactgctat gaggcatcaa 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
cgctgcccaa cacaaggtga agcctacctt 30
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 5
tcaagcaatc agacactcaa 20

Claims (10)

1.检测寨卡病毒的成套试剂，由引物对X和探针X组成；
所述引物对X由引物F和引物R组成；所述引物对X的靶序列含有特异DNA片段；所述特异DNA片段为如下y1)或y2)：
y1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；
y2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述探针X为46-52个核苷酸组成的单链DNA分子，从5’至3’依次包括DNA片段甲、外切酶exo的切断位点和DNA片段乙；
所述DNA片段甲为30-35个核苷酸组成的单链DNA分子，与所述特异DNA片段上的区段甲部分相同；
所述DNA片段乙与所述特异DNA片段上的区段乙部分相同；
所述区段甲和所述区段乙在所述特异DNA片段上无重叠。
2.如权利要求1所述的成套试剂，其特征在于：所述外切酶exo的切断位点为四氢呋喃。
3.如权利要求1或2所述成套试剂，其特征在于：
所述引物F为如下a1)或a2)：
a1)序列表中序列3所示的单链DNA分子；
a2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物R为如下b1)或b2)：
b1)序列表中序列2所示的单链DNA分子；
b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子；
所述DNA片段甲为如下c1)或c2)：
c1)序列4所示的单链DNA分子；
c2)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；
所述DNA片段乙为如下d1)或d2)：
d1)序列5所示的单链DNA分子；
d2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的单链DNA分子。
4.如权利要求1至3任一所述成套试剂，其特征在于：所述DNA片段甲的末端具有荧光标记；所述DNA片段乙的一个末端具有荧光淬灭基团，另一个末端具有封闭基团。
5.权利要求1至4任一所述成套试剂中的所述引物对X。
6.权利要求1至4任一所述成套试剂或权利要求5所述引物对X的应用，为如下d1)或d2)或d3)或d4)：
d1)制备用于检测或辅助检测寨卡病毒的试剂盒；
d2)检测或辅助检测待测样品中是否含有或疑似含有寨卡病毒；
d3)制备用于鉴定或辅助鉴定寨卡病毒的试剂盒；
d4)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为候选的寨卡病毒。
7.含有权利要求1至4任一所述成套试剂或权利要求5所述引物对X的试剂盒。
8.权利要求7所述试剂盒的应用，为如下d2)或d4)：
d2)检测或辅助检测待测样品中是否含有或疑似含有寨卡病毒；
d4)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为候选的寨卡病毒。
9.一种检测待测样品是否含有寨卡病毒的方法，为A1)或A2)或A3)：
A1)以待测样品的核酸为模板，以权利要求1至4任一所述成套试剂进行RPA，然后进行如下评判：如果所述成套试剂可以检测出RPA阳性信号，则待测样品中含有或疑似含有寨卡病毒；如果所述成套试剂不能检测出RPA阳性信号，则待测样品不含有或疑似不含有寨卡病毒；
A2)以待测样品的cDNA为模板，以权利要求5所述引物对X进行PCR扩增，然后进行如下评判：如果所述引物对X可以实现对所述cDNA的PCR扩增，则待测样品中含有或疑似含有寨卡病毒；如果所述引物对X不能实现对所述cDNA的PCR扩增，则待测样品不含有或疑似不含有寨卡病毒；
A3)检测待测样品的cDNA中是否含有特异DNA片段，然后进行如下评判：如果待测样品的cDNA中含有特异DNA片段，则待测样品中含有或疑似含有寨卡病毒；如果待测样品的cDNA中不含有特异DNA片段，则待测样品不含有或疑似不含有寨卡病毒；
所述特异DNA片段为如下y1)或y2)：
y1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
y2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子。
10.一种鉴定待测病毒是否为候选的寨卡病毒的方法，为B1)或B2)或B3)：
B1)以待测病毒的核酸为模板，以权利要求1至4任一所述成套试剂进行RPA，然后进行如下评判：如果所述成套试剂可以检测出RPA阳性信号，则待测病毒为候选的寨卡病毒；如果所述成套试剂不能检测出RPA阳性信号，则待测病毒为候选的非寨卡病毒；
B2)以待测病毒的cDNA为模板，以权利要求5所述引物对X进行PCR扩增，然后进行如下评判：如果所述引物对X可以实现对所述cDNA的PCR扩增，则待测病毒为候选的寨卡病毒；如果所述引物对X1不能实现对所述cDNA的PCR扩增，则待测病毒为候选的非寨卡病毒；
B3)检测待测病毒的cDNA中是否含有特异DNA片段，然后进行如下评判：如果待测病毒的cDNA中含有特异DNA片段，则待测病毒为候选的寨卡病毒；如果待测病毒的cDNA中不含有特异DNA片段，则待测病毒为候选的非寨卡病毒；
所述特异DNA片段为如下y1)或y2)：
y1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
y2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子。
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