CN112877479A - 一种猪伪狂犬活疫苗中外源病毒快速检测引物及其在试剂盒中的应用 - Google Patents

一种猪伪狂犬活疫苗中外源病毒快速检测引物及其在试剂盒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种猪伪狂犬活疫苗中外源病毒快速检测引物及其在试剂盒中的应用，该引物包括针对非洲猪瘟病毒的特异性引物Ⅰ、针对牛病毒性腹泻病毒的特异性引物Ⅱ和针对猪圆环病毒2型的特异性引物Ⅲ；将引物应用于试剂盒中，在一个反应体系中同时完成非洲猪瘟病毒(ASFV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和猪圆环病毒2型(PCV2)三种病原快速筛查检测；通过检测引物的设置，可提高检测ASFV、BVDV、PCV2三种病原的特异性、稳定性和灵敏度；该试剂盒在应用时，具有操作简单、检测时间短、且不受检测人员水平和实验室水平限制的优点。

Description

一种猪伪狂犬活疫苗中外源病毒快速检测引物及其在试剂盒 中的应用
技术领域
本发明属于分子生物学检验的技术领域，尤其涉及一种猪伪狂犬活疫苗中外源病毒快速检测引物及其在试剂盒中的应用。
背景技术
猪伪狂犬病是由伪狂犬病毒(PRV)引起的一种急性病毒性传染病，临床表现主要为母猪流产、产木乃伊胎、产弱仔、初生仔猪腹泻及神经症状，感染率和死亡率可达100％，是猪群常见、多发的重要疾病之一，严重危害猪养殖业的发展。当前，猪伪狂犬病无有效治疗方法，主要通过活疫苗接种进行预防。
猪伪狂犬病毒活疫苗生产中需要用到种毒、血清、胰蛋白酶及细胞基质等多种原辅材料，这些原辅材料均由动物源性物质制备，具有污染各种病毒的风险，有一定的生物安全隐患。
目前，在疫苗生产中，用到的血清多为牛血清，其中牛病毒性腹泻病毒(BVDV)存在较为普遍，牛病毒性腹泻病毒可引起牛黏膜发炎、糜烂、坏死以及腹泻等，在牛群中流行已相当严重，猪群也有感染和发病报道，症状类似猪伪狂犬，且与猪伪狂犬很难通过血清学方法鉴别，对养猪业潜在的危害不可忽视；胰蛋白酶多为猪源材料制备，而在猪群中广泛存在的圆环病毒2型(PCV2)对该材料有很高的污染几率，猪群圆环病毒2型(PCV2)在猪群中广泛存在，可与其他猪病混感在成一定经济损失；在疫苗等物资进猪场的过程中，携带的外源病毒也是不可忽视的方面，以非洲猪瘟病毒(ASFV)为例，一旦携带进入猪场，则会使猪场遭受毁灭性的打击；可见，活疫苗中的外源病毒和活疫苗物资外部携带的外源病毒在活疫苗出厂前均需进行检验，以避免活疫苗接种给动物造成巨大的安全隐患，在携带外源病毒的活疫苗接种动物体并在动物体内增值、随着动物排泄而排放到环境中后，会引起严重的生物安全问题，因此，在猪伪狂犬病毒活疫苗出厂前或使用前必须对ASFV、BVDV、PCV2等外源病毒检验。
疫苗外源病毒检验一直是困扰各兽用生物制品生产企业检验人员的难点内容，目前，对疫苗外源病毒检测方法为荧光抗体检查、致细胞病变检查和红细胞吸附试验等细胞培养法，这些方法操作繁琐、时间长、对人员水平和实验室条件要求较高，很难满足疫苗生产企业和猪场快速疫苗检验的需求，因此，提供一种易于操作、检测效率高、环境污染小的检测方法对猪场快速疫苗检测具有重要意义。
荧光PCR已作为一种快速、灵敏、便宜的诊断方法被广泛使用，与传统PCR检测比，敏感性高，不需要开盖电泳检测PCR产物，减少实验室气溶胶污染风险；该检测方法不仅能能确定是否有外源病毒污染，还可以确定被污染的外源病毒的种类，因此，荧光PCR检验可作为生物制品外病毒的一种检验手段以提高猪伪狂犬病毒活疫苗外源病毒检测效率。然而，当前国内外还未有同时检测ASFV、BVDV、PCV2的多重荧光PCR检测试剂盒，使对活疫苗检测需要分步进行，在浪费检测时间的同时，增加了劳动量、降低了检测效率，因此，设计一种同时对ASFV、BVDV、PCV2进行检测的试剂盒以满足实际疫苗快速品控的需求具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明提供了一种猪伪狂犬活疫苗中外源病毒快速检测引物及其在试剂盒中的应用，以满足猪伪狂犬活疫苗外源病毒检测时，在一个反应体系中同时完成非洲猪瘟病毒(ASFV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和猪圆环病毒2型(PCV2)三种病原快速筛查检测；通过检测引物的设置，可提高检测ASFV、BVDV、PCV2三种病原的特异性、稳定性和灵敏度；该试剂盒在应用时，具有操作简单、检测时间短、且不受检测人员水平和实验室水平限制的优点。
本发明的技术方案如下：
一种猪伪狂犬活疫苗中外源病毒快速检测引物，包括针对非洲猪瘟病毒的特异性引物Ⅰ、针对牛病毒性腹泻病毒的特异性引物Ⅱ和针对猪圆环病毒2型的特异性引物Ⅲ；
其中，针对非洲猪瘟病毒的特异性引物Ⅰ包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
针对牛病毒性腹泻病毒的特异性引物Ⅱ包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
针对猪圆环病毒2型的特异性引物Ⅲ包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
进一步的，针对非洲猪瘟病毒的特异性引物Ⅰ的核苷酸序列如下所示：
SEQ ID NO.1：上游引物ATCCAAACAGCAGGTAAA；
SEQ ID NO.2：下游引物CTGAGGGAATAGCAAGGT。
进一步的，针对牛病毒性腹泻病毒的特异性引物Ⅱ的核苷酸序列如下所示：
SEQ ID NO.3：上游引物GATGGCCGAATCCCTGAG；
SEQ ID NO.4：下游引物GTTAAGATGTGCCGTGGG。
进一步的，针对猪圆环病毒2型的特异性引物Ⅲ的核苷酸序列如下所示：
SEQ ID NO.5：上游引物TTGTTGGCGAGGAGGGTA；
SEQ ID NO.6：下游引物AGCGGGCACCGAAATACC。
进一步的，非洲猪瘟病毒的特异性引物Ⅰ是针对非洲猪瘟病毒的VP72基因序列进行设计；牛病毒性腹泻病毒的特异性引物Ⅱ是针对牛病毒性腹泻病毒的5’端非编码区基因序列进行设计；猪圆环病毒2型的特异性引物Ⅲ是针对猪圆环病毒2型的ORF1基因序列进行设计。
上述猪伪狂犬活疫苗中外源病毒快速检测引物在试剂盒中的应用，该试剂盒对非洲猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒和猪圆环病毒2型检测，具有特异性强、灵敏度高的优点。
优选的，在试剂盒中，SEQ ID NO.1～6所示6条引物的浓度分别为15pmol/μL；6条引物的摩尔比为1:1:1:1:1:1。
优选的，在上述试剂盒中，还包括阳性对照品、阴性对照品、2×One Step TBGreen RT-PCR BufferⅢ和酶混合物。
优选的，阳性对照品为含有SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示序列的pMD-18T混合质粒，阴性对照品为无核酸酶水。
优选的，混合酶为DNA聚合酶Ex Taq HS和反转录酶PrimeScript RT Enzyme Mix酶的混合物。
优选的，DNA聚合酶Ex Taq HS和反转录酶PrimeScript RT Enzyme Mix酶按照体积比1:1混合。
进一步的，试剂盒为多重荧光PCR检测试剂盒。
优选的，多重荧光PCR扩增的反应程序为：42℃反转录5min；95℃预变性10s 94℃变性10s；55℃退火10s；72℃延伸20s；40个循环；循环结束后，60℃1min，以0.1℃/s的速率升温，直到97℃，整个过程连续采集荧光，最后40℃冷却。
上述多重荧光PCR检测试剂盒，结果判定标准为，若检测样品熔解曲线Tm值为82±0.5℃出现熔解峰，则说明有非洲猪瘟病毒；若检测样品熔解曲线Tm值为84±0.5℃出现熔解峰，则说明有牛病毒性腹泻病毒；若检测样品熔解曲线Tm值为86±0.5℃出现熔解峰，则说明有猪圆环病毒2型。
相对于现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明分别针对非洲猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒和猪圆环病毒2型设计了3组引物，3组引物加入同一反应体系中，互不干扰，为引物的应用提供良好的使用基础。
2、本发明首次将3组分别针对非洲猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒和猪圆环病毒2型的引物用于同一试剂盒中，使得该试剂盒通过一次检测，即可实现对3种病毒定性，提高检测效率；且试剂盒易于操作，使得检测过程对人员水平和实验室条件要求低，可满足猪场对猪伪狂犬活疫苗质控进行质量控制的需求。
3、本发明首次将3组引物应用于多重荧光PCR检测试剂盒中，有效提高了病源筛查效率，检测速度快，可在1小时内完成检测，且在反应结束后，无需进行琼脂糖凝胶电泳检测，仅通过对扩增曲线的观察与分析即可判定结果，减少了实验室气溶胶的污染风险，提高了结果判定速率，满足了疫苗生产企业及猪场对猪伪狂犬活疫苗质控的需求。
4、本发明提供的试剂盒具有特异性强、稳定性强和灵敏度高的优点；使用该试剂盒对猪伪狂犬活疫苗中外源病毒检测，具有检测效率高、检测准确度高、结果易于判断、操作简单、避免环境污染的优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1的熔解曲线图。
图2为本发明实施例4中，样品1扩增后，熔解曲线图。
图3为本发明实施例4中，样品2扩增后，熔解曲线图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
非洲猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒和猪圆环病毒2型的多重荧光PCR反应体系的建立
1、引物的设计和制备
从Gen Bank中查找非洲猪瘟病毒(ASFV)不同毒株VP72基因序列、牛病毒腹泻病毒(BVDV)5’端非编码区基因序列和猪圆环病毒2型(PCV2)不同毒株ORF1基因序列，经比对分析，分别选取保守区域并设计一对扩增引物，序列如下：
用于非洲猪瘟病毒扩增的特异性引物Ⅰ为：
SEQ ID NO.1：上游引物ATCCAAACAGCAGGTAAA；
SEQ ID NO.2：下游引物CTGAGGGAATAGCAAGGT；
用于牛病毒性腹泻病毒扩增的特异性引物Ⅱ为：
SEQ ID NO.3：上游引物GATGGCCGAATCCCTGAG；
SEQ ID NO.4：下游引物GTTAAGATGTGCCGTGGG；
用于猪圆环病毒2型扩增的特异性引物Ⅲ为：
SEQ ID NO.5：上游引物TTGTTGGCGAGGAGGGTA；
SEQ ID NO.6：下游引物AGCGGGCACCGAAATACC；
上述引物由通用生物系统(安徽)有限公司合成并进行标记。
2、阳性对照质粒的制备
本实施例提供的阳性对照品为人工合成的为含有非洲猪瘟病毒VP72基因序列的阳性质粒、含牛病毒腹泻病毒5’端非编码区基因序列的阳性质粒和含有猪圆环病毒2型ORF1基因序列的阳性质粒。
含非洲猪瘟病毒VP72基因保守区序列的阳性质粒(命名为pMD-VP72)中的目的片段序列如SEQ ID NO.7所示；含牛病毒腹泻病毒5’端非编码区基因序列的阳性质粒(命名为pMD-5’)中的目的片段序列如SEQ ID NO.8所示；含猪圆环病毒2型ORF1基因序列的阳性质粒(命名为pMD-ORF1)中的目的片段序列如SEQ ID NO.9所示；
SEQ ID NO.7所示序列如下：
Figure BDA0003018675300000071
SEQ ID NO.8所示序列如下：
Figure BDA0003018675300000081
SEQ ID NO.9所示序列如下：
Figure BDA0003018675300000082
将阳性对照质粒pMD-VP72、pMD-5’和pMD-ORF1按照体积比1:1:1进行混合，得到混合质粒，即本发明的阳性对照品，将其命名为pMD-VP72/5’/ORF1。
3、核酸提取使用Axygen病毒基因组DNA/RNA共提取试剂盒(购自康宁生命科学(吴江)有限公司)，根据产品使用说明书进行病毒DNA/RNA提取，提取后的核酸置于-80℃冰箱保存备用。
4、反应体系的配制
反应体系：2×One Step RT-PCR Buffer 10μL，酶混合液1μL，浓度均为15pmol/μL的引物混合液共6μL，模板3μL进行混匀，共20μL；
其中，酶混合液为DNA聚合酶Ex Taq HS和反转录酶PrimeScript RT Enzyme Mix酶按照体积比1:1混合得到；引物混合液是由SEQ ID No.1～6所示的6条引物按照1:1:1:1:1:1的摩尔比混合得到；
模板分别为：阳性对照品和阴性对照品；
配制好反应体系后即可进行荧光PCR检测，获得熔解曲线；
在阳性对照品中含有标准非洲猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒和猪圆环病毒2型的核酸样品，经一次多重荧光PCR，获得的曲线1中同时出现了3个峰，3个峰之间无干扰，可见，通过本发明的多重荧光PCR检测，可获得检测3种猪常见病原(ASFV，BVDV，PCV2)的熔解曲线，结合阴性对照品，其获得的曲线2结果显示无扩增产物，证明本方法特异性好。
利用图1所示的熔解曲线分析软件，可对待测样品进行分析；结果判定标准如下：
若检测样品熔解曲线Tm值为82±0.5℃出现熔解峰，则说明有非洲猪瘟病毒；若检测样品熔解曲线Tm值为84±0.5℃出现熔解峰，则说明有牛病毒性腹泻病毒；若检测样品熔解曲线Tm值为86±0.5℃出现熔解峰，则说明有猪圆环病毒2型。
实施例2
灵敏度检测
将实施例1中的阳性对照品进行10倍系列稀释，混合液中非洲猪瘟病毒质粒标准pMD-VP72的浓度为8.2×104copies/μL～8.2×10-1copies/μL、牛病毒性腹泻病毒质粒标准pMD-5’的浓度为5.7×104copies/μL～5.7×10-1copies/μL、猪圆环病毒2型质粒标准pMD-ORF1的浓度为3.6×104copies/μL～3.6×10-1copies/μL，每个梯度做3个重复，在实施例1中的引物和TaqMan的引导下进行多重荧光定量PCR检测，检测体系及检测条件如实施例1中所述。
检测结果显示，多重荧光PCR方法对非洲猪瘟病毒的最低检测限为8.2copies/μL、对牛病毒性腹泻病毒的最低检测限为5.7copies/μL，对猪圆环病毒2型的最低检测限为7.6copies/μL，结果表明，本发明建立的多重荧光定量PCR方法具有较高的灵敏度。
实施例3
特异性检测
分别以阳性对照pMD-VP72/5’/ORF1、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪德尔塔冠状病毒基因组作为模板，进行特异性试验，并设无核酸酶水为阴性对照品；核酸提取、检测体系及检测条件如实施例1中所述。
结果显示：阳性对照pMD-VP72/5’/ORF1熔解曲线Tm值为82±0.5℃、84±0.5℃、86±0.5℃均出现熔解峰，其余样品和阴性对照均无上述三种特异性峰出现，证明本发明的试剂盒具有很好的特异性与其他常见病毒无交叉性，可特异性地检测猪伪狂犬病毒活疫苗中外源非洲猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒和猪圆环病毒2型。
实施例4
应用本发明的试剂盒进行人工模拟样本检测
从市场上购买某厂家生产的猪伪狂犬病毒活疫苗2瓶，分别加入灭菌生理盐水2mL稀释，混匀，一瓶加入质粒的浓度为8.2×104copies/μL的质粒标准品pMD-VP72 20μL和浓度为5.7×104copies/μL质粒标准品pMD-5’的20μL，标号为样品1；一瓶加入质粒的浓度为5.7×104copies/μL质粒标准品pMD-5’的20μL和质粒的浓度为7.6×104copies/μL质粒标准品pMD-ORF1的20μL，标号为样品2；取200μL样品1和样品2，分别用Axygen病毒基因组DNA/RNA共提取试剂盒提取样本核酸，以其为模板，用本发明的试剂盒进行非洲猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒和猪圆环病毒2型多重荧光PCR检测，按实施例1进行加样和扩增，并判定结果。结果样品1扩增结果如图2所示，样品2扩增结果如图3所示。
通过上述结果可以看出，图2中检出了ASFV和BVDV两种病毒，与样品1中加入的病毒质粒吻合；图3中检出了BVDV和PCV2两种病毒，与样品2中加入的病毒质粒吻合；可见，使用本发明的方法，能够实现对ASFV、BVDV和PCV2三种病毒有效检出。
实施例5
应用本发明的试剂盒进行实际样本检测
从市场上购买不同厂家生产的猪伪狂犬病毒活疫苗15个批次，按照以下方法分别进行处理：
(1)向15个批次的活疫苗中分别加入灭菌生理盐水2mL稀释，混匀；
(2)分别取200μL用Axygen病毒基因组DNA/RNA共提取试剂盒提取样本核酸，以其为模板，待用；
(3)使用本发明实施例1提供的多重荧光PCR检测试剂盒检测；
(4)检测结果判定：根据实施例1中的判定标准，得出的结论是15个批次的猪伪狂犬病毒活疫苗检测结果均为阴性。
另外，发明人还使用以下方法对上述15个批次的活疫苗进行检测：
(1)按照《中华人民共和国兽药典》2015年版本附录3305进行外源病毒非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型检测，15个批次的猪伪狂犬病毒活疫苗检测结果均为阴性。
(2)购买符合国家规定的商品化非洲猪瘟荧光PCR检测试剂盒检测外源病毒，检测结果均为阴性；
可见，使用本发明的多重荧光PCR检测试剂盒与兽药典和商品化试剂盒的检测结果一致，说明本发明的多重荧光PCR检测试剂盒检测结果的准确度高，与兽药典和商品化试剂盒的检测结果符合率100％。
由实施例1～5可知，本发明提供的快速检测引物，将该检测引物应用于试剂盒中，获得的试剂盒可以用于对非洲猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒和猪圆环病毒2型的同时检测，6条引物同时加入一个反应体系，互不干扰。使用该快速检测引物的试剂盒检测非洲猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒和猪圆环病毒2型时，一次扩增反应可完成三种病原筛查，较传统兽药典中猪伪狂犬病毒活疫苗外源病毒检测方法操作简便、检测速度快、敏感性高，与商品化非洲猪瘟检测试剂盒相比成本低、效果一致。结合实施例1～3可以看出，本发明的试剂盒对非洲猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒和猪圆环病毒2型灵敏度高、特异性强、稳定性好，对猪其它常见病原无扩增反应，对非洲猪瘟病毒的最低检测限度为8.2copies/μL，牛病毒性腹泻病毒的最低检测限度为5.7copies/μL，对猪圆环病毒2型最低检测限度为7.6copies/μL。
尽管通过参考优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 山东省滨州畜牧兽医研究院
<120> 一种猪伪狂犬活疫苗中外源病毒快速检测引物及其在试剂盒中的应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
atccaaacag caggtaaa 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
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<212> DNA
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<211> 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
gaaaatgata cgcagcgaac gtgtagccat accaacccga aatttctttc acagcatttt 60
cccgagaact ctcacaatat ccaaacagca ggtaaacaag atattactcc tatcacggac 120
gcaacgtatc tggacataag acgtaatgtt cattacagct gtaatggacc tcaaacccct 180
aaatactatc agccccctct tgcgctctgg attaagttgc gcttttggtt taatgagaac 240
gtgaaccttg ctattccctc agtatccatt cccttcggcg agcgctttat caccataaag 300
cttgcatcgc aaaaggattt ggtgaatgaa tttcctggac tt 342
<210> 8
<211> 217
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
tagccatgcc cttagtagga ctagcaaaag gaggggacta gcggtagcag tgagttcatt 60
ggatggccga atccctgagt acagggaagt cgtcaatggt tcgacactcc atcagtcgag 120
gagtctcgag atgccatgtg gacgagggct tgcccacggc acatcttaac ctatgcgggg 180
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<211> 225
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<213> 人工合成
<400> 9
cttccgagga cgagcgcaag aaaatacggg agcttccaat ctcccttttt gattatttta 60
ttgttggcga ggagggtaat gaggaaggac gaacacccca cctccagggg ttcgctaatt 120
ttgtgaagaa gcaaacattt aataaagtga aatggtattt cggtgcccgc tgccacatcg 180
agaaagcgaa aggaattgat cagcagaata aagaatattg cagta 225

Claims (10)

1.一种猪伪狂犬活疫苗中外源病毒快速检测引物，其特征在于，包括针对非洲猪瘟病毒的特异性引物Ⅰ、针对牛病毒性腹泻病毒的特异性引物Ⅱ和针对猪圆环病毒2型的特异性引物Ⅲ；
其中，特异性引物Ⅰ的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
特异性引物Ⅱ的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
特异性引物Ⅲ包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
2.如权利要求1所述的猪伪狂犬活疫苗中外源病毒快速检测引物，其特征在于，特异性引物Ⅰ的核苷酸序列如下所示：
SEQ ID NO.1：上游引物ATCCAAACAGCAGGTAAA；
SEQ ID NO.2：下游引物CTGAGGGAATAGCAAGGT。
特异性引物Ⅱ的核苷酸序列如下所示：
SEQ ID NO.3：上游引物GATGGCCGAATCCCTGAG；
SEQ ID NO.4：下游引物GTTAAGATGTGCCGTGGG。
特异性引物Ⅲ的核苷酸序列如下所示：
SEQ ID NO.5：上游引物TTGTTGGCGAGGAGGGTA；
SEQ ID NO.6：下游引物AGCGGGCACCGAAATACC。
3.如权利要求1所述的猪伪狂犬活疫苗中外源病毒快速检测引物，其特征在于，非洲猪瘟病毒的特异性引物Ⅰ是针对非洲猪瘟病毒的VP72基因序列进行设计；牛病毒性腹泻病毒的特异性引物Ⅱ是针对牛病毒性腹泻病毒的5’端非编码区基因序列进行设计；猪圆环病毒2型的特异性引物Ⅲ是针对猪圆环病毒2型的ORF1基因序列进行设计。
4.一种如权利要求1～3任一项所述的猪伪狂犬活疫苗中外源病毒快速检测引物在试剂盒中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，在试剂盒中，SEQ ID NO.1～6所示6条引物的浓度分别为15pmol/μL；6条引物的摩尔比为1:1:1:1:1:1。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，在上述试剂盒中，还包括阳性对照品、阴性对照品、2×One Step TB Green RT-PCR BufferⅢ和酶混合物；所述阳性对照品为含有SEQID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示序列的pMD-18T混合质粒，阴性对照品为无核酸酶水。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，混合酶为DNA聚合酶Ex Taq HS和反转录酶PrimeScript RT Enzyme Mix酶的混合物。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，DNA聚合酶Ex Taq HS和反转录酶PrimeScript RT Enzyme Mix酶按照体积比1:1混合。
9.如权利要求4所述的应用，其特征在于，试剂盒为多重荧光PCR检测试剂盒。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，多重荧光PCR扩增的反应程序为：42℃反转录5min；95℃预变性10s 94℃变性10s；55℃退火10s；72℃延伸20s；40个循环；循环结束后，60℃1min，以0.1℃/s的速率升温，直到97℃，整个过程连续采集荧光，最后40℃冷却。
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