CN114214459A

CN114214459A - 非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型双重数字pcr检测引物组合物及其检测方法

Info

Publication number: CN114214459A
Application number: CN202111580813.9A
Authority: CN
Inventors: 薛瑞雪; 王苗利; 李云岗; 兰邹然; 李玉杰; 孙圣福
Original assignee: SHANDONG PROVINCE CENTER FOR ANIMAL DISEASE CONTROL AND PREVENTION
Current assignee: SHANDONG PROVINCE CENTER FOR ANIMAL DISEASE CONTROL AND PREVENTION
Priority date: 2021-12-22
Filing date: 2021-12-22
Publication date: 2022-03-22

Abstract

本发明公开了非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型双重数字PCR检测引物探针组合物及其检测方法。所述双重数字PCR检测引物探针组合物包括非洲猪瘟病毒引物探针和猪圆环病毒2型引物探针。本发明还提供检测或辅助检测非洲猪瘟病毒和/或猪圆环病毒2型的方法，所述方法包括使用所述的双重数字PCR引物探针组合物对待测样品进行数字PCR检测，根据数字PCR检测结果判断或辅助判断是否为目的病原菌。本发明提供的试剂或方法操作简便，灵敏性和重复性好，可以精准把控疫病控制效果。

Description

非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型双重数字PCR检测引物组合物及其检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型双重数字PCR检测引物组合物及其检测方法。

背景技术

非洲猪瘟病毒(ASFV,African swine fever virus)是非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)下仅有的种，具有传染性和极高的致病性。急性病例临床症状以高热、病程短、死亡率高、内脏器官广泛性出血以及呼吸系统和神经系统功能紊乱为主要特征。ASFV是一种双链的核质大DNA病毒(Nucleocytoplasmic Large DNA Viruses,NCLDV)。

猪圆环病毒2型(PCV2)属圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)。是一种小而无囊膜、二十面体、共价闭合、环状的单股DNA病毒。猪是PCV2的天然宿主，各种年龄、不同性别的猪都可感染。

非洲猪瘟病毒(ASFV)和猪圆环病毒2型(PCV2)是严重影响猪只健康及农业经济发展的重要病毒病，目前这两种病毒病的检测方法为常规的荧光定量PCR检测方法，灵敏度较低，不能有效检测病毒含量低的样品，不能精准把控疫病防控效果，而且商品化的ASFV和PCV2试剂盒都是单项PCR，检测效率较低。

发明内容

本发明要解决的技术问题是传统非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型的病原检测方法灵敏度较低，不能有效检测病毒含量低的样品，不能精准把控疫病控制效果。

为解决上述技术问题，第一个方面本发明提供检测或辅助检测非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型的双重数字PCR试剂或试剂盒，所述双重数字PCR试剂或试剂盒包括非洲猪瘟病毒引物探针和猪圆环病毒2型引物探针，所述非洲猪瘟病毒引物探针由特异扩增含有核苷酸序列是SEQ ID No.1第75-173位的片段在内的非洲猪瘟病毒基因组DNA片段的引物和与核苷酸序列是SEQ ID No.1第75-173位的片段特异结合的探针组成，

所述猪圆环病毒2型引物探针由特异扩增含有核苷酸序列是SEQ ID No.2第70-186位的片段在内的猪圆环病毒2型基因组DNA片段的引物和与核苷酸序列是SEQ ID No.2第70-186位的片段特异结合的探针组成。

进一步地，上述的双重数字PCR试剂或试剂盒中，所述非洲猪瘟病毒引物探针包括引物ASFV-F和ASFV-R、探针ASFV-Probe，所述猪圆环病毒2型引物探针包括引物PCV2-F和PCV2-R、探针PCV2-Probe，

所述ASFV-F为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的单链DNA或其衍生物；

所述ASFV-Probe的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.4；

所述ASFV-R为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.5的单链DNA或其衍生物；

所述PCV2-F为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.6的单链DNA或其衍生物；

所述PCV2-Probe的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.7；

所述PCV2-R为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.8的单链DNA或其衍生物。

本发明中，所述SFV-Probe为特异性识别非洲猪瘟病毒的探针，所述PCV2-Probe为特异性识别猪圆环病毒2型的探针，探针的5'端连接有荧光基团，3'端连接有淬灭基团。

荧光基团可选自但不限于FAM(5/6-羧基荧光素)、VIC(绿色荧光蛋白)、TET(四氯-6-羧基荧光素)、JOE(2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素)、HEX(六氯-6-甲基荧光素)、Cy3、TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)、ROX(羧基-X-罗丹明)、Texas Red、LC RED640、Cy5(花菁燃料)、LC RED705、FITC(异硫氰酸荧光素)等常见荧光基团，进行双重PCR检测引物组合物中探针的荧光基团的选择原则是两个荧光的显色不同即可。

所述淬灭基团可选自TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB、Dabcy1中的至少一种。

进一步地，上述的双重数字PCR试剂或试剂盒中，所述ASFV-F、ASFV-R、ASFV-Probe、PCV2-F、PCV2-R和PCV2-Probe的物质的量比值为分别为2:2:1:2:2:1。

进一步地，上述的双重数字PCR试剂或试剂盒中，所述双重数字PCR试剂或试剂盒还包括阳性标准品质粒。

进一步地，上述的双重数字PCR试剂或试剂盒中，所述阳性标准品质粒为ASFV阳性标准品质粒和/或PCV2阳性标准品质粒。

进一步地，上述的试剂或试剂盒中，所述ASFV-F、ASFV-Probe、ASFV-R、PCV2-F、PCV2-Probe和PCV2-R可分别单独包装也可组合包装。所述阳性标准品质粒单独包装。

所述组合包装可为非洲猪瘟病毒引物探针组合物ASFV-F、ASFV-Probe和ASFV-R作为一组包装，猪圆环病毒2型引物探针组合物PCV2-F、PCV2-Probe和PCV2-R作为一组包装。也可将ASFV-F、ASFV-Probe、ASFV-R、PCV2-F、PCV2-Probe和PCV2-R组合包装。

本发明中，所述ASFV阳性标准品质粒含有核苷酸如SEQ ID No.1所示的DNA分子；所述PCV2阳性标准品质粒含有核苷酸如SEQ ID No.2所示的DNA分子。

为解决上述技术问题，第二个方面，本发明提供检测或辅助检测非洲猪瘟病毒和/或猪圆环病毒2型的组合物，所述组合物包括非洲猪瘟病毒引物探针和猪圆环病毒2型引物探针，所述非洲猪瘟病毒引物探针由特异扩增含有核苷酸序列是SEQ ID No.1第75-173位的片段在内的非洲猪瘟病毒基因组DNA片段的引物和与核苷酸序列是SEQ ID No.1第75-173位的片段特异结合的探针组成，

进一步，上述的组合物中，所述非洲猪瘟病毒引物探针包括引物ASFV-F和ASFV-R、探针ASFV-Probe，所述猪圆环病毒2型引物探针包括引物PCV2-F、PCV2-R和探针PCV2-Probe，

所述ASFV-Probe的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.4；

所述PCV2-Probe的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.7的单链DNA或其衍生物；

进一步地，上述的组合物中，

所述ASFV-F、ASFV-R、ASFV-Probe、PCV2-F、PCV2-R和PCV2-Probe的物质的量比值为分别为2:2:1:2:2:1。

为解决上述技术问题，第三个方面，本发明提供上述的组合物在如下A1)-A6)中的应用：

A1)检测或辅助检测非洲猪瘟病毒和/或猪圆环病毒2型；

A2)检测或辅助检测待测样本是否感染非洲猪瘟病毒和/或猪圆环病毒2型；

A3)检测或辅助检测待测病原是否为非洲猪瘟病毒和/或猪圆环病毒2型；

A4)制备检测或辅助检测非洲猪瘟病毒和/或猪圆环病毒2型的产品；

A5)制备检测或辅助检测待测样本是否感染非洲猪瘟病毒和/或猪圆环病毒2型的产品；

A6)制备检测或辅助检测待测病原是否为非洲猪瘟病毒和/或猪圆环病毒2型的产品。

本发明中，所述产品可为试剂或试剂盒。

为解决上述技术问题，第四个方面，本发明提供检测或辅助检测非洲猪瘟病毒和/或猪圆环病毒2型的方法，所述方法包括使用上述的双重数字PCR试剂或试剂盒或上述的组合物对待测样品进行数字PCR检测，根据数字PCR检测结果判断或辅助判断待测样品是否为非洲猪瘟病毒和/或猪圆环病毒2型或，是否含有非洲猪瘟病毒和/或猪圆环病毒2型或，是否感染非洲猪瘟病毒和/或猪圆环病毒2型。

所述数字PCR反应体系由ASFV-F、ASFV-R、ASFV-Probe、PCV2-F、PCV2-R、PCV2-Probe、2×supermx反应液、模板DNA和DEPC水组成。

进一步地，所述ASFV-F、ASFV-R、ASFV-Probe、PCV2-F、PCV2-R和PCV2-Probe在PCR反应体系内的体积比为2:2:1:2:2:1。

进一步地，的，所述数字PCR扩增的反应条件为95℃预变性10min，共计1个循环；94℃变性30sec、55℃退火、延伸60sec，共计40个循环；仪器冷却12℃，5min。

本发明实现的有益效果如下：本发明提高了ASFV和PCV2病原检测的灵敏度，尤其为非洲猪瘟防控提供了更高水准的检测方法。

附图说明

图1为本发明双重数字PCR灵敏性实验中的FAM散点图。

图2为本发明双重数字PCR灵敏性实验中的VIC散点图。

图3为本发明双重数字PCR特异性实验中的FAM散点图。

图4为本发明双重数字PCR特异性实验中的VIC散点图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

感染非洲猪瘟病毒的猪病体组织在文献“张艳艳,张静远,杨金金,杨金梅,韩桪,米立娟,张菲,齐宇,张守峰,王颖,周鑫韬,岳慧贤,王述超,陈腾,扈荣良.1株非洲猪瘟病毒自然变异毒株的鉴定[J].中国兽医学报,2021,41(02):199-207.”中公开，公众可从申请人获得上述生物材料，所得上述生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。

感染猪圆环病毒2型的猪病体组织在文献“薛瑞雪,田野,杨婉婷,王贵升,马慧玲,李玉杰,王苗利,蔺晓月,陈峰,孙圣福,李云岗.山东部分地区猪圆环病毒2型遗传变异分析[J].中国预防兽医学报,2021,43(02):198-201+218.”中公开，公众可从申请人获得上述生物材料，所得上述生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。

感染猪圆环病毒3型的病体组织在文献“姜子昕.山东省猪圆环病毒2型和3型流行病学调查及双重荧光PCR方法的建立[D].山东农业大学,2021.”中公开，公众可从申请人获得上述生物材料，所得上述生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。

感染猪伪狂犬病毒的病体组织在文献“陈超,刘存,李海娥,薛瑞雪,田野,孙圣福,张月,孙振,姜世金,田夫林.山东省免疫猪场猪伪狂犬病病毒分离鉴定及gE毒力基因的序列分析[J].中国兽医学报,2016,36(06):902-907.”中公开，公众可从申请人获得上述生物材料，所得上述生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1.数字PCR引物探针设计与合成

1.1.非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型特异性识别序列的筛选

选择核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的DNA片段作为非洲猪瘟病毒的特异性识别DNA片段；选择选择核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的DNA片段作为猪圆环病毒2型的特异性识别DNA片段。

针对SEQ ID No.1所示的DNA片段和SEQ ID No.2所示的DNA片段分别设计特异性扩增引物和探针。

1.2.提供两对检测病毒的引物探针组合物，分别是非洲猪瘟病毒引物探针组合物和猪圆环病毒2型引物探针组合物，所述非洲猪瘟病毒引物探针组包括ASFV-F、ASFV-Probe和ASFV-R，所述猪圆环病毒2型引物探针组包括PCV2-F、PCV2-Probe和PCV2-R，引物探针组合物的核苷酸序列具体如下：

ASFV-F:5'-AGTTCTGCAGCTCTTACATACC-3'(SEQ ID No.3)；

ASFV-Probe:(FAM)5'-TTCCACTACGGAGGCAATGCGATT-3'(BHQ1)(SEQ ID No.4)；

ASFV-R:5'-GTGGCTTCAAAGCAAAGGTAAT-3'(SEQ ID No.5)；

PCV2-F:5'-CATGGTGAAGAAGTGGTTGTTATT-3'(SEQ ID No.6)；

PCV2-Probe:(VIC)5'-TGCCCTGGGATGATCTACTGAGACT-3'(BHQ1)(SEQ ID No.7)；

PCV2-R:5'-GGTACAGTTCCACCTTTAGTCTC-3'(SEQ ID No.8)。

其中，ASFV-Probe是探针，其核苷酸序列是SEQ ID No.4，其5’端标记FAM，3’端标记BHQ1。PCV2-Probe是探针，其核苷酸序列是SEQ ID No.7，其5’端标记VIC，3’端标记BHQ1。

1.3.阳性标准品质粒的制备

ASFV阳性标准品质粒的结构为：将SEQ ID No.1所示的DNA片段插入pUC57质粒的SmaI酶切位点，保持pUC57质粒的其它核苷酸序列不变，得到ASFV阳性标准品质粒。

PCV2阳性标准品质粒的结构为：将SEQ ID No.2所示的DNA片段插入pUC57质粒的SmaI酶切位点，保持pUC57质粒的其它核苷酸序列不变，得到PCV2阳性标准品质粒。

其中,pUC57质粒的核苷酸序列是SEQ ID No.9，SEQ ID No.9第339-444位为SmaI酶切位点。

实施例2.非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型的双重数字PCR

2.1.样品的选择与处理

(1)选择实验室保存的感染非洲猪瘟病毒的猪病体组织和感染猪圆环病毒2型的猪病体组织放在2mL离心管中，剪碎，并加入适量的灭菌PBS溶液，放入钢珠，在振动频率为20-30HZ的环境下进行振动2min，然后取出钢珠，接着将病料于-80℃冰箱内冻融3次，然后将融化的材料放入离心机10000rpm离心5mn，完成上述操作后把样品放在-80℃冰箱保存备用。

(2)病毒DNA的提取(参照AB AMbon试剂盒操作说明进行病毒核酸提取)。

2.2.数字PCR流程操作

(1)数字PCR反应体系的配置

将2×One-Step Soluton(购自新翌生物公司，中国)、One Step Enzyme Mx(购自新翌生物公司，中国)、引物、探针及作为PCR反应模板的样本DNA加入灭菌PCR反应管中，添加DEPC水至总体积30μl(反应体系见下表)，同时设置实施例1的1.3中构建的阳性标准品质粒为阳性对照、PBS为阴性对照，使用PCR仪进行扩增反应；

表1：PCR反应体系

(2)数字PCR微滴生成

a.将新的DG8 cartrdge放入holder中，先将30μL样品反应液分别加入到GD8cartrdge第一排(水)的8个孔内。

b.在GD8cartrdge第二排(油)的8个孔内分别加入180μL微滴生成油。

c.盖上微滴生成板胶垫，将微滴生成板用胶垫盖好。

d.检查DG8 cartrdge放入holder是否盖好，如盖好则平稳放至微滴生成仪中，打开电脑程序开始运行，大约300秒即可生成微滴，形成油包水微滴；

(3)PCR扩增

取出8连板，盖好胶盖，做好标记进行PCR扩增，扩增的反应条件按实验过程优化后的反应条件进行，如表2所示：

表2：反应程序

(4)微滴信号的读取

将扩增完的PCR 8连板，放入数字微滴分析仪，打开电脑程序，进行微滴数据读取，数字PCR微滴分析仪会自动吸取每个样品中的微滴进行FAM及VC通道检测，能检测到的蓝色荧光信号为FAM阳性微滴，能检测到的绿色荧光信号为VC阳性微滴，无蓝色荧光信号的为FAM阴性微滴，无绿色荧光信号的为VC阴性微滴。软件会自动记录样品的阳性微滴的比例数，并根据泊松分布原理计算出检测浓度拷贝数。

实施例3.双重数字PCR灵敏性实验

分别以实施例1中1.3所示的ASFV阳性标准品质粒和PCV2阳性标准品质粒为样本，统一稀释到2.6×10⁵拷贝/uL，然后进行10^-1、10^-2、10^-3，10^-4，10^-5十倍梯度稀释，按照实施例2进行非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型的双重数字PCR，通过FAM和VIC通道检测扩增情况，结果如表3、图1和图2。结果表明：本试验建立的双重数字PCR方法检测的灵敏度能到达10¹，而普通荧光双重数字PCR检测的灵敏度最低只能达到10²，这表明本实验建立的方法灵敏度更低，能够准确地监测ASFV和PCV2疫病的发生。

表3：灵敏性测定结果

实施例4.双重数字PCR特异性实验

以实施例1中1.3所示的ASFV阳性标准品质粒和PCV2阳性标准品质粒为样本，分别以猪圆环病毒3型病体组织、猪伪狂犬病毒病体组织为对照样本，PBS为阴性对照及空白对照，参照实施例2的步骤和方法进行测定，其区别仅在于模板样品种类加入不一样。第1组反应体系中加入ASFV阳性标准品质粒、圆环病毒3型病毒病体组织DNA各2ul；第2组ASFV阳性标准品质粒、伪狂犬病毒病体组织DNA各2ul；第3组反应体系中加入PCV2阳性标准品质粒、圆环病毒3型病毒病体组织DNA各2ul；第4组PCV2阳性标准品质粒、伪狂犬病毒病体组织DNA各2ul；第5组圆环病毒3型、伪狂犬病毒病体组织DNA各2ul；将反应体系参照实施例2的方法和步骤分别进行数字PCR反应并读取结果。结果如表4和图3、图4所示。由检测结果可知本实验建立的双重数字PCR方法对其他相似临床症状DNA病毒检测值为0，说明该方法能够特异性检测ASFV和PCV2阳性样品。

表4：特异性验证测定结果

备注：表4中“/”表示无此检测项，“0”表示未检出

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

序列表

<110> 山东省动物疫病预防与控制中心

<120> 非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型双重数字PCR检测引物组合物及其检测方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 201

<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)

<400> 1

atccgtgtcc caactaatat aaaattctct tgctctggat acgttaatat gaccactggg 60

ttggtattcc tcccgtggct tcaaagcaaa ggtaatcatc atcgcacccg gatcatcggg 120

ggttttaatc gcattgcctc cgtagtggaa gggtatgtaa gagctgcaga actttgatgg 180

aaatttatcg ataagattga t 201

<210> 2

<211> 201

<212> DNA

<213> 猪圆环病毒2型(PCV2)

<400> 2

gctgctaatt ttgcagaccc ggaaaccaca tactggaaac cacctagaaa caagtggtgg 60

gatggttacc atggtgaaga agtggttgtt attgatgact tttatggctg gctgccctgg 120

gatgatctac tgagactgtg tgatcgatat ccattgactg tagagactaa aggtggaact 180

gtaccttttt tggcccgcag t 201

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agttctgcag ctcttacata cc 22

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttccactacg gaggcaatgc gatt 24

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtggcttcaa agcaaaggta at 22

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

catggtgaag aagtggttgt tatt 24

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgccctggga tgatctactg agact 25

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggtacagttc cacctttagt ctc 23

<210> 9

<211> 2710

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acctcgcgaa 420

tgcatctaga tatcggatcc cgggcccgtc gactgcagag gcctgcatgc aagcttggcg 480

taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac 540

atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca 600

ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat 660

taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc 720

tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 780

aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 840

aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 900

ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 960

acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 1020

ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 1080

tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 1140

tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 1200

gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 1260

agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 1320

tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 1380

agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 1440

tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 1500

acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 1560

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agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 1680

tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact 1740

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tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt 1860

ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta 1920

agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg 1980

tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt 2040

acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc 2100

agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt 2160

actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc 2220

tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc 2280

gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa 2340

ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac 2400

tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa 2460

aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt 2520

tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa 2580

tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct 2640

gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg 2700

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Claims

1.检测或辅助检测非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型的双重数字PCR试剂或试剂盒，所述双重数字PCR试剂或试剂盒包括非洲猪瘟病毒引物探针和猪圆环病毒2型引物探针，所述非洲猪瘟病毒引物探针由特异扩增含有核苷酸序列是SEQ ID No.1第75-173位的片段在内的非洲猪瘟病毒基因组DNA片段的引物和与核苷酸序列是SEQ ID No.1第75-173位的片段特异结合的探针组成，

所述猪圆环病毒2型引物探针由特异扩增含有核苷酸序列是SEQ ID No.2第70-186位的片段在内的猪圆环病毒2型基因组DNA片段的引物和与核苷酸序列是SEQ ID No.2第70-186的片段特异结合的探针组成。

2.如权利要求1所述的双重数字PCR试剂或试剂盒，其特征在于：所述非洲猪瘟病毒引物探针包括引物ASFV-F和ASFV-R、探针ASFV-Probe，所述猪圆环病毒2型引物探针包括引物PCV2-F和PCV2-R、探针PCV2-Probe，

所述ASFV-Probe的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.4；

所述PCV2-Probe的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.7；

3.如权利要求1或2所述的双重数字PCR试剂或试剂盒，其特征在于：所述ASFV-F、ASFV-R、ASFV-Probe、PCV2-F、PCV2-R和PCV2-Probe的物质的量比值为分别为2:2:1:2:2:1。

4.如权利要求1-3中任一项所述的双重数字PCR试剂或试剂盒，其特征在于：所述双重数字PCR试剂或试剂盒还包括阳性标准品质粒。

5.如4所述的双重数字PCR试剂或试剂盒，其特征在于：所述阳性标准品质粒包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的DNA分子，和/或所述阳性标准品质粒包括核苷酸序列如SEQID No.2所示的DNA分子。

6.检测或辅助检测非洲猪瘟病毒和/或猪圆环病毒2型的组合物，所述组合物包括非洲猪瘟病毒引物探针和猪圆环病毒2型引物探针，所述非洲猪瘟病毒引物探针由特异扩增含有核苷酸序列是SEQ ID No.1第75-173位的片段在内的非洲猪瘟病毒基因组DNA片段的引物和与核苷酸序列是SEQ ID No.1第75-173位的片段特异结合的探针组成，

7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于：所述非洲猪瘟病毒引物探针包括引物ASFV-F和ASFV-R、探针ASFV-Probe，所述猪圆环病毒2型引物探针包括引物PCV2-F和PCV2-R、探针PCV2-Probe，

所述ASFV-F为核苷酸序列是序列表中SEQ D No.3的单链DNA或其衍生物；

所述ASFV-Probe的核苷酸序列是序列表中SEQ D No.4；

所述ASFV-R为核苷酸序列是序列表中SEQ D No.5的单链DNA或其衍生物；

所述PCV2-F为核苷酸序列是序列表中SEQ D No.6的单链DNA或其衍生物；

所述PCV2-Probe的核苷酸序列是序列表中SEQ D No.7的单链DNA或其衍生物；

所述PCV2-R为核苷酸序列是序列表中SEQ D No.8的单链DNA或其衍生物。

8.如权利要求6或7所述的组合物，其特征在于：所述ASFV-F、ASFV-R、ASFV-Probe、PCV2-F、PCV2-R和PCV2-Probe的物质的量比值为分别为2:2:1:2:2:1。

9.权利要求6-8中任一项所述的组合物在如下A1)-A6)中的应用：

A1)检测或辅助检测非洲猪瘟病毒和/或猪圆环病毒2型；

10.检测或辅助检测非洲猪瘟病毒和/或猪圆环病毒2型的方法，其特征在于：所述方法包括使用权利要求1-5中任一项所述的双重数字PCR试剂或试剂盒或权利要求6-8中任一项所述的组合物对待测样品进行数字PCR检测，根据数字PCR检测结果判断或辅助判断待测样品是否为非洲猪瘟病毒和/或猪圆环病毒2型或，是否含有非洲猪瘟病毒和/或猪圆环病毒2型或，是否感染非洲猪瘟病毒和/或猪圆环病毒2型。