CN112626116A - 定点整合大片段外源dna的方法 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种对基因组中高效稳定地定点整合大片段外源DNA，例如300kb以上大片段外源DNA的方法。所述方法包括目的基因片段的获得、克隆、定点整合和筛选等过程。

Description

定点整合大片段外源DNA的方法

发明领域

本申请涉及基因工程技术领域。具体地，涉及定点整合目的基因片段的方法，本申请的方法适合将目的基因片段，尤其是300kb以上大片段外源DNA高效地定点整合到细胞的基因组中。

发明背景

对细胞的基因组进行大规模DNA修饰，尤其是对基因组中定点整合超长基因片段，尤其长度在300kb以上的外源基因大片段一直是生物技术的难点问题。

哺乳动物人工染色体(mammalian artificial chromosome，MAC)是从哺乳动物细胞中分离出的，并由复制起始区、端粒以及着丝粒构建而成的克隆载体。该载体可以用于装载大于1000kb的外源DNA片段。利用微细胞介导的染色体转移技术(microcell mediatedchromosome transfer，MMCT)可以将MAC所携带的大片段外源基因导入真核细胞(Martella,Pollard et al.2016)。由于MAC是游离于染色体存在的，因此外源基因不能稳定地整合到细胞染色体内，并获得稳定的遗传。

酵母人工染色体(Yeast artificial chromosomes，YAC)是人工染色体中能克隆最大DNA片段的载体，其中可以插入100-2000kb的外源DNA片段。利用酵母原生质体融合(yeast spheroplast cell fusion)技术可以将装配有大片段外源DNA的YAC载体插入到受体细胞染色体中(Mendez,Green et al.1997)。但是这种办法存在一系列问题：外源基因拷贝数目不可控，基因组整合位置随机，YAC载体调控序列导致受体细胞受到基因污染，在细胞融合和整合过程中大片段基因容易断裂等。同时，利用这种方法建立转基因小鼠时，既需要对基因编辑的ES细胞克隆进行大量的基因型鉴定，也需要对不同的转基因小鼠系的表型进行鉴定。

细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome，BAC)是一种以F质粒(F-plasmid)为基础构建而成的细菌染色体克隆载体，常用来克隆150kb-200kb大小的DNA片段。由于BAC载体具有容量大、遗传稳定、易于操作等优点，常被用来进行基因改造。利用传统的同源重组技术或重组酶系统可以将100kb到200kb的外源基因定点整合到胞基因组特定位置((Valenzuela,Murphy et al.2003；Wallace,Marques-Kranc et al.2007)。受到BAC载体基因容量的限制，如果希望对基因组进行更大规模的修饰，如定点插入或原位替换，则需要对细胞进行复杂的多次基因修饰(Macdonald,Karow et al.2014；Murphy,Macdonald et al.2014)。这种策略无疑周期长，技术难度高。

因此，本领域急需对基因组中定点整合大片段外源DNA，尤其300kb以上大片段外源DNA的方法。

发明概述

对细胞的基因组进行大规模DNA修饰，特别是将大片段的外源DNA定点整合到基因组中，一直是当前生物技术难点问题。定点整合的主要技术难点包括如下方面：1).难以将大片段的外源DNA克隆到基因载体里；2).难以完整地将含有大片段外源DNA的载体导入真核细胞；3).难以高效地将大片段外源DNA定点整合到受体细胞的基因组中；4).难以高效地筛选并检测定点整合重组细胞克隆。

本专利通过一系列技术革新，解决了上述技术难题，首次提供了一种对基因组中高效稳定地定点整合大片段外源DNA，尤其300kb以上大片段外源DNA的方法。

具体来说，一方面本申请利用了改良的重组酶系统Cre/Loxp，即利用Loxp71/66突变体将外源DNA稳定地不可逆地定点整合到受体细胞的基因组中。

Cre-Lox重组是一种用于在细胞DNA的特定位点上进行删除、插入、转座和倒位操作的位点特异性重组酶技术。Loxp位点由34bp的特殊位点序列组成，其中中间8bpDNA碱基是不对称序列，决定了Loxp序列的方向，不对称序列两边是两段13bp反向对称序列，决定了与Cre的结合效率。

虽然常规的Cre-Lox重组方法可催化外源基因的定点整合。但是在最初的实验中，野生型的Loxp不能将大分子DNA稳定地定点整合到细胞染色体。经分析，这可能是因为Cre催化的Loxp序列依赖的重组反应是可逆的，即Loxp位点之间可能发生反向重组或删除，所以野生型Loxp位点不能有效地介导大分子DNA稳定地定点整合到细胞染色体。

当对称序列的一端发生突变，如Loxp71(5’端对称序列存在突变)和Loxp66(3’端对称序列存在突变),Cre仍然可以催化突变Loxp之间(如Loxp71和Loxp66)发生重组反应。Loxp71和Loxp66发生重组反应后，产生野生型Loxp和双突变Loxp(Loxp71/66)。因为Loxp71/66的两端的对称序列都发生突变，其和Cre的结合能力大为降低，因此避免了野生型Loxp和Loxp71/66之间发生反向重组反应，导致外源DNA稳定地不可逆地整合到细胞染色体里，从而增强了敲入基因的稳定性。本申请首次发现了，这种突变型Loxp，而非野生型Loxp，有助于大片段DNA的定点整合到细胞基因组中。原理如说明书附图中的图2。

本申请通过实验发现，对于介导大分子DNA稳定地定点整合到细胞染色体，Loxp双突变Loxp66/71是最优选的方案。相对于野生型Loxp，或者含1个突变的Loxp，例如Loxp/Loxp66或者Loxp/Loxp71，或者含其他突变位置的Loxp双突变，loxp66/71的效果最好，转化效率最高，能最有效最稳定地将大分子DNA稳定地定点整合到细胞染色体，最适合于大片段DNA的定点整合和克隆。

另外，为了高效地筛选定点整合到染色体上的重组子，本申请还分别在DNA和染色体的Loxp位点之后设计了功能互补且截断型的抗性基因新霉素(NeoR)的表达盒。只有定点位置插入外源基因的重组子才可以表达G418药物的抗性，随机整合的DNA片段则不能产生药物抗性。示意图见说明书附图中的图3。

同时，本申请使用了FLP/FRT系统来切除不必要的载体序列和G418抗性表达盒。基因修饰元件及其重组原理见说明书附图中的图3。

此外，由于YAC载体最多可以容纳2000kb的外源DNA片段，本申请选用YAC作为装载外源基因的载体。传统的YAC载体是线性结构，在细胞内不稳定，容易发生断裂和同源重组。对此，本申请利用YAC载体将大片段DNA装载到环状的YAC载体中，从而提高了完整基因定点插入细胞染色体的效率。

大片段DNA定向敲入受体细胞的难度在于转化效率低，且外源DNA容易断裂，而且大片段DNA从酵母细胞纯化效率很低，因此本申请选用了酵母原生质球融合技术(yeastprotoplast fusion)。将酵母内的大片段外源基因导入到受体细胞。这种方法对外源基因体大小没有限制，而且可以避免外源基因在纯化过程中发生断裂(Brown，Chan etal.2017)。

本专利通过以上一系列的技术设计从而克服了大分子DNA定点整合染色体DNA过程中存在的各种问题，如大分子DNA转染效率差，外源基因易断裂，定点整合效率差等。因此本申请的方法可以高效稳定地将外源DNA，尤其是大片段外源DNA，更特别地300kb以上大片段外源DNA一次性地定点整合到基因组中。

具体地，本发明涉及以下方面：

1.整合目的基因片段的方法，其包括以下步骤：

1)获得目的基因片段；

2)将目的基因片段克隆到载体中，在所获得的包含目的基因片段的载体中插入了抗性表达盒1，优选截断型新霉素(G418)抗性表达盒1，所述表达盒1在5’至3’方向上包含突变型Loxp 1，优选Loxp66序列、部分HPRT内含子和抗性基因a部分，优选新霉素抗性基因Neo基因3’端部分；

3)将含有所述目的基因片段的载体转化到微生物细胞内，优选为酵母，尤其是酿酒酵母细胞内；

4)将所述微生物内含有目的基因片段的所述载体导入到受体细胞，其中所述受体细胞的基因组中已经定点导入了抗性表达盒2，优选截断型新霉素(G418)抗性表达盒2，所述表达盒2在5’至3’方向上包含部分HPRT内含子、突变型Loxp 2，优选Loxp71序列、抗性基因b部分，优选Neo基因5’端部分、含有雌激素受体(estrogen receptor，ER)的配体结合区突变体(ERT2)与Cre重组酶的融合蛋白CreERT2，和IRES-PuroR结构

其中所述突变型Loxp 1和突变型Loxp 2中的突变分别位于野生型Loxp位点的3’对称序列和5’对称序列，或者野生型Loxp位点的5’对称序列和3’对称序列，所述突变型Loxp 1和突变型Loxp 2均能与Cre结合，在所述步骤4)后形成两个末端都含有突变的Loxp序列，如Loxp66/71；

优选地，单端突变的loxp序列，突变型Loxp 1和突变型Loxp 2，例如Loxp71和Loxp66不影响与Cre的结合效率，而在重组后形成两个loxp序列，其中一个是野生型Loxp序列，另一个是两个末端都含有突变的Loxp序列，如Loxp66/71，后者相比于野生型Loxp序列降低了与Cre的结合效率；

现有技术中已知类似于Loxp66序列，有可能与loxp71重组形成双末端突变Loxp结构包括loxJTZ17、loxKR1、loxKR2、loxKR3、loxKR4等。这些类似的Loxp结构在不同细胞中介导重组，整合到染色体形成稳定重组子的效率略有不同。并且，整合到染色体形成稳定重组子的效率受多种因素的影响，例如所整合的细胞系。本申请的Loxp66/71结构相对于这些类似的Loxp突变体在细胞的染色体中形成稳定重组子的效率最高，因此DNA大片段克隆效率最高；

5)诱导CreERT2的重组酶活性，优选通过加入Tamoxifen诱导CreERT2的重组酶活性，所述Cre重组酶介导所述目的基因片段定点整合到所述受体细胞的基因组中，同时所述表达盒1和表达盒2形成表达完整抗性基因，优选新霉素的抗性表达盒；

6)筛选基因组中定点整合了所述目的基因片段的所述受体细胞。

2.根据项1的方法，其中在所述步骤2)中的抗性表达盒1中所包含的抗性基因a部分，优选新霉素抗性基因Neo的3’端部分和所述步骤4)中的抗性表达盒2中的抗性基因b部分，优选Neo基因5’端部分是功能互补的，任一单独的抗性表达盒1或2均不能使细胞产生抗性，例如截断型新霉素(G418)抗性表达盒1或2均不能使细胞产生新霉素抗性，优选地只有其中包含的抗性基因b部分和a部分，例如Neo基因5’端部分和3’端部分按照一定顺序重组之后才可以表达有新霉素抗药性蛋白。

优选地，所述Neo基因5’端部分和所述Neo的3’端部分是在92位截断的，更优选地，新霉素的第92位氨基酸是由所述Neo基因5’端部分的末尾核苷酸和Neo基因的3’端部分的起始核苷酸共同编码的，更优选地，新霉素的第92位氨基酸是由所述Neo基因5’端部分的末尾2个核苷酸和Neo基因的3’端部分的起始处第一个核苷酸共同编码的。也就是说，Neo基因的5’端部分表达新霉素从第1至91位的氨基酸，Neo基因的3’端部分表达新霉素从第93位到267位的氨基酸，同时5’端部分的末尾2个核苷酸和Neo基因的3’端部分的起始处第一个核苷酸共同编码新霉素的第92位氨基酸，

并且所述步骤6)通过加入特异性针对所述抗性基因的试剂，优选抗生素G418来筛选基因组中定点整合了所述目的基因片段的所述受体细胞。

3.根据项1或2的方法，其中在所述步骤1)中的所获得的包含目的基因片段的载体中，所述目的基因片段的上游存在FRT序列，同时在所述步骤4)中的表达盒中，在所述IRES-PuroR结构的下游存在FRT序列，

并且在所述步骤6)之后还包括步骤7)：将包含FLP的质粒转入所述受体细胞以除去所述表达盒。

4.根据前述项中之一的方法，其中所述步骤1)中的目的基因片段包括原核和真核基因片段，优选为真核基因片段，其长度优选超过100kb，优选超过300kb,更优选超过400kb。

5.根据前述项中之一的方法，其中所述步骤2)中所获得的包含目的基因片段的载体是环状BAC载体或基因组DNA。

6.根据前述项中之一的方法，其中所述步骤2)中的所述载体是线性化载体，所述线性化载体优选为拥有被克隆目的DNA片段同源末端序列的线性化载体，更优选为线性化酵母穿梭载体。

7.根据项6的方法，其中所述线性化载体是YAC或TAR克隆载体。

8.根据项7的方法，其中所述线性化载体是YAC克隆载体，优选pTARYAC克隆载体。

9.根据项1-5中之一的方法，其中所述步骤2)中的所述包含目的基因片段的载体是BAC(bacterial artificial chromosome)或PAC(P1 artificial chromosomes)。

10.根据项5的方法，其中所述环状载体是通过同源重组拼接技术(优选酵母的转化偶联重组(TAR)技术)，或者同源重组拼接技术(优选酵母的转化偶联重组(TAR)技术)与基因组编辑技术的组合获得的。

11.根据项10的方法，其中所述同源重组拼接技术选自以下的一种或者多种：序列依赖的体外装配技术(如Gibson assembling,SLIC，LIC等)，酵母的转化偶联重组(TAR)技术和细菌的Red/ET同源重组技术，优选酵母的转化偶联重组(TAR)技术。

12.根据前述项中之一的方法，其中所述步骤1)中的目的基因片段是从染色体或另外的载体(优选BAC载体)上获得的。

13.根据前述项中之一的方法，其中所述步骤1)中的目的基因片段是利用基因组编辑技术对所述染色体或载体进行切割获得的。

14.根据前述项中之一的方法，其中在所述步骤4)中通过基因组编辑技术将所述表达盒及其下游大片段DNA定点稳定地导入到所述受体细胞的基因组中。

15.根据项10、13或14的方法，其中所述基因组编辑技术选自以下的一种或者多种：锌指核酸酶技术(zinc finger nucleases，ZFNs)，类转录激活因子效应物核酸酶技术(transcription activator-like effector nucleases，TALENs)和成簇的规律间隔的短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat，CRISPR)技术，包括CRISPR/Cas9和CRISPR-Cpf1，优选CRISPR/Cas9。

16.根据前述项中之一的方法，其中所述酵母是酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)。

17.根据前述项中之一的方法，其中在所述步骤4)中使用酵母原生质球融合(yeast protoplast fusion)技术将将所述微生物内含有目的基因片段的所述载体导入到受体细胞。

18.根据前述项中之一的方法，其中所述步骤2)中的抗性表达盒1，优选截断型新霉素(G418)抗性表达盒1中的所述突变型Loxp 1和/或所述步骤4)中的抗性表达盒2，优选截断型新霉素(G418)抗性表达盒2中所述突变型Loxp 2用于将所述表达盒定点导入所述受体细胞的基因组中。

19.根据前述项中之一的方法，其中所述步骤2)中的抗性表达盒1，优选截断型新霉素(G418)抗性表达盒1中包含的HPRT内含子、抗性基因a部分，优选Neo基因3’端部分和所述步骤4)中的抗性表达盒2，优选截断型新霉素(G418)抗性表达盒2中包含的HPRT内含子、抗性基因b部分，优选Neo基因5’端部分，以及步骤5)中形成的表达完整抗性基因的抗性表达盒，优选新霉素Neo的新霉素(G418)抗性表达盒，用于筛选目的基因片段定点整合后的细胞重组子。

20.根据前述项中之一的方法，其中所述步骤4)中的受体细胞是真核细胞，优选动物胚胎干细胞。

另外，除了利用互补截断的G418基因抗性来筛选定点位置插入了外源基因的重组子之外，本申请也可以使用本领域已知的其他抗性筛选机制。这些常用的抗性筛选机制或者抗性基因可以为例如为嘌呤霉素(Puromycin)、潮霉素(Hygromycin)、HPRT等。

附图简述

图1.显示了大片段外源基因定点整合到细胞基因组中的总体策略。

图2.Loxp71/66突变体促进大分子环状DNA的定向整合。

图3.外源环状DNA定点整合细胞染色体示意图。

图4.TAR-YAC-HygR-ΔNeoGFP-Loxp66 FRT质粒图谱。

图5.载体TAR-IGL-Loxp66 PCR鉴定电泳结果。

在图5中，

M表示100bp DNA ladder，

泳道1是载体TAR-Loxp66末端和IGL1连接处PCR产物1，

泳道2是IGL1内部PCR产物2，

泳道3是IGL1和IGL2的连接处PCR产物3，

泳道4是IGL2内部PCR产物4，

泳道5是IGL2和IGL3连接处PCR产物5，

泳道6是IGL3内部PCR产物6，和

泳道7是IGL3和载体TAR-Loxp66末端连接处PCR产物7。

图6.用于鉴定TAR-IGL-Loxp66的引物序列。

图7.CRISPR/Cas9技术介导的基因敲入。

图8.鉴定基因修饰的受体细胞。

图9.鉴定大片段IGL的定点插入。

图10.截断型新霉素(G418)抗性表达盒2中的Neo基因5’端部分和截断型新霉素(G418)抗性表达盒1中所包含的新霉素抗性基因Neo的3’端部分的核苷酸序列和氨基酸序列示意图。图中所述Neo基因5’端部分和所述Neo的3’端部分是在92位截断的，Neo基因的5’端部分表达新霉素从第1至91位的氨基酸，Neo基因的3’端部分表达新霉素从第93位到267位的氨基酸，同时5’端部分的末尾2个核苷酸和Neo基因的3’端部分的起始处第一个核苷酸共同编码新霉素的第92位氨基酸R。图10中，上端未加阴影部分显示的是Neo基因的5’端部分表达新霉素从第1至91位的氨基酸序列极其相对应的核苷酸序列，下端加灰色阴影部分显示的是Neo基因的3’端部分表达新霉素从第93位到267位的氨基酸序列极其相对应的核苷酸序列。同时，加黑色阴影部分显示的是第92位氨基酸R，是由5’端部分的末尾2个核苷酸AG和Neo基因的3’端部分的起始处第一个核苷酸G共同编码的。

发明详述

除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有如本领域普通技术人员通常理解的相同意义。

所有专利、公开的专利申请、其他出版物、和来自GenBank和本文提到的其他数据库的序列，就相关的技术而言，通过引用以它们的整体并入。除非另外指出，所提供实施方式的实施将采用分子生物学等的常规技术，其在本领域技术人员的技术范围内。这些技术在文献中充分解释。参见例如Molecular Cloning：A Laboratory Mannual，(J.Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)；CurrentProtocols in Molecular Biology(F.Ausubel等编辑，1987和最新的)；EssentialMolecular Biology(Brown ed.，IRL Press 1991)；Gene Expression Technology(Goeddel编辑，Academic Press 1991)；Methods for Cloning and Analysis ofEukaryotic Genes(Bothwell等编辑，Bartlett Publ.1990)；Gene Transfer andExpression(Kriegler，Stockton Press 1990)；Recombinant DNA Methodology(R.Wu等编辑，Academic Press1989)；PCR：A PracticalApproach(M.McPherson等，IRL Press atOxford University Press 1991)；Cell Culture for Biochemists(R.Adams编辑，Elsevier Science Publishers 1990)；Gene Transfer Vectors for Mamalian Cells(Miller&M.Calos编辑，1987)；Mammalian Cell Biotechnology(M.Butler编辑，1991)；Animal Cell Culture(Pollard等编辑，Humana Press 1990)；Culture of Animal Cells，2nd Ed.(Freshney等编辑，Alan R.Liss 1987).

如本文所用，“一个(a)”或“一个(an)”意思是“一个(one)”、“至少一个”或“一个或多个”。

如本文所用，“限制性内切酶位点”指被限制酶识别并切割的靶核酸序列。限制酶是本领域所熟知的。

如本文所用，术语“目的基因片段”是指需要克隆的靶DNA片段，可以是基因组片段或者人工合成的外源片段，也可以是完整基因。

术语“基因组”包括自然发生的基因组和合成基因组，并包括遗传改造基因组，比如之前在实验室和自然中不存在的基因组，其包括修饰的基因组和包含来自多于一个种类的核酸和/或部分基因组的杂交基因组。术语“基因组”包括细胞器基因组(例如，线粒体和叶绿体基因组)、自我复制生物的基因组(细胞基因组)，其包括原核和真核生物、真菌、酵母、细菌(例如，支原体)、古细菌、脊椎动物、哺乳动物和其他生物，和病毒基因组以及依靠宿主增殖的其他基因组。基因组还包括没有落在任何已知林奈(Linnean)分类中的生物和合成生物的那些。示例性基因组可以是微生物基因组，比如包括细菌和酵母在内的单细胞生物的基因组。

如上所述，现有技术中缺少对基因组中定点整合针对300kb以上的大片段基因组DNA的方法。

为了解决此问题，本发明建立了一种高效稳定地定点整合300kb以上基因，特别是真核基因到基因组中的方法。与现有技术相比，本申请的方法不仅能够将大的外源DNA片段，例如300kb以上稳定地整合到基因组中，同时还提高了定点整合的效率。

如上所述，对细胞的基因组进行大规模DNA修饰，特别是将大片段的外源DNA定点整合到基因组中，一直是当前生物技术难点问题。定点整合的主要技术难点包括如下方面：1.如何将大片段的外源DNA克隆到基因载体里；2.如何完整地将含有外源DNA的载体导入真核细胞；3.如何高效地将大片段外源DNA定点整合到受体细胞的基因组中；4.如何高效地筛选并检测定点整合重组细胞克隆。

对于上述4个技术难点，本申请均进行了设计从而能够高效稳定地将外源DNA定点整合到基因组中。具体如下：

对于1)：如何将大片段的外源DNA克隆到基因载体里

由于载体，尤其是基因载体，例如YAC载体有很强的同源重组特性有助于大片段的外源DNA在细胞内重组。同时，考虑到YAC载体最多可以容纳2000kb的外源DNA片段，本申请选用YAC作为装载外源基因的载体。传统的YAC载体是线性结构，在细胞内不稳定，容易发生断裂和随机重组。对此，本申请利用YAC载体将大片段DNA装载到环状的YAC载体里，从而提高了完整基因定点插入细胞染色体的效率。

在一个实施方案中，利用同源重组拼接技术，或者同源重组拼接技术与基因组编辑技术的组合获得含有目的基因片段的环状YAC载体。在一个优选的实施方案中，使用同源重组拼接技术，例如酵母转化偶联重组(Transformation-associated recombination,TAR)技术将线型的YAC载体环化为环状闭合的YAC载体。在另一个优选的实施方案中，联合使用同源重组拼接技术与基因组编辑技术，例如Crispr/Cas9方法和TAR技术将多个BAC载体里的基因片段编辑成多个有同源末端的线性DNA段，并利用酿酒酵母的同源重组特性，在其细胞内拼接成环状的YAC载体。具体方法可参见中国专利申请号201811238618.6。

序列依赖的重组拼接技术包括序列依赖的体外装配技术(如Gibson assembling,SLIC，LIC等)，酵母的转化偶联重组(TAR)技术和细菌的Red/ET同源重组技术，克隆到一些基因载体里，例如BAC(bacterial artificial chromosome),YAC(Yeast artificialchromosomes)和PAC(P1 artificial chromosomes)。

酵母作为宿主细胞包括酿酒酵母和其他酵母种类比如粟酒裂殖酵母(Saccharomyces pombe)，其可用于克隆超长的基因组DNA。由于它们独特的遗传操作工具组，酵母宿主尤其适合操作供体基因组物质。酵母细胞的天然能力和几十年的研究已产生了丰富的用于在酵母中操作DNA的工具组。这些优点是本领域熟知的。例如，酵母，用它们丰富的遗传系统，可通过同源重组装配和重装配核苷酸序列，这是许多容易得到的生物不具备的能力。酵母例如酿酒酵母存在高效的同源重组机制，两个DNA分子间只要有60bp以上的同源区段就可以准确、有效地进行同源重组(Noskov,Koriabine et al.2001)。酵母细胞可用于克隆不能克隆入其他生物的更大的DNA，例如，整个细胞、细胞器和病毒基因组。因此，所描述方法的一种实施方式利用酵母遗传的巨大能力，通过使用酵母作为用于操作难处理的和其他生物的基因组和合成基因组的宿主细胞，推进合成生物学和合成基因组学。

另外，酵母，特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为克隆DNA片段的宿主细胞具有很大的优势。例如酵母有很强的重组酶活性，可以一次将多达25个重叠的片段的DNA片段连接到载体DNA上(Gibson,Benders et al.2008)，因此具有摄入多个DNA的能力。同时酵母的同源重组能力可以有效地将多片段DNA正确地装配为单个重组子。

另外，酵母人工染色体(Yeast artificial chromosome,YAC)含有着丝粒可以支持至少2Mb的真核不稳定DNA的复制(Kouprina,Leem et al.2003)。大的原核DNA片段可使用通用的遗传密码在酵母中克隆。有毒的基因表达通常不是在酵母中克隆供体核酸的障碍。例如，细菌和古生菌基因组的研究指示由于真核生物与这些细菌使用不同的蛋白表达机器，所以从克隆基因组表达的蛋白质对酵母宿主具有很少的危害风险。在酵母中转录信号与在细菌中的转录和翻译不同。事实上，大部分原核基因很可能不在酵母中表达。在酵母中没有限制障碍。如果有障碍，那么它可能是复制障碍，而不是基因表达障碍。基因毒性被最小化，这是因为在真核生物比如酵母中的基因表达调节与在原核生物中的不同。而且，支原体使用密码子UGA用作色氨酸而不是作为翻译终止信号。因此，大部分支原体基因，如果表达的话，将在酵母中产生截短的蛋白质。这很大程度上避免了有毒基因产物的可能性。

因此，本申请基于酵母特有的高效DNA同源重组机制，在酵母细胞内利用YAC载体将大片段DNA装载到环状的YAC载体里，从而提高了完整基因定点插入细胞染色体的效率。

对于2)：如何完整地将含有大片段外源基因的载体导入真核细胞

大片段DNA定向敲入受体细胞的难度在于转化效率低，且外源DNA容易断裂，而且在体外从酵母细胞纯化大片段DNA的效率很低，同时普通DNA转染方法对DNA的大小也有限制。

对此，作为改进，本申请采用了酵母原生质球融合(yeast protoplast fusion)的方法将酵母内的大片段外源基因导入到受体细胞。在PEG的介导下,酵母原生质球可以和细胞融合，大片段DNA被导入受体细胞。这种方法对外源基因体大小没有限制，而且可以避免外源基因在纯化过程中发生断裂(Brown,Chan et al.2017)。

大片段外源基因转化及定点整合到细胞基因组中的过程参见说明书附图中的图1。

对于3)如何高效地将大片段外源基因组DNA定点整合到受体细胞的基因组中；

本申请利用了改良的重组酶系统Cre/Loxp，即利用Loxp71/66突变体将外源DNA稳定不可逆地定点整合到受体细胞的基因组中。

利用传统的重组酶系统,如Cre/Loxp,FLP/FRT和phiC31-att等，虽然可以将环状的载体定点插入到细胞染色体中(Ohtsuka,Miura et al.2012)。但是尚未有上述重组酶可将超过300kb的外源环状基因一次性定点整合到细胞基因组中的报道。由于Cre/Loxp,FLP/FRT系统介导可逆的酶促反应，当大分子环状DNA重组到染色体时，重组酶介导的DNA切割反应远大于定点整合反应。这导致外源分子越大，获得的稳定的重组子效率越低。虽然phiC31-att重组系统可以介导DNA片段之间发生不可逆的重组反应，但是phiC31活性比Cre重组酶活性低，因此也并非介导大分子DNA重组的优选方案。在上述重组酶系统系统中，Cre/Loxp系统催化效率最高，使用最普遍，因此本申请考虑使用Cre/Loxp系统来介导大片段DNA的重组。

Cre-Lox重组是一种用于在细胞DNA的特定位点上进行删除、插入、转座和倒位操作的位点特异性重组酶技术。Loxp位点由34bp的特殊序列组成，其中中间8bpDNA碱基是不对称序列，决定了Loxp序列的方向，不对称序列两边是两段13bp反向对称序列，决定了与Cre的结合效率。

虽然常规Cre-Lox重组可催化外源基因的定点整合。但在最初试验中发现野生型的Loxp序列没能将大分子DNA稳定地定点整合到细胞染色体。这可能是因为Cre催化的Loxp序列依赖的重组反应是可逆的，即Loxp位点之间可能发生反向重组或删除，因此野生型Loxp位点之间的重组不能有效地介导大分子DNA稳定地定点整合到细胞染色体。

虽然在DNA片段两侧位点引入异源的Loxp序列(如Loxp和Loxp2272)可以介导同源Loxp位点间(Loxp和Loxp,Loxp2722和Loxp2722)发生重组，从而介导外源DNA定向插入染色体。但是Cre-lox重组的效率随着其插入长度的增大而大为降低。这种方案也许可以用于某些大分子DNA的定点插入，但也并非优选方案。

对此，在一个实施方案中，本申请利用tamoxifen诱导受体细胞，例如ES细胞表达Cre重组酶。当Loxp序列中的对称序列的一端发生突变，即突变型Loxp 1，优选Loxp71(5’端对称序列存在突变)和突变型Loxp 2，优选Loxp66(3’端对称序列存在突变)。

同时，其中所述突变型Loxp 1和突变型Loxp 2中的突变分别位于野生型Loxp位点的3’对称序列和5’对称序列，或者野生型Loxp位点的5’对称序列和3’对称序列，所述突变型Loxp 1和突变型Loxp 2均能与Cre结合，在所述步骤4)后形成两个末端都含有突变的Loxp序列，如Loxp66/71；

优选地，单端突变的loxp序列，突变型Loxp 1和突变型Loxp 2，例如Loxp71和Loxp66不影响与Cre的结合效率，而在重组后形成两个loxp序列，其中一个是野生型Loxp序列，另一个是两个末端都含有突变的Loxp序列，如Loxp66/71，后者相比于野生型Loxp序列降低了与Cre的结合效率；

现有技术中已知类似于Loxp66序列，有可能与loxp71重组形成双末端突变Loxp结构包括loxJTZ17、loxKR1、loxKR2、loxKR3、loxKR4等。这些类似的Loxp结构在不同细胞中介导重组，形成稳定整合到染色体形成稳定重组子的效率略有不同。并且，整合到染色体形成稳定重组子的效率受多种因素的影响，例如所整合的细胞系。本申请的Loxp66/71结构相对于这些类似的Loxp突变体在细胞的染色体中形成稳定重组子的效率最高，因此DNA大片段克隆效率最高。

在一个优选的实施方案中，单端突变的loxp序列，突变型Loxp 1和突变型Loxp 2，优选Loxp71和Loxp66不影响与Cre的结合效率，而在重组后形成两个loxp序列，其中一个是野生型Loxp序列，另一个是两个末端都含有突变的Loxp序列，优选Loxp66/71，后者相比于野生型Loxp序列降低了与Cre的结合。

重组后环状DNA可以定点插入染色体并在插入片段两侧产生野生型的Loxp位点和Loxp 1/2型突变体，例如Loxp71/66突变体。因为Loxp 1/2型突变体，优选Loxp71/66突变体的两端的对称序列都发生突变，其和Cre的结合能力大为降低，因此Cre不能有效地催化Loxp 1/2型突变体，优选Loxp71/66突变体发生反向重组，从而导致大片段的环状DNA可稳定不可逆地整合到细胞染色体里。也就是说，Loxp 1/2型突变体，优选Loxp71/66突变体避免了野生型Loxp和Loxp 1/2型突变体，优选Loxp71/66突变体之间发生反向重组反应，导致外源DNA稳定地不可逆地整合到细胞染色体里，从而增强了插入基因的稳定性。

如本申请实施例中显示的，野生型Loxp位点不能有效地通过Cre介导大型环状DNA稳定地定点整合到染色体。Loxp71/66突变体促进大分子环状DNA的定向整合工作原理参见说明书附图中的图2。

因此本申请首次发现了，突变型Loxp，例如Loxp71/66突变体而非野生型Loxp，有助于高效稳定地将大片段DNA定点整合到细胞基因组中。

同时，本申请通过实验发现，对于介导大分子DNA稳定地定点整合到细胞染色体，Loxp双突变Loxp66/71是最优选的方案。相对于野生型Loxp，或者含1个突变的Loxp，例如Loxp/Loxp66或者Loxp/Loxp71，或者含其他突变位置的Loxp双突变，loxp66/71的效果最好，转化效率最高，能最有效最稳定地将大分子DNA稳定地定点整合到细胞染色体，最适合于大片段DNA的定点整合和克隆。

对于4)如何高效地筛选并检测定点整合重组细胞克隆。

一旦目的基因片段定点整合到受体细胞的基因组中之后，还需要对受体细胞进行筛选。对此，载体一般包含在一个或多个期望细胞类型中促进载体复制所需的任何DNA元件(例如，复制原点)和用于不同细胞类型中的选择和/或抗性标记。

抗性标记是熟知的。技术人员能够为不同的宿主/供体组合确定合适的抗性标记。在一些情况下，期望使用非临床相关的标记。在其他情况下，抗性标记的选择取决于供体、宿主和/或受体细胞的性质。

对于本申请，为了高效地筛选定点整合到染色体上的重组子，本申请还分别在DNA和染色体的Loxp位点之后设计了功能互补且截断型的抗性基因新霉素(NeoR)的表达盒。只有定点位置插入外源基因的重组子才可以表达G418药物的抗性，随机整合的DNA片段则不能产生药物抗性。因此，这个表达盒可以用于鉴定外源基因的定点插入。任一单独的截断型新霉素(G418)抗性表达盒均不能使细胞产生新霉素抗性，优选地只有其中包含的Neo基因的5’端部分和3’端部分按照一定顺序重组之后才可以表达有新霉素抗药性蛋白。

在一个优选的实施方案中，所述Neo基因5’端部分和所述Neo的3’端部分是在92位截断的。更优选地，新霉素的第92位氨基酸是由所述Neo基因5’端部分的末尾核苷酸和Neo基因的3’端部分的起始核苷酸共同编码的。在一个具体的实施方案中，新霉素的第92位氨基酸是由所述Neo基因5’端部分的末尾2个核苷酸和Neo基因的3’端部分的起始处第一个核苷酸共同编码的。也就是说，Neo基因的5’端部分表达新霉素从第1至91位的氨基酸，Neo基因的3’端部分表达新霉素从第93位到267位的氨基酸，同时5’端部分的末尾2个核苷酸和Neo基因的3’端部分的起始处第一个核苷酸共同编码新霉素的第92位氨基酸。

同时，在NeoR表达盒的上游还设计了CreERT2-IRES-PuroR结构。CreERT2是含有雌激素受体(estrogen receptor，ER)的配体结合区突变体(ERT2)与Cre重组酶的融合蛋白。在无Tamoxifen诱导的情况下，Cre-ERT2在细胞质内处于无活性状态。当Tamoxifen诱导后，Tamoxifen的代谢产物4-OHT(雌激素类似物)与ERT结合，可使Cre-ERT2进细胞核发挥Cre重组酶活性。IRES-PuroR结构用于筛选基因敲入的阳性克隆。

另外，本申请使用了FLP/FRT系统来切除载体序列和G418抗性表达盒。随着外源基因插入到染色体基因组中，细胞会表达一些不必要的选择性基因，如HygR、NeoR和PuroR等。本申请利用FLP/FRT重组删除这些选择性基因。当外源基因整合到受体细胞染色体的Loxp71位点之后，NeoR-CreERT2-IRES-PuroR序列可以被FRT序列依赖的FLP重组酶删除。

另外，除了利用互补截断的G418基因抗性来筛选定点位置插入了外源基因的重组子之外，本申请也可以使用本领域已知的其他抗性筛选机制。这些常用的抗性筛选机制例如为嘌呤霉素(Puromycin)、潮霉素(Hygromycin)、HPRT等。

同时本申请提供了以下实施例，以帮助理解本发明，在所附权利要求中给出了本发明的真正的范围。应当理解，在不背离本发明精神的情况下，可以对给出的方法进行修改。

实施例:将部分人Lamda轻链基因座(IGL)定点整合到胚胎干细胞(ES细胞)中

1.制备装大片段外源DNA的YAC载体

根据以前报道的DNA大分子克隆方法(中国专利申请号201811238618.6),将340kb部分人IGL基因座(GRCh37/hg19 chr22:22,377,297-22,717,584)分别克隆到线形TAR克隆穿梭载体TAR-YAC-HygR-ΔNeoGFP-Loxp 66FRT(即TAR-Loxp 66，参见说明书附图中的图4)和TAR-YAC-HygR-ΔNeoGFP-WT Loxp FRT(即TAR-WT Loxp)。通过DNA合成获得载体TAR-Loxp 66和TAR-WT Loxp。TAR-Loxp 66序列(全称为TAR-YAC-HygR-ΔNeoGFP-Loxp 66FRT序列)为SEQ ID NO:25，见序列表。载体TAR-WT Loxp和TAR-Loxp 66的区别是，TAR-Loxp 66载体的Loxp 66序列(ATAACTTCGTATA ATGTATGC TATACGAACGGTA)，被替换为WT Loxp序列(ATAACTTCGTATA ATGTATGC TATACGAAGTTAT)。

340kb的部分人IGL基因座的模板序列源自BAC载体RP11-685C18,RP11-890G10和RP11-373H24。按照专利方法(中国专利申请号201811238618.6)，利用Crispr/Cas9方法体外酶切上述BAC载体，再利用TAR克隆技术将上述线形化的DNA片段克隆到pTARYAC载体里。重组后的pTARYAC载体可在细菌内扩增并纯化。经I-SceI酶切大量纯化后的载体，得到3个DNA片段，分别是DNA片段IGL1，38kbp(GRCh37/hg19 Chr22:22377208-22415482)；DNA片段IGL2,约155kb(GRCh37/hg19 Chr22：22415353-22571119)和DNA片段IGL3，147kb(GRCh37/hg19 Chr22：22570833-22718740)。上述酶切DNA产物之间有约100bp左右的同源重组序列。

利用ApaI和PAC I酶切和DNA胶纯化制备线性化的TAR-WT Loxp和TAR-Loxp 66。线性化TAR-WT Loxp和TAR-Loxp 66的末端分别含有DNA片段IGL1和DNA片段IGL3的末端同源序列。利用TAR克隆方法将经酶切的DNA片段IGL1，IGL2，IGL3和线性化的TAR-WT Loxp或TAR-Loxp 66转化到酿酒酵母，得到可用于基因整合的含有340kb人IGL基因座的环状载体。

具体试验操作如下:

参照专利申请(中国专利申请号201811238618.6)所列方法，将100ng DNA片段IGL1((GRCh37/hg19 Chr22:22377208-22415482)，100ngDNA片段IGL2(GRCh37/hg19Chr22：22415353-22571119)，100ngDNA片段IGL3(GRCh37/hg19 Chr22：22570833-22718740)分别和100ng的线性化的载体TAR-WT Loxp以及TAR-Loxp 66混合，使用酵母原生质融合方法(Kouprina and Larionov 2008)将DNA片段转化到感受态酵母细胞AB 1380(ATCC,Cata：20843)。

酵母原生质融合方法简略如下：

过夜收获酵母细胞培养物，然后用1M山梨醇洗涤。在1M山梨醇的存在下，用ZymolyaseTM和β-巯基乙醇处理细胞转变为原生质球。用山梨醇洗涤所述原生质球，并重悬于含山梨醇和CaCl₂的缓冲液中。将200μl的等同于5ml原始酵母培养物的感受态酵母与100ng线性化载体，100ng RP11-890G10酶切产物混合。30℃温育30分钟，然后置42℃水浴中热激20～25分钟。以6000～8000r/min离心15秒，用微量移液器除去转化混合液。将1.0mlYPD液体培养基(Sigma Cata#Y1375)加到每个反应管中，用微量移液器轻轻悬浮沉淀细胞，并在30℃培养过夜。

第二天，将等分的200μl转化混合液均匀涂抹在含有0.2mg/mL Hygromycin B的YPD固体培养基上以对其进行培养。48小时后，挑取阳性克隆并进行扩增，使阳性克隆在含有Hygromycin B的YPD液体培养基生长。使用试剂盒(

Yeast DNA Kit，D3370-01)提取酵母DNA，利用PCR检测鉴定阳性克隆。使用不同的PCR引物对完整的重组子进行鉴定。最终得到两个重组子，分别是TAR-IGL-HygR-ΔNeoGFP-Loxp 66(即TAR-IGL-Loxp 66)和TAR-IGL-HygR-ΔNeoGFP-WTLoxp(即TAR-IGL-WTLoxp)。连接产物，即载体TAR-IGL-Loxp66PCR的电泳鉴定结果参见说明书附图中的图5。引物序列参见说明书附图中的图6。

2.受体细胞的基因修饰

为了将外源基因定点整合到宿主细胞染色体特定位置，需要对宿主细胞的染色体进行基因修饰。

考虑到CRISPR/Cas9技术周期短、效率高的优点，本申请利用该技术在胚胎干细胞(ES细胞)特定位点Chr16:19046551-19048556(NCBI37/mm9)插入含有CreERT2和5'NeoR的表达盒。工作原理见说明书附图中的图7。

具体来说，在插入位点(Chr16:19046551-19048556(NCBI37/mm9))位点附近设计引导RNA(Guide RNA)。其识别靶序列为TTGGCTACAATAGCCAATGC/CGG，其中3’端的CGG为PAM序列。ES细胞(EDJ#22)购自ATCC(ATCC,cat:SCRC-1021)为129S5/SvEvTac来源ES细胞系。

被插入基因结构为:Loxp71-hprt intron-5'Neo-PGK promoter-rBGpA-EF1apromoter-CreERT2-IRES-puro-FRT，其序列见序列表。其中Loxp 71序列用于介导外源基因的定点整合。在Loxp 71位点上游是截断的NeoR抗性表达盒。当外源基因插入到Loxp 71位点之后，可以形成完整的NeoR表达盒。这个新形成的抗性表达盒可以用于鉴定外源基因的定点插入。

在NeoR表达盒的上游还设计了CreERT2-IRES-PuroR结构。CreERT2是含有雌激素受体(estrogen receptor，ER)的配体结合区突变体(ERT2)与Cre重组酶的融合蛋白。在无Tamoxifen诱导的情况下，Cre-ERT2在细胞质内处于无活性状态。当Tamoxifen诱导后，Tamoxifen的代谢产物4-OHT(雌激素类似物)与ERT结合，可使Cre-ERT2进细胞核发挥Cre重组酶活性。IRES-PuroR结构用于筛选基因插入的阳性克隆。当外源基因整合到染色`体的Loxp 71位点之后，NeoR-CreERT2-IRES-PuroR序列可以被FRT序列依赖的FLP重组酶删除。

在本实施例中，Neo基因5’端部分和所述Neo的3’端部分是在92位截断的，Neo基因的5’端部分表达新霉素从第1至91位的氨基酸，Neo基因的3’端部分表达新霉素从第93位到267位的氨基酸，同时第92位氨基酸R是由5’端部分的末尾2个核苷酸AG和Neo基因的3’端部分的起始处第一个核苷酸G共同编码的。

为将上述基因结构定点插入宿主细胞的基因组，在插入序列(Loxp 71-5’NeoR-CreERT2-IRES-PuroR-FRT)的上游克隆了1014bp的5’端重组臂，其序列位于chr16:19046411-19047425(NCBI37/mm9)。在其下游克隆了1087bp的3’端重组臂，其序列位于NCBI37/mm9 chr16:19047426-19048512(NCBI37/mm9)。

具体试验方法如下:

A.制备Cas9 ribonucleoprotein复合体(RNP)：根据模板序列(ttggctacaatagccaatgc/cgg)利用化学合成的方法合成该序列的CrRNA(IDTdna公司)。CrRNA除了包含20nt的靶位点的特异序列，还包含16nt用于融合tracrRNA的互补序列。将10μM CrRNA和10μM的TracrRNA(IDTdna cata:1072534)在95℃变性5min。随后冷却室温。加入等摩尔的Cas9 Nuclease V3,(IDTdna cata:1081058)，以PBS作为缓冲液，反应溶液体积为20ul，在25℃温育20min形成RNP。

B.使20μl RNP和100ng线性的模板DNA(Loxp 71-5’NeoR-CreERT2-IRES-PuroR-FRT)在冰浴混合10min。

C.3x 10⁵ES细胞和20ul RNP与DNA模板混合，在电转杯(BioRad,cata:1652081)中进行电转染。电转染条件：1200伏，脉冲间隔30毫秒。电转染后，在存在滋养细胞(sigmaaldrich Cata:PMEF-CFX)的10厘米培养皿中培养用培养液稀释的ES细胞。ES细胞的培养基和培养条件参照ATCC关于该细胞系的说明。

D.持续培养细胞ES48小时后，在培养基加入1ug/ml Puromycin(ThermofisherCata:A1113802)。连续培养7天。

E.挑取单克隆ES细胞，并转移到48孔培养板中继续生长。3天后，用移液器枪头打散ES细胞，其中一半细胞用于提取基因组DNA，另外一半细胞冻存在48孔细胞培养板备用。

F.分别在插入片段的5’端和3’端和插入位点的衔接处设计引物，利用PCR方法筛选定点整合了表达盒的基因组DNA。引物序列如下:Insert 5F:GCAGTCTGCACTCTCTGTGG；Insert 5R:tcgagggacctaTACCGTTC；Insert 3F:cgtgacatgtgagcaaaagg；Insert 3R：GGAACCTTTCCCCCATAAAA。引物设计原理和筛选结果如说明书附图中的图8。经PCR鉴定，28个克隆中有15个克隆是PCR阴性，有9个克隆插入片段的5‘端和3'端都为阳性，还有少数克隆只是在一个末端为PCR阳性。结果显示，利用CRISPR/Cas9技术，外源DNA定点插入受体细胞的比例达到30％。将经基因修饰的ES克隆命名为ES 5’Neo-Loxp 71。

利用同样的策略，本申请制备了另外一个ES克隆，被插入的基因结构是WT-Loxp-hprt intron-5'Neo-PGKpromoter-rBGpA-EF1a-CreERT2-IRES-

puro-FRT。将此经修饰后的ES克隆命名ES 5’Neo-WTLoxp。

3.酵母原生质球介导的细胞融合技术

大片段DNA定向插入受体细胞的难点在于使用传统的方法，如脂质体转染，电转等，转化效率低，线形大片段形式的外源DNA容易断裂，同时从酵母细胞纯化大片段DNA的效率非常低。对此，本申请选用了酵母原生质球融合技术。在PEG的介导下,酵母原生质球可以和细胞融合，从而将大片段DNA导入受体细胞。虽然现有技术中报道了酵母原生质球介导的细胞融合可以用于介导将含有大片段DNA的YAC导入受体细胞，但是这种导入多属于染色体随机插入，而不是定点插入。同时，线形的YAC载体容易在细胞内降解或断裂。对此，本申请进行了改进，本申请将YAC载体拼接成环状的YAC载体，同时，将大片段DNA装载到环状的YAC载体中，从而提高了完整基因定点插入细胞染色体的效率。另外，为了保持原生质融合后ES细胞的多功能性，我们还选用了以129S5/Sv为遗传背景的胚胎干细胞(ES细胞)。这种遗传背景的ES细胞比其他遗传背景的ES细胞更不容易在体外培养时产生分化。

具体方法步骤:

A.制备酵母原生质细胞:

将装载大片段IGL(携带TAR-IGL-Loxp 66基因)的酵母菌液加入到含有0.2mg/mLHygromycin的YPD(Sigma,Cata:Y1375)培养基中，30℃摇菌过夜。第二天，用YPD培养基10倍稀释菌液，继续摇菌3-4小时，直到OD600值2.0-3.0。随后以2500g离心15min，收集酵母菌。用20ml1M山梨醇悬浮酵母细胞沉淀，在4℃静置2小时。离心收集酵母细胞，用SPEM缓冲液(1M山梨醇,0.1M磷酸钠缓冲液混合物pH7.4,和10mM EDTA,pH 8.0)混匀细胞沉淀,再加75ul 14mM 2-ME和100UL Zymolase进行去壁处理，30℃消化30分钟。用1M山梨醇洗涤消化后的细胞。随后将细胞悬浮于2ml的STC溶液(1M sorbitol,10mM Tris-HCl,pH 7.5,10mMCaCl₂和2.5mM MgCl₂)备用。

B.PEG介导的细胞融合:

与此同时收集上述经过基因修饰的ES细胞(例如ES 5'Neo-Loxp 71)。将ES 5'Neo-Loxp 71细胞与TAR-IGL-Loxp 66酵母细胞以1：100混合于PBS溶液。室温离心，细胞混合液悬浮于含有10％DMSO的PEG1500溶液(Roche Applied Science,cata:10783641001)。两分钟后，用培养液悬浮融合后的ES细胞，200g离心5分钟。悬浮细胞混合液，用ES细胞培养基稀释2x10⁶ES细胞，在5个10cm培养皿培养。在50％ES细胞贴壁之后，加入Tamoxifen(1μg/ml)(Sigma，Cata：T5648-1G)诱导ES细胞表达Cre重组酶。16小时后，洗去Tamoxifen，加入G418，筛选抗性克隆。

作为对照，用PEG的方法将ES 5'Neo-WTLoxp细胞与TAR-IGL-WTLoxp酵母细胞加以融合，随后用G418筛选，但是未观察到G418抗性克隆生成，说明WT Loxp不能介导大片段环状DNA的定点插入，或者插入效率很低。

因此，本申请也尝试了常规的Cre-Lox重组方法，即使用野生型的Loxp序列，但没能将大分子DNA稳定地定点整合到细胞染色体。这可能是因为Cre催化的Loxp序列依赖的重组反应是可逆的，即Loxp位点之间可能发生反向重组或删除，因此野生型Loxp位点之间的重组不能有效地介导大分子DNA稳定地定点整合到细胞染色体。

C.阳性基因插入细胞的检测:

在G418的存在下连续培养一个星期之后，挑取表达GFP的G418抗性单克隆ES细胞(ES 5'Neo-WTLoxp)，转移到48孔培养板继续生长。3天后，用移液器枪头打散ES细胞，其中的一半细胞用于提取基因组DNA，而将另外一半细胞冻存在48孔细胞培养板备用。考虑到具有G418抗性的克隆会在外源片段的Loxp 66位点和染色体Loxp 71位置之间发生重组，从而在插入片段的两端生成WTLoxp位点和Loxp 71/66位点，因此在插入位点WTLoxp和Loxp 71/66的两端设计引物，用PCR方法鉴定定点插入ES克隆。

引物序列如下:

WT Loxp F:GGAGATCCTCAGGTCATTGC；

WT Loxp R:GGCAGAGCTTTGCTTTTGTT；

Loxp 66/71 F:CCTTGACCCAGAAATTCCAC；

Loxp 66/71 R:TGGAGGCCATAAACAAGAAGA。引物设计及其PCR鉴定结果如说明书附图中的图9。

经过G418筛选，所有细胞克隆都是Loxp 71/66PCR结果阳性，其中75％的细胞克隆是Loxp 71/66和WT Loxp双阳性，而25％的细胞克隆只有Loxp 71/66PCR单阳性而WT LoxpPCR是阴性的，说明在WT Loxp位点可能发生了第二次基因重组导致了多拷贝插入或者发生了基因断裂。可以用PCR的方法对这种情况予以排除，从而进一步挑选双阳性克隆并进行插入基因IGL完整性的鉴定。所用的PCR引物见说明书附图中的图6。鉴定结果显示所有的PCR结果是阳性，表明插入基因完整。

D.删除选择性标记:

随着外源基因IGL插入染色体，细胞会表达一些不必要的选择性基因，如HygR,NeoR，CreERT2和PuroR等。这些选择性基因可以利用FLP/FRT重组加以删除。如说明书附图中的图3显示。合成FLP质粒(pCAG-Flpe)序列(Addgene,Cata:13787)。利用常规脂质体转化方法，将pCAG-Flpe质粒转入插入了IGL基因的ES克隆，挑选GFP阴性，G418敏感和Puromycin敏感的ES克隆备用。

Cre-Lox重组是一种用于在细胞DNA的特定位点上进行删除、插入、转座和倒位操作的位点特异性重组酶技术。loxP位点由34bp的特殊位点序列组成，中间8bpDNA碱基是不对称序列，决定了loxP序列的方向，不对称序列两边是两段13bp反向对称序列，决定了与Cre的结合效率。当对称序列的一端发生突变，如Loxp 71(5’端对称序列存在突变)和Loxp66(3’端对称序列存在突变)，Cre仍然可以催化突变Loxp之间(如Loxp 71和Loxp 66)发生重组反应。不过在Loxp 71和Loxp 66发生重组反应后，产生野生型Loxp和双突变Loxp(Loxp71/66)。因为Loxp 71/66在两端的对称序列都存在突变，其和Cre的结合能力大为降低，所以避免了WT Loxp和Loxp 71/66之间发生反向重组反应，从而增强了插入基因的稳定性。本申请通过以上实验进行比较发现这种突变型Loxp，而非野生型Loxp，有助于大片段DNA的定点插入。

本申请通过实验发现，对于介导大分子DNA稳定地定点整合到细胞染色体，Loxp双突变Loxp66/71是最优选的方案。相对于野生型Loxp，或者含1个突变的Loxp，例如Loxp/Loxp66或者Loxp/Loxp71，或者含其他突变位置的Loxp双突变，loxp66/71的效果最好，转化效率最高，能最有效最稳定地将大分子DNA稳定地定点整合到细胞染色体，最适合于大片段DNA的定点整合和克隆。

本申请涉及的序列如下：

1.序列1 SEQ ID NO:1

loxp66序列：

ATAACTTCGTATA ATGTATGC TATACGAACGGTA

2.序列2 SEQ ID NO:2

WT loxp序列

ATAACTTCGTATA ATGTATGC TATACGAAGTTAT

3.序列3 SEQ ID NO:3

用于载体TAR-loxp66末端和IGL1连接处PCR产物1的正向引物

GGGTTCTCACCTCTGATTAG

4.序列4 SEQ ID NO:4

用于载体TAR-loxp66末端和IGL1连接处PCR产物1的反向引物

AGGTCCCTCGACCTGCAGCCC

5.序列5 SEQ ID NO:5

用于IGL1内部PCR产物2的正向引物

AAACCAAGACGGTGAGGAAAG

6.序列6 SEQ ID NO:6

用于IGL1内部PCR产物2的反向引物

GTAAATGAATAAAGGAATGG

7.序列7 SEQ ID NO:7

用于IGL1和IGL2的连接处PCR产物3的正向引物

TGGTGCAGACTCCCCGGATCT

8.序列8 SEQ ID NO:8

用于IGL1和IGL2的连接处PCR产物3的反向引物

GGAAATGATACCTGGCCCTGGCC

9.序列9 SEQ ID NO:9

用于IGL2内部PCR产物4的正向引物

AGGGAGGCAGATGCAGAGGT

10.序列10 SEQ ID NO:10

用于IGL2内部PCR产物4的反向引物

TTGACCCCACTCCTCCTCCTCA

11.序列11 SEQ ID NO:11

用于IGL2和IGL3连接处PCR产物5的正向引物

TCCAGTAATGGTCAGGGAGGC

12.序列12 SEQ ID NO:12

用于IGL2和IGL3连接处PCR产物5的反向引物

CCCACCTCTGCTCCAGCTTC

13.序列13 SEQ ID NO:13

用于IGL3内部PCR产物6的正向引物

CTCGGTGACTTGATCCCAG

14.序列14 SEQ ID NO:14

用于IGL3内部PCR产物6的反向引物

AATGTGTGTAGGGAACATCAT

15.序列15 SEQ ID NO:15

用于IGL3和载体TAR-loxp66末端连接处PCR产物7的正向引物

AGTTCTGCTCAAGCTTGGC

16.序列16 SEQ ID NO:16

用于IGL3和载体TAR-loxp66末端连接处PCR产物7的反向引物

CACAGCTACCCTCAAGAAAG

17.序列17 SEQ ID NO:17

用于筛选整合了表达盒的基因组DNA的PCR的引物Insert 5F:

GCAGTCTGCACTCTCTGTGG

18.序列18 SEQ ID NO:18

用于筛选整合了表达盒的基因组DNA的PCR的引物Insert 5R:

tcgagggacctaTACCGTTC

19.序列19 SEQ ID NO:19

用于筛选整合了表达盒的基因组DNA的PCR的引物Insert 3F:cgtgacatgtgagcaaaagg

20.序列20 SEQ ID NO:20

用于筛选整合了表达盒的基因组DNA的PCR的引物Insert 3R

GGAACCTTTCCCCCATAAAA

21.序列21 SEQ ID NO:21

用于鉴定WT loxp阳性的引物WT loxp F:

GGAGATCCTCAGGTCATTGC

22.序列22 SEQ ID NO:22

用于鉴定WT loxp阳性的引物WT loxp R:

GGCAGAGCTTTGCTTTTGTT

23.序列23 SEQ ID NO:23

用于鉴定Loxp66/71阳性的引物Loxp66/71F:

CCTTGACCCAGAAATTCCAC

24.序列24 SEQ ID NO:24

用于鉴定Loxp66/71阳性的引物Loxp66/71R:

TGGAGGCCATAAACAAGAAGA

25.序列25 SEQ ID NO:25

TAR-loxp66序列

GGCGCGCCACTAGTGGATCTCGAGCCCCAGCTGGTTCTTTCCGCCTCAGAAGGAATTTCGAGGTCGCTAGTGCTAGAGCTTGGGCTGCAGGTCGAGGGACCTAATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAACGGTAATTAAGGGTTCCGGATCAATTCTAGAGCTATCTAATATATTTTAAAGGTTGCATAGCATTCTGTCTTATGGAGATACCATAACTGATTTAACCAGTCCACTATTGATAGACACTATTTTGTTCTTACCGACTGTACTAGAAGAAACATTCTTTTACATGTTTGGTACTTGTTCAGCTTTATTCAAGTGGAATTTCTGGGTCAAGGGGAAAGAGTTTATTGAATATTTTGGTATTGCCAAATTTTCCTCTAAGAAGTTGAATCATTTTATACTCCTGATGTTATATGAGAGTACCTTTCTCTTCACAATTTGTCTCTTTTTTTTTTTTTTTTGAGACAAGGTCTCTGTTGCCCAGGCTGGGGTGCAGTGCAGCAGAATGATCACAGTTCACTGCAGTCTCAACCTCCTGGGTTCAAGCGATCCTTCCACCTCAGCCTCCTGAGTAGCTGGGACTATAGGTGTGCGCCACCACTCCCAGCTAATATTTTTATTTTGTAGAAACAGGGTTCGCCATGTTACCCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCATGAGCCACTGGCCCAGTTTCTACAGTCTCTCTTAATATTGTATATTATCCAAGAAATTTCATTTAATCAGAACCTGCCAGTCTGATAGGTGAAAATGGTATCTTGTTTTTATTTGCATTTAAAAAAAATTATGATAGTGGTATGCTTGGTTTTTTTGAAGGTATCAAATTTTTTACCTTATGAAACATGAGGGCAAAGGATGTGTTACGTGGAAGATTTAAAAAAAATTTTTAATGCATTTTTTTGAGACAAGGTCTTGCTCTATTGTCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCACAGTTCACTCCAGCCTCAACATCCTGCACTAAAGTGATTTTCCCACCTCACCTCTCAAGTAGCTGGGACTACAGGTACATGCTACCATGCCTGGCTAATTTTTTTTTTTTTGCAGGCATGGGGTCTCACTATATTGCCCAGGTTGGTGTGGAAGTTTAATGACTAAGAGGTGTTTGTTATAAAGTTTAATGTATGAAACTTTCTATTAAATTCCTGATTTTATTTCTGTAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGATGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCGGCAGTGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGAGAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCGATCCTCTAGTTGGGTACCTTCTGAGAATTCGCCCTCGCCGCAGGGCCTCGGTGGCCGGCCGCAGCTTGCAAATTAAAGCCTTCGAGCGTCCCAAAACCTTCTCAAGCAAGGTTTTCAGTATAATGTTACATGCGTACACGCGTCTGTACAGAAAAAAAAGAAAAATTTGAAATATAAATAACGTTCTTAATACTAACATAACTATAAAAAAATAAATAGGGACCTAGACTTCAGGTTGTCTAACTCCTTCCTTTTCGGTTAGAGCGGATGTGGGGGGAGGGCGTGAATGTAAGCGTGACATAACTAATTACATGATGCGGCCCTCTAGATGCATGCTCGAGCGGCCGCTACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTGCTGGGGCGTCGGTTTCCACTATCGGCGAGTACTTCTACACAGCCATCGGTCCAGACGGCCGCGCTTCTGCGGGCGATTTGTGTACGCCCGACAGTCCCGGCTCCGGATCGGACGATTGCGTCGCATCGACCCTGCGCCCAAGCTGCATCATCGAAATTGCCGTCAACCAAGCTCTGATAGAGTTGGTCAAGACCAATGCGGAGCATATACGCCCGGAGCCGCGGCGATCCTGCAAGCTCCGGATGCCTCCGCTCGAAGTAGCGCGTCTGCTGCTCCATACAAGCCAACCACGGCCTCCAGAAGAAGATGTTGGCGACCTCGTATTGGGAATCCCCGAACATCGCCTCGCTCCAGTCAATGACCGCTGTTATGCGGCCATTGTCCGTCAGGACATTGTTGGAGCCGAAATCCGCGTGCACGAGGTGCCGGACTTCGGGGCAGTCCTCGGCCCAAAGCATCAGCTCATCGAGAGCCTGCGCGACGGACGCACTGACGGTGTCGTCCATCACAGTTTGCCAGTGATACACATGGGGATCAGCAATCGCGCATATGAAATCACGCCATGTAGTGTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAATGGGCCGAACCCGCTCGTCTGGCTAAGATCGGCCGCAGCGATGGCATCCATGGCCTCCGCGACCGGCTGCAGAACAGCGGGCAGTTCGGTTTCAGGCAGGTCTTGCAACGTGACACCCTGTGCACGGCGGGAGATGCAATAGGTCAGGCTCTCGCTAAATTCCCCAATGTCAAGCACTTCCGGAATCGGGAGCGCGGCCGATGCAAAGTGCCGATAAACATAACGATCTTTGTAGAAACCATCGGCGCAGCTATTTACCCGCAGGACATATCCACGCCCTCCTACATCGAAGCTGAAAGCACGAGATTCTTCGCCCTCCGAGAGCTGCATCAGGTCGGAGACGCTGTCGAACTTTTCGATCAGAAACTTCTCGACAGACGTCGCGGTGAGTTCAGGCTTTTTACCCATGGTGGCAGCCTGCTTTTTTGTACAAACTTGCTTAGATTAGATTGCTATGCTTTCTTTCTAATGAGCAAGAAGTAAAAAAAGTTGTAATAGAACAAGAAAAATGAAACTGAAACTTGAGAAATTGAAGACCATTTATTAACTTAAATATCAATGGGAGGTCATCGAAAGAGAAAAAAATCAAAAAAAAAAATTTTCAAGAAAAAGAAACGTGATAAAAATTTTTATTGCCTTTTTCGACGAAGAAAAAGAAACGAGGCGGTCTCTTTTTTCTTTTCCAAACCTTTAGTACGGGTAATTAACGACACCCTAGAGGAAGAAAGAGGGGGAATTTAGTATGCTGTGCTTGGGTGTTTTGAAGTGGTACGGCGATGCGCGGAGTCCGAGAAAATCTGGAAGAGTAAAAAAGGAGTAGAAACATTTTGAAGCTATGGTGTGTGGGGGATCCAACTTTTCTATACAAAGTTGACTAGTGGATCGATCCCCTTTACATCTTCGGAAAACAAAAACTATTTTTTCTTTAATTTCTTTTTTTACTTTCTATTTTTAATTTATATATTTATATTAAAAAATTTAAATTATAATTATTTTTATAGCACGTGATCAGCCTGCTGTCGTGAATACGGCGCGCCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCTTATGAGGTCCCTCATCCAGAACTCTGGCTGCAGCAACCCCAGCAGAGGTCCTGAGTCTGCAGACTTGAAGAATAATACAAAGAAGAATTAGGGAAGTGAGTAGGCACTATTAATTAAAGTTCTGCTCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTCACGGGCCCTTGCCACCCGCTCTCACTGCCACACCCTCATAGAAATCCTTCCCCATATGGATCTTGTGTTCTTCTCTCTCTCTTCCCTCTCAGCTCCTGCTCAGTGGCTGAAGCAGATTTGGAGCCACGAACACGAGTCTGGCAGAGCTTTGCTTTTGTTTTTAACTGGGAGTCGACTGCAGAGGCCTGCATG

26.序列26 SEQ ID NO:26

loxp71-hprt intron-5'Neo-PGK promoter-rBGpA-EF1a-CreERT2-IRES-puro-FRT序列

CGATTTAAGAAACAGAGGAAAATTGCAAGATTTTCTTGATTCTCTGTCTTAAACAAAACAGACAAAGATGATGGGCTCTTTGACTTTCTTGTGTCACTTTAATTTTCCTTGTCTTTCTAAGGAAAGTTGCCTGAGATAGCATAATGAGGGTTGAACATGACTGACACTGATAGAAACCCTGGTGAGGAGGTAGACATGTAAATAACAAGCAGAGCATTTGACCAGCACTGTTTGGTGTCACTAAATCAGTGGGTGCTATAAGTGGTGATGATGTTACCTGTATTCTTGAATGTTTCAATTTATATTTACCTGGAAAACTGGTTCATTTTGTTAAGGATTCTATGTTGCATTCCCTAAGTGTTGTGAGGTAAATGATGAAAGTTCTTTCAGGTCTGAATGAGGAAGATGTCTTGATGTCTTTTCAAGGCAAGCTCTATAGTGCAGGAGAGATGAGAGTTGTATATTCTCCAACACTATCCTCCATGTTCAGAAACAGCTATCACTTCAAGCCTGGGGTATGGAATTATATGACAGAAGGCCTCTGAAATAATTTCCCTGCTCTACCTTGCAAATTAACCCCATCTCTCTTATCTGTCACTCAATACCTGTATTCCTATCAATTCGTAACAAAACCAAACTGTTGTGTCTGATTTAAATAATATCTATGAAGTTGATATGAGCATGGCATGGCTTCTCTGTCTACTAGGGTATGAAGAAAAATCACCTTTCAAACAGAGAAAAAATACACCGAGTAGCAGCTGTCTGACTCTGGCATTAACTGGTAAATATTTGCAGCATATACTATGGAGCTGTTCAGATTTGATGAGTATGTTATTTGTTGACTCACTCATTCACTGAACAAATCTTCAGTGAGCACAGGTGTAGGCATGGGTTAGGAGCAAAGAGATGAGGCCTACCTACTCTGGAGAAACTTAGGAGTTAGAGATAAATACAATGTAGAATGAATCATTATTCTTATCCAGGAGATCCTCAGGTCATTGCTTGTCTCCGGCAGGATCCGATGATCCGGAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAACGGTATAGGTCCCTCGACCTGCAGCCCAAGCTCTAGACACACTAATATTAAAAGTGTCCAATAACATTTAAAACTATACTCATACGTTAAAATATAAATGTATATATGTACTTTTGCATATAGTATACATGCATAGCCAGTGCTTGAGAAGAAATGTGTACAGAAGGCTGAAAGGAGAGAACTTTAGTCTTCTTGTTTATGGCCTCCATAGTTAGAATATTTTATAACACAAATATTTTGATATTATAATTTTAAAATAAAAACACAGAATAGCCAGACATACAATGCAAGCATTCAATACCAGGTAAGGTTTTTCACTGTAATTGACTTAACAGAAAATTTTCAAGCTAGATGTGCATAATAATAAAAATCTGACCTTGCCTTCATGTGATTCAGCCCCAGTCCATTACCCTGTTTAGGACTGAGAAATGCAAGACTCTGGCTAGAGTTCCTTCTTCCATCTCCCTTCAATGTTTACTTTGTTCTGGTCCCTACAGAGTCCCACTATACCACAACTGATACTAAGTAATTAGTAAGGCCCTCCTCTTTTATTTTTAATAAAGAAGATTTTAGAAAGCATCAGTTATTTAATAAGTTGGCCTAGTTTATGTTCAAATAGCAAGTACTCAGAACAGCTGCTGATGTTTGAAATTAACACAAGAAAAAGTAAAAAACCTCATTTTAAGATCTTACTTACCTTCCCGCTTCAGTGACAACGTCGAGCACAGCTGCGCAAGGAACGCCCGTCGTGGCCAGCCACGATAGCCGCGCTGCCTCGTCCTGCAGTTCATTCAGGGCACCGGACAGGTCGGTCTTGACAAAAAGAACCGGGCGCCCCTGCGCTGACAGCCGGAACACGGCGGCATCAGAGCAGCCGATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCCAAGCGGCCGGAGAACCTGCGTGCAATCCATCTTGTTCAATGGCCGATCCCATAACGGAGCCGGCCGGCGCGCGGGCTGACTGCTCAGGAGGAGGAAGCCGGTGGCGGAGCAGAGGAGGAGGCGGAGGCGCAGCAAGACCCCCCCCCCCCCCTGCAGGTCGAAAGGCCCGGAGATGAGGAAGAGGAGAACAGCGCGGCAGACGTGCGCTTTTGAAGCGTGCAGAATGCCGGGCCTCCGGAGGACCTTCGGGCGCCCGCCCCGCCCCTGAGCCCGCCCCTGAGCCCGCCCCCGGACCCACCCCTTCCCAGCCTCTGAGCCCAGAAAGCGAAGGAGCAAAGCTGCTATTGGCCGCTGCCCCAAAGGCCTACCCGCTTCCATTGCTCAGCGGTGCTGTCCATCTGCACGAGACTAGTGAGACGTGCTACTTCCATTTGTCACGTCCTGCACGACGCGAGCTGCGGGGCGGGGGGGAACTTCCTGACTAGGGGAGGAGTAGAAGGTGGCGCGAAGGGGCCACCAAAGAACGGAGCCGGTTGGCGCCTACCGGTGGATGTGGAATGTGTGCGAGGCCAGAGGCCACTTGTGTAGCGCCAAGTGCCCAGCGGGGCTGCTAAAGCGCATGCTCCAGACTGCCTTGGGAAAAGCGCCTCCCCTACCCGGTAGAATTCCTGGCGCGGATCTCCATAAGAGAAGAGGGACAGCTATGACTGGGAGTAGTCAGGAGAGGAGGAAAAATCTGGCTAGTAAAACATGTAAGGAAAATTTTAGGGATGTTAAAGAAAAAAATAACACAAAACAAAATATAAAAAAAATCTAACCTCAAGTCAAGGCTTTTCTATGGAATAAGGAATGGACAGCAGGGGGCTGTTTCATATACTGATGACCTCTTTATAGCCAACCTTTGTTCATGGCAGCCAGCATATGGGCATATGTTGCCAAACTCTAAACCAAATACTCATTCTGATGTTTTAAATGATTTGCCCTCCCATATGTCCTTCCGAGTGAGAGACACAAAAAATTCCAACACACTATTGCAATGAAAATAAATTTCCTTTATTAGCCAGAAGTCAGATGCTCAAGGGGCTTCATGATGTCCCCATAATTTTTGGCAGAGGGAAAAAGATCTCAGTGGTATTTGTGAGCCAGGGCATTGGCCACACCAGCCACCACCTTCTGATAGGCAGCCTGCACCTGAGGATCACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGTCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAAGCTTGGTACCGCCACCATGGGCTCCAATTTACTGACCGTACACCAAAATTTGCCTGCATTACCGGTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCGCAAGAACCTGATGGACATGTTCAGGGATCGCCAGGCGTTTTCTGAGCATACCTGGAAAATGCTTCTGTCCGTTTGCCGGTCGTGGGCGGCATGGTGCAAGTTGAATAACCGGAAATGGTTTCCCGCAGAACCTGAAGATGTTCGCGATTATCTTCTATATCTTCAGGCGCGCGGTCTGGCAGTAAAAACTATCCAGCAACATTTGGGCCAGCTAAACATGCTTCATCGTCGGTCCGGGCTGCCACGACCAAGTGACAGCAATGCTGTTTCACTGGTTATGCGGCGGATCCGAAAAGAAAACGTTGATGCCGGTGAACGTGCAAAACAGGCTCTAGCGTTCGAACGCACTGATTTCGACCAGGTTCGTTCACTCATGGAAAATAGCGATCGCTGCCAGGATATACGTAATCTGGCATTTCTGGGGATTGCTTATAACACCCTGTTACGTATAGCCGAAATTGCCAGGATCAGGGTTAAAGATATCTCACGTACTGACGGTGGGAGAATGTTAATCCATATTGGCAGAACGAAAACGCTGGTTAGCACCGCAGGTGTAGAGAAGGCACTTAGCCTGGGGGTAACTAAACTGGTCGAGCGATGGATTTCCGTCTCTGGTGTAGCTGATGATCCGAATAACTACCTGTTTTGCCGGGTCAGAAAAAATGGTGTTGCCGCGCCATCTGCCACCAGCCAGCTATCAACTCGCGCCCTGGAAGGGATTTTTGAAGCAACTCATCGATTGATTTACGGCGCTAAGGATGACTCTGGTCAGAGATACCTGGCCTGGTCTGGACACAGTGCCCGTGTCGGAGCCGCGCGAGATATGGCCCGCGCTGGAGTTTCAATACCGGAGATCATGCAAGCTGGTGGCTGGACCAATGTAAATATTGTCATGAACTATATCCGTAACCTGGATAGTGAAACAGGGGCAATGGTGCGCCTGCTGGAAGATGGCGATCTCGAGCCATCTGCTGGAGACATGAGAGCTGCCAACCTTTGGCCAAGCCCGCTCATGATCAAACGCTCTAAGAAGAACAGCCTGGCCTTGTCCCTGACGGCCGACCAGATGGTCAGTGCCTTGTTGGATGCTGAGCCCCCCATACTCTATTCCGAGTATGATCCTACCAGACCCTTCAGTGAAGCTTCGATGATGGGCTTACTGACCAACCTGGCAGACAGGGAGCTGGTTCACATGATCAACTGGGCGAAGAGGGTGCCAGGCTTTGTGGATTTGACCCTCCATGATCAGGTCCACCTTCTAGAATGTGCCTGGCTAGAGATCCTGATGATTGGTCTCGTCTGGCGCTCCATGGAGCACCCAGTGAAGCTACTGTTTGCTCCTAACTTGCTCTTGGACAGGAACCAGGGAAAATGTGTAGAGGGCATGGTGGAGATCTTCGACATGCTGCTGGCTACATCATCTCGGTTCCGCATGATGAATCTGCAGGGAGAGGAGTTTGTGTGCCTCAAATCTATTATTTTGCTTAATTCTGGAGTGTACACATTTCTGTCCAGCACCCTGAAGTCTCTGGAAGAGAAGGACCATATCCACCGAGTCCTGGACAAGATCACAGACACTTTGATCCACCTGATGGCCAAGGCAGGCCTGACCCTGCAGCAGCAGCACCAGCGGCTGGCCCAGCTCCTCCTCATCCTCTCCCACATCAGGCACATGAGTAACAAAGGCATGGAGCATCTGTACAGCATGAAGTGCAAGAACGTGGTGCCCCTCTATGACCTGCTGCTGGAGGCGGCGGACGCCCACCGCCTACATGCGCCCACTAGCCGTGGAGGGGCATCCGTGGAGGAGACGGACCAAAGCCACTTGGCCACTGCGGGCTCTACTTCATCGCATTCCTTGCAAAAGTATTACATCACGGGGGAGGCAGAGGGTTTCCCTGCCACAGCTTGATGAGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCCACAAGGAGACGACCTTCCATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCAGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGATCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAAACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTACTTAAGAGGGGGAGACCAAAGGGCGAGACGTTAAGGCCTCACGTGACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCTAAAAGTGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCTTGGCTATTGTAGCCAAAAATCTCATCAAAAGCCCAGAATGGATCTGAACAACAGAAAATTCCATGAGATGATCTGACTGTATGACCAGAGCCATTGTGGACACAGCACAGTACATTGCTGATTTCTTTTCAACTCTGAGGTATCAGGATTGCTAATGTCCATCATTTATGGGGTATCTACCATTAGATGTACAAAGGACTGACCCTGTTCCACTTATCATATATGACCAATTTATGTCTAGAGAATGAAAGTCAGAAAAAAATTAAACAATACATAAACACAAACCCAACCACAAAACTTGTGATCTACAGACTGTTCTCAATGCAAAATATGCTAGGGCAATGGGGGCACAAATCTTAGAGAAATAATTAAACAACATTTGATTTGACTTAAATCTCATTCCATGACATGGAACTCATGAACACTGTTTGGCAGACCAAGATCTAGAGACTAAATAGACCAATGACCTATGATAAACCAAATACTACTGGCTTAAAACAAAAGTATCACTAACATGACTCCTGATGATATTCTGCTATCTCATAGATTGTGCTTTATTTAGCCATCATCAGGTAGGCTTCCTCATACATCACGGTTAGGGTTAGGCTTAGGGGTTAGGGTTAGCATTAGAGTTAGGTCCCAGAAATATTTGGAGATCTGCAGTCTTTTAAAATATCTTTCATGACAAAAAGGAGCAATCTCTGCCCCAAAGGGAAGGTTTGACTTTCCTGTTGCATGAGTTAACTGGAATATTTGCATCATAAATTTAGTTTGAAACTGTAATATATCTTGTAACATATAAAAATTTCAAGACTACATATGATGGCTTAAAGGCTGGCACTATGGCTTAGCCAGTAAAAGTACTTGGCACAAATTGTGATGACCTGAATTTGATCCCAGAACTTACATCTGACTATTTAACTTGCCTTCTGACAATGTTTCTCCCCCCTCTCTCTGCCATTATGTAACTCTCTCCATCTCTCAATAAATAACATTATTTTAAAATTATTTTTATTTTTAAACTTGAAGTTTAAGAATGAATAACATAATTAAGTCAAACAATGATCCTCAAATGGATAAGATCAA

序列表

<110> Huang, jing

<120> 定点整合大片段外源DNA的方法

<130> C19P5092

<160> 26

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> loxp66序列

<400> 1

ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaac ggta 34

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> WT loxp序列

<400> 2

ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttat 34

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于载体TAR-loxp66末端和IGL1连接处PCR产物1的正向引物

<400> 3

gggttctcac ctctgattag 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于载体TAR-loxp66末端和IGL1连接处PCR产物1的反向引物

<400> 4

aggtccctcg acctgcagcc c 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于IGL1内部PCR产物2的正向引物

<400> 5

aaaccaagac ggtgaggaaa g 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于IGL1内部PCR产物2的反向引物

<400> 6

gtaaatgaat aaaggaatgg 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于IGL1和IGL2的连接处PCR产物3的正向引物

<400> 7

tggtgcagac tccccggatc t 21

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于IGL1和IGL2的连接处PCR产物3的反向引物

<400> 8

ggaaatgata cctggccctg gcc 23

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于IGL2内部PCR产物4的正向引物

<400> 9

agggaggcag atgcagaggt 20

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于IGL2内部PCR产物4的反向引物

<400> 10

ttgaccccac tcctcctcct ca 22

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于IGL2和IGL3连接处PCR产物5的正向引物

<400> 11

tccagtaatg gtcagggagg c 21

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于IGL2和IGL3连接处PCR产物5的反向引物

<400> 12

cccacctctg ctccagcttc 20

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于IGL3内部PCR产物6的正向引物

<400> 13

ctcggtgact tgatcccag 19

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于IGL3内部PCR产物6的反向引物

<400> 14

aatgtgtgta gggaacatca t 21

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于IGL3和载体TAR-loxp66末端连接处PCR产物7的正向引物

<400> 15

agttctgctc aagcttggc 19

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于IGL3和载体TAR-loxp66末端连接处PCR产物7的反向引物

<400> 16

cacagctacc ctcaagaaag 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于筛选整合了表达盒的基因组DNA的PCR的引物 Insert 5F

<400> 17

gcagtctgca ctctctgtgg 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于筛选整合了表达盒的基因组DNA的PCR的引物Insert 5R:

<400> 18

tcgagggacc tataccgttc 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于筛选整合了表达盒的基因组DNA的PCR的引物Insert 3F

<400> 19

cgtgacatgt gagcaaaagg 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于筛选整合了表达盒的基因组DNA的PCR的引物Insert 3R

<400> 20

ggaacctttc ccccataaaa 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于鉴定WT loxp阳性的引物WT loxp F:

<400> 21

ggagatcctc aggtcattgc 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于鉴定WT loxp阳性的引物WT loxp R

<400> 22

ggcagagctt tgcttttgtt 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于鉴定Loxp66/71阳性的引物Loxp66/71 F

<400> 23

ccttgaccca gaaattccac 20

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于鉴定Loxp66/71阳性的引物Loxp66/71 R

<400> 24

tggaggccat aaacaagaag a 21

<210> 25

<211> 7778

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TAR-loxp66序列

<400> 25

ggcgcgccac tagtggatct cgagccccag ctggttcttt ccgcctcaga aggaatttcg 60

aggtcgctag tgctagagct tgggctgcag gtcgagggac ctaataactt cgtataatgt 120

atgctatacg aacggtaatt aagggttccg gatcaattct agagctatct aatatatttt 180

aaaggttgca tagcattctg tcttatggag ataccataac tgatttaacc agtccactat 240

tgatagacac tattttgttc ttaccgactg tactagaaga aacattcttt tacatgtttg 300

gtacttgttc agctttattc aagtggaatt tctgggtcaa ggggaaagag tttattgaat 360

attttggtat tgccaaattt tcctctaaga agttgaatca ttttatactc ctgatgttat 420

atgagagtac ctttctcttc acaatttgtc tctttttttt ttttttttga gacaaggtct 480

ctgttgccca ggctggggtg cagtgcagca gaatgatcac agttcactgc agtctcaacc 540

tcctgggttc aagcgatcct tccacctcag cctcctgagt agctgggact ataggtgtgc 600

gccaccactc ccagctaata tttttatttt gtagaaacag ggttcgccat gttacccagc 660

ctcccaaagt gctgggatta caggcatgag ccactggccc agtttctaca gtctctctta 720

atattgtata ttatccaaga aatttcattt aatcagaacc tgccagtctg ataggtgaaa 780

atggtatctt gtttttattt gcatttaaaa aaaattatga tagtggtatg cttggttttt 840

ttgaaggtat caaatttttt accttatgaa acatgagggc aaaggatgtg ttacgtggaa 900

gatttaaaaa aaatttttaa tgcatttttt tgagacaagg tcttgctcta ttgtccaggc 960

tggagtgcag tggcacaatc acagttcact ccagcctcaa catcctgcac taaagtgatt 1020

ttcccacctc acctctcaag tagctgggac tacaggtaca tgctaccatg cctggctaat 1080

tttttttttt ttgcaggcat ggggtctcac tatattgccc aggttggtgt ggaagtttaa 1140

tgactaagag gtgtttgtta taaagtttaa tgtatgaaac tttctattaa attcctgatt 1200

ttatttctgt agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc 1260

tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac 1320

gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg 1380

tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct 1440

cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa ggcgcgcatg cccgacggcg atgatctcgt 1500

cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg 1560

attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag cgttggctac 1620

ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg 1680

tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg agttcttcgg 1740

cagtggagag ggcagaggaa gtctgctaac atgcggtgac gtcgaggaga atcctggccc 1800

agtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc atcctggtcg agctggacgg 1860

cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc gagggcgatg ccacctacgg 1920

caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct ggcccaccct 1980

cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc taccccgacc acatgaagca 2040

gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc caggagcgca ccatcttctt 2100

caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg acaccctggt 2160

gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc tggggcacaa 2220

gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg gccgacaagc agaagaacgg 2280

catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac ggcagcgtgc agctcgccga 2340

ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg acaaccacta 2400

cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc acatggtcct 2460

gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt acaagtaaag 2520

agctcgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc 2580

ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga 2640

ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca 2700

ggacagcaag ggggaggatt gggaagagaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc 2760

tatggcttct gaggcggaaa gaaccagctg gggctcgatc ctctagttgg gtaccttctg 2820

agaattcgcc ctcgccgcag ggcctcggtg gccggccgca gcttgcaaat taaagccttc 2880

gagcgtccca aaaccttctc aagcaaggtt ttcagtataa tgttacatgc gtacacgcgt 2940

ctgtacagaa aaaaaagaaa aatttgaaat ataaataacg ttcttaatac taacataact 3000

ataaaaaaat aaatagggac ctagacttca ggttgtctaa ctccttcctt ttcggttaga 3060

gcggatgtgg ggggagggcg tgaatgtaag cgtgacataa ctaattacat gatgcggccc 3120

tctagatgca tgctcgagcg gccgctacca ctttgtacaa gaaagctggg tttattcctt 3180

tgccctcgga cgagtgctgg ggcgtcggtt tccactatcg gcgagtactt ctacacagcc 3240

atcggtccag acggccgcgc ttctgcgggc gatttgtgta cgcccgacag tcccggctcc 3300

ggatcggacg attgcgtcgc atcgaccctg cgcccaagct gcatcatcga aattgccgtc 3360

aaccaagctc tgatagagtt ggtcaagacc aatgcggagc atatacgccc ggagccgcgg 3420

cgatcctgca agctccggat gcctccgctc gaagtagcgc gtctgctgct ccatacaagc 3480

caaccacggc ctccagaaga agatgttggc gacctcgtat tgggaatccc cgaacatcgc 3540

ctcgctccag tcaatgaccg ctgttatgcg gccattgtcc gtcaggacat tgttggagcc 3600

gaaatccgcg tgcacgaggt gccggacttc ggggcagtcc tcggcccaaa gcatcagctc 3660

atcgagagcc tgcgcgacgg acgcactgac ggtgtcgtcc atcacagttt gccagtgata 3720

cacatgggga tcagcaatcg cgcatatgaa atcacgccat gtagtgtatt gaccgattcc 3780

ttgcggtccg aatgggccga acccgctcgt ctggctaaga tcggccgcag cgatggcatc 3840

catggcctcc gcgaccggct gcagaacagc gggcagttcg gtttcaggca ggtcttgcaa 3900

cgtgacaccc tgtgcacggc gggagatgca ataggtcagg ctctcgctaa attccccaat 3960

gtcaagcact tccggaatcg ggagcgcggc cgatgcaaag tgccgataaa cataacgatc 4020

tttgtagaaa ccatcggcgc agctatttac ccgcaggaca tatccacgcc ctcctacatc 4080

gaagctgaaa gcacgagatt cttcgccctc cgagagctgc atcaggtcgg agacgctgtc 4140

gaacttttcg atcagaaact tctcgacaga cgtcgcggtg agttcaggct ttttacccat 4200

ggtggcagcc tgcttttttg tacaaacttg cttagattag attgctatgc tttctttcta 4260

atgagcaaga agtaaaaaaa gttgtaatag aacaagaaaa atgaaactga aacttgagaa 4320

attgaagacc atttattaac ttaaatatca atgggaggtc atcgaaagag aaaaaaatca 4380

aaaaaaaaaa ttttcaagaa aaagaaacgt gataaaaatt tttattgcct ttttcgacga 4440

agaaaaagaa acgaggcggt ctcttttttc ttttccaaac ctttagtacg ggtaattaac 4500

gacaccctag aggaagaaag agggggaatt tagtatgctg tgcttgggtg ttttgaagtg 4560

gtacggcgat gcgcggagtc cgagaaaatc tggaagagta aaaaaggagt agaaacattt 4620

tgaagctatg gtgtgtgggg gatccaactt ttctatacaa agttgactag tggatcgatc 4680

ccctttacat cttcggaaaa caaaaactat tttttcttta atttcttttt ttactttcta 4740

tttttaattt atatatttat attaaaaaat ttaaattata attattttta tagcacgtga 4800

tcagcctgct gtcgtgaata cggcgcgccg aagttcctat actttctaga gaataggaac 4860

ttcggaatag gaacttctta tgaggtccct catccagaac tctggctgca gcaaccccag 4920

cagaggtcct gagtctgcag acttgaagaa taatacaaag aagaattagg gaagtgagta 4980

ggcactatta attaaagttc tgctcaagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg 5040

tgtgaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact 5100

gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc 5160

ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg 5220

ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc 5280

cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag 5340

gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca 5400

tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca 5460

ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg 5520

atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag 5580

gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt 5640

tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca 5700

cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg 5760

cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt 5820

tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc 5880

cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg 5940

cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg 6000

gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta 6060

gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg 6120

gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg 6180

ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc 6240

atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc 6300

agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc 6360

ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag 6420

tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat 6480

ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg 6540

caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt 6600

gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag 6660

atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg 6720

accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt 6780

aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct 6840

gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac 6900

tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat 6960

aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat 7020

ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca 7080

aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat 7140

tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc tcgcgcgttt 7200

cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct 7260

gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg 7320

tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg 7380

gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc attcgccatt 7440

caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct 7500

ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc 7560

acgacgttgt aaaacgacgg ccagtcacgg gcccttgcca cccgctctca ctgccacacc 7620

ctcatagaaa tccttcccca tatggatctt gtgttcttct ctctctcttc cctctcagct 7680

cctgctcagt ggctgaagca gatttggagc cacgaacacg agtctggcag agctttgctt 7740

ttgtttttaa ctgggagtcg actgcagagg cctgcatg 7778

<210> 26

<211> 9067

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> loxp71-hprt intron-5'Neo-PGK promoter-rBGpA-EF1a-CreERT2-IRES-

puro-FRT序列

<400> 26

cgatttaaga aacagaggaa aattgcaaga ttttcttgat tctctgtctt aaacaaaaca 60

gacaaagatg atgggctctt tgactttctt gtgtcacttt aattttcctt gtctttctaa 120

ggaaagttgc ctgagatagc ataatgaggg ttgaacatga ctgacactga tagaaaccct 180

ggtgaggagg tagacatgta aataacaagc agagcatttg accagcactg tttggtgtca 240

ctaaatcagt gggtgctata agtggtgatg atgttacctg tattcttgaa tgtttcaatt 300

tatatttacc tggaaaactg gttcattttg ttaaggattc tatgttgcat tccctaagtg 360

ttgtgaggta aatgatgaaa gttctttcag gtctgaatga ggaagatgtc ttgatgtctt 420

ttcaaggcaa gctctatagt gcaggagaga tgagagttgt atattctcca acactatcct 480

ccatgttcag aaacagctat cacttcaagc ctggggtatg gaattatatg acagaaggcc 540

tctgaaataa tttccctgct ctaccttgca aattaacccc atctctctta tctgtcactc 600

aatacctgta ttcctatcaa ttcgtaacaa aaccaaactg ttgtgtctga tttaaataat 660

atctatgaag ttgatatgag catggcatgg cttctctgtc tactagggta tgaagaaaaa 720

tcacctttca aacagagaaa aaatacaccg agtagcagct gtctgactct ggcattaact 780

ggtaaatatt tgcagcatat actatggagc tgttcagatt tgatgagtat gttatttgtt 840

gactcactca ttcactgaac aaatcttcag tgagcacagg tgtaggcatg ggttaggagc 900

aaagagatga ggcctaccta ctctggagaa acttaggagt tagagataaa tacaatgtag 960

aatgaatcat tattcttatc caggagatcc tcaggtcatt gcttgtctcc ggcaggatcc 1020

gatgatccgg aacccttaat ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaac ggtataggtc 1080

cctcgacctg cagcccaagc tctagacaca ctaatattaa aagtgtccaa taacatttaa 1140

aactatactc atacgttaaa atataaatgt atatatgtac ttttgcatat agtatacatg 1200

catagccagt gcttgagaag aaatgtgtac agaaggctga aaggagagaa ctttagtctt 1260

cttgtttatg gcctccatag ttagaatatt ttataacaca aatattttga tattataatt 1320

ttaaaataaa aacacagaat agccagacat acaatgcaag cattcaatac caggtaaggt 1380

ttttcactgt aattgactta acagaaaatt ttcaagctag atgtgcataa taataaaaat 1440

ctgaccttgc cttcatgtga ttcagcccca gtccattacc ctgtttagga ctgagaaatg 1500

caagactctg gctagagttc cttcttccat ctcccttcaa tgtttacttt gttctggtcc 1560

ctacagagtc ccactatacc acaactgata ctaagtaatt agtaaggccc tcctctttta 1620

tttttaataa agaagatttt agaaagcatc agttatttaa taagttggcc tagtttatgt 1680

tcaaatagca agtactcaga acagctgctg atgtttgaaa ttaacacaag aaaaagtaaa 1740

aaacctcatt ttaagatctt acttaccttc ccgcttcagt gacaacgtcg agcacagctg 1800

cgcaaggaac gcccgtcgtg gccagccacg atagccgcgc tgcctcgtcc tgcagttcat 1860

tcagggcacc ggacaggtcg gtcttgacaa aaagaaccgg gcgcccctgc gctgacagcc 1920

ggaacacggc ggcatcagag cagccgattg tctgttgtgc ccagtcatag ccgaatagcc 1980

tctccaccca agcggccgga gaacctgcgt gcaatccatc ttgttcaatg gccgatccca 2040

taacggagcc ggccggcgcg cgggctgact gctcaggagg aggaagccgg tggcggagca 2100

gaggaggagg cggaggcgca gcaagacccc cccccccccc tgcaggtcga aaggcccgga 2160

gatgaggaag aggagaacag cgcggcagac gtgcgctttt gaagcgtgca gaatgccggg 2220

cctccggagg accttcgggc gcccgccccg cccctgagcc cgcccctgag cccgcccccg 2280

gacccacccc ttcccagcct ctgagcccag aaagcgaagg agcaaagctg ctattggccg 2340

ctgccccaaa ggcctacccg cttccattgc tcagcggtgc tgtccatctg cacgagacta 2400

gtgagacgtg ctacttccat ttgtcacgtc ctgcacgacg cgagctgcgg ggcggggggg 2460

aacttcctga ctaggggagg agtagaaggt ggcgcgaagg ggccaccaaa gaacggagcc 2520

ggttggcgcc taccggtgga tgtggaatgt gtgcgaggcc agaggccact tgtgtagcgc 2580

caagtgccca gcggggctgc taaagcgcat gctccagact gccttgggaa aagcgcctcc 2640

cctacccggt agaattcctg gcgcggatct ccataagaga agagggacag ctatgactgg 2700

gagtagtcag gagaggagga aaaatctggc tagtaaaaca tgtaaggaaa attttaggga 2760

tgttaaagaa aaaaataaca caaaacaaaa tataaaaaaa atctaacctc aagtcaaggc 2820

ttttctatgg aataaggaat ggacagcagg gggctgtttc atatactgat gacctcttta 2880

tagccaacct ttgttcatgg cagccagcat atgggcatat gttgccaaac tctaaaccaa 2940

atactcattc tgatgtttta aatgatttgc cctcccatat gtccttccga gtgagagaca 3000

caaaaaattc caacacacta ttgcaatgaa aataaatttc ctttattagc cagaagtcag 3060

atgctcaagg ggcttcatga tgtccccata atttttggca gagggaaaaa gatctcagtg 3120

gtatttgtga gccagggcat tggccacacc agccaccacc ttctgatagg cagcctgcac 3180

ctgaggatca ccactttgta caagaaagct gggtggctcc ggtgcccgtc agtgggcaga 3240

gcgcacatcg cccacagtcc ccgagaagtt ggggggaggg gtcggcaatt gaaccggtgc 3300

ctagagaagg tggcgcgggg taaactggga aagtgatgtc gtgtactggc tccgcctttt 3360

tcccgagggt gggggagaac cgtatataag tgcagtagtc gccgtgaacg ttctttttcg 3420

caacgggttt gccgccagaa cacaggtaag tgccgtgtgt ggttcccgcg ggcctggcct 3480

ctttacgggt tatggccctt gcgtgccttg aattacttcc acctggctgc agtacgtgat 3540

tcttgatccc gagcttcggg ttggaagtgg gtgggagagt tcgaggcctt gcgcttaagg 3600

agccccttcg cctcgtgctt gagttgaggc ctggcctggg cgctggggcc gccgcgtgcg 3660

aatctggtgg caccttcgcg cctgtctcgc tgctttcgat aagtctctag ccatttaaaa 3720

tttttgatga cctgctgcga cgcttttttt ctggcaagat agtcttgtaa atgcgggcca 3780

agatctgcac actggtattt cggtttttgg ggccgcgggc ggcgacgggg cccgtgcgtc 3840

ccagcgcaca tgttcggcga ggcggggcct gcgagcgcgg ccaccgagaa tcggacgggg 3900

gtagtctcaa gctggccggc ctgctctggt gcctggtctc gcgccgccgt gtatcgcccc 3960

gccctgggcg gcaaggctgg cccggtcggc accagttgcg tgagcggaaa gatggccgct 4020

tcccggccct gctgcaggga gctcaaaatg gaggacgcgg cgctcgggag agcgggcggg 4080

tgagtcaccc acacaaagga aaagggcctt tccgtcctca gccgtcgctt catgtgactc 4140

cacggagtac cgggcgccgt ccaggcacct cgattagttc tcgagctttt ggagtacgtc 4200

gtctttaggt tggggggagg ggttttatgc gatggagttt ccccacactg agtgggtgga 4260

gactgaagtt aggccagctt ggcacttgat gtaattctcc ttggaatttg ccctttttga 4320

gtttggatct tggttcattc tcaagcctca gacagtggtt caaagttttt ttcttccatt 4380

tcaggtgtcg tgaagcttgg taccgccacc atgggctcca atttactgac cgtacaccaa 4440

aatttgcctg cattaccggt cgatgcaacg agtgatgagg ttcgcaagaa cctgatggac 4500

atgttcaggg atcgccaggc gttttctgag catacctgga aaatgcttct gtccgtttgc 4560

cggtcgtggg cggcatggtg caagttgaat aaccggaaat ggtttcccgc agaacctgaa 4620

gatgttcgcg attatcttct atatcttcag gcgcgcggtc tggcagtaaa aactatccag 4680

caacatttgg gccagctaaa catgcttcat cgtcggtccg ggctgccacg accaagtgac 4740

agcaatgctg tttcactggt tatgcggcgg atccgaaaag aaaacgttga tgccggtgaa 4800

cgtgcaaaac aggctctagc gttcgaacgc actgatttcg accaggttcg ttcactcatg 4860

gaaaatagcg atcgctgcca ggatatacgt aatctggcat ttctggggat tgcttataac 4920

accctgttac gtatagccga aattgccagg atcagggtta aagatatctc acgtactgac 4980

ggtgggagaa tgttaatcca tattggcaga acgaaaacgc tggttagcac cgcaggtgta 5040

gagaaggcac ttagcctggg ggtaactaaa ctggtcgagc gatggatttc cgtctctggt 5100

gtagctgatg atccgaataa ctacctgttt tgccgggtca gaaaaaatgg tgttgccgcg 5160

ccatctgcca ccagccagct atcaactcgc gccctggaag ggatttttga agcaactcat 5220

cgattgattt acggcgctaa ggatgactct ggtcagagat acctggcctg gtctggacac 5280

agtgcccgtg tcggagccgc gcgagatatg gcccgcgctg gagtttcaat accggagatc 5340

atgcaagctg gtggctggac caatgtaaat attgtcatga actatatccg taacctggat 5400

agtgaaacag gggcaatggt gcgcctgctg gaagatggcg atctcgagcc atctgctgga 5460

gacatgagag ctgccaacct ttggccaagc ccgctcatga tcaaacgctc taagaagaac 5520

agcctggcct tgtccctgac ggccgaccag atggtcagtg ccttgttgga tgctgagccc 5580

cccatactct attccgagta tgatcctacc agacccttca gtgaagcttc gatgatgggc 5640

ttactgacca acctggcaga cagggagctg gttcacatga tcaactgggc gaagagggtg 5700

ccaggctttg tggatttgac cctccatgat caggtccacc ttctagaatg tgcctggcta 5760

gagatcctga tgattggtct cgtctggcgc tccatggagc acccagtgaa gctactgttt 5820

gctcctaact tgctcttgga caggaaccag ggaaaatgtg tagagggcat ggtggagatc 5880

ttcgacatgc tgctggctac atcatctcgg ttccgcatga tgaatctgca gggagaggag 5940

tttgtgtgcc tcaaatctat tattttgctt aattctggag tgtacacatt tctgtccagc 6000

accctgaagt ctctggaaga gaaggaccat atccaccgag tcctggacaa gatcacagac 6060

actttgatcc acctgatggc caaggcaggc ctgaccctgc agcagcagca ccagcggctg 6120

gcccagctcc tcctcatcct ctcccacatc aggcacatga gtaacaaagg catggagcat 6180

ctgtacagca tgaagtgcaa gaacgtggtg cccctctatg acctgctgct ggaggcggcg 6240

gacgcccacc gcctacatgc gcccactagc cgtggagggg catccgtgga ggagacggac 6300

caaagccact tggccactgc gggctctact tcatcgcatt ccttgcaaaa gtattacatc 6360

acgggggagg cagagggttt ccctgccaca gcttgatgag cccctctccc tccccccccc 6420

ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg tgcgtttgtc tatatgttat 6480

tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg gaaacctggc cctgtcttct 6540

tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg aatgcaaggt ctgttgaatg 6600

tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca aacaacgtct gtagcgaccc 6660

tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct ctgcggccaa aagccacgtg 6720

tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca cgttgtgagt tggatagttg 6780

tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa ggggctgaag gatgcccaga 6840

aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggtg cacatgcttt acatgtgttt 6900

agtcgaggtt aaaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg ggacgtggtt ttcctttgaa 6960

aaacacgatg ataatatggc cacaacccac aaggagacga ccttccatga ccgagtacaa 7020

gcccacggtg cgcctcgcca cccgcgacga cgtccccagg gccgtacgca ccctcgccgc 7080

cgcgttcgcc gactaccccg ccacgcgcca caccgtcgat ccggaccgcc acatcgagcg 7140

ggtcaccgag ctgcaagaac tcttcctcac gcgcgtcggg ctcgacatcg gcaaggtgtg 7200

ggtcgcggac gacggcgccg cggtggcggt ctggaccacg ccggagagcg tcgaagcggg 7260

ggcggtgttc gccgagatcg gcccgcgcat ggccgagttg agcggttccc ggctggccgc 7320

gcagcaacag atggaaggcc tcctggcgcc gcaccggccc aaggagcccg cgtggttcct 7380

ggccaccgtc ggcgtctcgc ccgaccacca gggcaagggt ctgggcagcg ccgtcgtgct 7440

ccccggagtg gaggcggccg agcgcgccgg ggtgcccgcc ttcctggaaa cctccgcgcc 7500

ccgcaacctc cccttctacg agcggctcgg cttcaccgtc accgccgacg tcgaggtgcc 7560

cgaaggaccg cgcacctggt gcatgacccg caagcccggt gcctgagttt ggacaaacca 7620

caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat 7680

ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa caattgcatt cattttatgt 7740

ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt tttaaagcaa gtaaaacctc tacaaatgtg 7800

gtacttaaga gggggagacc aaagggcgag acgttaaggc ctcacgtgac atgtgagcaa 7860

aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa agaagttcct attctctaga aagtatagga 7920

acttctaaaa gtgaagttcc tatactttct agagaatagg aacttcggaa taggaacttc 7980

ttggctattg tagccaaaaa tctcatcaaa agcccagaat ggatctgaac aacagaaaat 8040

tccatgagat gatctgactg tatgaccaga gccattgtgg acacagcaca gtacattgct 8100

gatttctttt caactctgag gtatcaggat tgctaatgtc catcatttat ggggtatcta 8160

ccattagatg tacaaaggac tgaccctgtt ccacttatca tatatgacca atttatgtct 8220

agagaatgaa agtcagaaaa aaattaaaca atacataaac acaaacccaa ccacaaaact 8280

tgtgatctac agactgttct caatgcaaaa tatgctaggg caatgggggc acaaatctta 8340

gagaaataat taaacaacat ttgatttgac ttaaatctca ttccatgaca tggaactcat 8400

gaacactgtt tggcagacca agatctagag actaaataga ccaatgacct atgataaacc 8460

aaatactact ggcttaaaac aaaagtatca ctaacatgac tcctgatgat attctgctat 8520

ctcatagatt gtgctttatt tagccatcat caggtaggct tcctcataca tcacggttag 8580

ggttaggctt aggggttagg gttagcatta gagttaggtc ccagaaatat ttggagatct 8640

gcagtctttt aaaatatctt tcatgacaaa aaggagcaat ctctgcccca aagggaaggt 8700

ttgactttcc tgttgcatga gttaactgga atatttgcat cataaattta gtttgaaact 8760

gtaatatatc ttgtaacata taaaaatttc aagactacat atgatggctt aaaggctggc 8820

actatggctt agccagtaaa agtacttggc acaaattgtg atgacctgaa tttgatccca 8880

gaacttacat ctgactattt aacttgcctt ctgacaatgt ttctcccccc tctctctgcc 8940

attatgtaac tctctccatc tctcaataaa taacattatt ttaaaattat ttttattttt 9000

aaacttgaag tttaagaatg aataacataa ttaagtcaaa caatgatcct caaatggata 9060

agatcaa 9067

Claims (10)

1.整合目的基因片段的方法，其包括以下步骤：

1)获得目的基因片段；

2)将目的基因片段克隆到载体中，在所获得的包含目的基因片段的载体中插入了抗性表达盒1，优选截断型新霉素(G418)抗性表达盒1，所述表达盒1在5’至3’方向上包含突变型Loxp 1，优选Loxp66序列、部分HPRT内含子和抗性基因a部分，优选新霉素抗性基因Neo基因3’端部分；

3)将含有所述目的基因片段的载体转化到微生物细胞内，优选为酵母，尤其是酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)细胞内；

4)将所述微生物内含有目的基因片段的所述载体导入到受体细胞，其中所述受体细胞的基因组中已经定点导入了抗性表达盒2，优选截断型新霉素(G418)抗性表达盒2，所述表达盒2在5’至3’方向上包含部分HPRT内含子、突变型Loxp 2，优选Loxp71序列、抗性基因b部分，优选Neo基因5’端部分、含有雌激素受体(estrogen receptor，ER)的配体结合区突变体(ERT2)与Cre重组酶的融合蛋白CreERT2，和IRES-PuroR结构；

5)诱导CreERT2的重组酶活性，优选通过加入Tamoxifen诱导CreERT2的重组酶活性，所述Cre重组酶介导所述目的基因片段定点整合到所述受体细胞的基因组中，同时所述表达盒1和表达盒2形成表达完整抗性基因，优选新霉素的抗性表达盒；

6)筛选基因组中定点整合了所述目的基因片段的所述受体细胞。

2.根据权利要求1的方法，其中在所述步骤2)中的抗性表达盒1中所包含的抗性基因a部分，优选新霉素抗性基因Neo的3’端部分和所述步骤4)中的抗性表达盒2中的抗性基因b部分，优选Neo基因5’端部分是功能互补的，优选地，所述Neo基因5’端部分和所述Neo的3’端部分是在92位截断的，更优选地，新霉素的第92位氨基酸是由所述Neo基因5’端部分的末尾核苷酸和Neo基因的3’端部分的起始核苷酸共同编码的，更优选地，新霉素的第92位氨基酸是由所述Neo基因5’端部分的末尾2个核苷酸和Neo基因的3’端部分的起始处第一个核苷酸共同编码的，

并且所述步骤6)通过加入特异性针对所述抗性基因的试剂，优选抗生素G418来筛选基因组中定点整合了所述目的基因片段的所述受体细胞。

3.根据权利要求1或2的方法，其中在所述步骤1)中的所获得的包含目的基因片段的载体中，所述目的基因片段的上游存在FRT序列，同时在所述步骤4)中的表达盒中，在所述IRES-PuroR结构的下游存在FRT序列，

并且在所述步骤6)之后还包括步骤7)：将包含FLP的质粒转入所述受体细胞以除去所述表达盒。

4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述步骤1)中的目的基因片段包括原核和真核基因片段，优选为真核基因片段，其长度优选超过100kb，优选超过300kb,更优选超过400kb。

5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述步骤2)中所获得的包含目的基因片段的载体是环状载体。

6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述步骤2)中的所述载体是线性化载体，所述线性化载体优选为拥有被克隆目的DNA片段同源末端序列的线性化载体，更优选为线性化酵母穿梭载体。

7.根据权利要求5的方法，其中所述环状载体是通过同源重组拼接技术(优选酵母的转化偶联重组(TAR)技术)，或者同源重组拼接技术(优选酵母的转化偶联重组(TAR)技术)与基因组编辑技术的组合获得的。

8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中在所述步骤4)中使用酵母原生质球融合(yeast protoplast fusion)技术将将所述微生物内含有目的基因片段的所述载体导入到受体细胞。

9.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述步骤2)中的抗性表达盒1，优选截断型新霉素(G418)抗性表达盒1中的所述突变型Loxp 1和/或所述步骤4)中的抗性表达盒2，优选截断型新霉素(G418)抗性表达盒2中所述突变型Loxp 2用于将所述表达盒及其下游大片段DNA定点稳定地导入所述受体细胞的基因组中。

10.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述步骤2)中的抗性表达盒1，优选截断型新霉素(G418)抗性表达盒1中包含的HPRT内含子、抗性基因a部分，优选Neo基因3’端部分和所述步骤4)中的抗性表达盒2，优选截断型新霉素(G418)抗性表达盒2中包含的HPRT内含子、抗性基因b部分，优选Neo基因5’端部分，以及步骤5)中形成的表达完整抗性基因的抗性表达盒，优选新霉素Neo的新霉素(G418)抗性表达盒，用于筛选目的基因片段定点整合后的细胞重组子。

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