CN107058358B - 一种双spacer序列识别切割CRISPR-Cas9载体构建及其在疣孢菌中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双spacer序列识别切割CRISPR‑Cas9载体构建及其在疣孢菌中的应用。本发明提供了一种双spacer序列识别切割CRISPR‑Cas9载体构建方法，利用该方法成功构建了用于敲除海洋疣孢菌abyssomicin基因簇的双spacer序列识别切割CRISPR‑Cas9载体。通过实验证明：本发明构建的用于敲除海洋疣孢菌abyssomicin基因簇的双spacer序列识别切割CRISPR‑Cas9载体可成功敲除海洋疣孢菌abyssomicin基因簇。

Description

一种双spacer序列识别切割CRISPR-Cas9载体构建及其在疣 孢菌中的应用

技术领域

本发明属于基因组编辑技术领域，具体涉及一种双spacer序列识别切割CRISPR-Cas9载体构建及其在疣孢菌中的应用。

背景技术

疣孢菌属(Verrucosispora)属于小单孢菌目小单孢菌科(Micromonosporaceae)，是一类重要的“稀有放线菌”，其产生很多的活性次级代谢产物，如抗肿瘤细胞系活性的proximicins和抗结核分枝杆菌的abyssomicins等，这些化合物具有很好的成药潜力。然而海洋疣孢菌传统的基因敲除策略基本上是通过同源重组方式来实现的，整个过程周期长，工作量大，效率低且很难进行无痕敲除。抗性标记也会为之后对菌株的操作造成影响。

基于CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Small PalindromicRepeats)/Cas9系统的基因组编辑方法已经彻底改变了人类编辑基因组的历史。CRISPR/Cas9系统是原核生物中广泛存在的一套针对外源核酸分子入侵的适应性免疫系统，可以抵御噬菌体侵染，消灭偶然转化获得的质粒等。当细胞第一次被攻击后，入侵的DNA的部分序列有规律的整合到事先存在的CRISPR重复序列之间，称为间隔子(spacer)。当细胞再次受到攻击时，这段序列被一同转录为小分子RNA-crRNA(CRISPR RNA)。对于CRISPR II型系统，还存在一个小分子RNA-tracrRNA与crRNA形成二聚体，一同被加工、行使功能。与其他类型相比，CRISPR II型系统的结构是最紧凑的：唯一的蛋白酶CAS9在crRNA:tracrRNA双元分子的指导下入侵的DNA双链中形成R-loop。蛋白酶CAS9的两个内切酶活位点对DNA进行序列特异的切割。为了正确的识别外源DNA分子，spacer序列下游(5’-3’方向)存在PAM(Protospacer Adjacent Motif)基序5’-NGG-3’。为了便于载体构建，crRNA:tracrRNA双元分子可以融合为单个的sgRNA(single guide RNA)，其5’端20nt是负责识别特定基因的区域。这样只要同时表达CAS9蛋白和sgRNA就有可能实现基因组编辑。这种基于CRISPR/Cas9系统的技术不同于以往基于蛋白质的基因组编辑技术，CRISPR/Cas9系统对DNA进行特异的切割是由小分子RNA介导的，针对不同的靶标基因，只需要设计、替换不同的小分子RNA即可。

目前，已发表在放线菌中使用一个spacer序列识别并切割基因组的CRISPR/Cas9系统脱靶概率高，且通过同源重组修复后，部分基因由于重组到质粒上导致其功能不变，只能先进行质粒丢失工作再进行下一步工作。切割之后，放线菌有一定几率自身修复，也会导致基因无法删除。同时，已知双spacer一般进行基因全合成方式克隆，成本昂贵且时间较长，同时其使用同一种启动子和终止子，增加了质粒的不稳定性。故亟需开发一种构建成本低、稳定的双spacer序列识别切割放线菌基因组CRISPR-Cas9系统，提高基因组编辑效率。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种CRISPR-Cas9载体。

本发明提供的CRISPR-Cas9载体包括双spacer的sgRNA表达盒和CAS9蛋白表达盒；

所述双spacer的sgRNA表达盒表达名称为sgRNA1和名称为sgRNA2的两个sgRNA；

所述CAS9蛋白表达盒表达CAS9蛋白；

所述双spacer的sgRNA表达盒由名称分别为sgRNA1的表达盒和sgRNA2的表达盒连接而成；

所述sgRNA1的表达盒和所述sgRNA2的表达盒的转录方向相反。

上述CRISPR-Cas9载体中，所述sgRNA1的表达盒自上游至下游依次包括名称为启动子甲的启动子、sgRNA1的编码基因和名称为终止子甲的终止子；所述启动子甲启动所述sgRNA1的编码基因的表达；

所述sgRNA2的表达盒自上游至下游依次包括名称为终止子乙的终止子、sgRNA2的编码基因和名称为启动子乙的终止子；所述启动子乙启动所述sgRNA2的编码基因的表达；

所述CAS9蛋白表达盒自上游至下游依次包括名称为启动子丙的启动子、CAS9蛋白的编码基因和名称为终止子丙的终止子；所述启动子丙启动CAS9蛋白的表达；

所述启动子甲和所述启动子乙为不同或相同的启动子；

所述终止子甲和所述终止子乙为不同或相同的终止子。

上述CRISPR-Cas9载体中，

所述启动子甲具体为启动子ermE；所述启动子乙具体为启动子psf；所述启动子丙具体为启动子tipA；所述终止子甲具体为终止子Term21；所述终止子乙具体为终止子to；所述终止子丙具体为终止子fd。

上述CRISPR-Cas9载体中，

所述CRISPR-Cas9载体还包括靶基因的同源臂序列；

所述靶基因的同源臂序列位于所述CAS9蛋白表达盒的下游。

上述CRISPR-Cas9载体中，

所述靶基因为abyssomicin基因簇；

所述sgRNA1的编码基因序列为序列3第3120-3139位；

所述sgRNA2的编码基因序列为序列3第3649-3668位；

所述CAS9蛋白的编码基因序列为序列3第3933-8039位；

所述同源臂序列由同源左臂序列和同源右臂序列组成；

所述同源左臂序列为序列3第9219-11039位；

所述同源右臂序列为序列3第11040-12908位。

上述CRISPR-Cas9载体中，所述CRISPR-Cas9载体的核苷酸序列为序列3。

本发明的另一个目的是提供上述CRISPR-Cas9载体的新用途。

本发明提供了上述CRISPR-Cas9载体在敲除靶基因中的应用。

本发明还提供了上述CRISPR-Cas9载体在敲除放线菌靶基因中的应用。

上述应用中，所述放线菌为海洋疣孢菌；所述海洋疣孢菌为海洋疣孢菌MS100047。

本发明还有一个目的是提供上述CRISPR-Cas9载体的构建方法。

本发明提供的RISPR-Cas9载体的构建方法包括如下步骤：

(1)制备辅助克隆spacer的载体pHelp

所述辅助克隆spacer的载体pHelp包括名称为表达盒甲的表达盒，所述表达盒甲自上游至下游依次包括上述启动子甲、ncRNA1编码基因和上述终止子甲，所述ncRNA1编码基因含有限制性内切酶A的识别序列和限制性内切酶B的识别序列；

(2)制备转录sgRNA的载体pCRISPR–Cas9

所述转录sgRNA的载体pCRISPR–Cas9包括名称为表达盒乙的表达盒和上述CAS9蛋白表达盒，所述表达盒乙自上游至下游依次包括上述启动子乙、ncRNA2编码基因、上述终止子乙、限制性内切酶C的识别序列、抗性基因和限制性内切酶D的识别序列；所述ncRNA2编码基因含有限制性内切酶A的识别序列和限制性内切酶B的识别序列；

(3)制备带有限制性内切酶A的粘性末端、靶基因spacer序列1和限制性内切酶B的粘性末端的双链DNA分子甲；

制备带有限制性内切酶C的粘性末端、靶基因spacer序列2和限制性内切酶D的粘性末端的双链DNA分子乙；

(4)将所述双链DNA分子甲通过酶切连接替换所述辅助克隆spacer的载体pHelp中所述限制性内切酶A和所述限制性内切酶B之间的片段，得到含有双链DNA分子甲的辅助克隆spacer的载体pHelp，其含有上述sgRNA1的表达盒；

将所述双链DNA分子乙通过酶切连接替换所述转录sgRNA的载体pCRISPR–Cas9中所述限制性内切酶A和所述限制性内切酶B之间的片段，得到含有双链DNA分子乙的转录sgRNA的载体pCRISPR–Cas9，其含有上述sgRNA2的表达盒；

(5)将所述含有双链DNA分子甲的辅助克隆spacer的载体pHelp中所述sgRNA1的表达盒替换所述含有双链DNA分子乙的转录sgRNA的载体pCRISPR–Cas9中所述限制性内切酶C和所述限制性内切酶D之间的片段，得到CRISPR-Cas9载体。

上述方法中，

所述步骤(4)和步骤(5)之间还包括将靶基因的同源臂序列插入所述含有双链DNA分子乙的转录sgRNA的载体pCRISPR–Cas9中的步骤；

上述方法中，所述步骤(4)包括如下步骤：

用限制性内切酶A和限制性内切酶B酶切所述辅助克隆spacer的载体pHelp，得到带有限制性内切酶A的粘性末端和限制性内切酶B的粘性末端的载体骨架A；再将所述双链DNA分子甲与所述载体骨架A连接；

用限制性内切酶A和限制性内切酶B酶切所述转录sgRNA的载体pCRISPR–Cas9，得到带有限制性内切酶A的粘性末端和限制性内切酶B的粘性末端的载体骨架B；再将所述双链DNA分子乙与所述载体骨架B连接；

上述方法中，所述限制性内切酶A具体为NcoⅠ；所述限制性内切酶B具体为XbaⅠ；所述限制性内切酶C具体为SpeⅠ；所述限制性内切酶D具体为NheⅠ。

上述方法中，所述靶基因spacer序列1为序列4；所述靶基因spacer序列2为序列5。

本发明还有一个目的是提供上述辅助克隆spacer的载体pHelp和/或上述转录sgRNA的载体pCRISPR–Cas9。

上述辅助克隆spacer的载体pHelp和/或上述转录sgRNA的载体pCRISPR–Cas9在敲除靶基因中的应用也属于本发明的保护范围。

上述辅助克隆spacer的载体pHelp和/或上述转录sgRNA的载体pCRISPR–Cas9在敲除放线菌靶基因中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的最后一个目的是提供一种用于敲除靶基因的成套产品。

本发明提供的成套产品包括上述辅助克隆spacer的载体pHelp和/或上述转录sgRNA的载体pCRISPR–Cas9。

上述成套产品在敲除靶基因中的应用也属于本发明的保护范围。

上述成套产品在敲除放线菌靶基因中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的有益效果在于：

1.本发明提供的双spacer技术相比现有的直接全合成两个sgRNA以及其启动子和终止子的策略有成本上的优势。

2.本发明提供的双spacer技术选用不同的启动子和终止子，并且其在载体上反向排列，增加了质粒的稳定性。

3.本发明提供的双spacer基因删除技术可以在海洋疣孢菌中删除掉约61kb的长片段基因。

4.海洋疣孢菌中次级代谢产物基因簇丰富，通过本研究对abyssomicin基因簇进行敲除工作，可以更好地对其他基因簇进行研究，检测其他次级代谢产物的产生。

本发明提供了一种双spacer序列识别切割CRISPR-Cas9载体构建方法，利用该方法成功构建了用于敲除海洋疣孢菌abyssomicin基因簇的双spacer序列识别切割CRISPR-Cas9载体。通过实验证明：本发明构建的用于敲除海洋疣孢菌abyssomicin基因簇的双spacer序列识别切割CRISPR-Cas9载体可成功敲除海洋疣孢菌abyssomicin基因簇。

附图说明

图1为pHelp质粒载体图谱。

图2为改造的pCRISPR–Cas9质粒载体图谱。

图3为aby基因簇敲除PCR验证图。第一个泳道为marker，第二个泳道为野生型菌株左臂PCR结果，第三个泳道为突变菌株左臂PCR结果，第四个泳道为野生型菌株右臂PCR结果，第五个泳道为突变菌株右臂PCR结果。

图4为aby基因簇敲除发酵结果HPLC图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下面结合附图对本发明作进一步说明：

下述实施例中的海洋疣孢菌MS100047记载于如下文献：Anti-MRSA and anti-TBmetabolites from marine-derived Verrucosispora sp.MS100047,Appl MicrobiolBiotechnol(2016)100:7437–7447，公众可从中科院微生物所获得。

下述实施例中的Ver01培养基的配方如下：可溶性淀粉10g，葡萄糖10g，甘油10g，玉米粉2.5g，蛋白胨(Difco)5g，酵母提取物(OXOID)2g，氯化钠1g，使用1L蒸馏水充分溶解，调节pH到7.5，再加入3g碳酸钙。固体Ver01培养基再加入20g琼脂。

下述实施例中的高天培养基的配方如下：可溶性淀粉20g，L-天冬素5g，氯化钠5g，MgSO₄·7H₂O 5g，KNO₃ 1g，K₂HPO₄·H₂O 5g，使用1L蒸馏水充分溶解，调节pH到7.5，加入1g碳酸钙。高天固体培养基再加入20g琼脂。

下述实施例中的E.coli ET12567/pUZ8002感受态细胞由英国john inners研究所免费提供科学界使用，参考<practical streptomyces genetics>，记载于如下文献：A newsalicylate synthase AmS is identified for siderophores biosynthesis inAmycolatopsis methanolica 239，公众可从中科院微生物所获得。

实施例1、一种双spacer序列识别切割CRISPR-Cas9载体的构建及其在疣孢菌中的应用

一、双spacer序列识别切割CRISPR-Cas9载体的构建

1、改造辅助克隆spacer的载体pHelp

改造辅助克隆转录sgRNA的载体pHelp通过包括如下步骤的方法进行：突变辅助克隆表达spacer载体，在其中加入启动子psf和终止子Term21，启动子psf和终止子Term21中间含有转录sgRNA的元件和酶切识别位点NcoI和XbaI，可以通过粘性末端酶切连接的方式插入spacer序列，得到改造后辅助克隆spacer的载体pHelp(简称改造后pHelp载体)。质粒图谱见附图1，从图中可以看出：改造后pHelp载体包含表达盒甲，表达盒甲自上游至下游依次包括启动子psf，ncRNA1编码基因以及终止子Term21，ncRNA1编码基因中含有限制性内切酶NcoI和XbaI的识别序列，可用于将spacer序列克隆至改造后pHelp载体。

改造后pHelp载体的核苷酸序列如序列1所示。表达盒甲的核苷酸序列为序列1第408-614位，其中，序列1第408-459位为启动子psf的核苷酸序列、第466-547位为ncRNA1编码基因，第554-614位为终止子Term21的核苷酸序列。

2、改造转录sgRNA的载体pCRISPR–Cas9

改造转录sgRNA的载体通过包括如下步骤的方法进行：突变转录sgRNA的载体中终止子后的序列，在其中引入氨苄青霉素抗性基因序列，同时在抗性基因序列两端引入酶切位点NheI和SpeI，得到改造后转录sgRNA的载体pCRISPR–Cas9(简称改造后pCRISPR–Cas9载体)。质粒图谱见附图2。从图中可以看出：改造后pCRISPR–Cas9载体自上游至下游依次包括表达盒乙、限制性内切酶SpeI的识别序列、氨苄青霉素抗性基因序列Amp-Operon和限制性内切酶NheI的识别序列；表达盒乙自上游至下游依次包括启动子ermE、ncRNA2编码基因和终止子to，ncRNA2编码基因中含有限制性内切酶NcoI和XbaI的识别序列。

改造后pCRISPR–Cas9载体的核苷酸序列如序列2所示。表达盒乙的核苷酸序列为序列2第3000-3384位，其中，序列2第3000-3113位为启动子ermE的核苷酸序列、第3120-3201位为ncRNA2编码基因，第3214-3384位为终止子to的核苷酸序列。限制性内切酶SpeI的识别序列为序列2第3418-3423位、氨苄青霉素抗性基因序列Amp-Operon为序列2第3424-4498位，限制性内切酶NheI的识别序列为序列2第4499-4504位。

3、靶序列spacer的设计及合成

针对abyssomicin合成基因簇设计的spacer序列如下：5’-gctacggcatcgacctgacc-3’(序列4)和5’-gggagatcgtgacgtcgagt-3’(序列5)。设计的具体步骤如下：

1)选择以5’-NGG-3’结尾的23nt序列，包含spacer的20nt和PAM的3nt，将包含连续五个T的序列排除；其中，N是A或T或C或G；

2)将3’端的15个碱基，包含spacer的12nt和PAM的3nt，用BOWTIE进行序列比对，排除有多个比对位置的序列；

3)将BOWTIE生成的文件进行分析，去除非特异识别的spacer。

最终合成两对单链DNA分子。每对单链DNA分子中的两条spacer退火形成带有NcoI和XbaI粘性末端的双链DNA分子。两对单链DNA分子的序列如下(下划线标记的碱基为粘性末端)：

aby-sp1-F(正向引物)：catgggctacggcatcgacctgaccgttttagag；

aby-sp1-R(反向引物)：ctagctctaaaacggtcaggtcgatgccgtagcc；

aby-sp2-F(正向引物)：catgggggagatcgtgacgtcgagtgttttagag；

aby-sp2-R(反向引物)：ctagctctaaaacactcgacgtcacgatctcccc。

4、spacer克隆至改造后pHelp载体和pCRISPR–Cas9载体

1)用限制性内切酶NcoⅠ和XbaⅠ分别对改造后pHelp载体和改造后pCRISPR–Cas9载体进行酶切，分别得到带有限制性内切酶NcoⅠ的粘性末端和限制性内切酶XbaⅠ的粘性末端的骨架载体pHelp和骨架载体pCRISPR–Cas9，酶切体系(30μL)如下：NcoⅠ2μL、XbaⅠ2μL、改造后pHelp/pCRISPR-Cas9 15μL、ddH₂O 11μL。混匀离心后于37℃水浴，酶切4h以上。

2)将步骤3中设计并合成的单链DNA片段aby-sp1-F和aby-sp1-R进行退火反应，形成带有粘性末端NcoⅠ和XbaⅠ的双链DNA分子spacer1。

将步骤3中设计并合成的单链DNA片段aby-sp2-F和aby-sp2-R进行退火反应，形成带有粘性末端NcoⅠ和XbaⅠ的双链DNA分子spacer2。

上述退火反应体系(10μL)如下：F(正向引物)2μL、R(反向引物)2μL、10x cutsmartbuffer 1μL、ddH₂O 5μL。混匀离心后于放入沸水中，自然冷却，进行退火反应。

3)分别将两个双链DNA分子和骨架载体进行连接，连接体系如下：Solution I(takara)2μL、片段1.8μL、载体骨架0.2μL。25℃金属浴恒温30min，将spacer连接到载体上，分别得到pHelp-spacer1载体和pCRISPR–Cas9-spacer2载体。转化大肠杆菌后，通过测序到筛选正确质粒。

测序结果表明：pHelp-spacer1载体为将双链DNA分子spacer1替换改造后pHelp载体的NcoⅠ和XbaⅠ酶切位点间的DNA片段，且保持改造后pHelp载体的其他序列不变得到的载体。pHelp-spacer1载体含有sgRNA1的编码基因。

pCRISPR–Cas9-spacer2载体为将双链DNA分子spacer2替换改造后pCRISPR–Cas9载体的NcoⅠ和XbaⅠ酶切位点间的DNA片段，且保持改造后pCRISPR–Cas9载体的其他序列不变得到的载体。pCRISPR–Cas9-spacer2载体含有sgRNA2的表达盒。

5、同源臂插入pCRISPR–Cas9-spacer2载体

1)设计同源左右臂引物，在左右臂引物5’端分别加入20bp的同源序列，以便于后续利用Gibbson连接一步将左右臂连接至载体上，左右臂引物分别为：

ABY-L-F：TCTCGTCGAAGGCACTAGAAGGTCATCGTGGACGCCGCTGCCCTC；

ABY-L-R：GTGGGCGGCATCGTCCATGCTGTT；

ABY-R-F：AGCATGGACGATGCCGCCCACCATGGATGGTTGTTATCGCCGTGTCGG；

ABY-R-R：GCGGTCGATCCCCGCATATAGGCTGGTTCTTCACGATGAGGTCGCCGCT。

2)以海洋疣孢菌MS100047基因组为模板，采用步骤1)设计的特异性引物进行PCR，分别扩增出同源左臂和同源右臂，PCR反应体系如下：Primer F1μL、Primer R1μL、5xReaction buffer 5μL、5×high-GC enhancer 5μL、dNTP 2μL、模板DNA 1μL、Q5 0.2μL、ddH₂O 9.8μl。充分混匀后，使用PCR仪进行反应，反应条件为：1.预变性温度98℃，时间2分钟；2.变性温度98℃，30秒，退火温度72℃(根据每对引物的不同适量调整)，30秒，延伸温度72℃，40秒(20sec/kb)，总共30个循环；3.延伸温度72℃，延伸10分钟。反应结束后，使用1％琼脂糖凝胶电泳，回收产物。

3)使用限制性内切酶Stu I酶切pCRISPR–Cas9-spacer2载体，得到线性化的pCRISPR–Cas9-spacer2载体。酶切反应体系(30μL)如下：Stu I 1μL、pCRISPR–Cas9-spacer2 15μL、ddH₂O 14μL。混匀离心后于37℃水浴，酶切4h以上，使用1％琼脂糖凝胶电泳，回收产物。

4)将线性化的pCRISPR–Cas9-spacer2载体、同源左臂和同源右臂连接，得到pCRISPR-LR-Cas9-spacer2载体。连接反应体系如下：pCRISPR–Cas9-spacer2载体2μL、L(左臂)2μL、R(右臂)2μL、2x一步克隆试剂6μL。50℃恒温60min，转化大肠杆菌中，验证，并提取质粒测序。

6、将pHelp-spacer1载体上的spacer连接到pCRISPR-LR-Cas9-spacer2载体

1)用限制性内切酶SpeⅠ和NheⅠ对pCRISPR-LR-Cas9-spacer2载体进行酶切，得到骨架载体。酶切反应体系(30μL)如下：SpeⅠ2μL、NheⅠ2μL、pCRISPR-LR-Cas9-spacer215μL、ddH₂O 11μL。混匀离心后于37℃水浴，酶切4h以上，使用1％琼脂糖凝胶电泳，回收产物。

2)以pHelp-spacer1载体为模板，采用设计的通用引物pHelp-F和pHelp-R进行PCR扩增，得到PCR产物，其含有sgRNA1的表达盒。pHelp-F和pHelp-R引物序列如下：

pHelp-F：GTCCAGTAATGACCTCAGCGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC；

pHelp-R：GCGTTCTGAACAAATCCAGAGCGGATAACAATTTCACACAGG。

3)将1)获得的骨架载体和2)中所获得的DNA片段连接，得到敲除质粒，即双spacer序列识别切割CRISPR-Cas9载体。并对其进行测序验证。

敲除质粒的核苷酸序列为序列3。敲除质粒依次包括双spacer的sgRNA表达盒、CAS9蛋白表达盒和靶基因的同源臂序列。

双spacer的sgRNA表达盒含有sgRNA1的表达盒和sgRNA2的表达盒。sgRNA1的表达盒自上游至下游依次包括启动子ermE的核苷酸序列，sgRNA1的编码基因、终止子to的核苷酸序列，其中，启动子ermE的核苷酸序列为序列3第3000-3113位，sgRNA1的编码基因序列为序列3第3120-3139位、终止子to的核苷酸序列为序列3第3234-3404位。sgRNA2的表达盒自上游至下游依次包括终止子Term21的核苷酸序列、sgRNA2的编码基因和启动子psf的核苷酸序列，其中，终止子Term21的核苷酸序列为序列3第3500-3560位、sgRNA2的编码基因为序列3第3649-3668位、启动子psf的核苷酸序列为序列3第3675-3726位。

CAS9蛋白表达盒自上游至下游依次包括用于启动CAS9蛋白的启动子tipA的核苷酸序列、CAS9蛋白的编码基因和终止子fd，其中，用于启动CAS9蛋白的启动子tipA的核苷酸序列为序列3第3800-3900位、CAS9蛋白的编码基因序列为序列3第3933-8039位、终止子fd的核苷酸序列为序列3第8087-9195位。

靶基因的同源臂序列包括靶基因同源左臂的核苷酸序列和靶基因同源右臂的核苷酸序列。靶基因同源左臂的核苷酸序列为序列3第9219-11039位、靶基因同源右臂的核苷酸序列为序列3的第11040-12908位。

二、双spacer序列识别切割CRISPR-Cas9载体在敲除海洋疣孢菌aby基因簇中的应用

1、aby敲除菌株的制备

将步骤一制备的敲除质粒(双spacer序列识别切割CRISPR-Cas9载体)导入海洋疣孢菌MS100047中，敲除海洋疣孢菌的aby基因簇，得到aby敲除菌株。具体步骤如下：

1)将敲除质粒转化E.coli ET12567/pUZ8002感受态细胞，E.coli ET12567/pUZ8002自身需要卡那霉素和氯霉素筛选抗性，故而筛选平板需要相应抗生素和卡那霉素、氯霉素作为筛选条件，37℃培养12-16h。

2)待三抗的平板长出克隆后，验证，挑取单克隆接种到对应的三抗LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L)中，进行扩大培养。

3)将过夜培养的细胞按1％的比例接种于新鲜的三抗LB液体培养基中，在37℃条件下摇箱培养，待OD600达到0.4-0.6时，离心收集细胞，并用无抗的LB液体培养基洗涤菌体三次，除去携带的抗生素，得到大肠杆菌菌液，待用。

4)挑取活化在平板上的海洋疣孢菌MS100047单克隆接种于加有弹簧的40mLVer01培养基中培养3天，8000rpm离心1min富集菌丝体，使用孢子过滤器过滤，收集分散度好的菌体，使用10％甘油清洗菌体两次，得到菌丝体悬液，备用。

5)将步骤3)制备得到的大肠杆菌菌液和步骤4)制备得到的菌丝体悬液在1.5mL离心管中混匀，均匀涂布于加有10mM MgCl₂的高天固体培养基，28℃培养；

6)培养16-20h后，取1mL无菌水加入1mg萘啶酮酸、相应浓度质粒携带抗性基因的抗生素。使含有这两种抗生素的无菌水均匀覆盖平板，通风橱下吹干后，密封好置于28℃培养10-15d，直到有可见的转化子长出。

7)挑取长出的克隆划线于加有50mg/L硫酸安普霉素和10mg/L硫链丝菌肽的Ver01固体培养基，置于28℃培养约3-5d，挑取长出的克隆，再次挑取单克隆到相同抗生素的培养基上，选取在平板上长势良好的突变菌株，即为aby敲除菌株，并将其命名为海洋疣孢菌MS100047△aby。

海洋疣孢菌MS100047△aby为将海洋疣孢菌MS100047中的aby基因簇敲除，且保持海洋疣孢菌MS100047基因组其他序列不变得到的菌。

2、aby敲除菌株的PCR鉴定

1)提取aby敲除菌株的基因组DNA

选取在平板上长势良好的aby敲除菌株和野生菌株(海洋疣孢菌MS100047)，提取基因组DNA。具体步骤如下：挑取适量菌体到1.5mL的EP管中，加入180μL溶菌酶溶液处理过夜；过夜处理的体系中加入2μl蛋白酶K溶液(蛋白酶K终浓度为0.18mg/ml)，混匀，再加入1μl 10％的SDS(SDS终浓度为0.5％)，充分混匀，55℃处理1-2h，每10-15min缓慢颠倒混匀反应体系。加入1μL RNase溶液(RNase终浓度为0.09mg/mL)37℃处理0.5h；加入36μL 5M NaCl(NaCl终浓度为0.8M)，缓慢充分混匀；加入20μL CTAB/NaCl，充分混匀并且55℃下孵育10min；冷却至室温，加入5ml苯酚/氯仿/异戊醇，缓慢反复颠倒约10-15min；20℃下13,500g离心15min；吸取上清，用等体积氯仿/异戊醇抽提，缓慢反复颠倒约10-15min，13,500g离心15min；吸取上清至干净管子中，加入0.6倍体积异丙醇，颠倒混匀后，13,500g离心15min，除去上清，使用70％乙醇清洗沉淀两次，晾干后，使用50μL水溶解。

2)PCR验证

分别以海洋疣孢菌MS100047△aby和海洋疣孢菌MS100047的基因组DNA为模板，选取同源左臂5’端外面一段序列和同源右臂5’端内部一段序列作为引物对甲(F1:cgctggtccgatctagcacc和R1:gaacgcccgctatccacg)，同源左臂3’端内部一段序列和同源右臂3’端外部一段序列作为引物对乙(F2:cggtgtcacgccctgctc和R2:cggtgttgatgctcgcgc)进行PCR。PCR反应体系如下：Primer F 0.5μL、Primer R 0.5μL、2×High-GC PCR StarMixwith Loading Dye 5μL、模板DNA 0.5μL、ddH₂O 3.5μL。PCR反应条件为：预变性温度95℃，时间5分钟；变性温度95℃，30秒，退火温度60℃，30秒，延伸温度72℃，120秒(60秒/kb)，总共30个循环；延伸温度72℃，延伸10分钟。待反应结束后，取5μL样品点样于1.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，检测PCR产物大小是否正确。

结果如图3所示：从图中可以看出：引物对甲和引物对乙在野生型菌株海洋疣孢菌MS100047中均没有PCR条带产生，而在海洋疣孢菌MS100047△aby中均扩增出约2kb条带，说明aby基因簇被成功敲除。

3、aby敲除菌株的发酵鉴定

1)菌株发酵：分别将aby敲除菌株和野生菌株(海洋疣孢菌MS100047)接种到40mLVer01培养基中作为种子液培养3天，之后将种子液按照5％(V/V)接种量接种于Ver01液体培养基，在28℃、200rpm条件下发酵培养8d，分别得到发酵液(MS100047△aby)和发酵液(MS100047)。

2)产物处理：用等体积乙酸乙酯萃取步骤1)获得的发酵液，之后将乙酸乙酯相减压蒸馏，使用甲醇重新溶解，经0.22μm滤膜过滤后，使用HPLC分析发酵液(MS100047△aby)和发酵液(MS100047)中的产物变化。本实验中使用的HPLC系统是Agilent 1200seriesHPLCsystem。检测器是紫外和可见光谱的diode array detector(DAD)检测器。对于Proximicins的检测波长选用254nm吸收。分析色谱柱选用ZORBAX SB‐CN column(4.6mm×150mm,Agilent)，水、乙腈和0.1％三氟乙酸乙腈作为流动相，分析条件为：进样体积40μL，流速1.0mL/min，0.1％三氟乙酸乙腈浓度为10％不变，前15min乙腈相浓度由0％增加到45％，然后45％浓度维持10min，随后乙腈浓度在5min内梯度上升到90％，90％乙腈维持5min，再在1min内降至0％，维持5min结束。

HPLC检测结果如图4所示，和发酵液(MS100047)中的产物相比，发酵液(MS100047△aby)中的多环聚酮类抗生素abyssomicin的产量消失了，说明aby基因簇确实已经被成功敲除。

序列表

<110>中国科学院微生物研究所 安徽大学

<120>一种双 spacer序列识别切割CRISPR-Cas9 载体构建及其在疣孢菌中的应用

<160>5

<210>1

<211>2860bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgctagcata tgccttgacc 420

ttgatgaggc ggcgtgagct acaatcaata ctcgattagc catgggtttt aggtctagaa 480

atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg 540

cttttttctg cagctcggta ccaaattcca gaaaagaggc ctcccgaaag gggggccttt 600

tttcgttttg gtccactagt aagcttggcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga 660

aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc 720

tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc 780

cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc 840

ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt 900

cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca 960

ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa 1020

aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat 1080

cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 1140

cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc 1200

gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt 1260

tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac 1320

cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg 1380

ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca 1440

gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc 1500

gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa 1560

accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa 1620

ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac 1680

tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta 1740

aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt 1800

taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata 1860

gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc 1920

agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac 1980

cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag 2040

tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac 2100

gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc 2160

agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg 2220

gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc 2280

atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct 2340

gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc 2400

tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc 2460

atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc 2520

agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc 2580

gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca 2640

cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt 2700

tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt 2760

ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca 2820

ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc 2860

<210>2

<211>13129bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

ggccgtcgac gacgacgcgt ccgcctgcct gcttttggcc ggcgggccgg gccgcggttg 60

tccgccgggt cggaccggtc ccttggtcga ccgatgcctc ggccacgacg atgctgggcc 120

cgaagcggta cgcgacccgt gccgggccgc agcggatcgc ggcagcagga gctccccgcc 180

cgccacggct ggctggatgg tcgcctcacg cgcccgcagg ggtgacggcg tgggtgcggc 240

ggtcagcccc gtgatcgggc gtcagacggc cgctgaggga ccgcgaccac ccctcccttc 300

ccgcctgccg tctttcaccg cccggccggt ccgcagacgc cgtacggcca ggccacggag 360

gattacgggc agatggcgcc cacccggcac ccgggctggg gcaccctgga cagcacgaag 420

gtccgcccca ctcaccgggg cgggccttcg cgttgagcta gagttcccgc cagcctcgca 480

gagcaggatt cccgttgagc accgccaggt gcgaataagg gacagtgaag aaggaacacc 540

cgctcgcggg tgggcctact tcacctatcc tgcccggctg acgccgttgg atacaccaag 600

gaaagtctac acgaaccctt tggcaaaatc ctgtatatcg tgcgaaaaag gatggatata 660

ccgaaaaaat cgctataatg accccgaagc agggttatgc agcggaaaat gcagctcacg 720

gtaactgatg ccgtatttgc agtaccagcg tacggcccac agaatgatgt cacgctgaaa 780

atgccggcct ttgaatgggt tcatgtgcag ctccataagc aaaaggggat gataagttta 840

tcaccaccga ctatttgcaa cagtgccgtt gatcgtgcta tgatcgactg atgtcatcag 900

cggtggagtg caatgtcgtg caatacgaat ggcgaaaagc cgagctcatc ggtcagcttc 960

tcaaccttgg ggttaccccc ggcggtgtgc tgctggtcca cagctccttc cgtagcgtcc 1020

ggcccctcga agatgggcca cttggactga tcgaggccct gcgtgctgcg ctgggtccgg 1080

gagggacgct cgtcatgccc tcgtggtcag gtctggacga cgagccgttc gatcctgcca 1140

cgtcgcccgt tacaccggac cttggagttg tctctgactc attctggcgc ctgccaaatg 1200

taaagcgcag cgcccatcca tttgcctttg cggcagcggg gccacaggca gagcagatca 1260

tctctgatcc attgcccctg ccacctcact cgcctgcaag cccggtcgcc cgtgtccatg 1320

aactcgatgg gcaggtactt ctcctcggcg tgggacacga tgccaacacg acgctgcatc 1380

ttgccgagtt gttggcaaag gttccctatg gggtgccgag acactgcacc attcttcagg 1440

atggcaagtt ggtacgcgtc gattatctcg agaatgacca ctgctgtgag cgctttgcct 1500

tggcggacag gtggctcaag gagaagagcc ttcagaagga aggtccagtc ggtcatgcct 1560

ttgctcggtt gatccgctcc cgcgacattg tggcgacagc cctgggtcaa ctgggccgag 1620

atccgttgat cttcctgcat ccgccagagg cgggatgcga agaatgcgat gccgctcgcc 1680

agtcgattgg ctgagctcat aagttcctat tccgaagttc ctattcgaaa tgaccgacca 1740

agcgacgccc aacctgccat cacgagattt cgattccacc gccgccttct atgaaaggtt 1800

gggcttcgga atcgttttcc gggacgccgg ctggatgatc ctccagcgcg gggatctcat 1860

gctggagttc ttcgcccacc ccaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat 1920

gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat 1980

caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa 2040

accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa 2100

ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtt cttctagtgt agccgtagtt 2160

aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt 2220

accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata 2280

gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt cgtgcacaca gcccagcttg 2340

gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg 2400

cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag 2460

cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc 2520

cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa 2580

aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg 2640

ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct 2700

gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa 2760

gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg 2820

cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttag 2880

ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat gttgtgtgga 2940

attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg acatgattac gaattgtacg 3000

cggtcgatct tgacggctgg cgagaggtgc ggggaggatc tgaccgacgc ggtccacacg 3060

tggcaccgcg atgctgttgt gggcacaatc gtgccggttg gtaggatcga cggccatggg 3120

ttttaggtct agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg 3180

gcaccgagtc ggtgcttttt ttacgtaggc gtcagctacg atgttccggg gactgctgat 3240

ccggtcagca ggtggaagag ggactggatt ccaaagttct caatgctgct tgctgttctt 3300

gaatgggggg tcgttgacga cgacatggct cgattggcgc gacaagttgc tgcgattctc 3360

accaataaaa aacgcccggc ggcaaccgag cgttctgaac aaatccagat ggagttcact 3420

agttgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca 3480

tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc 3540

aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc 3600

acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt 3660

acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt 3720

ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg 3780

ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact 3840

caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg 3900

ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga 3960

aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg 4020

aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa 4080

tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac 4140

aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc 4200

cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca 4260

ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga 4320

gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta 4380

agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc 4440

atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatgc 4500

tagctgaggt cattactgga ccggatcggg gatctgggct gagggagccg acggcacgcg 4560

gcggctcacg gcgtggcacg cggaacgtcc gggcttgcac ctcacgtcac gtgaggaggc 4620

agcgtggacg gcgtcagaga agggagcgga catatggaca agaagtactc catcggcctc 4680

gacatcggca ccaactccgt gggctgggcg gtcatcaccg acgagtacaa ggtcccctcc 4740

aagaagttca aggtcctggg caacaccgac cggcactcga tcaagaagaa cctgatcggc 4800

gccctgctct tcgacagcgg cgagaccgcc gaggcgaccc gcctgaagcg gaccgcgcgt 4860

cgccgctaca cccggcgcaa gaaccgcatc tgctacctgc aggaaatctt ctccaacgag 4920

atggccaagg tggacgactc gttcttccac cgcctggagg agagcttcct ggtggaggag 4980

gacaagaagc acgagcgcca cccgatcttc ggcaacatcg tggacgaggt ggcctaccac 5040

gagaagtacc ccaccatcta ccacctccgc aagaagctgg tggactcgac cgacaaggcg 5100

gacctgcggc tcatctacct ggccctcgcg cacatgatca agttccgcgg ccacttcctc 5160

atcgagggcg acctgaaccc ggacaactcc gacgtggaca agctcttcat ccagctggtg 5220

cagacctaca accagctgtt cgaggagaac cccatcaacg ccagcggcgt ggacgccaag 5280

gcgatcctct ccgcgcgcct gagcaagtcc cggcgcctgg agaacctcat cgcccagctg 5340

ccgggcgaga agaagaacgg cctcttcggc aacctgatcg cgctgtcgct cggcctgacc 5400

cccaacttca agagcaactt cgacctggcc gaggacgcga agctccagct gtccaaggac 5460

acctacgacg acgacctgga caacctgctc gcccagatcg gcgaccagta cgcggacctc 5520

ttcctggccg cgaagaacct ctcggacgcc atcctgctca gcgacatcct gcgggtcaac 5580

accgagatca ccaaggcccc gctgtcggcg agcatgatca agcggtacga cgagcaccac 5640

caggacctga ccctgctcaa ggccctcgtg cgccagcagc tgcccgagaa gtacaaggaa 5700

atcttcttcg accagtccaa gaacggctac gccggctaca tcgacggcgg cgcgtcgcag 5760

gaggagttct acaagttcat caagccgatc ctggagaaga tggacggcac cgaggagctg 5820

ctcgtcaagc tgaaccgcga ggacctgctc cgcaagcagc ggaccttcga caacggctcc 5880

atcccgcacc agatccacct gggcgagctc cacgccatcc tccggcgcca ggaggacttc 5940

taccccttcc tgaaggacaa ccgcgagaag atcgagaaga tcctgacctt ccgcatcccg 6000

tactacgtcg gccccctggc ccgcggcaac tcccggttcg cgtggatgac ccggaagtcg 6060

gaggagacca tcaccccgtg gaacttcgag gaggtcgtgg acaagggcgc gtccgcgcag 6120

tcgttcatcg agcgcatgac caacttcgac aagaacctcc cgaacgagaa ggtcctgccc 6180

aagcactccc tgctctacga gtacttcacc gtgtacaacg agctgaccaa ggtcaagtac 6240

gtgaccgagg gcatgcggaa gccggccttc ctgtcgggcg agcagaagaa ggcgatcgtg 6300

gacctgctct tcaagaccaa ccgcaaggtc accgtgaagc agctgaagga ggactacttc 6360

aagaagatcg agtgcttcga ctccgtcgag atcagcggcg tggaggaccg cttcaacgcc 6420

tccctgggca cctaccacga cctgctcaag atcatcaagg acaaggactt cctcgacaac 6480

gaggagaacg aggacatcct ggaggacatc gtcctcaccc tgaccctctt cgaggaccgc 6540

gagatgatcg aggagcggct caagacctac gcccacctgt tcgacgacaa ggtgatgaag 6600

cagctgaagc gtcgccgcta caccggctgg ggccgcctct cccggaagct gatcaacggc 6660

atccgggaca agcagagcgg caagaccatc ctggacttcc tcaagtccga cggcttcgcc 6720

aaccgcaact tcatgcagct catccacgac gacagcctga ccttcaagga ggacatccag 6780

aaggcccagg tctcgggcca gggcgacagc ctccacgagc acatcgccaa cctggcgggc 6840

tccccggcga tcaagaaggg catcctccag accgtcaagg tcgtggacga gctggtcaag 6900

gtgatgggcc gccacaagcc cgagaacatc gtgatcgaga tggcccggga gaaccagacc 6960

acccagaagg gccagaagaa ctcgcgcgag cggatgaagc ggatcgagga gggcatcaag 7020

gagctcggca gccagatcct gaaggagcac ccggtcgaga acacccagct gcagaacgag 7080

aagctgtacc tctactacct gcagaacggc cgcgacatgt acgtggacca ggagctcgac 7140

atcaaccggc tgtccgacta caacgtggac cacatcgtgc cgcagtcctt cctgaaggac 7200

gactcgatcg acaacaaggt cctgacccgc tcggacaaga accggggcaa gtccgacaac 7260

gtgccctcgg aggaggtcgt gaagaagatg aagaactact ggcgccagct gctcaacgcc 7320

aagctcatca cccagcgcaa gttcgacaac ctgaccaagg ccgagcgggg cggcctgagc 7380

gagctcgaca aggcgggctt catcaagcgc cagctggtcg agacccggca gatcaccaag 7440

cacgtggccc agatcctgga ctcccggatg aacaccaagt acgacgagaa cgacaagctg 7500

atccgcgagg tcaaggtgat caccctcaag agcaagctgg tctccgactt ccgcaaggac 7560

ttccagttct acaaggtccg ggagatcaac aactaccacc acgcccacga cgcgtacctg 7620

aacgccgtcg tgggcaccgc gctgatcaag aagtacccga agctggagtc cgagttcgtc 7680

tacggcgact acaaggtcta cgacgtgcgc aagatgatcg ccaagagcga gcaggagatc 7740

ggcaaggcca ccgcgaagta cttcttctac tccaacatca tgaacttctt caagaccgag 7800

atcaccctgg ccaacggcga gatccgcaag cggcccctga tcgagaccaa cggcgagacc 7860

ggcgagatcg tctgggacaa gggccgcgac ttcgccaccg tccggaaggt gctgtcgatg 7920

ccgcaggtca acatcgtgaa gaagaccgag gtgcagaccg gcggcttcag caaggagtcc 7980

atcctcccca agcgcaacag cgacaagctg atcgcccgga agaaggactg ggacccgaag 8040

aagtacggcg gcttcgacag ccccaccgtc gcctactccg tgctggtcgt ggcgaaggtc 8100

gagaagggca agagcaagaa gctgaagtcc gtgaaggagc tgctcggcat caccatcatg 8160

gagcgctcct cgttcgagaa gaacccgatc gacttcctgg aggccaaggg ctacaaggag 8220

gtcaagaagg acctcatcat caagctgccc aagtacagcc tgttcgagct ggagaacggc 8280

cgcaagcgga tgctcgcctc cgcgggcgag ctgcagaagg gcaacgagct ggccctcccg 8340

tcgaagtacg tcaacttcct gtacctcgcg tcccactacg agaagctgaa gggctcgccc 8400

gaggacaacg agcagaagca gctcttcgtg gagcagcaca agcactacct ggacgagatc 8460

atcgagcaga tcagcgagtt cagcaagcgc gtcatcctgg ccgacgcgaa cctcgacaag 8520

gtgctgtccg cctacaacaa gcaccgcgac aagccgatcc gggagcaggc ggagaacatc 8580

atccacctgt tcaccctcac caacctgggc gcccccgccg cgttcaagta cttcgacacc 8640

accatcgacc gcaagcggta cacctccacc aaggaggtcc tcgacgcgac cctgatccac 8700

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aggccgcttt tgcgggatct cgtcgaaggc actagaggat cgtggacgcc gctgccctcg 9240

ccgaggccgg gctgcccgcc gttcccaaca ccatctgggt gaccggcccc ggcacggcac 9300

aggccgtgtc ggacagcgac gtccccgccg acatcgtgct gcgcaccgac gtcctgcagg 9360

cgcaacgagt ggcgccgctg accgcaggga cactacggct ggcctggacg accgccgcgg 9420

tgctgctggc gctgggactg ctcggcctca cgctcgccgc cgccgccggt gcgcaggaac 9480

ggtggcagac cctgacccgg ctgcggaccc tcggcctgcg gccacgcgac gcccgctggg 9540

tcgccgcagg agaactgctg ccaccggtcg tggtcgccgc ggtgtgcggc ccgctactcg 9600

gggccctgct cgcgcatttg acgctcggcc cgctcgagct acagctgctc accggccaag 9660

ccgccgaccc ggcgacggtc ctgccgtggt ggctgctcgg cctgacgggt gtggcgctgg 9720

tggcggcggc cgccgcagtc gtcccggtcg aggcggcgct gcggcgacac gaccggctca 9780

gcgaggtact ccgcgccggt gagtaaccgg ctcatgctgc cacgatggca aggcgtcgag 9840

ggccaccagc gcgcaggcgg acgcgcatga agtcgcctcg gggcctggta tgcggccgtt 9900

cccgccagcg tcgccggccc tcaatcgcct cagccaccga gtgcgcgctt gacgttgacg 9960

ggccgatggt cggcgtccgg tcagccggtg cagaagtccg agtcccagcc cccggagcag 10020

tccagattgc atcggagggc cgcctacccg ccgagcagac gcggcgatcg cgccgcccgg 10080

gttgaccagc tggacacggg ccgtcttgat ccggagaacg aacagttcgg caaatgaccg 10140

ggtgggccac tttgtcctct gtcggctgat gcgcgacaca cgtccgtcaa ctgatctgcg 10200

acgtgggcgc aaggccggtg caagagtcgg tgcgagtgct agccgtggct cggggcgtcc 10260

cacaactccg ggtgttgata gtgattgcga gcaccagcct tcaggaccgc gcgaagcgtg 10320

gcaaagtgct ccgtttccgg cggtaggtcc aggcggttca gcagcgtgag cgccgccgct 10380

ggttcgaggt cgccgtagaa gtcgtggtag ctggtcagca agcccttgaa cagcgccggg 10440

tgcagctcgg ttacggcggc gacggcctca tagacatcgt gtttgtaggc ccagcgtacg 10500

ggccccgagc acgcgagaat tcgggctgcc ctgcggtgca gggggccggt ggccagcgcg 10560

ctcaggccca atccagcccg taggtagcgc acgtcgtcgc cgagcagcgc tgcgaacgcc 10620

acgcccgcgg tgttttgatc ttcgaaccag tcaacccata gtgagtactg cagctgctcg 10680

cttgcgtcgg gggcttccag gcgctgccgg tagccagccc aaaaggcttc gctgatcccc 10740

gtgtcggcct ggtcagcgat gaagtgacgg agctcgacgg tcacccagta ttcgtcaagt 10800

aggtcgagaa gcccaagacc taatcggagc cgctccccgc gggctaggcg gtcctcgtcc 10860

agcatggcgg tcgtccgccc gtgggcaaga tcgttgtcgc tgtgctccag gtcgcccgac 10920

ggcagactct gccgccatcg cccgggacct aacggtgtca cgccctgctc ggcgagccag 10980

cgcagcgcct cgttcgcctc cggtgtgtgc acgccaacag catggacgat gccgcccacg 11040

gatggttgtt atcgccgtgt cggtccaggc ggtcacgacg acaatgccat ctcatcgtgg 11100

atagcgggcg ttcggcgccc cggtcgatcg ggaccagcgt gccgtcgagg atcgcgtacg 11160

ccagtcgagc ggcccgcggt gccaggttat gcctgcgcag cacggtgtgt gccgcacttt 11220

gcggtagcaa tggaaagcca ctggcaggaa cgcaggcggc tcggcgcact gtcctacttc 11280

gtcatccgag acgagccgga cgccccttct tcggcggcag cattccttgt tgtcgacgtg 11340

gcggaacatc tggtcatctt catttctggt gcccgtgttc gttggcgcga tgatcggcat 11400

cctggtcgct gggcttccga acaggtggca cgttcttgcg tctatcgtga cgccggccgc 11460

gacctcgacg gccggcgggt cggtggttgt cgccacaacc ttcaccaacc aggtttcggc 11520

atttccctga ccgacaatcg cccgtcatct cattctcgcg ctgcacatca gccgccttca 11580

ccagcctcgg cttcgccctg gacgacgtcg ctcggatgct cgagtcggag gagcgcggcc 11640

aggagtcccc ccacgggcta cacgcgccgg agaacgagcg cctctctcgc cgaccgggcg 11700

gccaccacgc tcagggggtc ttcgccaccc gccctgacac gctcctcggc atcgacaaca 11760

gctgggcggg acagccaaag gccgacgtgg tccatgacta cgaaacagcg tgggtacgta 11820

gccggccgtc ccgccctgtg atctccactt gcccattacc tactttcact ataggaaaag 11880

tgggtgacca ccacagtctc cgcgtcaccc accgcggaaa cctcgatcgg tgcatcgacg 11940

gccgcccgga gggctctggc accccgtggc gggcgccgcc gtcggatcct gcttcggctc 12000

ctcgccctcg tcgtgctcta cgggctctgg gaagtcgccg cccggaccac cggcaatccg 12060

accttcatcc cctcacccgg cgcggtgtgg caccaactgg tccagacgtc gaccacccac 12120

gacggcatcc gcggctacag cgggcatctg ctcatcgaac acctcggcgt cagcctgcgg 12180

cgcatcctga tcggctccat gatcggcatc gccggtgggg tgctcctcgg tgtcgtgatg 12240

ggaactgtca gcgggttccg ggtagtgatc gaaccggtcg tcaccttcgt ccgcgccctt 12300

ccgccgcttg cctacttcag cctcttcatc atctggttcg gcatcgacga gacgcccaag 12360

ctctggttgc tctccatcgc cgcgttgccg cccgtggcgg tcgcgaccgc cgcggccgtc 12420

cactccgcac cgaccggtct ggtcgaggcc gcgcgggcgc tgggcgccgg tcgtgttcac 12480

gtgatccgcg acgtggtgct cccccacgcg ttaccggaga tattcaccgg catccggatc 12540

gcggtggggg tcgcgtactc ctcggtggtc gccgccgaga cgatcaacgg cgtacccggc 12600

atcggtggca tggttcgcga cgcccagcgc tactcccaga ccgacgtcgt cattctcggc 12660

ctcttcgcca ttggcctgtc cggcctcatc atcgacgccc tgctacggac cgccgaaaac 12720

cggctcatcc cgtggcgggg ccagatctag gagacaacag atgcgcaaga cactcggtct 12780

gctggcagcc gtgtccctgc tgttgagtgc ctgcggcgac ggtgccgcca gcggcggcga 12840

tccgggccgc aagaccatcc ggatcgccta ccaggccttc cccagcggcg acctcatcgt 12900

gaagaacccc tatatgcggg gatcgaccgc gcgggtcccg gacggggaag agcggggagc 12960

tttgccagag agcgacgact tccccttgcg ttggtgattg ccggtcaggg cagccatccg 13020

ccatcgtcgc gtagggtgtc acaccccagg aatcgcgtca ctgaacacag cagccggtag 13080

gacgaccatg actgagttgg acaccatcgc aaatccgtcc gatcccgcgg tgcagcggat 13140

catcgatgtc accaagccgt cgcgatccaa cataaagaca acgttgatcg aggacgtcga 13200

gcccctcatg cacagcatcg cggccggggt ggagttcatc gaggtctacg gcagcgacag 13260

cagtcctttt ccatctgagt tgctggatct gtgcgggcgg cagaacatac cggtccgcct 13320

catcgactcc tcgatcgtca accagttgtt caagggggag cggaaggcca agacattcgg 13380

catcgcccgc gtccctcgcc cggccaggtt cggcgatatc gcgagccggc gtggggacgt 13440

cgtcgttctc gacggggtga agatcgtcgg gaacatcggc gcgatagtac gcacgtcgct 13500

cgcgctcgga gcgtcgggga tcatcctggt cgacagtgac atcaccagca tcgcggaccg 13560

gcgtctccaa agggccagcc gaggttacgt cttctccctt cccgtcgttc tctccggtcg 13620

cgaggaggcc atcgccttca ttcgggacag cggtatgcag ctgatgacgc tcaaggcgga 13680

tggcgacatt tccgtgaagg aactcgggga caatccggat cggctggcct tgctgttcgg 13740

cagcgaaaag ggtgggcctt ccgacctgtt cgaggaggcg tcttccgcct cggtttccat 13800

ccccatgatg agccagaccg agtctctcaa cgtttccgtt tccctcggaa tcgcgctgca 13860

cgagaggatc gacaggaatc tcgcggccaa ccgataagcg cctctgttcc tcggacgctc 13920

ggttgctcga cctcgattcg tcagtgatga tcaacaggac ccagaaatgg cacgagcccg 13980

ggattggcct cccgggctcg ccgcccccga accggcgcag catgccgagt gaggacgttt 14040

gctctgtgac gagcgtacga gagaacagcg cgtcgacacc accgcgcccc gccggaccga 14100

agtgccactg cggcaccccg atcgtccaca tccccgggaa gcgccccaaa atctactgct 14160

cggacgcctg ccgaaagcgc gcaaagcgtc tcattgcgga ccagtcacgc agcgtagcaa 14220

gcacgactac agcgggtaat ccggacgcgg gctttagtag taagggaaaa tctccgtcca 14280

ctgcaggtca gagcgctgta actggaacgg gttctacccc aaacgagggt gccgcgacag 14340

ccgggcggga ggacccgcgc gacgagcggt tcgcccggcg ggaccggcac cagacggtgt 14400

cgctgaacga ggcgttcaag ggctgcggga cccggctcac tgccgggacg gccgagctga 14460

tgtggaagcc gggcgaggcg acgtggggca acacgtgccg ctgcaacaac gtccacacct 14520

gcccgtggtg catgagccgc atcctggccg tacggggctc gaacgtgcag ctcgccgccg 14580

acggtctcgc ggacgccggg tacgggctgc accttggcac gaacacgttg cgccacttcg 14640

agcgcatggc gttcggcacc gtccgcaagg gaatgcggca cggcctggtc gcggtcttgc 14700

acgacggctg gaagggcgcg tacggctcgt ccggccgccg ctggcgcacg atgcgcgacg 14760

acttcgggat catcggctac gagcgggcct tcgaggacac cttcggctgg ggctccggct 14820

ggcacctgca ctggcacacg ctctgggtca cccgcgaggt gctcggcccg gacgcccagg 14880

ccgcgttccg cgacgcactc gccggagcct gggccgccgg ggtcgaatcc gcgggcggct 14940

acaccgtcag cgagacgtgc gaccggcccg gttgctcctg tgagggcaag ggccacggca 15000

ccgacgtgcg cccactcaac ggcgcggacg ccgctgacgg cgatgcgggc aagcaggccc 15060

gctacctcta caaggacggc gacaagacca agggcggcgt cgccaagatc ggcctggagc 15120

tggccggaca gaacttcaag gccggtcgcg gcgacgaccg catgggaccg ctcgacctgg 15180

gcgacgcggc ggccgccgag ctgcagcggc ttcgtcggcc cggcccgttc gtcgagaagt 15240

accgcgagcg cgagttcggc gtcttccagg tccgcaagca ctaccggtcg cagaacctga 15300

accggctgat caaggaactc ggcatccagc aggacgtccg caccgaggag gagatcaccg 15360

acgacaccga gggcctggtc gccatcgcgg tcatcccggc ctacatctgg taccgataca 15420

tcgcccgcgt cgccggacgt cgcctcgacc tcatcaaggt cgccgagacg tacggcctac 15480

cgggcgtccg gcggctcgtc gagtcctggg gcctggtgtg gggcaaggac gtcctggacc 15540

cgcccgcccc ggaagcgccg gccgcgccgg gcgaccttga cgctgaccag atgaggttcg 15600

aggtcatgtc cgaggaggaa gctgctttcc gcgaggcgcg ccggaaggcc aacgaggccc 15660

gcacggagga gctggccgct tcgctcgacc gagtgcgtca gccgaagaag gaggcgatcc 15720

gcccgacgat cagccttcgg aagcgcctga agccgaagcc ggtcaccgtc gacgtcaaga 15780

ctcccccgcc cggcgccgcg tcgcccgtgt gccgccgctg caagggcaag ctcgccccgg 15840

tactccagcc ctggggccag caccccggag actgcctccg cgtcgacaca gcggtcgcgt 15900

agggccgctg agggaccgcc atgagaccgc caccccggac atccgggtgg cggtctcatg 15960

gcggtcccgg cgcgaaagcc gagggtctgc ctgccgtgag gtggccggcg gacctgggtt 16020

actgctggaa tcccgcgccc agtccgagcg tccgccggcg cttttcacct ggctccgggt 16080

gctcgtcgat gagcacca 16098

<210>4

<211>20bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

gctacggcat cgacctgacc 20

<210>5

<211>20bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

gggagatcgt gacgtcgagt 20

Claims (14)

1.一种CRISPR-Cas9 载体，其依次包括双spacer的sgRNA表达盒、CAS9蛋白表达盒和靶基因的同源臂序列；

所述双spacer的sgRNA表达盒表达名称为sgRNA1和名称为sgRNA2的两个sgRNA；

所述CAS9蛋白表达盒表达CAS9蛋白；

所述靶基因的同源臂序列位于所述CAS9蛋白表达盒的下游；

所述双spacer的sgRNA表达盒由名称分别为sgRNA1的表达盒和sgRNA2的表达盒连接而成；

所述sgRNA1的表达盒和所述sgRNA2的表达盒的转录方向相反；

所述sgRNA1的表达盒自上游至下游依次包括名称为启动子甲的启动子、sgRNA1的编码基因和名称为终止子甲的终止子；所述启动子甲启动所述sgRNA1的编码基因的表达；

所述sgRNA2的表达盒自上游至下游依次包括名称为终止子乙的终止子、sgRNA2的编码基因和名称为启动子乙的终止子；所述启动子乙启动所述sgRNA2的编码基因的表达；

所述CAS9蛋白表达盒自上游至下游依次包括名称为启动子丙的启动子、CAS9蛋白的编码基因和名称为终止子丙的终止子；所述启动子丙启动CAS9蛋白的表达；

所述启动子甲和所述启动子乙为不同或相同的启动子；

所述终止子甲和所述终止子乙为不同或相同的终止子。

2.根据权利要求1所述的CRISPR-Cas9 载体，其特征在于：

所述靶基因为abyssomicin基因簇；

所述sgRNA1的编码基因序列为序列3第3120-3139位；

所述sgRNA2的编码基因序列为序列3第3649-3668位；

所述CAS9蛋白的编码基因序列为序列3第3933-8039位；

所述同源臂序列由同源左臂序列和同源右臂序列组成；

所述同源左臂序列为序列3第9219-11039位；

所述同源右臂序列为序列3第11040-12908位。

3.根据权利要求1或2所述的CRISPR-Cas9 载体，其特征在于：所述CRISPR-Cas9 载体的核苷酸序列为序列3。

4.权利要求1-3中任一所述的CRISPR-Cas9 载体在敲除海洋疣孢菌靶基因中的应用。

5.权利要求1-3中任一所述的CRISPR-Cas9 载体的构建方法，包括如下步骤：

（1）制备辅助克隆spacer的载体pHelp

所述辅助克隆spacer的载体pHelp为将名称为表达盒甲的表达盒插入载体pHelp中得到，所述表达盒甲表达盒甲的核苷酸序列为序列1第408-614位；

（2）制备转录sgRNA的载体pCRISPR–Cas9

所述转录sgRNA 的载体pCRISPR–Cas9为将名称为表达盒乙的表达盒插入到pCRISPR–Cas9载体中得到，所述表达盒乙的核苷酸序列为序列2第3000-3384位；

（3）制备带有限制性内切酶A的粘性末端、靶基因spacer序列1和限制性内切酶B的粘性末端的双链DNA分子甲；

制备带有限制性内切酶C的粘性末端、靶基因spacer序列2和限制性内切酶D的粘性末端的双链DNA分子乙；

（4）将所述双链DNA分子甲通过酶切连接替换所述辅助克隆spacer的载体pHelp中所述限制性内切酶A和所述限制性内切酶B之间的片段，得到含有双链DNA分子甲的辅助克隆spacer的载体pHelp，其含有权利要求1-3中任一所述的sgRNA1的表达盒；

将所述双链DNA分子乙通过酶切连接替换所述转录sgRNA的载体pCRISPR–Cas9中的所述限制性内切酶A和所述限制性内切酶B之间的片段，得到含有双链DNA分子乙的转录sgRNA的载体pCRISPR–Cas9，其含有权利要求1-3中任一所述的sgRNA2的表达盒；

（5）将所述含有双链DNA分子甲的辅助克隆spacer的载体pHelp中sgRNA1的表达盒替换所述含有双链DNA分子乙的转录sgRNA的载体pCRISPR–Cas9中所述限制性内切酶C和所述限制性内切酶D之间的片段，得到CRISPR-Cas9 载体。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

所述步骤（4）和步骤（5）之间还包括将权利要求3中所述的靶基因的同源臂序列插入所述含有双链DNA分子乙的转录sgRNA的载体pCRISPR–Cas9中的步骤；

所述靶基因spacer序列1为序列4；

所述靶基因spacer序列2为序列5。

7.权利要求5或6中所述的辅助克隆spacer的载体pHelp。

8.权利要求5或6中所述的转录sgRNA的载体pCRISPR–Cas9。

9.权利要求5或6中所述的辅助克隆spacer的载体pHelp和权利要求5或6中所述的转录sgRNA的载体pCRISPR–Cas9。

10.权利要求5或6中所述的转录sgRNA的载体pCRISPR–Cas9在敲除海洋疣孢菌靶基因中的应用。

11.权利要求5或6中所述的辅助克隆spacer的载体pHelp和权利要求5或6中所述的转录sgRNA的载体pCRISPR–Cas9在敲除海洋疣孢菌靶基因中的应用。

12.一种用于敲除靶基因的成套产品，其包括权利要求5或6中所述的转录sgRNA的载体pCRISPR–Cas9。

13.一种用于敲除靶基因的成套产品，其包括权利要求5或6中所述的辅助克隆spacer的载体pHelp和/或权利要求5或6中所述的转录sgRNA的载体pCRISPR–Cas9。

14.权利要求12或13所述的成套产品在敲除海洋疣孢菌靶基因中的应用。

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