CN1875102B

CN1875102B - 新型质粒及其利用

Info

Publication number: CN1875102B
Application number: CN2004800324274A
Authority: CN
Inventors: 山村荣虎; 藤本升
Original assignee: Kyowa Pharma Chemical Co Ltd
Current assignee: Kyowa Pharma Chemical Co Ltd
Priority date: 2003-10-31
Filing date: 2004-10-29
Publication date: 2011-03-23
Anticipated expiration: 2024-10-29
Also published as: JPWO2005042739A1; DE602004029180D1; EP1688491A1; US20070031948A1; ATE481479T1; US7446187B2; KR20060108640A; EP1688491B1; SG128684A1; US20090042275A1; JP4579833B2; SG128683A1; EP1688491A4; WO2005042739A1; CN1875102A

Abstract

本发明从来源于红球菌属菌的具有序列号73记录的碱基序列的质粒和具有序列号74记录的碱基序列的质粒或其DNA片段等，制备在红球菌属菌内可复制的DNA区域，从来源于大肠杆菌的质粒或其DNA片段，制备在大肠杆菌内可复制的DNA区域，制作穿梭载体。在穿梭载体中插入氨基酮不对称还原酶基因构建载体，制作包含该载体的转化体，制造氨基酮不对称还原酶和光学活性氨基醇。

Description

新型质粒及其利用

技术领域

本发明涉及来源于属于红球菌属(Rhodococcus)的微生物(以下称为红球菌属菌)的新型质粒及其利用。更具体地说，涉及质粒及作为其一部分的DNA片段(以下简称DNA片段)，以及利用它们的穿梭载体、载体(vector)、转化体、氨基酮不对称还原酶的制造方法、以及光学活性氨基醇的制造方法。

背景技术

红球菌属(Rhodococcus)菌，已知可以产生与腈类的代谢相关的酶，可以产生不对称地还原氨基酮的酶。特别是红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)，已知具有极高的氨基酮不对称还原活性。这样的微生物和酶，作用于α-氨基酮，可以高收率且高选择性地生产光学活性β-氨基醇(例如，专利文献1和5)。因此，从以前就期待在红球菌属菌中，以有用的酶等的大量生产为目的的宿主载体系统的开发。但是，现状是适合于以红球菌属菌为宿主的载体的开发缓慢。红球菌属菌中发现有质粒的微生物，仅有红球菌属sp.H13-A株(非专利文献1)、紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)ATCC4276株(专利文献2)、紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)ATCC4001株(专利文献3)、和红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)IFO12320株(专利文献4)等几株。

【专利文献1】国际公开WO01/73100号公报

【专利文献2】日本特开平4-148685号公报

【专利文献3】日本特开平4-330287号公报

【专利文献4】日本特开平9-28379号公报

【专利文献5】国际公开WO02/070714号公报

【非专利文献1】J.Bacteriol.，170，638，1988

发明内容

如上所述人们希望由红球菌属菌开发用于育种、改良(突变株)在工业上可利用的菌株的新的载体。特别是，从重组DNA微生物和作为其产物的食品和添加物的安全性方面出发，希望通过自身克隆(selfcloning)系统实现。本发明的目的在于，提供一种在此类宿主载体系统中作为载体利用的新型质粒。

希望在具有氨基酮不对称还原活性的红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)中，创造出工业上可利用的重组微生物。特别地，本发明的第一目的在于，提供一种在此类重组微生物的创造中可以利用的新型质粒或作为其一部分的DNA片段。

如果得到上述的质粒，也就容易构建在其它微生物中可复制的穿梭载体。本发明的第二目的在于，提供此类穿梭载体构建必要的DNA复制相关的碱基序列信息(复制区域等)。

本发明的第三目的在于，提供在红球菌属菌和大肠杆菌中都可以复制的穿梭载体。

再者，本发明的第四目的在于，上述穿梭载体在氨基酮不对称还原酶中的应用。

本发明者专心筛选了用于由红球菌属菌株制造载体的质粒，结果发现了可作为宿主载体系统中的载体利用的几个新型质粒。

此外，本发明者发现，在上述质粒中，通过导入耐药基因、在大肠杆菌内可复制的基因区域等，可以制造穿梭载体。这样，得到完成上述课题的碱基序列信息、质粒和穿梭载体，从而完成了本发明。

即，根据本发明，提供了在以下的(1)～(39)中记载的DNA片段、DNA、质粒、穿梭载体、载体、转化体、氨基酮不对称还原酶的制造方法，以及光学活性氨基醇的制造方法。

(1)DNA片段，具有选自序列号35、序列号36和序列号37记录的碱基序列的至少1个碱基序列。

(2)质粒或作为其一部分的DNA片段，其特征在于，包含具有选自序列号35、序列号36和序列号37记录的碱基序列的至少1个碱基序列的DNA复制区域。

(3)DNA片段，具有选自序列号1、序列号4、序列号14、序列号17和序列号22记录的碱基序列的至少1个碱基序列。

(4)质粒或作为其一部分的DNA片段，其特征在于，包含具有选自序列号1、序列号4、序列号14、序列号17和序列号22中记录的碱基序列的至少1个碱基序列的DNA复制相关蛋白质的编码区域。

(5)质粒或作为其一部分的DNA片段，其特征在于，包含具有选自序列号1、序列号4、序列号14、序列号17和序列号22记录的碱基序列的至少1个碱基序列的DNA复制相关蛋白质的编码区域，且包含具有选自序列号35、序列号36和序列号37记录的碱基序列中的至少1个碱基序列的DNA复制区域。

(6)DNA片段，具有序列号76记录的碱基序列。

(7)质粒或作为其一部分的DNA片段，其特征在于，包含具有序列号76记录的碱基序列的启动子区域。

(8)质粒或作为其一部分的DNA片段，其特征在于，包含具有选自序列号1、序列号4、序列号14、序列号17和序列号22记录的碱基序列的至少1个碱基序列的DNA复制相关蛋白质的编码区域，包含具有选自序列号35、序列号36和序列号37记录的碱基序列的至少1个碱基序列的DNA复制区域，并且包含具有序列号76记录的碱基序列的启动子区域。

(9)环状质粒，其特征在于，具有(1)～(8)项中任一项所述的质粒或DNA片段，限制性内切酶切割位点数为，BamHI：2，EcoRI：2，KpnI：1，PvuII：1，SacI：1，以及SmaI：1，大小为约5.4kbp。

(10)质粒，具有序列号73记录的碱基序列。

(11)(1)～(10)中任一项所述的质粒或DNA片段，其特征在于，来源于红球菌属菌。

(12)DNA片段，具有选自序列号70、序列号71和序列号72记录的碱基序列的至少1个碱基序列。

(13)质粒或作为其一部分的DNA片段，其特征在于，包含具有选自序列号70、序列号71和序列号72记录的碱基序列的至少1个碱基序列的DNA复制区域。

(14)DNA片段，具有选自序列号40、序列号42、序列号44、序列号45、序列号53、序列号55、序列号56、序列号61、序列号62和序列号69记录的碱基序列的至少1个碱基序列。

(15)质粒或作为其一部分的DNA片段，其特征在于，包含具有选自序列号40、序列号42、序列号44、序列号45、序列号53、序列号55、序列号56、序列号61、序列号62和序列号69记录的碱基序列的至少1个碱基序列的DNA复制相关蛋白质的编码区域。

(16)质粒或作为其一部分的DNA片段，其特征在于，包含具有选自序列号40、序列号42、序列号44、序列号45、序列号53、序列号55、序列号56、序列号61、序列号62和序列号69记录的碱基序列的至少1个碱基序列的DNA复制相关蛋白质的编码区域，并且包含具有选自序列号70、序列号71和序列号72记录的碱基序列的至少1个碱基序列的DNA复制区域。

(17)质粒或作为其一部分的DNA片段，其特征在于，包含具有选自序列号40、序列号42、序列号44、序列号45、序列号53、序列号55、序列号56、序列号61、序列号62和序列号69记录的碱基序列的至少1个碱基序列的DNA复制相关蛋白质的编码区域，包含具有选自序列号70、序列号71和序列号72记录的碱基序列的至少1个碱基序列的DNA复制区域，并且包含具有序列号76记录的碱基序列的启动子区域。

(18)DNA片段，具有选自序列号67和序列号47记录的碱基序列的至少1个碱基序列。

(19)质粒或作为其一部分的DNA片段，其特征在于，包含具有选自序列号67和序列号47记录的碱基序列的至少1个碱基序列的接合蛋白质区域。

(20)DNA片段，具有序列号75记录的碱基序列。

(21)质粒或作为其一部分的DNA片段，其特征在于，包含与具有序列号75记录的碱基序列的接合相关的区域。

(22)环状质粒，其特征在于，具有(12)～(21)中任一项所述的质粒或DNA片段，限制性内切酶切割位点数为，BamHI：2，PvuII：4，SacI：3，和SmaI：4，大小为约5.8kbp。

(23)质粒：具有序列号74记录的碱基序列。

(24)如(12)～(23)中任一项所述的质粒或DNA片段，其特征在于，来源于红球菌属菌。

(25)DNA片段，具有序列号77记录的碱基序列。

(26)DNA片段，其特征在于，包含具有序列号77记录的碱基序列的启动子区域。

(27)在红球菌属菌和大肠杆菌内可复制的穿梭载体，包含(1)～(26)中任一项所述的质粒或作为其一部分的DNA片段，和在大肠杆菌内可复制的DNA区域。

(28)载体，其特征在于，使用(27)所述的穿梭载体制造。

(29)载体，其特征在于，包含(6)、(7)、(25)或(26)中任一项所述的质粒或DNA片段。

(30)如(28)或(29)所述的载体，其特征在于，插入有氨基酮不对称还原酶基因。

(31)如(30)所述的载体，其特征在于，氨基酮不对称还原酶基因，是编码含有序列号78记录的氨基酸序列的蛋白质的核酸；或编码具有序列号78的氨基酸序列中缺失、插入、取代或加成1个或多个氨基酸的氨基酸序列，且具有氨基酮不对称还原活性的蛋白质的核酸。

(32)如(30)所述的载体，其特征在于，氨基酮不对称还原酶基因，是含有序列号79记录的碱基序列的核酸；或编码在严格条件下与含有与序列号79互补的碱基序列的核酸杂交、且具有氨基酮不对称还原活性的蛋白质的核酸。

(33)转化体，包含(28)或(29)所述的载体。

(34)转化体，包含(30)～(32)中任一项所述的载体。

(35)氨基酮不对称还原酶的制造方法，包括，将(34)所述的转化体在可增殖该转化体的培养基中培养的培养工序，和由上述培养工序所得的该转化体精制氨基酮不对称还原酶的精制工序。

(36)光学活性氨基醇的制造方法，使得(35)所述的制造方法得到的氨基酮不对称还原酶作用于由通式(1)表示的α-氨基酮化合物或其盐的对映体混合物，生成通式(2)表示的、且具有期望的光学活性的光学活性氨基醇化合物，其中，

式中，X可以相同也可以不同，表示选自卤原子、低级烷基、也可以由保护基保护的羟基、硝基和磺酰基的至少一种；n表示0～3的整数；R¹表示低级烷基；R²、R³可以相同也可以不同，表示选自氢原子和低级烷基的至少一种；*表示不对称碳，

式中，X、n、R¹、R²、R³和*与上述定义相同。

(37)光学活性氨基醇的制造方法，使得(34)所述的转化体作用于由通式(1)表示的α-氨基酮化合物或其盐的对映体混合物，可以生成通式(2)表示的、具有期望的光学活性的光学活性氨基醇化合物，

其中，

式中，X、n、R¹、R²、R³和*与上述定义相同。

(38)光学活性氨基醇的制造方法，在(37)所述的光学活性氨基醇的制造方法中，进一步添加由通式(3)表示的化合物，或其制药学上可接受的盐或者溶剂合物，生成光学活性氨基醇，其中，

式中，A表示结构式(Y)或(Z)，

这里，R⁴表示氢原子、也可以具有取代基的碳原子数1～3的烷基、与R⁸结合形成碳原子数为5～10的烃环或与R⁸结合形成含有1～3个杂原子的5～8元环的杂环状骨架，

这里，R⁵表示氢原子、碳原子数1～3的烷基、或者与R⁶或R⁹结合形成含有1～3个杂原子的5～8元环的杂环状骨架，R⁶表示氢原子、也可以具有取代基的碳原子数1～3的烷基、与R⁸结合形成碳原子数为5～10的烃环、与R⁵或R⁹结合形成含有1～3个杂原子的5～8元环的杂环状骨架，R⁷表示氢原子、也可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基，

R⁸表示氢原子、羧基、也可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、与R⁴结合形成含有1～3个杂原子的5～8元环的杂环状骨架、与R⁶结合形成碳原子数为5～10的烃环；R⁹表示氢原子、也可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、也可以具有取代基的碳原子数1～6的烷氧基羰基、也可以具有取代基的酰基、与R⁵或R⁶结合形成含有1～3个杂原子的5～8元环的杂环状骨架；R¹⁰表示氢原子或也可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基。

(39)(27)所述的穿梭载体，具有选自序列号89～序列号100记录的碱基序列的碱基序列。

本发明的质粒，是目前未知的新型质粒，具有作为属于工业上有用的红球菌属的宿主载体系统中的载体的价值。特别是，在创造可在工业上进行的氨基酮的不对称还原的重组微生物方面有用。作为这样的微生物贡献的氨基酮不对称还原，可以举出由1-2-甲基氨基-1-苯基-1-丙酮制造d-(1S，2S)-伪麻黄碱的反应。

此外，本发明的质粒，由于与单一的红球菌属细胞共存，所以除了利用复制功能的单独使用以外，也可以分别作为相容性质粒利用。即，通过将其它蛋白质(酶等)基因插入于各个质粒中，可以同时在同一细胞内表达其它蛋白质。

并且，本发明的穿梭载体，在红球菌属菌和大肠杆菌(埃希氏菌属(Escherichia)菌)中，在创造工业上可利用的重组微生物方面有用。

由本发明的质粒得到的DNA复制相关的碱基序列信息，基于此可构建上述穿梭载体，具体提供载体的构建要素的DNA片段等。

附图说明

图1是质粒pRET1100的限制性内切酶切割图。

图2是质粒pRET1000的限制性内切酶切割图。

图3是表示构建穿梭载体pRET1101的概要图。

图4是表示构建穿梭载体pRET1102的概要图。

图5是表示构建穿梭载体pRET1103的概要图。

具体实施方式

以下按照优选的实施方式说明本发明。

本发明的第一质粒是由红球菌属菌分离的质粒或其衍生物。具体地说，例如，可以从红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)IAM1400、IAM1503、JCM2893和JCM2894株等的菌株分离，其大小为约5.4kbp，并且是具有相对表1中所示的限制性内切酶的分解特性的环状质粒。以下，将由各个菌株分离的质粒分别称为pRET1100、pRET1300、pRET1500和pRET1700。其中，对于由试样菌株制备本发明的质粒，可以采用公知的方法(例如，煮沸法、碱溶解法、氯化铯密度梯度超离心法：实验室手册(Lab-manul)基因工程，第3版，第10章，55-59页，丸善株式会社)。

【表1】

限制性内切酶	切割位点数	生成片段的大小(kbp)
			BamHI	2	0.4，5.0
EcoRI	2	0.3，5.1
			KpnI	1	5.4
PvuII	1	5.4
			SacI	1	5.4
SmaI	1	5.4

在图1中表示质粒pRET1100的限制性内切酶图。关于该质粒，用公知的方法(例如，荧光式自动定序器)定序时，可知其全碱基序列是序列表的序列号73所示的5444bp。

此外，本发明的第二质粒也是由红球菌属菌分离的质粒或其衍生物。具体地说，例如，可以从椿象红球菌(Rhodococcus rhodnii)JCM3203株分离，其大小为约5.8kbp，并且是具有相对表2所示的限制性内切酶的分解特性的环状质粒。以下，将该质粒称为pRET1000。

【表2】

限制性内切酶	切割位点数	生成片段的大小(kbp)
			BamHI	2	2.0，3.8
PvuII	4	0.1，1.4，2.0，2.3
			SacI	3	0.9，1.0，3.9
SmaI	4	0.1，1.2，1.6，2.9

质粒pRET1000的限制性内切酶图如图2所示。关于该质粒，用公知的方法定序时，可知具有序列表的序列号74所示的5813bp的碱基序列。

如上所述，本发明的质粒类(天然型或野生型)，是可由表1或表2中所示的限制性内切酶切割图案特定的环状质粒。因此，本发明包含以下2种环状质粒。

(1)一种环状质粒，来自红球菌属菌，其特征在于，大小为约5.4kbp，限制性内切酶切割位点数为BamHI：2，EcoRI：2，KpnI：1，PvuII：1，SacI：1和SmaI：1。

(2)一种环状质粒，来自红球菌属菌，其特征在于，大小为约5.8kbp，限制性内切酶切割位点数为BamHI：2，PvuII：4，SacI：3和SmaI：4。

分析质粒pRET1100和pRET1000的碱基序列(即，序列号73和序列号74)的结果是，可以推测存在编码具有DNA复制或其它功能的蛋白质的一组碱基序列(可读框，以下称为orf)。

在该技术领域中，“DNA复制”是指，DNA自身成为模板，形成与已有的双链DNA(母链DNA)完全相同的2个双链DNA。其复制机构，由从复制开始点(复制起点)的开始、DNA链的伸长、终结3个阶段构成。复制时，DNA双链的一部分解开，分别合成与单链互补的新的DNA链。解开双链的，是DNA解螺旋酶和螺旋不稳定性蛋白(也称为单链DNA结合蛋白)，被解开的部分称为复制叉。朝向复制叉3’→5’方向的模板DNA称为前导链(leading chain)，其相反的5’→3’方向称为后随链(lagging chain)。DNA聚合酶向着5’→3’逐渐延长DNA链。因此，当前导链为模板时，DNA在复制叉的方向上合成。而当相反侧的后随链为模板时，DNA链必须在复制叉的反方向上延伸。因此，后随链的复制，以称为冈崎片段的约每200个碱基的片段进行。约每200个碱基的RNA引物以DNA为模板，在5’→3’的方向合成10碱基的RNA。将该RNA作为引物，以后随链为模板，DNA聚合酶在5’→3’方向上合成DNA链。被复制的约200碱基的DNA片段，除去其后的RNA而结合为单链的DNA。在这样的复制机构中，DNA解螺旋酶、螺旋不稳定性蛋白等的各种蛋白质协同形成复制装置。作为相关的其它蛋白质，可以举出DNA拓扑异构酶(防止DNA复制时的扭曲)、复制开始蛋白和复制终了蛋白等。关于DNA复制机构，例如，在“细胞的分子生物学，第3版，中村桂子等译，251-262页，教育社，1996年”中有详细解说。

此外，进一步分析质粒pRET1100和pRET1000的碱基序列的结果是，在上述DNA复制相关的orf的附近，发现了具有富含AT的同源性或相似性的重复性的序列或被认为具有DNA的二次结构的序列，即，推测为DNA复制区域(识别DNA的复制相关的蛋白质的碱基序列区域、或存在DNA复制开始点的区域)的碱基序列。

以上，在DNA复制中，DNA复制区域和编码DNA复制相关的蛋白质(以下，称为DNA复制相关蛋白质)的区域是必须的。根据本发明，可以取得pRET1100和pRET1000两个质粒的这些区域的碱基序列相关的信息。

首先，在质粒pRET1100中，序列号35～37记录的碱基序列被鉴定为DNA复制区域。此外，序列号1～3记录的碱基序列(orf1)、序列号4记录的碱基序列(orf2)、序列号5～16记录的碱基序列(orf3)、序列号17～21记录的碱基序列(orf4)、序列号22～26记录的碱基序列(orf5)、序列号27或28记录的碱基序列(orf6)、序列号29或30记录的碱基序列(orf7)、序列号31或32记录的碱基序列(orf8)、序列号33或34记录的碱基序列(orf9)被鉴定为DNA复制相关蛋白质的编码区域。

为了从pRET1100制造可复制DNA的质粒，该重组质粒，需要包括至少1个上述DNA复制区域和至少1个上述DNA复制相关蛋白质的编码区域(orf)。因此，本发明的质粒(重组型)的特征在于，包括至少1个这样的DNA复制区域和至少1个DNA复制相关蛋白质的编码区域。这里，DNA复制相关蛋白质的编码区域，优选具有选自序列号1、4、14、17和22记录的碱基序列的碱基序列。

由此，可知序列号76记录的碱基序列的区域是与关系到复制的蛋白质的表达相关的启动子，本发明的质粒，优选包含具有序列号76记录的碱基序列的启动子区域。

在制造质粒时，基于上述的碱基序列信息，可以适当选择并构建DNA片段。此外，本发明也包含该质粒的衍生物或功能性的(DNA复制)片段。

接着，在质粒pRET1000中，序列号70～72中记载的碱基序列被鉴定为DNA复制区域。此外，序列号38～41记录的碱基序列(orf10)、序列号42或43记录的碱基序列(orf11)、序列号44记录的碱基序列(orf12)、序列号45或46记录的碱基序列(orf13)、序列号48～50记录的碱基序列(orf14)、序列号51或52记录的碱基序列(orf15)、序列号53或54记录的碱基序列(orf16)、序列号55记录的碱基序列(orf17)、序列号56～60记录的碱基序列(orf18)、序列号61记录的碱基序列(orf19)、序列号62记录的碱基序列(orf20)、序列号63～69记录的碱基序列(orf21)被鉴定为DNA复制相关蛋白质的编码区域。

为了从pRET1000制造可复制DNA的质粒，该重组质粒，必须包括至少1个上述DNA复制区域和至少1个上述DNA复制相关蛋白质的编码区域(orf)。因此，本发明的质粒(重组型)的特征在于，包括至少1个这样的DNA复制区域和至少1个DNA复制相关蛋白质的编码区域。这里，DNA复制相关蛋白质的编码区域，优选具有选自序列号40、42、44、45、53、55、56、61、62和69记录的碱基序列的碱基序列。

由此，可知序列号67和47记录的碱基序列的区域是与接合蛋白质(mobilization protein)有同源性，与接合相关。此外，可知序列号75记录的碱基序列的区域与接合蛋白质基因的表达相关，或是表达蛋白质的识别部位。因此，本发明的质粒，优选包含具有序列号67和47记录的碱基序列的接合蛋白质区域，或包含具有序列号75记录的碱基序列的接合相关的区域。

在质粒制造时，基于上述的碱基序列信息，可以适当选择并构建DNA片段。此外，本发明也包含该质粒的衍生物或功能性的(DNA复制)片段。

本发明的质粒或DNA片段，在DNA复制区域、DNA复制相关蛋白质编码区域、启动子区域、接合蛋白质区域、接合相关区域或其一部分中，只要不损害各个区域的功能，也可以具有包含1个或多个核苷酸的取代、缺失、或插入的碱基序列。

此外，本发明的穿梭载体，包含本发明的DNA复制区域、DNA复制相关蛋白质编码区域、启动子区域、接合蛋白质区域、接合相关的区域的任一个记录的质粒或DNA片段、以及可在大肠杆菌内复制的DNA区域，可以是可在红球菌属菌和大肠杆菌内复制的穿梭载体，例如，可以举出具有序列号89～序列号100的碱基序列的穿梭载体。本发明的穿梭载体，只要是可在红球菌属菌和大肠杆菌内复制的穿梭载体，也可以具有包含1个或多个核苷酸的取代、缺失、或插入的碱基序列。

上述“多个”，根据区域的种类而不同，但具体来说，为2～1100个，优选2～800个，更优选2～300个。进一步优选为2～100个，更进一步优选为2～20个，最优选为2～10个。

此外，作为DNA复制区域、DNA复制相关蛋白质编码区域、启动子区域、接合蛋白质区域、与接合相关的区域或其一部分、以及实际上具有相同的碱基序列的质粒或DNA片段，具体地可以举出，DNA复制区域、DNA复制相关蛋白质编码区域、启动子区域、接合蛋白质区域、接合相关的区域或其一部分、以及在严格的条件下杂交的碱基序列。“严格的条件”是指形成所谓的特异的杂种，而不形成非特异的杂种的条件。虽然难以明确的数值化此条件，但是如果示例，可以举出同源性高的DNA之间，例如具有80％以上、优选为90％、更优选为95％以上的同源性的DNA之间杂交，而与此相比，同源性低的DNA之间不杂交的条件。更具体地说，可以举出，在相当于通常的DNA杂交(Southern hybridization)的清洗条件的60℃，1×SSC、0.1％SDS，优选为0.1×SSC、0.1％SDS的盐浓度下杂交的条件。当DNA复制区域、DNA复制相关蛋白质编码区域、启动子区域、接合蛋白质区域、接合相关的区域的一部分使用300bp左右的长度的DNA片段时，作为杂交的清洗条件，可以举出，50℃、2×SSC、0.1％SDS。

如上所述，具有DNA复制区域、DNA复制相关蛋白质编码区域、启动子区域、接合蛋白质区域、接合相关的区域或与其一部分实质上相同的碱基序列的质粒或DNA片段，例如，可以用位点专一突变法，通过以在特定的位点的核苷酸中包含取代、缺失或插入的方式，改变DNA复制区域、DNA复制相关蛋白质编码区域、启动子区域、接合蛋白质区域、接合相关的区域或其一部分而取得。此外，如上所述被改变的DNA，也可以通过现有已知的突变处理而取得。作为突变处理，可以举出，将含有DNA复制区域、DNA复制相关蛋白质编码区域、启动子区域、接合蛋白质区域、接合相关的区域或其一部分的DNA用羟胺等进行体外处理的方法，和将保持同DNA的微生物，例如，埃希氏菌(Escherichia)属细菌，用紫外线或N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或EMS等的通常用于突变处理的诱变剂处理的方法。

此外，在上述的核苷酸的取代、缺失或插入中，也包含由红球菌属菌的菌株的差异等的天然产生的变异(mutant或variant)。

本发明的穿梭载体，包含上述的质粒或作为其一部分的DNA片段(A)和可在大肠杆菌内复制的DNA区域(B)。此外，该穿梭载体，根据情况也可以包含含耐药性基因的DNA区域，且其是优选的。在该技术领域中，一般地，“穿梭载体”是指包含2种细胞的DNA复制机构，优选进一步包含作为选择标记的耐药性基因等，并且可以在该二种细胞中自主复制的载体。质粒或作为其一部分的DNA片段(A)，是可在红球菌属菌中复制的DNA区域。可在大肠杆菌内复制的DNA区域(B)，只要是可在大肠杆菌内复制增殖的质粒，可以是质粒整体，也可以是其一部分。作为上述可在大肠杆菌内复制的DNA区域，例如，可以使用pUC18、pHSG299、pHSG398等的质粒。

本发明的穿梭质粒包含耐药性基因时，优选使用耐氨苄青霉素(ampicillin)性基因、耐卡那霉素性基因、耐氯霉素性基因等，但只要是可以在作为宿主的红球菌属菌和大肠杆菌内表达，赋予宿主细胞耐药性的，并且在两种菌属间，由耐药性能可以确认质粒的存在的，就不限定药剂的种类。此外，也可以使用多个这样的耐药性基因。

在穿梭载体中，优选包含多个克隆位点(多克隆位点)，该克隆位点和上述耐药性基因，例如，可以从大肠杆菌质粒衍生。即，将上述列举的公知的大肠杆菌质粒由适当的限制性内切酶切割，制造包含克隆位点和耐药性基因的DNA区域，与其它DNA片段(在红球菌属菌中可复制的DNA区域)连接。

作为实例，在图3～5中表示穿梭载体的构建的概略。穿梭载体，在用适当的限制性内切酶处理上述质粒和来源于大肠杆菌的质粒后，可以通过连接两者而构建。这样，本发明者使用红球菌属菌的质粒pRET1000、pRET1100和pRET1200和大肠杆菌的质粒pUC18、pHSG299和pHSG398，制造了18种穿梭载体(表5)。

本发明的穿梭载体，可以以红球菌属菌或大肠杆菌为宿主，可以在它们的任一中复制，可以在工业上利用。由本发明的穿梭载体转化的红球菌属菌或大肠杆菌，以及其它微生物的转化体，也可这样利用，这些转化体也包含于本发明。

本发明的载体的特征在于，使用本发明的穿梭载体制造。即，要导入的目标DNA被插入本发明的穿梭载体中形成的载体。在用适当的限制性内切酶处理要导入的DNA和本发明的穿梭载体后，可以通过连接两者制造该载体。通过利用该载体，可以得到导入有期望的DNA的转化体。

作为插入的DNA，例如，可以举出氨基酮不对称还原酶基因和辅酶再生类酶基因。氨基酮不对称还原酶基因，是WO02/070714中记载的编码氨基酮不对称还原酶的基因，更具体地说，是编码序列号78记录的由氨基酸序列构成的蛋白质(来源于红串红球菌(R.erythropolis)MAK-34株的氨基酮不对称还原酶)的DNA，特别是由序列号79记录的碱基序列构成的DNA。在本说明书中完全包含WO02/070714中记载的内容。

氨基酮不对称还原酶，只要具有WO02/070714中记载的性质就可以，也包括具有序列表的序列号78记录的氨基酸序列的蛋白质，和，具有在上述氨基酸序列中缺失、插入、取代或加成1个或多个氨基酸的氨基酸序列、并且具有氨基酮不对称还原活性的蛋白质。这里，氨基酮不对称还原活性，是指以由上述通式(1)表示的α-氨基酮为底物生成由上述通式(2)表示的光学活性的氨基醇的活性。

作为实施此类缺失、插入、取代、加成的方法没有特别限制，可以使用公知的方法。例如，可以举出，日本生化学会编，《续生化学实验讲座1，基因研究法II》，p105(广濑进)，东京化学同人(1986)；日本生化学会编，《新生化学实验讲座2，核酸III(重组DNA技术)》，p233(广濑进)，东京化学同人(1992)；R.Wu，L. Grossman编，《Methodsin Enzymology》，Vol.154，p.350&p.367，Academic Press，NewYork(1987)；R.Wu，L. Grossman编，《Methods in Enzymology》，Vol.100，p.457&p.468，Academic Press，New York(1983)；J.A.Wells等，《Gene》，Vol.34，p.315(1985)；T. Grundstroem等，《Nucleic Acids Res.》，Vol.13，p.3305(1985)；J.Taylor等，《Nucleic Acids Res.》，Vol.13，p.8765(1985)；R.Wu编，《Methods in Enzymology》，Vol.155，p.568，Academic Press，New York(1987)；A.R.Oliphant等，《Gene》，Vol.44，p.177(1986)中记载的方法。具体地说，可以举出，例如，利用合成低聚核苷酸等的位点专一突变导入法，Kunkel法，dNTP[αS]法(Eckstein)法，使用亚硫酸或亚硝酸等的区域指定变异导入法等的方法。

此外，在很多蛋白质中存在糖链被加成的情况，通过取代1个或多个氨基酸可以调节糖链的加成。所以，序列表的序列号78记录的氨基酸序列中，只要上述已调节糖链的蛋白质也具有上述的氨基酮不对称还原活性，也包含于本发明的氨基酮不对称还原酶中。

并且，本发明的氨基酮不对称还原酶，可以用化学的方法修饰其含有的氨基酸残基，使用肽酶，例如，胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠罗蛋白酶、肽链内切酶、肽链端解酶等的酶修饰，或部分分解而改变为其衍生物。

此外，在用基因重组法制造时，也可以变换、加工为作为融合蛋白质表达的、在生物体内或生物体外与天然的氨基酮不对称还原酶实质上具有同等的生物学活性的物质。此时，可以使用基因工程上常用的融合产生法，这样的融合蛋白质也可以利用其融合部以亲和色谱法精制。蛋白质的结构的修饰、改变等，可以参考例如日本生化学会编，《新生化学实验讲座1，蛋白质VII，蛋白质工程》，东京化学同人(1993)，可以用那里记载的方法或在那里引用的文献记载的方法、或者实质上与它们同样的方法进行。

并且，本发明的氨基酮不对称还原酶也可以是，1个以上的氨基酸残基在同一性方面与天然的不同的物质，1个以上的氨基酸残基的位置与天然的不同的物质。本发明也包含，在天然的氨基酮不对称还原酶中特有的氨基酸残基1个以上(例如，1～80个，优选为1～60个，更优选为1～40个，进一步优选为1～20个，特别优选为1～10个等)缺失的缺失类似体，特有的氨基酸残基的1个以上(例如，1～80个，优选为1～60个，更优选为1～40个，进一步优选为1～20个，特别优选为1～10个等)被其它残基取代的取代类似体，1个以上(例如，1～80个，优选为1～60个，更优选为1～40个，进一步优选为1～20个，特别优选为1～10个等)的氨基酸残基被加成的加成类似体。也可以包含具有天然的氨基酮不对称还原酶的特征的域(domain)结构的氨基酮不对称还原酶。此外，还可以举出具有相同性质的氨基酮不对称还原酶活性的氨基酮不对称还原酶。

只要保持作为天然的氨基酮不对称还原酶的特征的域结构，如上述的突变体，全部包含于本发明的氨基酮不对称还原酶中。此外，本发明人认为，也可以含有具有与本发明的天然的氨基酮不对称还原酶实质上同等的一次结构构象或其一部分的氨基酮不对称还原酶，并且也可以含有具有与天然的氨基酮不对称还原酶实质上同等的生物学活性的氨基酮不对称还原酶。再者，也可以是天然产生的突变体的一个。这样的本发明的氨基酮不对称还原酶，可以如下述说明地被分离·精制处理。另一方面，本发明也包含，编码上述的多肽的DNA片段，具有天然的特性的全部或一部分的氨基酮不对称还原酶的多肽，以及编码其类似体或衍生物的DNA片段。该氨基酮不对称还原酶的核苷酸，也可以被修饰(例如，加成、除去、取代等)，也可以包含这样被修饰的物质。

本发明的氨基酮不对称还原酶基因，是编码上述氨基酮不对称还原酶的核酸。代表性地可以举出，编码具有序列表的序列号78记录的氨基酸序列的蛋白质的核酸，特别是具有序列号79记录的碱基序列的核酸，由于编码一个氨基酸的碱基序列(密码子)存在多个，所以编码具有在序列号78记录的氨基酸序列的蛋白质的核酸存在许多。因此，本发明的氨基酮不对称还原酶基因中也包含这样的核酸。这里，“编码蛋白质”是指，当DNA为双链时，互补的双链的任意一方包含具有编码蛋白质的碱基序列的物质，因此在本发明的核酸中也包含，由直接编码序列号78记录的氨基酸序列的碱基序列构成的核酸或由其的互补的碱基序列构成的核酸。再者，本发明的氨基酮不对称还原酶基因，也可以是编码在严格的条件下，与含有与序列号79互补的碱基序列的核酸杂交，且具有氨基酮不对称还原活性的蛋白质的核酸。这里，“严格的条件”与上述定义相同。

辅酶再生类酶基因，可以举出各种脱氢酶，即，葡萄糖脱氢酶、葡萄糖六磷酸脱氢酶、醛脱氢酶、醇脱氢酶、有机酸脱氢酶和氨基酸脱氢酶等。更具体地可以适宜使用乙醛脱氢酶、乙醇脱氢酶、丙醇脱氢酶、甘油脱氢酶、甲酸脱氢酶、乙酸脱氢酶、丁酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶等。

本发明的转化体特征为含有上述载体。转化体，通过在宿主细胞中导入上述载体而得到。载体的导入方法，可以用公知的方法，例如，磷酸钙法、脂质转染法(lipofection)、电穿孔法(electroporation)、微注射法(microinjection)进行。

例如，包含插入有氨基酮不对称还原酶基因的载体的本发明的转化体，具有氨基酮不对称还原活性，可以应用于下述的氨基酮不对称还原酶的制造方法和光学活性氨基醇的制造方法中。

本发明的氨基酮不对称还原酶的制造方法，其特征在于，包括，将包含插入有氨基酮不对称还原酶基因的载体的转化体在该转化体可增殖的培养基中培养的培养工序，和，由在上述培养工序中得到的该转化体精制氨基酮不对称还原酶的精制工序。

作为上述培养的方法，只要是使用的菌体可生长的条件就可以没有特别限制的使用公知的方法，通常可以使用含有碳源、氮源、其它养分的液体培养基。作为培养基的碳源，只要是上述菌体可利用的都可以使用。具体来说，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、糊精、淀粉、山梨糖醇等的糖类，甲醇、乙醇、甘油等的醇类，富马酸、柠檬酸、乙酸、丙酸等的有机酸类及其盐，链烷烃等的烃类，或者它们的混合物等。作为氮源，只要是上述菌体可利用的任何氮源都可以使用。具体来说，可以使用氯化铵、硫酸铵、磷酸铵等的无机酸的铵盐；富马酸铵、柠檬酸铵等的有机酸的铵盐；硝酸钠，硝酸钾等的硝酸盐；肉膏、酵母提取物、麦芽提取物、蛋白胨等的无机或有机含氮化合物，或者它们的混合物。此外，在培养基中，也可以适当添加无机盐、微量金属盐、维生素类等的用于通常的培养的营养源。此外，根据需要，也可以在培养基中添加促进菌体增殖的物质、有效用于培养基的pH保持的缓冲物质等。

菌体的培养，可以在适宜生长的条件下进行。具体来说，可以在培养基的pH为3～10，优选为4～9，温度0～50℃，优选为20～40℃下进行。菌体的培养，可以在好氧或厌氧的条件下进行。培养时间优选为10～150小时，应该根据各个菌体而适当确定。

将这样培养的菌体的培养液过滤或离心分离，用水或缓冲液充分清洗其菌体。清洗后的菌体悬浊于适量的缓冲液中，破碎菌体。作为破碎的方法没有特别限制，可以举出，例如，研钵、戴诺研磨机(Dyno-millダイノミル)、弗式压碎器(French pressフレンチブレス)、超声波破碎机等的机械破碎法。由所得的菌体的破碎液中，通过过滤或离心分离除去固体物质而得到的无细胞提取液中的氨基酮不对称还原酶，通过酶分离的通常方法取得。

作为这样的酶分离的方法，没有特别限制，可以使用公知的方法，但是可以通过以下方法精制，例如，硫酸铵沉淀法等的盐析；由交联葡聚糖等的凝胶过滤法；使用具有二乙基氨基乙基或羧甲基等的载体等的离子交换层析法；使用具有丁基、辛基、苯基等疏水性基团的载体等的疏水性层析法；色素凝胶层析法；电泳法；透析；超滤法；亲和层析法；高效液相色谱法等进行精制。

并且，也可以将上述酶作为固定化酶使用。作为这样的方法没有特别限制，可以使用公知的方法，可以举出固定化酶或酶产生细胞的方法，可以通过称为共价键法或吸附法的载体结合法、交联法、遮盖法等进行固定化。此外，也可以根据需要使用戊二醛、1，2-己二异氰酸酯、1，2-己二异硫氰酸酯(hexamethylene diisothiocyanate)等的缩合剂。此外，作为其它固定化法，可以举出，例如，使单体由聚合反应进行凝胶化的单体法；使比通常的单体更大的分子聚合的预聚合物法；使聚合物进行凝胶化的聚合物法；使用聚丙烯酰胺的固定化；使用褐藻酸、胶原、明胶、琼脂、κ-角叉菜胶等的天然高分子的固定化；使用光固化性树脂、聚氨酯聚合物等的合成高分子的固定化。

这样被精制的酶，只要通过电泳(SDS-PAGE等)可以确认单频带(band)，就可以判断已充分进行精制。

本发明的光学活性氨基醇的制造方法，其特征在于，使由本发明的制造方法所得的氨基酮不对称还原酶作用于由通式(1)表示的α-氨基酮化合物或其盐的对映体混合物，生成由通式(2)表示的、具有期望的光学活性的光学活性氨基醇化合物，其中，

(式中，

X可以相同也可以不同，表示选自卤原子、低级烷基、也可以由保护基保护的羟基、硝基和磺酰基的至少一种；

n表示0～3的整数；

R¹表示低级烷基；

R²、R³可以相同也可以不同，表示选自氢原子和低级烷基的至少一种；

*表示不对称碳)，

(式中，X、n、R¹、R²、R³和*与上述定义相同)。

首先，说明本发明相关的由通式(1)表示的α-氨基酮。

说明取代基X。作为上述卤原子，可以举出氟原子、氯原子、溴原子和碘原子等。

此外，作为低级烷基，优选碳原子数1～6的烷基，可以举出，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基和己基等。它们可以取直链状或支链状的任意的结构。此外，作为取代基，也可以具有氟原子或氯原子等的卤原子，羟基，烷基，氨基或烷氧基等。

作为也可以由保护基保护的羟基的保护基，可以举出可用水处理除去的保护基，可用酸或弱碱除去的保护基，可通过加氢除去的保护基，可用路易斯酸催化剂和硫脲等除去的保护基，在上述保护基中，包含也可以具有取代基的酰基、也可以具有取代基的甲硅烷基、烷氧基烷基、也可以具有取代基的低级烷基、苄基、对甲氧基苄基、2，2，2-三氯乙酯基、烯丙氧基羰基和三苯甲基等。

其中，上述酰基包括，乙酰基、氯乙酰基、二氯乙酰基、三甲基乙酰基、苯酰基和对硝基苯酰基等。此外，作为取代基，也可以具有羟基、烷基、烷氧基、硝基和卤原子等。上述甲硅烷基包括，三甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基和三芳基甲硅烷基等。此外，作为取代基，也可以具有烷基、芳基、羟基、烷氧基、硝基和卤原子等的取代基。上述烷氧基烷基包括：甲氧基甲基和2-甲氧基乙氧基甲基等。上述低级烷基包括碳原子数1～6的烷基，可以举出，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基和己基等。它们可以取直链状或支链状的任意的结构。此外，作为取代基，也可以具有氟原子或氯原子等的卤原子，羟基，烷基，氨基和烷氧基等。

此外，X也可以是硝基或磺酰基，具体可以举出甲基磺酰基等。

再者，X的数n是0～3的整数，优选为0。

此外，上述通式(1)中的R¹表示低级烷基。作为这样的低级烷基，优选碳原子数1～6的烷基，可以举出，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基和己基等。它们可以取直链状或支链状的任意的结构。

R²、R³表示氢原子或低级烷基。在上述低级烷基中，包括碳原子数1～6的烷基，可以举出，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基和己基等。它们可以取直链状或支链状的任意的结构。

此外，作为上述α-氨基酮化合物的盐，可以举出盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、碳酸盐等的无机酸的盐，或者，乙酸、柠檬酸等的有机酸的盐。

上述α-氨基酮，可以卤化对应的1-二苯甲酮衍生物的α碳，例如，溴化后，将溴基等的卤素取代为胺，由此可以容易地合成(Ger.(East)，11，332，Mar.12，1956)。

接着，说明本发明的由通式(2)表示的光学活性氨基醇。在上述通式(2)中的X、n、R¹、R²、R³和*与上述通式(1)中的定义相同。并且，作为具有期望的光学活性的β-氨基醇，可以举出(1S，2S)氨基醇。作为(1S，2S)氨基醇的具体例，可以举出，d-苏型-2-甲基氨基-1-苯基丙醇(d-伪麻黄碱)，d-苏型-2-二甲基氨基-1-苯基丙醇(d-甲基伪麻黄碱)，(1S，2S)-α-(1-氨基乙基)-苄基醇(d-去甲假麻黄碱)，(1S，2S)-1-(对羟基苯基)-2-甲基氨基-1-丙醇，(1S，2S)-α-(1-氨基乙基)-2，5-二甲氧基-苄基醇，(1S，2S)-1-(间羟基苯基)-2-氨基-1-丙醇，(1S，2S)-1-(对羟基苯基)-2-氨基-1-丙醇，(1S，2S)-1-苯基-2-乙基氨基-1-丙醇，(1S，2S)-1-苯基-2-氨基-1-丁醇，(1S，2S)-1-苯基-2-甲基氨基-1-丁醇等。

只要生成具有期望的光学活性的由通式(2)表示的光学活性氨基醇，使氨基酮不对称还原酶作用的条件没有特别限定，但是由于该酶的最适pH是8.1，最适温度是55℃，所以优选在pH7～9和温度30～65℃的条件下进行。

再者，本发明的光学活性氨基醇的制造方法，其特征在于，使本发明的转化体作用于由通式(1)表示的α-氨基酮化合物或其盐的对映体混合物，生成由通式(2)表示的、具有期望的光学活性的氨基醇化合物，其中，

作为进行上述反应时的反应条件，例如可以是在液体培养基中对振荡培养的转化体菌进行集菌，在所得的菌体中加入氨基酮水溶液(0.1～10％浓度)，边调整pH至6～8边在温度20～40℃下反应几个小时到1天。反应结束后，分离菌体，通过分离反应液中的生成物，可以得到光学活性氨基醇。这里，转化体菌的处理菌体(干燥菌体和固定化菌体等)和从转化体菌得到的酶、或固定化酶等也可以同样进行。

此外，在本发明的光学活性氨基醇的制造方法中，通过进一步添加由通式(3)表示的化合物，或其在药学上接受的盐或溶剂合物进行反应，可更高效的进行光学活性氨基醇的制造，其中，

(式中，

A表示下述式(Y)或(Z)，

(这里，R⁴表示氢原子、也可以具有取代基的碳原子数1～3的烷基、与R⁸结合形成碳原子数为5～10的烃环或与R⁸结合形成含有1～3个杂原子的5～8元环的杂环状骨架)，

(这里，R⁵表示氢原子、碳原子数1～3的烷基、或与R⁶或R⁹结合形成含有1～3个杂原子的5～8元环的杂环状骨架，R⁶表示氢原子、也可以具有取代基的碳原子数1～3的烷基、与R⁸结合形成碳原子数为5～10的烃环、与R⁵或R⁹结合形成含有1～3个杂原子的5～8元环的杂环状骨架，R⁷表示氢原子、也可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基)；R⁸表示氢原子、羧基、也可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、与R⁴结合形成含有1～3个杂原子的5～8元环的杂环状骨架、与R⁶结合形成碳原子数为5～10的烃环；R⁹表示氢原子、也可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、也可以具有取代基的碳原子数1～6的烷氧基羰基、也可以具有取代基的酰基、与R⁵或R⁶结合形成含有1～3个杂原子的5～8元环的杂环状骨架；R¹⁰表示氢原子或也可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基)

在上述通式(3)中，作为碳原子数1～3的烷基，是直链状、支链状均可，具体可以举出，甲基、乙基、正丙基、异丙基等。此外，作为碳原子数1～6的烷基，是直链状、支链状均可，具体可以举出，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基和己基等。作为碳原子数5～10的烃环，可以举出环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基和环癸基等。

在包含1～3个杂原子的5～8元环的杂环状骨架中，作为杂原子，可以举出氮原子、氧原子、硫原子等，特别优选氮原子、氧原子，作为5～8元环的杂环状骨架，可以举出吡咯烷、哌啶、咪唑烷(imidazolidine)、哌嗪、四氢呋喃、四氢吡喃、四氢噻吩和吗啉等。

此外，作为碳原子数1～6的烷氧基羰基，可以举出，甲氧基羰基、乙氧基羰基、异丙氧基羰基、异丁氧基羰基和叔丁氧基羰基等。作为酰基，可以举出甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、三甲基乙酰基、苯酰基和戊酰基等。当上述的碳原子数1～3或碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的烷氧基羰基或酰基具有取代基时，取代基的种类、取代位置以及取代基的数目没有限定，作为取代基，可以举出例如，氟原子或氯原子等的卤原子、羟基、烷基、羧基、氨基、烷氧基、硝基和芳基等。并且，作为制药学上可接受的盐，可以举出盐酸、硫酸、硝酸、磷酸等的无机酸的盐，乙酸、柠檬酸等的有机酸的盐，Na、K、Mg、Ca、铵等的无机碱性的盐和三乙基胺、环己基胺等的有机碱性的盐。

作为这样的由通式(3)表示的化合物，可以举出例如，1-乙酰胺基-2-羟基丙烷、1-甲基氨基-2-羟基丙烷、1-氨基-2-羟基丙烷、1-氨基-2-羟基环戊烷、1-氨基-2，3-二羟基丙烷、L-苏氨酸、4-氨基-3-羟基丁酸、1-氨基-2-氧环己烷、吗啉、3-羟基吡咯烷、3-羟基哌啶、2-氨基甲基-四氢呋喃、1-(2-羟基丙基)氨基-2-羟基丙烷、1-叔丁氧基羰基氨基-2-羟基丙烷、2-氨基-3-羟基丁烷、DL-丝氨酸、1-氨基-2-羟基丙烷、1-氨基-2-羟基丁烷、1-氨基-2-羟基环己烷。其中，在具有不对称碳原子的化合物中，只要没有特别记载，可以是旋光体，也可以是外消旋体。

通过在培养基中添加这些活性诱导剂，可以诱导菌体的活性，可以比不添加时更有效的进行其后的光学活性的β-氨基醇的生成。活性诱导剂可以分别单独使用，也可以以多个诱导剂的混合物使用。这样的活性诱导剂的添加量，优选为相对于培养基0.01～10重量％。

作为本发明的β-氨基醇的制造中的反应方法，只要是上述菌体或菌株得到的酶作用于上述通式(1)所示的α-氨基酮化合物或其盐的对映体混合物，生成对应的由通式(2)表示的光学活性β-氨基醇化合物的方法，就没有特别限定，在原料α-氨基酮的水溶液中，将由缓冲液或水等清洗的菌体混合开始反应。

此外，反应条件可以在不损害由通式(2)表示的光学活性β-氨基醇化合物的生成的范围内选择。菌体量，作为干燥菌体，相对于外消旋氨基酮，优选为1/100～1000倍，更优选为1/10～100倍。此外，作为底物的外消旋氨基酮的浓度优选为0.01～20％，更优选为0.1～10％。再者，反应液的pH，优选为5～9，更优选为6～8，反应温度优选为10～50℃，更优选为20～40℃。此外，反应时间优选为5～150小时，可以根据各个菌体适当确定。

此外，为了更高效地进行反应，可以添加葡萄糖等的糖类、乙酸等的有机酸、甘油等的能量物质。它们可以分别单独使用，也可以以它们的混合物使用。添加量相对于底物优选为1/100～10倍的量。此外，可以添加辅酶等。作为辅酶，可以单独或以混合物使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)等，添加量相对于外消旋氨基酮优选为1/1000～1/5的量。此外，除了这些辅酶以外，还可以添加辅酶再生酶，例如，葡萄糖脱氢酶，添加量相对于外消旋氨基酮优选为1/1000～1/5的量。此外，也可以添加辅酶再生酶的底物，例如葡萄糖，添加量相对于外消旋氨基酮优选为1/100～10倍的量。此外，也可以分别组合使用葡萄糖等的糖类、乙酸等的有机酸、甘油等的能量物质、辅酶、辅酶再生酶和辅酶再生酶的底物。虽然它们是本来就在菌体中蓄积的，但是通过根据需要添加这些物质，可以提高反应速度、收率等，可以适当选择。

此外，反应液如上所述加入特定的盐，在该条件下反应时，可以促进未反应的α-氨基酮异构体的外消旋化，可以有效地向菌体或菌体得到的酶的底物旋光异构体变换。由此，有从原料以50％以上的高收率得到目的氨基醇的趋势。

作为促进未反应的α-氨基酮的外消旋化的盐，只要是乙酸盐、酒石酸盐、安息香酸盐、柠檬酸盐、丙二酸盐、磷酸盐、碳酸盐、对硝基苯酚盐、亚硫酸盐和硼酸盐等的弱酸的盐就可以，但是优选使用磷酸盐(例如，磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢铵)、碳酸盐(例如，碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸铵)、柠檬酸盐(例如，柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸铵)等。此外，也可以使用它们的混合物，作为pH为6.0～8.0的缓冲液，优选添加使得最终浓度为0.01～1M。例如，是磷酸盐时，可以将磷酸二氢钠和磷酸氢钠以从9对1到5对95的比例混合。

由反应生成的光学活性α-氨基醇，可以通过常用的分离精制方法精制。例如，从反应液直接或分离菌体后，通过膜分离、由有机溶剂(例如，甲苯、三氯甲烷等)提取、柱层析、减压浓缩、蒸馏、晶析、再结晶等的通常的精制方法，可以得到光学活性β-氨基醇。生成的光学活性β-氨基醇的光学纯度，可以通过高效液相色谱(HPLC)测定。

【实施例】

以下，通过实施例更具体地说明本发明，但是下述实施例并不用于限定本发明的技术范围。

(实施例1)质粒的分离精制

(1)方法

将红球菌属菌在5mL的GPY培养基(1％葡萄糖、0.5％细菌蛋白胨(bacto-peptone)、0.3％酵母提取物)中植菌，在25℃下振荡培养。在对数生长期添加250μL的100mg/mL的氨苄青霉素溶液，在25℃下振荡培养2小时。用离心分离(12krpm，5分钟)集菌，除去上清液后，用1mL的50mM Tris(pH7.5)悬浊，再次用离心分离(12krpm，5分钟)集菌，除去上清液。以溶解于TE溶液(10mM Tris(pH7.5)、1mMEDTA)的250μL的10mg/mL溶菌酶溶液悬浊，在37℃放置30分钟。然后，加入100μL的3M食盐水和25μL的10％SDS，在-20℃下放置一夜。在离心分离(12krpm，5分钟)后的上清液中分别加入0.5μL的50μg/mL蛋白酶K和50μg/mL核糖核酸酶A，在37℃下放置15分钟。然后，添加等量的苯酚/氯仿/异戊醇溶液，进行离心分离(12krpm，5分钟)。在上清液中加入2.5倍量的乙醇，离心分离(12krpm，5分钟)，在50μL的杀菌水中溶解沉淀。质粒的确认是由0.8％琼脂糖凝胶进行电泳，用溴化乙锭染色后，进行UV照射。

(2)试样菌株及结果

在本实施例中，由红球菌属及其类似菌分枝杆菌属(Mycobacterium)的各菌种可得到的菌株，按照上述(1)的方法，对质粒的有无进行筛选。

在表3中表示筛选的菌株中可以确认质粒的保持的菌株。即，在红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)(IAM1400、IAM1503、JCM2893、JCM2894以及JCM2895)和椿象红球菌(Rhodococcusrhodnii)(JCM3203)中，可以确认各约5.4kbp和约5.8kbp的质粒。将这些质粒，如在表3中列举的名称，命名为pRET1100、pRET1200、pRET1300、pRET1400、pRET1500、pRET1600、pRET1700、pRET1800、pRET0500、pRET1000(表3)。

其中，红串红球菌(R.erythropolis)IAM1400和IAM1503，在东京大学分子细胞生物学研究所发行的《IAM Catalogue of Strains，ThirdEdition，2004》中已有记载，可以从该研究所得到。此外，红串红球菌(R.erythropolis)JCM2893和JCM2895、以及椿象红球菌(R.rhodnii)JCM3203，在独立行政法人理化学研究所发行的《JCM Catalogue ofStrains，Eighth Edition，2002》中已有记载，可以从该研究所得到。

【表3】

(实施例2)限制性内切酶位点的确定

为了将表3中所示的质粒分类，使用各种限制性内切酶，研究限制性内切酶位点。用实施例1记载的方法分离各质粒后，由EcoRI、HindIII、PvuII、ScaI、SpHI、SmaI、SacI、BamHI及KpnI消化，通过由0.8％琼脂糖凝胶进行电泳而确认DNA片段。大小标记使用LoadingQuick DNA size Marker λ/EcoRI+HindIII double digest(东洋纺)。基于大小标记，由限制性内切酶确定切断的位点的数目及其片段的大小。将结果汇总于表4。

【表4】

()内为大小kbp

上述分析的结果是，表3中的质粒，被分类为保持与pRET1100同样的限制性内切酶位点的质粒类、保持与pRET1200同样的限制性内切酶位点的质粒类和pRET1000的3种。

(实施例3)质粒的序列和同源性检索

由于由实施例2的结果，质粒被分类为3种，即pRET1000、pRET1100和pRET1200，所以测试各质粒的序列。

首先，为了确定碱基序列，进行这些质粒类的克隆。对于红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)(IAM1400)，分离质粒(pRET1100、pRET1200)后，由SmaI和SacI消化。用0.8％琼脂糖凝胶进行电泳，确认DNA片段时，可以确认约0.5kbp、约1.7kbp、约3.7kbp、约4.9kbp的DNA片段。使用GFX^TM PCR DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Bioscience Co.Ltd.制)从琼脂糖凝胶中回收这些DNA片段，作为插入DNA。另一方面，作为载体DNA，使用由SmaI单独或由SmaI和SacI消化的pBluescript II KS(-)的产物。使用Ligation high(东洋纺)连接插入DNA和载体DNA，转化为大肠杆菌JM109。使用GFX Micro Plasmid Prep Kit(Amersham Bioscience Co.Ltd.制)筛选所得的转化体，得到各个克隆。

另一方面，对于椿象红球菌(Rhodococcus rhodnii)(JCM3203)，分离质粒(pRET1000)后，由BamHI消化。用0.8％琼脂糖凝胶进行电泳时，可以确认约2.0kbp、约3.8kbp的DNA片段。使用上述的Kit从凝胶中回收这些DNA片段，作为插入DNA。载体DNA，使用由BamHI消化pBluescript II KS(-)的产物。

质粒的插入的碱基序列确定，用引物步移法(Primer Walking)。使用的机器是ABI PRISM^TM 310NT Genetic Analyzer，使用的酶是BigDyeTerminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(ABI制)。

首先，使用P7(M13 forward，东洋纺)引物和P8(M13 reverse，东洋纺)引物译码插入的碱基序列的一部分。接着，在已译码的序列内设计引物(使用序列分析软件DNASIS Pro；日立软件公司)，使用已设计引物(合成低聚DNA)进一步译码碱基序列。重复该步骤，直到插入的碱基序列完全可以译码。插入的碱基序列译码结束后，为了分析这些插入物是怎样连接的，在各插入物的末端，以在载体方向上进行反应的方式设计引物，以从红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)(IAM1400)中分离的质粒作为模板进行PCR(使用KOD Plus)。使用GFX^TM PCR DNA and Gel Band Purification Kit精制其PCR产物，使用与在PCR中使用的引物相同的引物进行测序，分析插入物的阵列。

由测序的结果得知，pRET1100是由5444bp构成，其G+C含量为59％。在序列表的序列号73中表示确定了的全碱基序列。pRET1200是由5421bp构成，其G+C含量为62％。pRET1000是由5813bp构成，其G+C含量为67％。在序列表的序列号74中表示确定的全碱基序列。

使用DNASIS Pro进行这些被确定的碱基序列的同源性检索时，可以判断pRET1000和pRET1100是新型质粒。另一方面，pRET1200与pN30(Gene bank accession no.AF312210)有约99.6％(基于pRET1200计算)的同源性。

此外，对于pRET1000和pRET1100，基于被确定的碱基序列使用DNASIS Pro进行与公知质粒的比较。其结果是，两种质粒中，未检测到全部的限制性内切酶位点一致的质粒。

(实施例4)碱基序列的分析

分析pRET1100和pRET1000的碱基序列的结果如下所示。

在pRET1100中发现了以下的orf：

在序列号73记录的碱基序列上，由从第202个、第238个或第337个到第480个碱基序列构成的orf1(序列号1、序列号2或序列号3)；

在序列号73记录的碱基序列上，由从第477个到第758个碱基序列构成的orf2(序列号4)；

在序列号73记录的碱基序列上，由从第862个、第1294个、第1450个、第1462个、第1486个、第1489个、第1513个、第1630个、第1645个、第1687个、第2224个或第2227个到第2409个碱基序列构成的orf3(序列号5、序列号6、序列号7、序列号8、序列号9、序列号10、序列号11、序列号12、序列号13、序列号14、序列号15或序列号16)；

在序列号73记录的碱基序列上，由与从第1875个、第1734个、第1701个、第1674个或第1581个到第1444个碱基序列互补的碱基序列构成的orf4(序列号17、序列号18、序列号19、序列号20或序列号21)；

在序列号73记录的碱基序列上，由与从第2828个、第2792个、第2747个、第2594个或第2540个到第2406个碱基序列互补的碱基序列构成的orf5(序列号22、序列号23、序列号24、序列号25或序列号26)；

在序列号73记录的碱基序列上，由从第2971个或第3049个到第3306个碱基序列构成的orf6(序列号27或序列号28)；

在序列号73记录的碱基序列上，由与从第3577个或第3571个到第3053个碱基序列互补的碱基序列构成的orf7(序列号29或序列号30)；

在序列号73记录的碱基序列上，由从第3339个或第3648个分别到第3902个碱基序列构成的orf8(序列号31或序列号32)；和

在序列号73记录的碱基序列上，由从第4366个或第4477个到第5034个碱基序列构成的orf9(序列号33或序列号34)。

在pRET1000中发现了以下的orf：

在序列号74记录的碱基序列上，由与从第3350个、第3251个、第2945个或第2849个到第2412个碱基序列互补的碱基序列构成的orf10(序列号38、序列号39、序列号40或序列号41)；

在序列号74记录的碱基序列上，由与从第2365个或第2332个到第2159个碱基序列互补的碱基序列构成的orf11(序列号42或序列号43)；

在序列号74记录的碱基序列上，由从第3197个到第3526个碱基构成的orf12(序列号44)；

在序列号74记录的碱基序列上，由与从第4035个或第3996个到第3679个碱基序列互补的碱基序列构成的orf13(序列号45或序列号46)；

在序列号74记录的碱基序列上，由与从第4621个、第4654个、或第4666个到第4830个碱基序列构成的orf14(序列号48、序列号49、或序列号50)；

在序列号74记录的碱基序列上，由与从第5161个或第5062个到第4709个碱基序列互补的碱基序列构成的orf15(序列号51或序列号52)；

在序列号74记录的碱基序列上，由从第2331个或第2334个到第2618个碱基序列构成的orf16(序列号53或序列号54)；

在序列号74记录的碱基序列上，由从第2907个到第3242个碱基序列构成的orf17(序列号55)；

在序列号74记录的碱基序列上，由从第1650个、第1689个、第1713个、第1827个或第1875个到第2162个碱基序列构成的orf18(序列号56、序列号57、序列号58、序列号59或序列号60)；

在序列号74记录的碱基序列上，由从第1906个到第2169个碱基序列构成的orf19(序列号61)；

在序列号74记录的碱基序列上，由与从第810个到第553个碱基序列互补的碱基序列构成的orf20(序列号62)；

在序列号74记录的碱基序列上，由从第117个、第147个、第306个、第456个、第5144个、第5276个或第5534个到第656个碱基序列的orf21(序列号63、序列号64、序列号65、序列号66、序列号67、序列号68或序列号69)。

在pRET1100中的DNA复制区域，是由序列号35记录的碱基序列(从第2410个到3200个)、序列号36记录的碱基序列(从第1000个到1500个)、或序列号37记录的碱基序列(从第5000个到500个)表示的区域。在pRET1000中的DNA复制区域，是由序列号70记录的碱基序列(从第3355个到3507个)、序列号71记录的碱基序列(从第4290个到4350个)、或序列号72记录的碱基序列(从第3570个到3894个)表示的区域。

由此可知，pRET1000(序列号74)的碱基序列上，从第5144个到第656个碱基序列(序列号67)的区域和从第4381个到第4830个碱基序列(序列号47)的区域，是与mobilization protein(接合蛋白质)具有同源性，与接合相关的。

再者，pRET1000(序列号74)的碱基序列上，从第4260个到第4339个碱基序列(序列号75)的区域，可以推断DNA的二次结构，由此可知上述mobilization protein基因的表达和表达的蛋白质的识别部位。

另一方面，由此可知，pRET1100(序列号73)的碱基序列上，从第761个到第868个碱基序列(序列号76)的区域是有关复制相关的蛋白质的表达的启动子。

(实施例5)穿梭载体的构建

为了构建红球菌属菌与大肠杆菌间的穿梭载体，使用红球菌属菌的质粒pRET1000、pRET1100和pRET1200与大肠杆菌的质粒pUC18、pHSG299和pHSG398进行以下的实验。

首先，从红串红球菌(R.erythropolis)的质粒制备DNA片段。即，从红串红球菌(R.erythropolis)(IAM1400)取得质粒pRET1100和pRET1200后，通过使用Alw44I，在37℃下对pRET1100进行2小时消化，使用Blunting high(东洋纺)平端化，另一方面，pRET1200使用BspLU11I在48℃下消化2小时，使用Blunting high平端化，得到红串红球菌(R.erythropolis)质粒的DNA片段。在TE溶液中溶解各DNA片段。

另一方面，对于pRET1000，从椿象红球菌(R.rhodnii)(JCM3203)取得质粒pRET1000后，使用DrdI在37℃下对pRET1000进行2个小时消化，使用Bluntinghigh平端化，得到pRET1000的DNA，将其溶解于TE溶液中。

接着，从大肠肝菌(E.coli)质粒制备DNA片段。即，pUC18(含有耐氨苄青霉素基因(Amp^r))是通过使用SmaI在30℃下进行2小时消化，pHSG299(含有耐卡那霉素基因(Km^r))和pHSG398(含有耐氯霉素基因(Cm^r))是通过使用HincII在37℃下进行2小时消化，而得到大肠肝菌(E.coli)的质粒的DNA片段，溶解在TE中。

将如上述制备的来自红球菌属菌和大肠杆菌的质粒的DNA片段连接后，转化为大肠肝菌(E.coli)DH5α，涂布30μL的0.1M IPTG(异丙基-β-半乳糖苷)和4％的X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷)，在含有100μg/mL的卡那霉素、100μg/mL的氨苄青霉素或30μg/mL的氯霉素的LB(1％色氨酸、0.5％酵母提取物、1％氯化钠；pH7.2)琼脂培养基中平板接种，在30℃下放置60小时。选择出现的菌落中的白色菌落，在含有100μg/mL的卡那霉素、100μg/mL的氨苄青霉素或30μg/mL的氯霉素的LB液体培养基中，30℃振荡培养60小时。使用GFX^TM Micro Plasmid Prep Kit(Amersham Bioscience Co.Ltd.制，在商品所附资料的条件下精制)从所得的培养液中精制DNA。将所得的DNA用0.8％琼脂糖凝胶电泳确认。在表5中表示所得的穿梭载体，在图3～5中表示使用pRET1100的各穿梭载体的制作方法。

【表5】

将由pRET1100和pUC18、pHSG299或pHSG398构建的穿梭载体分别命名为pRET1101(序列号89)、pRET1102(序列号90)或pRET1103(序列号91)。其中，pRET1101是显示耐氨苄青霉素的穿梭载体，pRET1102是显示耐卡那霉素性的穿梭载体，pRET1103是显示耐氯霉素性的穿梭载体。此外，将pRET1101～1103的各大肠杆菌基因和pRET1100的结合方法相反(Rv)的穿梭载体分别命名为pRET1101Rv(序列号92)、pRET1102Rv(序列号93)和pRET1103Rv(序列号94)。

同样，将使用pRET1000和pRET1200构建的穿梭载体分别命名为pRET1001～pRET1003(序列号95～序列号97)和pRET1001Rv～pRET1003Rv(序列号98～序列号100)以及pRET1201～pRET1203和pRET1201Rv～pRET1203Rv(表5)。

(实施例6)对红串红球菌(R.erythropolis)的转化方法的研究

使用在实施例5中所得的红球菌属菌-大肠肝菌(E.coli)的穿梭载体，转化红串红球菌(R.erythropolis)MAK-34菌株(MAK-34；保藏号FERM BP-7451，在经济产业省产业技术综合研究所生命工学工业技术研究所(现为独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心)于平成13年2月15日保藏)。作为基因导入方法，研究电穿孔法。

首先，在5mL的GPY培养基中植菌红串红球菌(R.erythropolis)MAK-34菌株，在30℃下振荡培养36小时。将该培养液1mL移植到100mL的LB培养基中，在30℃下以200rpm培养10小时。通过离心分离(12krpm，5分钟，4℃)回收培养的菌体，用超纯水清洗回收的菌体2次。通过离心分离(12krpm，5分钟，4℃)回收清洗完成的菌体，在2.4mL的10％甘油溶液中悬浊。将以每30μL分注悬浊液，在-80℃下冻结作为感受态细胞。

将制作的感受态细胞90μL和穿梭载体(pRET1001、pRET1002、pRET1003、pRET1101、pRET1102、pRET1103、pRET1201、pRET1202和pRET1203)5μL在冰上混合。将混合溶液在冰上冷却，静静流入的0.1cm的比色皿中，置于Gene Pulser II Electroporation System(BIO-RAD制)。以20kV/cm、400Ω、25μF加脉冲，立即加入300μL的LB培养基，在25℃下放置3小时。

将该菌悬浊液的一部分在含有抗生素物质的LB平板(100μg/mL的卡那霉素、100μg/mL的氨苄青霉素或30μg/mL的氯霉素)上平板接种。其结果是，使用具有耐卡那霉素基因的pRET1002、pRET1102和pRET1202时，可以得到菌落。此外，为了确认该得到的菌落是否保持质粒，分离质粒确认，确认保持全部穿梭载体。

由上可知，通过电穿孔可以转化红串红球菌(R.erythropolis)，并且pRET1002、pRET1102和pRET1202作为穿梭载体发挥功能。

(实施例7)氨基酮不对称还原酶基因(mak gene)的取得

为了在表5中所示的穿梭载体中插入mak gene，从红串红球菌(R.erythropolis)MAK-34菌株中分离mak gene。

最初时，进行红串红球菌(R.erythropolis)MAK-34菌株的基因组DNA的取得。在5mL的GPY培养基中进行红串红球菌(R.erythropolis)MAK-34菌株的植菌，在30℃下振荡培养48小时后，移植该培养液到100mL的GPY培养基中，在30℃下以200rpm培养10小时。使用Genomic DNA Buffer set和Genomic-tip 500/G(QIAGEN)取得基因组DNA。

接着，以取得的基因组DNA为模板，使用KOD-plus-进行PCR。引物是MAKF1(5’-GAATCTTCTCGTTGATGCAGATCAGGTC-3’；序列号80)和MAKR2(5’-CTGACTCCGTAGTGTTCTGCCAGTTC-3’；序列号81)，以退火温度68℃、伸长反应1分50秒进行PCR。将所得的PCR产物进行苯酚/氯仿处理和乙醇沉淀后，使用SmaI在30℃下消化2小时，与pUC18混合，使用Ligation High进行连接。使用Competent high(东洋纺)转化大肠肝菌(E.coli)DH5α，在涂布30μL的0.1M IPTG和4％的X-gal的LB琼脂培养基(含有100μg/mL的氨苄青霉素)上进行平板接种，在30℃下放置60小时。选择出现的菌落中的白色菌落，在含有100μg/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基中30℃振荡培养60小时。使用GFX^TM Micro Plasmid Prep Kit从所得的培养液中精制DNA。将所得的DNA用0.8％琼脂糖凝胶电泳确认。将所得的克隆命名为pMAK-1。

(实施例8)表达载体的构建-1

在表5中所示的穿梭载体中插入启动子和氨基酮不对称还原酶基因(mak gene)。

首先，构建含有mak gene的上游约400bp的表达载体(无外来启动子)的质粒。

使用SmaI在30℃下用2小时消化pMAK-1，进一步使用PstI在37℃下用2小时消化。将该溶液以0.8％琼脂糖凝胶供给电泳。DNA大小标记使用Loading Quick DNA size Marker λ/EcoRI+HindIII doubledigest。电泳后，将约1.4kbp的DNA片段用GFX^TM PCR DNA and GelBand Purification Kit精制，将其作为插入DNA使用。另一方面，载体是使用将pRET1102用HincII和PstI以37℃进行2小时消化的产物。将这些DNA片段用Ligation High进行连接，用Competent high转化大肠肝菌(E.coli)DH5α。在含有100μg/mL的卡那霉素的LB琼脂培养基上进行平板接种，在30℃下放置60小时。

将出现的菌落用含有100μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基在30℃下振荡培养60小时。用GFX^TM Micro Plasmid Prep Kit从所得的培养液精制DNA。将所得的DNA用0.8％琼脂糖凝胶电泳确认。

筛选是将未经限制性内切酶处理的所得的DNA和使用PstI在37℃消化2小时的所得的DNA供给0.8％琼脂糖凝胶电泳，由所得的DNA的大小得到目的质粒。此时，大小标记使用Loading Quick DNA sizeMarker λ/EcoRI+HindIII double digest，以及pRET1102和用PstI以37℃进行2小时消化的pRET1102。将这样得到的质粒命名为pRET1104。

(实施例9)表达载体的构建-2

由于载体的缩小在表达载体的改良、基因改变、转化效率提高以及在菌体内的复制等中有效，因此进行穿梭载体的缩小。

首先，进行穿梭载体pRET1102的缩小。将pRET1102用BamHI和HincII消化2小时后供给0.8％琼脂糖凝胶电泳，将约2.7kbp的DNA片段用GFX^TM PCR DNA and Gel Band Purification Kit回收，制备pRET1102的DNA片段。此时，大小标记使用Loading Quick DNA sizeMarker λ/EcoRI+HindIII double digest。

另一方面，由大肠杆菌复制的DNA片段，是通过将pHSG299用BamHI和HincII消化2小时后供给0.8％琼脂糖凝胶电泳，将约2.7kbp的DNA片段用GFX^TM PCR DNA and Gel Band Purification Kit回收制备的。

将这些DNA片段用Ligation High进行连接，用Competent high转化大肠杆菌JM109，在涂布有30μL的0.1M IPTG和4％X-gal的含有100μg/mL的卡那霉素的LB琼脂培养基上进行平板接种，在30℃下放置48小时。

选择出现的菌落中的白色菌落，用含有100μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基在30℃下振荡培养48小时。由所得的培养液用GFX^TMMicro Plasmid Prep Kit精制DNA。将由此得到的pRET1102的缩小穿梭载体命名为pRET1123(约5.3kbp)。

接着，进行穿梭载体pRET1202的缩小。来源于红球菌属菌的DNA片段，是通过将pRET1202用EcoRI消化2小时，进一步用DraIII消化2小时后，用Blunting High平端化，供给0.8％琼脂糖凝胶电泳后，将约3.7kbp的DNA片段用GFX^TM PCR DNA and Gel Band PurificationKit回收而制备。此时，大小标记使用Loading Quick DNA size Markerλ/EcoRI+HindIII double digest。将该DNA片段插入pHSG299的HincII位点。连接后，用Competent high转化大肠杆菌DH5α，在涂布有30μL的0.1M IPTG和4％X-gal的含有100μg/mL的卡那霉素的LB琼脂培养基上进行平板接种，在30℃下放置72小时。选择出现的菌落中的白色的菌落，在含有100μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基中，在30℃下振荡培养72小时。由所得的培养液用GFX^TM Micro Plasmid Prep Kit进行DNA精制。将由筛选所得的质粒用SacI、BamHI、PstI或EcoRI消化2小时，全部的克隆来源于红球菌属菌的区域中，EcoRI位点侧约500bp被削除。将该质粒命名为pRET1204(约5.9kbp)。其中，不能取得红球菌属菌复制区域未被削除的克隆。

同样，进行穿梭载体pRET1002的缩小，得到pRET1006(约4.9kbp)。

使用这3种的缩小质粒pRET1006、pRET1123和pRET1204转化红串红球菌，采用实施例6记载的方法确认是否保持穿梭载体时，确认保持有穿梭载体。由此可知，3种缩小质粒pRET1006、pRET1123和pRET1204在红串红球菌中复制。

(实施例10)表达载体的构建-3

向在实施例9中构建的穿梭载体插入mak gene，构建表达载体。

为了在阶段1中克隆启动子，使在实施例9中构建的pRET1123的PstI位点缺损。用PstI用2小时消化pRET1123后，用Blunting High平端化，用Ligation High进行连接。将该溶液用Competent high转化大肠杆菌JM109，在含有100μg/mL的卡那霉素的LB平板上在30℃下培养36小时。将形成的菌落培植在含有100μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基中，在30℃下培养24小时后，用GFX^TM Micro Plasmid PrepKit进行DNA精制，作为pRET1132。

其中，取得的pRET1132，用PstI消化1小时后，供给0.8％琼脂糖凝胶电泳，可以确认pRET1132未被PstI切断。此时，作为控制，使用未PstI处理的pRET1123和pRET1132、以及PstI处理过的pRET1123。

(实施例11)表达载体的构建-4

构建在上述穿梭载体中插入有启动子和mak gene的克隆。

为了插入启动子，构建在mak gene上游具有PstI位点的克隆。为了得到在氨基酮不对称还原酶的C末端加成有His-Tag的克隆，进行以下操作。以实施例7中得到的pMAK-1为模板，以MAKPstF(5’-GACCACTGCAGATCAATCAACTCTGATGAGGTCC-3’；序列号82)和MAKHisBglIIR(5’-CGCTTAGATCTCAGTTCGCCGAGCGCCATCGCCG-3’；序列号83)为引物，使用KOD-plus-，以退火温度68℃、拉伸反应1分50秒进行PCR。将所得的PCR产物用BglII在37℃下消化2小时的PCR片段(插入)和pQE70(用SpHI在37℃下消化2小时，用Blunting High平端化，然后用BglII在37℃下消化2小时)，用Ligation High进行连接，用Competent high转化大肠肝菌(E.coli)DH5α，在含有100μg/mL的氨苄青霉素的LB琼脂培养基上进行平板接种，在30℃下放置60小时。将出现的菌落用含有100μg/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基在30℃下振荡培养60小时。由所得的培养液用GFX^TM Micro Plasmid Prep Kit进行DNA精制。将所得的DNA用0.8％琼脂糖凝胶电泳确认。

筛选是，将未经限制性内切酶处理的所得的DNA以及使用PstI和BglII在37℃消化2小时的物质供给0.8％琼脂糖凝胶电泳，由所得的DNA的大小得到目的质粒。将这样得到的质粒命名为pMAK-2。大小标记使用Loading Quick DNA size Marker λ/EcoRI+HindIII doubledigest，以及pQE70和用BglII以37℃消化2小时的pQE70。

其中，构建在pMAK-2的EcoRI-PstI位点上插入有pRET1200的RepA启动子(pRET1204中、被编码为来源于红球菌属菌的DNA片段的repA的方向，以与被编码为pHSG299的耐卡那霉素性基因相同方向的克隆为模板，以P1200rep-Pst5195(5’-AGCCGCTGCAGAAGCAACACCGCATCCGCCCATTG-3’；序列号84)和P7(5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’；序列号85)为引物，以退火温度60℃、拉伸反应1分钟进行PCR增幅后，用EcoRI和PstI在37℃下消化2小时的产物)的克隆(命名为pMAK-19)。

接着，以pMAK-19为模板，以pQE70F1(5’-GGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCACC-3’；序列号86)和pQE70R1135Bm(5’-GGTTGGATCCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAG-3’；序列号87)为引物，在PCR酶上使用KOD-plus-，以退火温度60℃，拉伸反应3分钟进行PCR。采用GFX^TM PCR DNA and Gel Band Purification KiT从该反应液精制PCR产物，将精制的PCR产物用EcoRI和BamHI进行2小时消化后，供给0.8％琼脂糖电泳，将DNA片段用GFX^TM PCR DNA andGel Band Purification Kit精制。插入该DNA片段。

另一方面，表达穿梭载体用的载体，使用将用EcoRI和BamHI以2小时消化pRET1132的DNA片段供给0.8％琼脂糖电泳，用GFX^TMPCR DNA and Gel Band PuRificaTion Kit精制的DNA片段。将这些插入片段与载体混合，用Ligation High连接后，用Competent High转化大肠杆菌(E.coli)JM109，在含有100μg/mL的卡那霉素的LB平板上进行平板接种。通过将所得的菌落用含有100μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基培养后，用GFX^TM Micro Plasmid Prep Kit回收质粒DNA，进行0.8％琼脂糖电泳进行筛选。大小标记使用Loading Quick DNA sizeMarkerλ/EcoRI+HindIII double digest和pRET1132。将这样得到的表达载体命名为pRET1133。

此外，将pMAK-19用EcoRI和HindIII在37℃下进行2小时消化后，用Blunting high平端化，供给0.8％琼脂糖电泳，将约1.6kbp的DNA片段用GFX^TM PCR DNA and Gel Band Purification Kit精制。将该片段插入到pRET1102的HincII位点的克隆命名为pRET1114。

再者，进行pRET1133的启动子的改良。被编码为pRET1133的MAK基因表达的启动子，为在pRET1200的repA基因的启动子中约800bp的长度，构建该启动子缺损约200bp的质粒。在该克隆中使用的启动子的制备用PCR进行。以质粒pRET1200为模板，对于引物使用P1204rep-Ec2958(5’-CGCGGAATTCGACCACCACGCACGCACACCGCAC-3’；序列号88)和P1200rep-Pst5195(5’-AGCCGCTGCAGAAGCAACACCGCATCCGCCCATTG-3’；序列号84)，对于PCR酶使用KOD-plus-，以退火温度60℃、拉伸反应50秒进行PCR。将PCR产物用GFX^TM PCR DNA and Gel Band Purification Kit精制，用限制性内切酶EcoRI和PstI进行2小时消化后，供给1.6％琼脂糖电泳，将DNA片段用GFX^TM PCR DNA and Gel Band Purification Kit精制。将该DNA片段作为插入片段。在序列号77中表示了在该DNA片段中所含的启动子区域的碱基序列。

另一方面，对于载体，将pRET1133用限制性内切酶EcoRI和PstI进行2小时消化后，供给0.8％琼脂糖电泳，将约7.2kbp的DNA片段用GFX^TM PCR DNA and Gel Band Purification Kit精制。大小标记使用Loading Quick DNA size Markerλ/EcoRI+HindIII double digest。

将这样得到的插入片段和载体用Ligation High连接，用CompetentHigh转化大肠杆菌(E.coli)JM109，在含有100μg/mL的卡那霉素的LB平板上进行平板接种。通过将所得的菌落在含有100μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基中培养后，用GFX^TM Micro Plasmid Prep Kit回收质粒DNA，进行0.8％琼脂糖电泳而进行筛选。大小标记使用Loading Quick DNA size Markerλ/EcoRI+HindIII double digest和pRET1133。

进一步，将所得的DNA用限制性内切酶EcoRI和PstI进行2小时消化后，进行1.6％琼脂糖电泳，确认了相当约600bp的插入片段的DNA片段。大小标记使用100bp DNA Ladder。将这样所得的表达载体命名为pRET1138。

(实施例12)重组红串红球菌的转化和活性测定

使用上述的表达载体pRET1102、pRET1104、pRET1114和pRET1138转化红串红球菌MAK-34菌株和R.erythropolis JCM2895

(由独立行政法人理化学研究所分售)，进行活性测定。由MAK-34菌株精制的氨基酮不对称还原酶，如国际公开WO02/070714所记载的，具有作用于1-2-甲基氨基-1-苯基-1-丙酮，生成d-(1S，2S)-伪麻黄碱的能力。其它可以确认，作用于1-2-二甲基氨基苯丙酮、1-氨基-2-丁酮等，分别生成对应的β-氨基醇。

活性测定是，制备菌量O.D.＝5、2％葡萄糖和0.2M磷酸钠缓冲液(pH6.0)的反应液，使在该反应中作为底物含有3％的(1S，2S)-2-(N-乙基氨基)-1-苯基-1-丙醇(EAM)。有关EAM，在J.Am.Chem.Soc.，vol.50，pp.2287-2292，1928中记载其合成方法。将反应液在30℃下进行16小时振荡反应。反应生成物的β-氨基醇的(1S，2S)-2-(N-乙基氨基)-1-苯基-1-丙醇(EPE)的确认用HPLC进行。色谱柱为Inertsil PH-33.0×75mm，洗提液是7％乙腈水溶液和0.05M的磷酸钠缓冲液(pH6.0)，检测用UV(220nm)进行。

在表6中表示该活性测定的结果。导入不具有外来启动子区域的pRET1104的重组体，显示与导入不具有作为对照的mak gene的pRET1102的重组体基本相同的活性，未发现重组酶的表达。

在MAK-34菌株中导入pRET1114时，确认有高于pRET1104的比活性。这表示，在载体中插入的pRET1200的repA启动子区域，作为启动子发挥功能。

导入pRET1138时，重组红串红球菌MAK-34菌株的比活性为37.7μg/h·mL/O.D.，重组红串红球菌JCM2895菌株的比活性为34.9μg/h·mL/O.D.，可以确认在红串红球菌株中的酶的表达。

【表6】

载体	MAK-34菌株	JCM2895
			pRET1102	1.0	1.0
pRET1104	0.7	2.0
			pRET1114	17.2	not tested
pRET1138	37.7	34.9

比活性(单位：μg/h·mL/O.D.)

(实施例13)酶的精制

将在实施例12中所得的重组菌体在含有100μg/mL的卡那霉素的LB培养基100mL中以30℃、4日培养，以12000rpm进行5分钟离心分离集菌，用The QIAexpressionist Kit(QIAGEN Company制)精制加成有His-tag的蛋白质。具体来说，通过超声波处理破碎菌体，通过离心分离得到其上清液，通过镍螯合物(Nickel chelate)色谱柱精制蛋白质。将所得的蛋白质供给SDS-PAGE时，可以发现分子量约28000的蛋白质带。该分子量，与国际公开WO02/070714中记载的氨基酮不对称还原酶的分子量基本相同，表示氨基酮不对称还原酶在重组红球菌中产生。

(实施例14)由酶制造β-氨基醇

将含有在实施例13中所得的精制酶(0.5μg/mL)、5mM的NADPH、120mM Tris-HCl(pH7.5)和5mM EAM的反应液0.5mL，在37℃下反应16小时。底物和生成物(EPE)的分析用HPLC进行。色谱柱是InertsilPH-3 3.0×75mm，洗提液是7％乙腈水溶液和0.05M磷酸钠缓冲液(pH6.0)，检测用UV(220nm)进行。其结果是，确认有EPE生成。

同样，将由精制酶或在实施例13中记载的培养所得的重组体的破碎酶粗提取液作用于1-2-二甲基氨基苯丙酮、1-氨基-2-丙酮等，确认可以制造对应的β-氨基醇。

产业上的可利用性

如上述说明，本发明的质粒和穿梭载体，是来源于红球菌属菌(特别是，红串红球菌或椿象红球菌)的物质，利用其可以将同菌通过重组而改变，可以更有效地制造产生氨基酮不对称还原酶的菌株。此外，可以在转化体中大量生产含有氨基酮不对称还原酶的有用酶。

序列表

<110>第一精密化学股份有限公司

<120>新型质粒及其利用

<130>FP04-0397

<150>JP 2003-373476

<151>2003-10-31

<160>100

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>279

<212>DNA

<213>红串红球菌

<220>

<221>misc_feature

<223>202bp to 480bp pRET1100

<400>1

atgactctga gggtggacga accggagtcg gtgagaatgc ttcatccgag cgcttccccg 60

gaagactgtg ccctggtcga gaccttcaag cctggtacct gccttttcga gaagccagga 120

gaaggccggc agattatgcg atgcgacttt gtcggcgagt acgggagata tgcgcgagcc 180

atcgagtctt cggatctgcg ttttctcgcc accctccagc aagaccaggc ccaacgcgaa 240

ttcttcgctg aggagttcgg tgtggtggat ccgtcatga 279

<210>2

<211>243

<212>DNA

<213>红串红球菌

<220>

<221>misc_feaure

<223>238bp to 480bp pRET1100

<400>2

atgcttcatc cgagcgcttc cccggaagac tgtgccctgg tcgagacctt caagcctggt 60

acctgccttt tcgagaagcc aggagaaggc cggcagatta tgcgatgcga ctttgtcggc 120

gagtacggga gatatgcgcg agccatcgag tcttcggatc tgcgttttct cgccaccctc 180

cagcaagacc aggcccaacg cgaattcttc gctgaggagt tcggtgtggt ggatccgtca 240

tga 243

<210>3

<211>144

<212>DNA

<213>红串红球菌

<220>

<221>misc_feature

<223>337bp to 480bp pRET1100

<400>3

atgcgatgcg actttgtcgg cgagtacggg agatatgcgc gagccatcga gtcttcggat 60

ctgcgttttc tcgccaccct ccagcaagac caggcccaac gcgaattctt cgctgaggag 120

ttcggtgtgg tggatccgtc atga 144

<210>4

<211>282

<212>DNA

<213>红串红球菌

<220>

<221>misc_feature

<223>477bp to 758bp pRET1100

<400>4

atgactggac cacaggagag aaagcgcaag gcggcgaagc cgtcgcggga gcctcagttg 60

aactgctgtg aagcggacgt gccgaaacga gcaaaacagc ccccggttcc ctctacgttc 120

gacctgctca cggtgaagga gactgcgggg ctgctgagag tcagtcaggc aactctttac 180

cggctgcttc ggagtgggga aggacccaca tacacacgga tcggtggaca gatacgcgtt 240

caccgcgagt cgctgcgtcg gttcatcgaa ccgcgtggat aa 282

<210>5

<211>1548

<212>DNA

<213>红串红球菌

<220>

<221>misc_feature

<223>862bp to 2409bp pRET1100

<400>5

atgcacttcc acgataacgc agaggtcgga caagagggaa gaactgccgt tctctcgccg 60

ttgcgcggcg tagccgccaa gcgggacgtg tctgacgatg cagcgaagcg gagtcggcag 120

gcgcggcacg cgcctgggct tgttacatct gccacaactg tccgtgaatc tctgccagct 180

cctgaaaccg ctggtcaggg ccttgcggaa tccgtgaccg ctgatgattt ttggtctcat 240

tcgttccccc gcgctgacga tgtacgcggc gcagctgctt ccttccagtc ggtggctaac 300

tgggatgggc gtgagggtcc gaggccgcgt ttcgttgtcg cgcctggcgt tgtccgcttg 360

gaggtttgtg atctcgcacg ccgcgaacga acggctgaac gtgcgtatct ggctgctcgg 420

gctcgggtgg atatggcggc tgccaggcat aactcgccgt acgacttcga cgtggacgat 480

gaagagttgg cggaactggc ttctctgcaa ggcctcgagg acgacgacat tgggggctgg 540

tctgcggaga gggaaatagt gggctggtct gctcgttctc ggtcacggat gatcttgcga 600

atggcagaac tcgactgggc tcccatgatg gatttgccgg gcattcctgc gatggtgacc 660

ctcacctatc cgggggactg gcttacggtt gcccccaccg gcgctgaggt caaaaaacat 720

ctccagacgt tcttcaaacg gttccaacgg gcctggggca ttgcctggat gggtgcgtgg 780

aaaatggagt tccaaagccg aggcgctccg cattttcacc tgtacatggt ccctcctcat 840

gggaaggcag gagactcgcg gaagctgcgg catgatgctg agctcttgaa atgggagata 900

gcacgtgcag agggtgaaga cccaggtcgc aggccgtatt tccgggaagc tccaagcgat 960

ggattgaagt ttcgtccgtg gctttctgcg gtgtgggccg acgtcgtaga tcatccggac 1020

cccaaggaaa aagaaaagca cgtcagtgcc ggcactggag tggactacgc ggagggcacg 1080

cgagggtcag atccgaaaag gcttgcggtg tacttctcca agcatggaac ctttgccgac 1140

aaggaatatc agcacgtagt tcctgctcaa tggcagaaaa cgggtgcggg acctggcagg 1200

ttctggggct accgcggttt gtcgccggcc acggctgcca ccgagatttc ctgggatgag 1260

tacctgcttt tatctcgcac gttgcgacga ttgtcagcgc gaacgaagat ctgggacccg 1320

gctttacgag gcggtagcgg cggccacaga tggactaagg cgatgatgcg acgcacggtt 1380

acccggcacc gcttggacct cgtgaccggt gagattctgg gcacgaagac gcggaaggtt 1440

cgggcgccag tgaagaggtt tgtccggact tcgggatacc tgtgtgtcaa tgacgggccc 1500

gcactggctc gaaccctcag ccgtcttcgt acaagctgcc tgagctag 1548

<210>6

<211>1116

<212>DNA

<213>红串红球菌

<220>

<221>misc_feature

<223>1294bp to 2409bp pRET1100

<400>6

atggcggctg ccaggcataa ctcgccgtac gacttcgacg tggacgatga agagttggcg 60

gaactggctt ctctgcaagg cctcgaggac gacgacattg ggggctggtc tgcggagagg 120

gaaatagtgg gctggtctgc tcgttctcgg tcacggatga tcttgcgaat ggcagaactc 180

gactgggctc ccatgatgga tttgccgggc attcctgcga tggtgaccct cacctatccg 240

ggggactggc ttacggttgc ccccaccggc gctgaggtca aaaaacatct ccagacgttc 300

ttcaaacggt tccaacgggc ctggggcatt gcctggatgg gtgcgtggaa aatggagttc 360

caaagccgag gcgctccgca ttttcacctg tacatggtcc ctcctcatgg gaaggcagga 420

gactcgcgga agctgcggca tgatgctgag ctcttgaaat gggagatagc acgtgcagag 480

ggtgaagacc caggtcgcag gccgtatttc cgggaagctc caagcgatgg attgaagttt 540

cgtccgtggc tttctgcggt gtgggccgac gtcgtagatc atccggaccc caaggaaaaa 600

gaaaagcacg tcagtgccgg cactggagtg gactacgcgg agggcacgcg agggtcagat 660

ccgaaaaggc ttgcggtgta cttctccaag catggaacct ttgccgacaa ggaatatcag 720

cacgtagttc ctgctcaatg gcagaaaacg ggtgcgggac ctggcaggtt ctggggctac 780

cgcggtttgt cgccggccac ggctgccacc gagatttcct gggatgagta cctgctttta 840

tctcgcacgt tgcgacgatt gtcagcgcga acgaagatct gggacccggc tttacgaggc 900

ggtagcggcg gccacagatg gactaaggcg atgatgcgac gcacggttac ccggcaccgc 960

ttggacctcg tgaccggtga gattctgggc acgaagacgc ggaaggttcg ggcgccagtg 1020

aagaggtttg tccggacttc gggatacctg tgtgtcaatg acgggcccgc actggctcga 1080

accctcagcc gtcttcgtac aagctgcctg agctag 1116

<210>7

<211>960

<212>DNA

<213>红串红球菌

<220>

<221>misc_feature

<223>1450bp to 2409bp pRET1100

<400>7

atgatcttgc gaatggcaga actcgactgg gctcccatga tggatttgcc gggcattcct 60

gcgatggtga ccctcaccta tccgggggac tggcttacgg ttgcccccac cggcgctgag 120

gtcaaaaaac atctccagac gttcttcaaa cggttccaac gggcctgggg cattgcctgg 180

atgggtgcgt ggaaaatgga gttccaaagc cgaggcgctc cgcattttca cctgtacatg 240

gtccctcctc atgggaaggc aggagactcg cggaagctgc ggcatgatgc tgagctcttg 300

aaatgggaga tagcacgtgc agagggtgaa gacccaggtc gcaggccgta tttccgggaa 360

gctccaagcg atggattgaa gtttcgtccg tggctttctg cggtgtgggc cgacgtcgta 420

gatcatccgg accccaagga aaaagaaaag cacgtcagtg ccggcactgg agtggactac 480

gcggagggca cgcgagggtc agatccgaaa aggcttgcgg tgtacttctc caagcatgga 540

acctttgccg acaaggaata tcagcacgta gttcctgctc aatggcagaa aacgggtgcg 600

ggacctggca ggttctgggg ctaccgcggt ttgtcgccgg ccacggctgc caccgagatt 660

tcctgggatg agtacctgct tttatctcgc acgttgcgac gattgtcagc gcgaacgaag 720

atctgggacc cggctttacg aggcggtagc ggcggccaca gatggactaa ggcgatgatg 780

cgacgcacgg ttacccggca ccgcttggac ctcgtgaccg gtgagattct gggcacgaag 840

acgcggaagg ttcgggcgcc agtgaagagg tttgtccgga cttcgggata cctgtgtgtc 900

aatgacgggc ccgcactggc tcgaaccctc agccgtcttc gtacaagctg cctgagctag 960

<210>8

<211>948

<212>DNA

<213>红串红球菌

<220>

<221>misc_feature

<223>1462bp to 2409bp pRET1100

<400>8

atggcagaac tcgactgggc tcccatgatg gatttgccgg gcattcctgc gatggtgacc 60

ctcacctatc cgggggactg gcttacggtt gcccccaccg gcgctgaggt caaaaaacat 120

ctccagacgt tcttcaaacg gttccaacgg gcctggggca ttgcctggat gggtgcgtgg 180

aaaatggagt tccaaagccg aggcgctccg cattttcacc tgtacatggt ccctcctcat 240

gggaaggcag gagactcgcg gaagctgcgg catgatgctg agctcttgaa atgggagata 300

gcacgtgcag agggtgaaga cccaggtcgc aggccgtatt tccgggaagc tccaagcgat 360

ggattgaagt ttcgtccgtg gctttctgcg gtgtgggccg acgtcgtaga tcatccggac 420

cccaaggaaa aagaaaagca cgtcagtgcc ggcactggag tggactacgc ggagggcacg 480

cgagggtcag atccgaaaag gcttgcggtg tacttctcca agcatggaac ctttgccgac 540

aaggaatatc agcacgtagt tcctgctcaa tggcagaaaa cgggtgcggg acctggcagg 600

ttctggggct accgcggttt gtcgccggcc acggctgcca ccgagatttc ctgggatgag 660

tacctgcttt tatctcgcac gttgcgacga ttgtcagcgc gaacgaagat ctgggacccg 720

gctttacgag gcggtagcgg cggccacaga tggactaagg cgatgatgcg acgcacggtt 780

acccggcacc gcttggacct cgtgaccggt gagattctgg gcacgaagac gcggaaggtt 840

cgggcgccag tgaagaggtt tgtccggact tcgggatacc tgtgtgtcaa tgacgggccc 900

gcactggctc gaaccctcag ccgtcttcgt acaagctgcc tgagctag 948

<210>9

<211>924

<212>DNA

<213>红串红球菌

<220>

<221>misc_feature

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<213>红串红球菌

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<213>红串红球菌

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<213>红串红球菌

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<213>红串红球菌

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<213>红串红球菌

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<213>红串红球菌

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<213>红串红球菌

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<213>红串红球菌

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<213>红串红球菌

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<213>红串红球菌

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<213>红串红球菌

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<213>椿象红球菌

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<213>椿象红球菌

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<213>椿象红球菌

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<213>椿象红球菌

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<213>椿象红球菌

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<213>椿象红球菌

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<213>椿象红球菌

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<213>椿象红球菌

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<213>椿象红球菌

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<213>椿象红球菌

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<213>椿象红球菌

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<213>椿象红球菌

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<213>椿象红球菌

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<213>椿象红球菌

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<213>椿象红球菌

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<213>椿象红球菌

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<213>椿象红球菌

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<213>椿象红球菌

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<212>DNA

<213>椿象红球菌

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<212>DNA

<213>椿象红球菌

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<212>DNA

<213>椿象红球菌

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atgaatggct acagcttcaa cctgcccggc tacgtcgacg ccgccgggga gccgatctgg 60

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cagtacgcga ccgcaaaagc ccaagcagaa cgcgccgcga aggccaagga cgccgcgaaa 540

tggaccgagg tcgccggcgg cggctaccag cgggacgtgc gcgggatgaa cctgcgactg 600

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ccggcccgcc gccagggacc aaccatgccg cagtcggccc cggggtatca gccacccggc 900

cgcgaccgag gtcgagaatc cggaatggga ctgtga 936

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<212>DNA

<213>椿象红球菌

<220>

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aacacactca cacacaagat cgatttattc cggtacgaca cgccagccaa gtcagatgtt 60

tcggtttctg gagcggtcct ccagaccttt gagatccgct ccagaaacgt ccacaaatta 120

ttggggtacg tcgaaccaag ccttatcagg tat 153

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<212>DNA

<213>椿象红球菌

<220>

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gagctatgcc cagggttgcg cagtgacttc gtcactgcgt aaccctgggc gctcgcctcc 60

c 61

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<212>DNA

<213>椿象红球菌

<220>

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ccgctcgaag tccttgagtc agtgacagga ccactgctgg gctcccagcg cagaaggcaa 60

gtgaaggcag acgactgcgg gaggtaagtc gggtacggca tgaggtcctt cagaagcggc 120

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tcggtgagct cgcgctgggc ggatcccacc agtagctccc cgtgccggta accgcttggg 300

gccaagcgaa gacacccacc gcggc 325

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<212>DNA

<213>红串红球菌

<220>

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<223>pRET1100Full Length

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cccgggatcc tcgagggggc agcggacgaa gacgccgcgt taggccgaaa acctgccgag 60

cgtctcgcac cccgcatttc ggcctacgtg cgtcagatag cagcgcagtc ggcaaaggct 120

ggaattcgcc ttctcctgct ctcgcaacga gcggaggcct cgatcattgg cggcaatgcg 180

cgttcgaatt tcggggtcaa gatgactctg agggtggacg aaccggagtc ggtgagaatg 240

cttcatccga gcgcttcccc ggaagactgt gccctggtcg agaccttcaa gcctggtacc 300

tgccttttcg agaagccagg agaaggccgg cagattatgc gatgcgactt tgtcggcgag 360

tacgggagat atgcgcgagc catcgagtct tcggatctgc gttttctcgc caccctccag 420

caagaccagg cccaacgcga attcttcgct gaggagttcg gtgtggtgga tccgtcatga 480

ctggaccaca ggagagaaag cgcaaggcgg cgaagccgtc gcgggagcct cagttgaact 540

gctgtgaagc ggacgtgccg aaacgagcaa aacagccccc ggttccctct acgttcgacc 600

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cctcccctgg gtcaatccgg ttaccgccgg actgggggag gcgcttcgac acctacatcc 840

gtcgcccctc gaaaggctca gatgcacttc cacgataacg cagaggtcgg acaagaggga 900

agaactgccg ttctctcgcc gttgcgcggc gtagccgcca agcgggacgt gtctgacgat 960

gcagcgaagc ggagtcggca ggcgcggcac gcgcctgggc ttgttacatc tgccacaact 1020

gtccgtgaat ctctgccagc tcctgaaacc gctggtcagg gccttgcgga atccgtgacc 1080

gctgatgatt tttggtctca ttcgttcccc cgcgctgacg atgtacgcgg cgcagctgct 1140

tccttccagt cggtggctaa ctgggatggg cgtgagggtc cgaggccgcg tttcgttgtc 1200

gcgcctggcg ttgtccgctt ggaggtttgt gatctcgcac gccgcgaacg aacggctgaa 1260

cgtgcgtatc tggctgctcg ggctcgggtg gatatggcgg ctgccaggca taactcgccg 1320

tacgacttcg acgtggacga tgaagagttg gcggaactgg cttctctgca aggcctcgag 1380

gacgacgaca ttgggggctg gtctgcggag agggaaatag tgggctggtc tgctcgttct 1440

cggtcacgga tgatcttgcg aatggcagaa ctcgactggg ctcccatgat ggatttgccg 1500

ggcattcctg cgatggtgac cctcacctat ccgggggact ggcttacggt tgcccccacc 1560

ggcgctgagg tcaaaaaaca tctccagacg ttcttcaaac ggttccaacg ggcctggggc 1620

attgcctgga tgggtgcgtg gaaaatggag ttccaaagcc gaggcgctcc gcattttcac 1680

ctgtacatgg tccctcctca tgggaaggca ggagactcgc ggaagctgcg gcatgatgct 1740

gagctcttga aatgggagat agcacgtgca gagggtgaag acccaggtcg caggccgtat 1800

ttccgggaag ctccaagcga tggattgaag tttcgtccgt ggctttctgc ggtgtgggcc 1860

gacgtcgtag atcatccgga ccccaaggaa aaagaaaagc acgtcagtgc cggcactgga 1920

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aagttcgaca cctcgaaaga aggcctcgac atggctttga aagctgctgg caacgtgatt 3000

cctgattcct ccgcgtacga gtaccgggcg gttcaggtcg agccgaagat ggtcagaaaa 3060

gacccggaag acccgaactc tgagcagttc cagaagcaga aggacggcac gccggtgtgg 3120

tcgatcgact gcattcgggt cgaccgggca tcaggcaaca aggcaatcgt gaccgtgacg 3180

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cgctgggtgt gggtgccctc gtgctcgtgt ttgtgctggt tgcggcaggt tggcaagcgg 3420

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atcgtgcggg acggattacg ccgggaagcc tgcggtgacg ctggaagctg tgtggatttc 4200

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aagtttgaaa ctggttcggg gatacgcaca ctcgtgtttt ctttgccgcc cggagtcact 4800

gccgagagct ttgagaaagt tcgccctgcg ctggcagacg cgatgggggg tcaccgctgc 4860

caagtagaga aggtggcccc cggacaggtc cgcgtcagag tgattgatga ggattcgatg 4920

aagacgccgc gtgatgcggg atgggcgaaa gatgtggtgc tggaagagga tacgttcgac 4980

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cggcgggagt atctcggatt cctatccgtc tcgggcgctc tcagtacggg gaagacgttg 5100

gattcgatct cgctgcggac gccgctcaca tcgccatgca gggcaaaacc cgatccggca 5160

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tagggtccga cccgacacac gtactcctgg agcccttcaa acatcgaggg gtgtccgagc 5280

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gtgagtctga tcgtcgcatc gaccagatgt ggcccctgcg taccgacaag ttttccgagt 5400

tcggggcttc gttcccgctg atactcgtcg tgctcgaaga gttt 5444

<210>74

<211>5813

<212>DNA

<213>椿象红球菌

<220>

<221>misc_feature

<223>pRET1000Full Length

<400>74

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gccaagaccg ggccgaggag caggctgccg aggcagcgcg ggtcgcctcc gctgtcatgg 120

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aggaccccga ccgccagtac gccgcaggtc aggccgacac cgtcgcgcag gcccaagccg 420

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caggtggtgc tcgaggtgaa cactccgcgg ccgttcgatg ctgcggcccc ggagggtgac 1260

tactgctgca ccttccggat cagcgggaac atggatgccc cttacgacgg attcggtggc 1320

ggcgtcgacg cagtgcaggc gctgctactc gcattggcca tggcacacga ggaacttcgt 1380

caaacttcgc cagagttgac gtttctaggc gagacgaacc tcggtctacc ggtcttgaac 1440

atcaagcccg acaacgcgat cgaagccgtg gtctcattcc ccgctccctg atgtgacgca 1500

ctttcacccc tggcactcat gtaccgaagc tgggactgag aaagggctgc cgcgtcaccg 1560

cttcgcgttg acttgccact gaacgggggc gtgtcccggt cagggcgggg tgtgacctgg 1620

gttcatgaca ccgctaacac gctgcggaaa tgcggattga actagttcat ttggggaacg 1680

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cggtccgcac tgccgacggg aagtggatga ttcccctcgg tgacctatca gcggcagggc 1860

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cggtgtcggc cctggagccc gcggcggttc cagtggcggg tccgccgccg cccgtcccgg 2100

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aggagctgac cgcgtacttg cgtgcgtcgt gcaggagctt tcccaccgtt ccggtggaga 2220

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ggcgacggtt ctcggctgcc cgtgcgagga actggtcccg cggctcggcc atgatgcgct 2340

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gctcgtttcc ggtttgcctc gcgcttcttc tcactcatct tgcgaccgcg tgcggcttgt 2520

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agcgcccaca cagcgtgtgc gtgcccgtta cgggggttct ccacgatcgc gttcggcaga 3120

ggatgattcc cggccgccga cagcgcccgc agcgcggcgt ccgggtggtc aacgtccacg 3180

acgagcaggt tgctcaatgc ctgcgggttc gactcgatgt agcggcgatc cagtgcgtct 3240

gatcgccgca tccggtagac gccgtcgagg aaatcgtcgg ttgccagtgg ccacagcggt 3300

agccacagct gttcccaggc gccgcctgtg tgctcttcca ccgcaaccat ggggaacaca 3360

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tctggagcgg tcctccagac ctttgagatc cgctccagaa acgtccacaa attattgggg 3480

tacgtcgaac caagccttat caggtatccc ggggttccgg gggtgaacac caccctccga 3540

ccggtccaga atccgtcgat ctcacctatc cgctcgaagt ccttgagtca gtgacaggac 3600

cactgctggg ctcccagcgc agaaggcaag tgaaggcaga cgactgcggg aggtaagtcg 3660

ggtacggcat gaggtccttc agaagcggcg tcgacgccag gcccacacgc acaatccgct 3720

tcccacgagg gacaccaccg gtagcgcccc ctgcaaccgg cgcagtgtca cgaggcgccg 3780

gtactgctcg tttgacagga actgcagggt cggtgagctc gcgctgggcg gatcccacca 3840

gtagctcccc gtgccggtaa ccgcttgggg ccaagcgaag acacccaccg cggcagcgat 3900

ggcaatgcac gtggatggga acaccaccca gaaccaggga aatcctggtg ccggcccgag 3960

acgatcccgg cgcggtaaga ccacaccggc caccatcgcc acggcccccg acgcaacaag 4020

caataaccac cccatgagcg gacggtacaa gcgccgacgc cgggtggccg ttaggtgcgc 4080

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cgtgcccgtt ctgaccggtg gtctcggtcg ctcgttcctc gcgtcctcac ctgccggtca 4200

gcccgtgacc gtgccgtcca ccacccggtg cctggtctgc gtctccctcg gctcgttcct 4260

cgcctatcct ggtgaccaga caccggagcg agctatgccc agggttgcgc agtgacttcg 4320

tcactgcgta accctgggcg ctcgcctccc attcgcttcg ctcacaggag ggggccgtcg 4380

atggccgctg acgctgcatc tgacgaccgg cggaccgagg tccgcgccgc tgcttcgcgg 4440

gccgctgacg cggccccggc gaagcgcacc cgcaccgtgg cggtgcggct gaccgatggg 4500

gaggaggccg cgtggatcga cgccgcgctg gccgatggcc accggcagct cggggcgtgg 4560

gtgcgtgagc gggcggtggc cggctatctc gggaaggtcc gcccgaagac cggcagtgga 4620

atgtcggcgg aggcggccgc ggaggtcgcc gcgatgcggc agcagatgac gaaggtgggg 4680

aacaacctga accagatcgc gagggcgatc aacgccgggc aggtgccgtc gcagatggcc 4740

gagtccctgc agaaggggtg gctggagagg tgggggcagg agttggggcg gatggcggat 4800

cggctcgacg cgctcgacga ccagggctga cgtgatcgcg aagatcagca cgggcagcga 4860

cccgaagggg ttggcggcgt atctgcacgg gccggggaag gccaccccgc acagctaccg 4920

caccgaggcg ggccggctga ttgccggcgg gacggtgatc gcgggatcgg tgcaggtcac 4980

cgccaaaaac ccgacccggt gggggcggga cttcgagcgg gccgccgcga cgaacgcgcg 5040

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tccgtgggtg gcggtgcggc acgacgacga ccacatccac ctggctgtct cccgggtcga 5220

ttttcagggc gtgacctgga agaacagcaa cgaccggtgg aaggtcgtcg aggtgatgcg 5280

cgaggtcgaa cgcgcgcacg gcctgatcga ggtggcgagc ccggagcggg cccgtggccg 5340

gcaagccagc agcggcgagc aacgccgcgc ggtgcggacc ggcaaggtgg cgcagcggga 5400

cggtctgagg gaaattgtga ccgccgcccg cgacatcgcc gcaggccagg gtgtgggggc 5460

gttcgaagtg gcgctcgtac agaacccgat tacccgagtg caggtgcggc gcaacgtcgc 5520

gaagacgggc cggatgaatg gctacagctt caacctgccc ggctacgtcg acgccgccgg 5580

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<212>DNA

<213>椿象红球菌

<220>

<221>misc_feature

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<212>DNA

<213>红串红球菌

<220>

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<212>DNA

<213>红串红球菌

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<210>78

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<212>PRT

<213>红串红球菌

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Met Phe Asn Ser Ile Glu Gly Arg Ser Val Val Val Thr Gly Gly Ser

1 5 10 15

Lys Gly Ile Gly Leu Gly Met Val Arg Val Phe Ala Arg Ala Gly Ala

20 25 30

Asn Val Leu Met Thr Ala Arg Asp Ala Leu Thr Leu Glu Arg Ala Ala

35 40 45

Glu Gly Leu Asn Gly Leu Pro Gly Ala Val Ser Thr Leu Gln Val Asp

50 55 60

VAl Thr Asn Pro Asp Ser Leu Ala Gly Met Ala Glu Val Ala Ala Glu

65 70 75 80

Arg His Gly Gly Ile Asp Val Leu Cys Ala Asn Ala Gly Ile Phe Pro

85 90 95

Ser Lys Arg Leu Gly Glu Met Thr Ser Glu Asp Met Asp Ser Val Phe

100 105 110

Gly Val Asn Val Lys Gly Thr Ile His Ala Val Gln Ala Cys Met Pro

115 120 125

Trp Leu Glu Thr Ser Gly Arg Gly Arg Val Val Val Thr Ser Ser Ile

130 135 140

Thr Gly Pro Val Thr Gly Tyr Pro Gly Trp Ser His Tyr Gly Ala Ser

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Lys Ala Ala Gln Met Gly Phe Ile Arg Thr Ala Ala Ile Glu Leu Ala

165 170 175

Pro Lys Arg Ile Thr Ile Asn Ala Val Leu Pro Gly Asn Val Ile Thr

180 185 190

Glu Gly Leu Asp Gly Leu Gly Gln Glu Tyr Leu Asp Gln Met Ala Ser

195 200 205

Ser Val Pro Ala Gly Ser Leu Gly Ser Val Glu Asp Ile Ala Asn Ala

210 215 220

Ala Leu Phe Phe Ala Leu Asp Glu Ala Ala Tyr Ile Thr Gly Gln Ser

225 230 235 240

Leu Ile Val Asp Gly Gly Gln Val Leu Pro Glu Ser Ala Met Ala Leu

245 250 255

Gly Glu Leu

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<212>DNA

<213>红串红球菌

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<212>DNA

<213>人工

<220>

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<212>DNA

<213>人工

<220>

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<210>82

<211>34

<212>DNA

<213>人工

<220>

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<210>83

<211>34

<212>DNA

<213>人工

<220>

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cgcttagatc tcagttcgcc gagcgccatc gccg 34

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<211>35

<212>DNA

<213>人工

<220>

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<210>85

<211>24

<212>DNA

<213>人工

<220>

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cgccagggtt ttcccagtca cgac 24

<210>86

<211>30

<212>DNA

<213>人工

<220>

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ggcgtatcac gaggcccttt cgtcttcacc 30

<210>87

<211>35

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物(pQE70 R1135Bm)

<400>87

ggttggatcc gtcatcaccg aaacgcgcga ggcag 35

<210>88

<211>34

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物(P1204rep-Ec2958)

<400>88

cgcggaattc gaccaccacg cacgcacacc gcac 34

<210>89

<211>8134

<212>DNA

<213>人工

<220>

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aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa 180

acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta 240

ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc 300

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<212>DNA

<213>人工

<220>

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gactctagag gatccccggg taccgagctc gaattcactg gccgtcgttt tacaacgtcg 60

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ctgctctcgc aacgagcgga ggcctcgatc attggcggca atgcgcgttc gaatttcggg 4500

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catttcgacg cggaacctgg cgatgatgtt gtctctgtct tcattcataa ctgaagcgta 6660

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ctcggttcag gggcgaaagt tcgacacctc gaaagaaggc ctcgacatgg ctttgaaagc 6840

tgctggcaac gtgattcctg attcctccgc gtacgagtac cgggcggttc aggtcgagcc 6900

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ccagttgagc cggagaggtt ggagcgcgac tgggtgaggt cggctgagtg cgtttcggcg 7500

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gatttcgttc gttcgtggaa agtggcgagt gatgattact gctatgaggg tgataacccg 7620

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<213>人工

<220>

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gcggacacga agtggaagca ggtgaacgag gcgttgacca gccaagaccg ggccgaggag 1680

caggctgccg aggcagcgcg ggtcgcctcc gctgtcatgg gaggccaccc gacaccgcta 1740

cgggacatgc tcgccgccca ggagcagcgc cggaagccgt ggactccgga gcagaaacgc 1800

cagtacgcga ccgcaaaagc ccaagcagaa cgcgccgcga aggccaagga cgccgcgaaa 1860

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ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta 7620

gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct 7680

aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc 7740

aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca 7800

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aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg 7920

aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt 7980

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tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt 8160

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ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta 8280

atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa 8340

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<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>pRET1002

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ccccggcgaa gcgcacccgc accgtggcgg tgcggctgac cgatggggag gaggccgcgt 300

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cggtggccgg ctatctcggg aaggtccgcc cgaagaccgg cagtggaatg tcggcggagg 420

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cgtgcgagga actggtcccg cggctcggcc atgatgcgct ggatcgtgcg cgtggaggcc 3960

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agaagcggcg tcgacgccag gcccacacgc acaatccgct tcccacgagg gacaccaccg 5340

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cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg 5940

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tcacttattc aggcgtagca ccaggcgttt aagggcacca ataactgcct taaaaaaatt 6180

acgccccgcc ctgccactca tcgcagtact gttgtaattc attaagcatt ctgccgacat 6240

ggaagccatc acagacggca tgatgaacct gaatcgccag cggcatcagc accttgtcgc 6300

cttgcgtata atatttgccc atggtgaaaa cgggggcgaa gaagttgtcc atattggcca 6360

cgtttaaatc aaaactggtg aaactcaccc agggattggc tgagacgaaa aacatattct 6420

caataaaccc tttagggaaa taggccaggt tttcaccgta acacgccaca tcttgcgaat 6480

atatgtgtag aaactgccgg aaatcgtcgt ggtattcact ccagagcgat gaaaacgttt 6540

cagtttgctc atggaaaacg gtgtaacaag ggtgaacact atcccatatc accagctcac 6600

cgtctttcat tgccatacga aattccggat gagcattcat caggcgggca agaatgtgaa 6660

taaaggccgg ataaaacttg tgcttatttt tctttacggt ctttaaaaag gccgtaatat 6720

ccagctgaac ggtctggtta taggtacatt gagcaactga ctgaaatgcc tcaaaatgtt 6780

ctttacgatg ccattgggat atatcaacgg tggtatatcc agtgattttt ttctccattt 6840

tagcttcctt agctcctgaa aatctcgata actcaaaaaa tacgcccggt agtgatctta 6900

tttcattatg gtgaaagttg gaacctctta cgtgccgatc aacgtctcat tttcgccaaa 6960

agttggccca gggcttcccg gtatcaacag ggacaccagg atttatttat tctgcgaagt 7020

gatcttccgt tcgacggagt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc 7080

ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct 7140

accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg 7200

cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca 7260

cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc 7320

tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga 7380

taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac 7440

gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagcattga gaaagcgcca cgcttcccga 7500

agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag 7560

ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg 7620

acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag 7680

caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc 7740

tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc 7800

tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagaagctca 7860

ttcgccattc aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt 7920

acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt 7980

ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtc 8038

Claims

1.DNA片段，由序列号35记录的碱基序列构成。

2.质粒，其特征在于，包含，

由序列号35记录的碱基序列构成的DNA复制区域。

3.环状质粒，其特征在于，

包含权利要求1或2所述的质粒或DNA片段，限制性内切酶切割位点数为BamHI:2，EcoRI:2，KpnI:1，PvuII:1，SacI:1和SmaI:1，大小为5.4kbp。

4.由序列号73记录的碱基序列构成的质粒。

5.如权利要求1～4中任一项所述的质粒或DNA片段，其特征在于，来源于红球菌(Rhodococcus)属菌。

6.在红球菌属菌和大肠杆菌内可复制的穿梭载体，包含权利要求1～4中任一项所述的质粒或DNA片段，和在大肠杆菌内可复制的DNA区域。

7.载体，其特征在于，使用权利要求6所述的穿梭载体制造。

8.如权利要求7所述的载体，其特征在于，插入有氨基酮不对称还原酶基因。

9.如权利要求8所述的载体，其特征在于，氨基酮不对称还原酶基因是编码由序列号78记录的氨基酸序列构成的蛋白质的核酸。

10.如权利要求8所述的载体，其特征在于，氨基酮不对称还原酶基因是由序列号79记录的碱基序列构成的核酸。

11.包含权利要求7所述的载体的转化体。

12.包含权利要求8～10中任一项所述的载体的转化体。

13.一种氨基酮不对称还原酶的制造方法，包括：

将权利要求12所述的转化体在可增殖该转化体的培养基中培养的培养工序，和

由所述培养工序中所得的该转化体精制氨基酮不对称还原酶的精制工序。

14.一种光学活性氨基醇的制造方法，使由权利要求12所述的转化体作用于由通式(1)表示的α-氨基酮化合物或其盐的对映体混合物，生成具有期望的光学活性、由通式(2)表示的光学活性氨基醇化合物，其中，

式中，X可以相同也可以不同，表示选自卤原子、低级烷基、可以由保护基保护的羟基、硝基和磺酰基的至少一种；n表示0～3的整数；R¹表示低级烷基；R²、R³可以相同也可以不同，表示选自氢原子和低级烷基的至少一种；*表示不对称碳，

式中，X、n、R¹、R²、R³和*与所述式(1)定义相同。

15.一种光学活性氨基醇的制造方法，在权利要求14所述的光学活性氨基醇的制造方法中，进一步添加由通式(3)表示的化合物、或其在制药学上可接受的盐或溶剂合物，生成光学活性氨基醇，其中，

式中，A表示结构式(Y)或(Z)；

这里，R⁵表示氢原子、碳原子数1～3的烷基、或与R⁶或R⁹结合形成含有1～3个杂原子的5～8元环的杂环状骨架，R⁶表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～3的烷基、与R⁸结合形成碳原子数为5～10的烃环、与R⁵或R⁹结合形成含有1～3个杂原子的5～8元环的杂环状骨架，R⁷表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基；

R⁸表示氢原子、羧基、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、与R⁴结合形成含有1～3个杂原子的5～8元环的杂环状骨架、与R⁶结合形成碳原子数为5～10的烃环；

R⁹表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷氧基羰基、可以具有取代基的酰基、与R⁵或R⁶结合形成含有1～3个杂原子的5～8元环的杂环状骨架；

R¹⁰表示氢原子或可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基。