WO2005042739A1

WO2005042739A1 - 新規なプラスミド及びその利用

Info

Publication number: WO2005042739A1
Application number: PCT/JP2004/016104
Authority: WO
Inventors: Eitora Yamamura; Noboru Fujimoto
Original assignee: Daiichi Fine Chemical Co., Ltd.
Priority date: 2003-10-31
Filing date: 2004-10-29
Publication date: 2005-05-12
Also published as: DE602004029180D1; US20090042275A1; KR20060108640A; SG128684A1; US7446187B2; CN1875102B; SG128683A1; CN1875102A; EP1688491A4; JPWO2005042739A1; ATE481479T1; EP1688491B1; EP1688491A1; JP4579833B2; US20070031948A1

Abstract

　Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌由来の配列番号７３に記載の塩基配列を有するプラスミド及び配列番号７４に記載の塩基配列を有するプラスミド又はそのＤＮＡ断片等から、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌内で複製可能なＤＮＡ領域を調製し、大腸菌由来のプラスミド又はそのＤＮＡ断片から、大腸菌内で複製可能なＤＮＡ領域を調製し、シャトルベクターを作製する。シャトルベクターにアミノケトン不斉還元酵素遺伝子を挿入してベクターを構築し、当該ベクターを含む形質転換体を作製し、アミノケトン不斉還元酵素及び光学活性アミノアルコールを製造する。

Description

明細書

新規なプラスミド及びその利用

技術分野

[0001] 本発明は、 Rhodococcus (ロドコッカス）属に属する微生物（以下、 Rhodococcus 属菌という）由来の新規なプラスミド及びその利用に関する。より具体的には、プラスミド及びその一部である DNA断片（以下、単に DNA断片ともいう）、並びにそれらを利用するシャトルベクター、ベクター、形質転換体、アミノケトン不斉還元酵素の製造方法及び光学活性アミノアルコールの製造方法に関する。

背景技術

[0002] Rhodococcus属菌は、二トリル類の代謝に関与する酵素を生産することやアミノケトンを不斉的に還元する酵素を産生することが知られている。特に、 Rhodococcus erythropolisは、きわめて高!、アミノケトン不斉還元活性を有することが知られて！/、る。このような微生物及び酵素は、 α—アミノケトンに作用して、光学活性 j8—ァミノアルコールを高収率かつ高選択的に生産する（例えば、特許文献 1及び 5)。したがって、 Rhodococcus属菌において、有用な酵素等の大量生産を目的とする宿主一べクタ一系の開発が以前力期待されてきた。し力しながら、 Rhodococcus属菌を宿主とするに適したベクターの開発は遅れているのが現状である。 Rhodococcus属菌においてプラスミドが見出された微生物は、 Rhodococcus sp. H13— A株（非特許文献 1)、 Rhodococcus rhodochrous ATCC4276株（特許文献 2)、 Rhodococc us rhodochrous ATCC4001株（特許文献 3)及び Rhodococcus erythropoli s IFO12320株 (特許文献 4)など数株にしかすぎな!/、。

[0003] 特許文献 1：国際公開 WO01Z73100号パンフレット

特許文献 2：特開平 4-148685号公報

特許文献 3：特開平 4-330287号公報

特許文献 4：特開平 9-28379号公報

特許文献 5：国際公開 WO02Z070714号パンフレット

非特許文献 1 : Bacteriol. , 170, 638, 1988 発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0004] 上記のように Rhodococcus属菌から工業的に利用できる菌株を育種、改良（変異株)するための新しいベクターの開発が望まれている。特に、組換え DNA微生物及びその産物である食品や添加物の安全性の面力もセルフクローニング系によることが望ましいとされている。本発明は、このような宿主-ベクタ一系におけるベクターとして利用できる新規なプラスミドを提供することを目的とする。

[0005] アミノケトン不斉還元活性を有する Rhodococcus erythropolisにおいて、工業的に利用できる組換え微生物の創出が望まれている。特に、このような組換え微生物の創出に利用できる新規なプラスミド又はその一部である DNA断片を提供することを本発明の第一の目的とする。

[0006] 前記プラスミドが得られれば、他の微生物でも複製可能なシャトルベクターを構築することも容易となる。本発明は、このようなシャトルベクター構築に必要となる DNA 複製に関する塩基配列情報 (複製領域等)を提供することを第二の目的とする。

[0007] 本発明は、 Rhodococcus属菌及び大腸菌の、ずれにお、ても複製可能なシャトルベクターを提供することを第三の目的とする。

[0008] さらに、本発明は前記シャトルベクターのアミノケトン不斉還元酵素への適用を第四の目的とする。

課題を解決するための手段

[0009] 本発明者らは、 Rhodococcus属菌株よりベクター作製のためのプラスミドを鋭意スクリーニングした結果、宿主ベクター系におけるベクターとして利用可能な幾つかの新規なプラスミドを見出した。

[0010] また、本発明者らは、前記プラスミドに、薬剤耐性遺伝子、大腸菌内で複製可能な遺伝子領域などを導入することによって、シャトルベクターを作製できることを見出した。このように、上記課題を達成する塩基配列情報、プラスミド及びシャトルベクターを得て、本発明を完成するに至った。

[0011] すなわち、本発明によれば、以下の（1)一（39)に記載の DNA断片、 DNA、プラスミド、シャトルベクター、ベクター、形質転換体、アミノケトン不斉還元酵素の製造方法及び光学活性ァミノアルコールの製造方法が提供される。

(1) 配列番号 35、配列番号 36及び配列番号 37に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも 1つの塩基配列を有する DNA断片。

(2) 配列番号 35、配列番号 36及び配列番号 37に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも 1つの塩基配列を有する DNA複製領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部である DNA断片。

(3) 配列番号 1、配列番号 4、配列番号 14、配列番号 17及び配列番号 22に記載の塩基配列力なる群より選ばれる少なくとも 1つの塩基配列を有する DNA断片。

(4) 配列番号 1、配列番号 4、配列番号 14、配列番号 17及び配列番号 22に記載の塩基配列力なる群より選ばれる少なくとも 1つの塩基配列を有する DNA複製関連タンパク質のコード領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部である DN A断片。

(5) 配列番号 1、配列番号 4、配列番号 14、配列番号 17及び配列番号 22に記載の塩基配列力なる群より選ばれる少なくとも 1つの塩基配列を有する DNA複製関連タンパク質のコード領域を含み、且つ配列番号 35、配列番号 36及び配列番号 37 に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも 1つの塩基配列を有する DNA 複製領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部である DNA断片。

(6) 配列番号 76に記載の塩基配列を有する DNA断片。

(7) 配列番号 76に記載の塩基配列を有するプロモーター領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部である DNA断片。

(8) 配列番号 1、配列番号 4、配列番号 14、配列番号 17及び配列番号 22に記載の塩基配列力なる群より選ばれる少なくとも 1つの塩基配列を有する DNA複製関連タンパク質のコード領域を含み、配列番号 35、配列番号 36及び配列番号 37に記載の塩基配列力なる群より選ばれる少なくとも 1つの塩基配列を有する DNA複製領域を含み、且つ配列番号 76に記載の塩基配列を有するプロモーター領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部である DNA断片。

(9) (1)一 (8)のいずれかに記載のプラスミド又は DNA断片を有し、制限酵素切断部位数が BamHI : 2、 EcoRI : 2、 Kpnl: 1、 PvuII: 1、 Sacl : 1及び Smal : 1であり、大きさが約 5. 4kbpであることを特徴とする環状プラスミド。

(10) 配列番号 73に記載の塩基配列を有するプラスミド。

(11) Rhodococcus属菌由来であることを特徴とする（ 1)一（ 10)の、ずれかに記載のプラスミド又は DNA断片。

(12) 配列番号 70、配列番号 71及び配列番号 72に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも 1つの塩基配列を有する DNA断片。

(13) 配列番号 70、配列番号 71及び配列番号 72に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも 1つの塩基配列を有する DNA複製領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部である DNA断片。

(14) 配列番号 40、配列番号 42、配列番号 44、配列番号 45、配列番号 53、配列番号 55、配列番号 56、配列番号 61、配列番号 62及び配列番号 69に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも 1つの塩基配列を有する DNA断片。

(15) 配列番号 40、配列番号 42、配列番号 44、配列番号 45、配列番号 53、配列番号 55、配列番号 56、配列番号 61、配列番号 62及び配列番号 69に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも 1つの塩基配列を有する DNA複製関連タンパク質のコード領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部である DNA断片。

(16) 配列番号 40、配列番号 42、配列番号 44、配列番号 45、配列番号 53、配列番号 55、配列番号 56、配列番号 61、配列番号 62及び配列番号 69に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも 1つの塩基配列を有する DNA複製関連タンパク質のコード領域を含み、且つ配列番号 70、配列番号 71及び配列番号 72に記載の塩基配列力なる群より選ばれる少なくとも 1つの塩基配列を有する DNA複製領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部である DNA断片。

(17) 配列番号 40、配列番号 42、配列番号 44、配列番号 45、配列番号 53、配列番号 55、配列番号 56、配列番号 61、配列番号 62及び配列番号 69に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも 1つの塩基配列を有する DNA複製関連タンパク質のコード領域を含み、配列番号 70、配列番号 71及び配列番号 72に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも 1つの塩基配列を有する DNA複製領域を含み、且つ配列番号 76に記載の塩基配列を有するプロモーター領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部である DNA断片。

(18) 配列番号 67及び配列番号 47に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも 1つの塩基配列を有する DNA断片。

(19) 配列番号 67及び配列番号 47に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも 1つの塩基配列を有する接合タンパク質領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部である DNA断片。

(20) 配列番号 75に記載の塩基配列を有する DNA断片。

(21) 配列番号 75に記載の塩基配列を有する接合に関する領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部である DNA断片。

(22) (12)—（21)のいずれかに記載のプラスミド又は DNA断片を有し、制限酵素切断部位数が BamHI : 2、 PvuII :4、 Sacl : 3及び Smal :4であり、大きさが約 5. 8kb pであることを特徴とする環状プラスミド。

(23) 配列番号 74に記載の塩基配列を有するプラスミド。

(24) Rhodococcus属菌由来であることを特徴とする（12)— (23)のいずれかに記載のプラスミド又は DNA断片。

(25) 配列番号 77に記載の塩基配列を有する DNA断片。

(26) 配列番号 77に記載の塩基配列を有するプロモーター領域を含むことを特徴とする DNA断片。

(27) (1)一（26)のいずれかに記載のプラスミド又はその一部である DNA断片と大腸菌内で複製可能な DNA領域とを含み、 Rhodococcus属菌及び大腸菌内で複製可能なシャトルベクター。

(28) (27)に記載のシャトルベクターを用いて作製することを特徴とするベクター。

(29) (6)、（7)、（25)又は（26)のいずれかに記載のプラスミド又は DNA断片を含むことを特徴とするベクター。

(30) アミノケトン不斉還元酵素遺伝子が挿入されて!ヽることを特徴とする（28)又は (29)に記載のベクター。

(31) アミノケトン不斉還元酵素遺伝子が、配列番号 78に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、又は配列番号 78のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、且つァミノケトン不斉還元活性を有するタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする（

30)に記載のベクター。

(32) アミノケトン不斉還元酵素遺伝子が、配列番号 79に記載の塩基配列力もなる核酸、又は配列番号 79と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジントな条件下でハイブリダィズし、且つアミノケトン不斉還元活性を有するタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする（30)に記載のベクター。

(33) (28)又は（29)に記載のベクターを含む形質転換体。

(34) (30)一 (32)のいずれかに記載のベクターを含む形質転換体。

(35) (34)に記載の形質転換体を該形質転換体が増殖可能な培地中で培養する培養工程と、

前記培養工程で得られた該形質転換体からアミノケトン不斉還元酵素を精製する精製工程と

を含むアミノケトン不斉還元酵素の製造方法。

(36) 一般式 (1) :

[化 1]

(式中、 Xは同一又は異なっていてもよぐハロゲン原子、低級アルキル基、保護基で保護されて、てもよ、ヒドロキシル基、ニトロ基及びスルホ -ル基力なる群より選ばれる少なくとも一種を示し； nは 0— 3の整数を示し； R¹は低級アルキル基を示し； R², R³は同一又は異なっていてもよぐ水素原子及び低級アルキル基力もなる群より選ばれる少なくとも一種を示し； *は不斉炭素を示す）

で表される α—アミノケトンィ匕合物又はその塩のェナンチォマー混合物に（35)記載の製造方法で得られるアミノケトン不斉還元酵素を作用させて一般式 (2) :

[化 2]

(式中、 X、 n、

R³及び *は前記定義と同一）

で表される光学活性ァミノアルコールィ匕合物であって、所望の光学活性を有する該化合物を生成せしめる光学活性ァミノアルコールの製造方法。

(37) 一般式 (1) :

[化 3]

で表される α—アミノケトンィ匕合物又はその塩のェナンチォマー混合物に（34)記載の形質転換体を作用させて一般式 (2)：

[化 4]

(式中、 X、 n、

R³及び *は前記定義と同一）

(38) (37)に記載の光学活性ァミノアルコールの製造方法において、

一般式 (3) :

[化 5]

(式中、 Aは構造式 (Y)又は (Z)を表し、

(ここで、 R⁴は水素原子、置換基を有していてもよい炭素数 1一 3のアルキル基、と結合してなる炭素数 5— 10の炭化水素環又は R⁸と結合してなる 1一 3個のへテロ原子を含む 5— 8員環のへテロ環状骨格を表す。 )、

[化 7]

(ここで、 R⁵は水素原子、炭素数 1一 3のアルキル基、若しくは R⁶又は R⁹と結合してなる 1一 3個のへテロ原子を含む 5— 8員環のへテロ環状骨格を表し、 R⁶は水素原子、置換基を有していてもよい炭素数 1一 3のアルキル基、 R⁸と結合してなる炭素数 5— 1 0の炭化水素環、 R⁵又は R⁹と結合してなる 1一 3個のへテロ原子を含む 5— 8員環のヘテロ環状骨格を表し、 R⁷は水素原子、置換基を有していてもよい炭素数 1一 6のァルキル基を表す。 )；

R⁸は水素原子、カルボキシル基、置換基を有していてもよい炭素数 1一 6のアルキル基、 R⁴と結合してなる 1一 3個のへテロ原子を含む 5— 8員環のへテロ環状骨格、と結合してなる炭素数 5— 10の炭化水素環を表し; R⁹は水素原子、置換基を有していてもよ、炭素数 1一 6のアルキル基、置換基を有して!/、てもよ、炭素数 1一 6のアルキルォキシカルボ-ル基、置換基を有していてもよいァシル基、 R⁵又は R⁶と結合してなる 1一 3個のへテロ原子を含む 5— 8員環のへテロ環状骨格を表し、 R^1C>は水素原子又は置換基を有して、てもよ、炭素数 1一 6のアルキル基を表す。 )

で表される化合物、又はその製薬学的に許容される塩あるヽは溶媒和物をさらに添加して光学活性ァミノアルコールを生成させる光学活性ァミノアルコールの製造方法

(39) 配列番号 89—配列番号 100に記載の塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列を有する（27)に記載のシャトルベクター。

発明の効果

本発明のプラスミドは、従来知られていない新規なプラスミドであり、工業的に有用な Rhodococcus属に属する宿主ベクター系におけるベクターとして価値がある。特に、アミノケトンの不斉還元を工業的に行なえる組換え微生物の創出に有用である。このような微生物が貢献するアミノケトンの不斉還元としては、 1 2—メチルアミノー 1 フエ-ルー 1 プロパノン力 d （IS, 2S)—プソイドエフェドリンを製造する反応が挙げられる。

[0013] また、本発明のプラスミドは、単一のロドコッカス細胞に共存することから、複製機能を利用した単独での使用の他に、それぞれ和合性プラスミドとしても利用できる。すなわち、別のタンパク質 (酵素等)遺伝子をそれぞれのプラスミドに挿入することにより、別のタンパク質を同時に同一細胞内で発現できるようになる。

[0014] さらに、本発明のシャトルベクターは、 Rhodococcus属菌及び大腸菌（Escherich ia属菌）において、工業的に利用し得る組換え微生物の創出に有用である。

[0015] 本発明のプラスミドから得られる DNA複製に関する塩基配列情報は、それに基づいて前記シャトルベクターの構築を可能とし、具体的にはベクターの構成要素である DNA断片等を提供する。

図面の簡単な説明

[0016] [図 1]図 1は、プラスミド pRETl 100の制限酵素切断地図である。

[図 2]図 2は、プラスミド pRETlOOOの制限酵素切断地図である。

[図 3]図 3は、シャトルベクター pRETl 101の構築の概要を示す図である。

[図 4]図 4は、シャトルベクター pRETl 102の構築の概要を示す図である。

[図 5]図 5は、シャトルベクター pRETl 103の構築の概要を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

[0017] 以下、本発明を好適な実施の形態に従って説明する。

[0018] 本発明の第 1のプラスミドは、 Rhodococcus属菌から単離されるプラスミド又はその誘導体である。具体的には、例えば、 Rhodococcus erythropolis IAM1400, I AM1503, JCM2893及び JCM2894株等の菌株から単離することができ、その大きさが約 5. 4kbpであり、且つ表 1に示す制限酵素に対する分解特性を有する環状プラスミドである。以下、それぞれの菌株から単離されるプラスミドを pRETl 100、 pR ET1300、 pRET1500及び pRET1700と称する。なお、供試菌株から本発明のプラスミドを調製するには、公知の方法 (例えば、ボイル法、アルカリ溶解法、塩化セシゥム密度勾配超遠心法:ラボマニュアル遺伝子工学、第 3版、第 10章、 55 - 59頁、丸善株式会社)を採用することができる。 [0019] [表 1]

[0020] プラスミド pRETl 100の制限酵素地図を図 1に示す。このプラスミドについて、公知の方法 (例えば、蛍光式自動シークェンサ一）によりシークェンスしたところ、その全塩基配列は、配列表の配列番号 73に示す 5444bpであることが分かった。

[0021] また、本発明の第 2のプラスミドも、 Rhodococcus属菌から単離されるプラスミド又はその誘導体である。具体的には、例えば、 Rhodococcus rhodnii JCM3203株力も単離することができ、その大きさが約 5. 8kbpであり、且つ表 2に示す制限酵素に対する分解特性を有する環状プラスミドである。以下このプラスミドを pRETlOOOと称する。

[0022] [表 2]

プラスミド pRETlOOOの制限酵素地図を図 2に示す。このプラスミドについても、公知の方法によりシークェンスしたところ、配列表の配列番号 74に示す 5813bpの塩基配列を有することが分力つた。 [0024] 以上のように本発明のプラスミド類 (天然型もしくは野生型）は、表 1又は表 2に示す制限酵素切断パターンによっても特定され得る環状プラスミドである。したがって、本発明は次の 2種類の環状プラスミドを包含する。

(1) Rhodococcus属菌由来の環状プラスミドであって、その大きさが約 5. 4kbpであり、制限酵素切断部位数が BamHI : 2、 EcoRI : 2、 Kpnl : 1、 PvuII : 1、 Sacl : 1及び Smal : 1であることを特徴とする環状プラスミド。

(2) Rhodococcus属菌由来の環状プラスミドであって、その大きさが約 5. 8kbpであり、制限酵素切断部位数が BamHI : 2、 PvuII :4, Sacl : 3及び Smal :4であることを特徴とする環状プラスミド。

[0025] プラスミド pRETl 100及び pRETlOOOの塩基配列（すなわち、配列番号 73及び配列番号 74)を解析した結果、 DNA複製やその他の機能を有するタンパク質をコードしている一群の塩基配列（オープンリーディングフレーム、以下 orfという）が存在することが推測される。

[0026] 当該技術分野において、「DNA複製」とは、 DNA自身が铸型となって、すでにある 2本鎖 DNA (親 DNA)と全く同じ 2個の 2本鎖 DNAが形成されることを指す。その複製機構は、複製開始点 (複製起点)からの開始、 DNA鎖の伸長、終結の 3段階からなる。複製の際には DNA2本鎖の一部がほどけ、それぞれの 1本鎖に相補的な新しい DNA鎖が合成される。 2本鎖をほどくのは、 DNAヘリカーゼとらせん不安定化蛋白（一本鎖 DNA結合蛋白ともいう）であり、ほどかれた部分は複製フォークと呼ばれる。複製フォークに向かって 3，→5，方向の铸型 DNAをリーディング鎖、その逆で 5， →3 '方向をラギング鎖と呼ぶ。 DNAポリメラーゼは、 5'→3 'に向かって DNA鎖を伸ばしてゆく。そのためリーディング鎖を铸型にする場合、複製フォークの方向に DNA が合成される。しかし、反対側のラギング鎖を铸型にすると、複製フォークと逆方向に DNA鎖を伸ばさねばならない。そのためラギング鎖の複製は、岡崎フラグメントと呼ぶ 200塩基程度の断片ごとに行われる。約 200塩基ごとに RNAプライマーが DNA を铸型にして、 10塩基の RNAを 5'→3 'の方向に合成する。その RNAをプライマーにして、ラギング鎖を铸型に DNAポリメラーゼが 5'→3 '方向に DNA鎖を合成する。複製された 200塩基程度の DNA断片は、その後 RNAが除去され 1本鎖の DNAに結合される。このような複製機構の中で、 DNAヘリカーゼ、らせん不安定ィ匕蛋白などの種々のタンパク質が協同して複製装置を形成して、る。関与して!/、る他のタンパク質として、 DNAトポイソメラーゼ (DNA複製の際のよじれを防ぐ）、複製開始蛋白や複製終了蛋白などが挙げられる。 DNA複製機構については、例えば、「細胞の分子生物学、第 3版、中村桂子ら訳、 251-262頁、教育社、 1996年」に詳しく解説されている。

[0027] そこで、さらにプラスミド pRETl lOO及び pRETlOOOの塩基配列を解析した結果、前記 DNA複製に関与する orfの近辺に、 ATリッチな相同性又は相似性のある繰返しを持った配列や DNAの二次構造をもっと思われる配列、すなわち DNA複製領域 (DNAの複製に関与するタンパク質が認識する塩基配列領域、又は DNAの複製開始点が存在する領域)と推測される塩基配列が見出された。

[0028] 以上、 DNA複製には、 DNA複製領域及び DNA複製に関与するタンパク質 (以下、 DNA複製関連タンパク質という）をコードする領域が必須である。本発明に従えば、 pRETl 100及び pRETlOOOの両プラスミドについて、これらの領域の塩基配列に関する情報が取得できる。

[0029] まず、プラスミド pRETl 100において、 DNA複製領域としては、配列番号 35— 37 に記載の塩基配列が同定される。また、 DNA複製関連タンパク質のコード領域としては、配列番号 1一 3に記載の塩基配列（orf 1)、配列番号 4に記載の塩基配列（orf 2)、配列番号 5— 16に記載の塩基配列（orf3)、配列番号 17— 21に記載の塩基配列（orf4)、配列番号 22— 26に記載の塩基配列（orf5)、配列番号 27又は 28に記載の塩基配列（orf 6)、塩基配列 29又は 30に記載の塩基配列（orf 7)、配列番号 31 又は 32に記載の塩基配列（orf8)、配列番号 33又は 34に記載の塩基配列（orf9) が同定される。

[0030] pRETl 100から DNA複製可能なプラスミドを作製するためには、この組換えプラスミドは、前記 DNA複製領域を少なくとも 1つと前記 DNA複製関連タンパク質のコード領域 (orf)を少なくとも 1つ備える必要がある。したがって、本発明のプラスミド (組換え型）は、このような DNA複製領域を少なくとも 1つと DNA複製関連タンパク質のコード領域を少なくとも 1つ含むことを特徴とする。ここで、 DNA複製関連タンパク質のコード領域は、配列番号 1、 4、 14、 17及び 22に記載の塩基配列力もなる群より選ばれる塩基配列を有することが好ま、。

[0031] 配列番号 76に記載の塩基配列の領域は複製に関係するタンパク質の発現に関与するプロモーターであることが示唆されており、本発明のプラスミドは、配列番号 76に記載の塩基配列を有するプロモーター領域を含んで、ることが好ま、。

[0032] プラスミド作製に際しては、前述の塩基配列情報に基づ、て、 DNA断片を適宜選択して、構築することができる。また、本発明は、該プラスミドの誘導体もしくは機能的な (DNA複製)断片をも包含する。

[0033] 次に、プラスミド pRETlOOOにおいて、 DNA複製領域としては、配列番号 70— 72 に記載の塩基配列が同定される。また、 DNA複製関連タンパク質のコード領域としては、配列番号 38— 41に記載の塩基配列（orf 10)、配列番号 42又は 43に記載の塩基配列（orf 11)、配列番号 44に記載の塩基配列（orf 12)、配列番号 45又は 46 に記載の塩基配列（orf 13)、配列番号 48— 50に記載の塩基配列（orf 14)、配列番号 51又は 52に記載の塩基配列（orf 15)、配列番号 53又は 54に記載の塩基配列（ orf 16)、配列番号 55に記載の塩基配列（orf 17)、配列番号 56— 60に記載の塩基配列（orf 18)、配列番号 61に記載の塩基配列（orf 19)、配列番号 62に記載の塩基配列（orf20)、配列番号 63— 69に記載の塩基配列（orf21)が同定される。

[0034] pRETlOOOから DNA複製可能なプラスミドを作製するためには、この組換えプラスミドは、前記 DNA複製領域を少なくとも 1つと前記 DNA複製関連タンパク質のコード領域 (orf)を少なくとも 1つ備える必要がある。したがって、本発明のプラスミド (組換え型）は、このような DNA複製領域を少なくとも 1つと DNA複製関連タンパク質のコード領域を少なくとも 1つ含むことを特徴とする。ここで、 DNA複製関連タンパク質のコード領域は、配列番号 40、 42、 44、 45、 53、 55、 56、 61、 62及び 69に記載の塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列を有することが好ましい。

[0035] 配列番号 67及び 47に記載の塩基配列の領域は接合タンパク質 (mobilization p rotein)と相同性があり、接合に関与することが示唆されている。また、配列番号 75 に記載の塩基配列の領域は接合タンパク質遺伝子の発現に関与することや発現タンパク質の認識部位であることが示唆されている。したがって、本発明のプラスミドは、配列番号 67及び 47に記載の塩基配列を有する接合タンパク質領域を含んでヽることや配列番号 75に記載の塩基配列を有する接合に関する領域を含んでいることが好ましい。

[0036] プラスミド作製に際しては、前述の塩基配列情報に基づ、て、 DNA断片を適宜選択して、構築することができる。また、本発明は、該プラスミドの誘導体もしくは機能的な (DNA複製)断片をも包含する。

[0037] 本発明のプラスミド又は DNA断片は、 DNA複製領域、 DNA複製関連タンパク質コード領域、プロモーター領域、接合タンパク質領域、接合に関する領域又はそれらの一部において、それぞれの領域の機能が損なわれない限り、 1若しくは複数個のヌクレオチドの置換、欠失、又は挿入を含む塩基配列を有していてもよい。

[0038] また、本発明のシャトルベクターは、本発明の DNA複製領域、 DNA複製関連タンパク質コード領域、プロモーター領域、接合タンパク質領域、接合に関する領域のいずれかに記載のプラスミド又は DNA断片と大腸菌内で複製可能な DNA領域を含み、 Rhodococcus属菌及び大腸菌内で複製可能なものであればよぐ例えば、配列番号 89—配列番号 100の塩基配列を有するものが挙げられる。本発明のシャトルべクタ一は、 Rhodococcus属菌及び大腸菌内で複製可能なものであれば、該塩基配列に、 1若しくは複数個のヌクレオチドの置換、欠失、又は挿入を含む塩基配列を有していてもよい。

[0039] 前記「複数個」とは、領域の種類によっても異なる力具体的には、 2— 1100個、好ましくは、 2— 800個、より好ましくは 2— 300個である。更に好ましくは、 2— 100個、更により好ましくは、 2— 20個、最も好ましくは 2— 10個である。

[0040] また、上記のような、 DNA複製領域、 DNA複製関連タンパク質コード領域、プロモ一ター領域、接合タンパク質領域、接合に関する領域又はそれらの一部と実質的に同一の塩基配列を有するプラスミド又は DNA断片として具体的には、 DNA複製領域、 DNA複製関連タンパク質コード領域、プロモーター領域、接合タンパク質領域、接合に関する領域又はそれらの一部とストリンジェントな条件下でノ、イブリダィズする塩基配列が挙げられる。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値ィ匕することは困難である力一例を示せば、相同性が高い DNA同士、例えば 8 0%以上、好ましくは 90%以上、より好ましくは 95%以上の相同性を有する DNA同士がハイブリダィズし、それより相同性が低、DNA同士がハイブリダィズしな、条件が挙げられる。より具体的には、通常のサザンノヽイブリダィゼーシヨンの洗浄の条件である 60°C、 1 X SSC, 0. 1⁰/₀SDS、好ましく ίま、 0. 1 X SSC、0. 1⁰/₀SDSにネ目当する塩濃度でハイブリダィズする条件が挙げられる。 DNA複製領域、 DNA複製関連タンパク質コード領域、プロモーター領域、接合タンパク質領域、接合に関する領域の一部が 300bp程度の長さの DNA断片を用いる場合には、ハイブリダィゼーションの洗浄の条件としては、 50°C、 2 X SSC、 0. 1%SDSが挙げられる。

[0041] 上記のような、 DNA複製領域、 DNA複製関連タンパク質コード領域、プロモータ一領域、接合タンパク質領域、接合に関する領域又はそれらの一部と実質的に同一の塩基配列を有するプラスミド又は DNA断片は、例えば、部位特異的変異法によつて、特定の部位のヌクレオチドにおいて置換、欠失、又は挿入を含むように、 DNA複製領域、 DNA複製関連タンパク質コード領域、プロモーター領域、接合タンパク質領域、接合に関する領域又はそれらの一部を改変することによって取得することができる。また、上記のような改変された DNAは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、 DNA複製領域、 DNA複製関連タンパク質コード領域、プロモーター領域、接合タンパク質領域、接合に関する領域又はそれらの一部を含む DNAをヒドロキシルァミン等でインビトロ処理する方法、および同 DNAを保持する微生物、例えばェシエリヒア属細菌を、紫外線または N—メチルー N'—二トロー N 一二トロソグァ二ジン (NTG)もしくは EMS等の通常変異処理に用いられて、る変異剤によって処理する方法が挙げられる。

[0042] また、上記のようなヌクレオチドの置換、欠失又は挿入には、ロドコッカス属菌の菌株による違いなどの天然に生じる変異 (mutant又は variant)も含まれる。

[0043] 本発明のシャトルベクターは、上記のプラスミド又はその一部である DNA断片（A) 及び大腸菌内で複製可能な DNA領域 (B)を含む。また、このシャトルベクターは、場合により薬剤耐性遺伝子を含む DNA領域を含んでもよぐこれは好ましい。当該技術分野において、一般的に「シャトルベクター」とは、二種の細胞の DNA複製機構を含み、望ましくはさらに選択マーカーとしての薬剤耐性遺伝子等を含む、その二種の細胞中で自律複製することができるベクターをいう。プラスミド又はその一部である DNA断片 (A)は、 Rhodococcus属菌中で複製可能な DNA領域である。大腸菌内で複製可能な DNA領域 (B)は、大腸菌内で複製増殖可能なプラスミドであれば、プラスミド全体であってもよぐ又はその一部であってもよい。前記大腸菌内で複製可能な DNA領域としては、例えば、 pUC18、 pHSG299、 pHSG398等のプラスミドを用いることが可能である。

[0044] 本発明のシャトルベクターが薬剤耐性遺伝子を含む場合、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフエ-コール耐性遺伝子などが好適に用いられる力宿主となる Rhodococcus属菌及び大腸菌内で発現し、宿主細胞に薬剤耐性を与えることができ、両菌属間で、薬剤耐性能によりプラスミドの存在が確認できるものであれば、薬剤の種類に限定はない。また、そのような薬剤耐性遺伝子を複数個、使用してちょい。

[0045] シャトルベクターには、複数のクロー-ングサイト（マルチクロー-ングサイト）が含まれることが望ましぐこのクローニングサイトと前記薬剤耐性遺伝子は、例えば、大腸菌プラスミドから誘導されうる。すなわち、上記で列挙した公知の大腸菌プラスミドを適当な制限酵素によって、切断して、クローユングサイトと薬剤耐性遺伝子を含む D NA領域を作製し、他方の DNA断片（Rhodococcus属菌中で複製可能な DN A領域)とライゲーシヨンする。

[0046] 実例として、シャトルベクターの構築の概略を図 3— 5に示す。シャトルベクターは、上記プラスミド及び大腸菌由来のプラスミドを適切な制限酵素で処理した後、両者をライゲーシヨンすることにより構築することが可能である。このようにして、本発明者らは、 Rhodococcus属菌のプラスミド pRETl 000、 pRETl lOO及び pRET1200と大腸菌のプラスミド pUC18、 pHSG299及び pHSG398とを使用して 18種類のシャトルベクター（表 ₅₎を作製した。

[0047] 本発明のシャトルベクターは、 Rhodococcus属菌又は大腸菌を宿主とすることができ、それらのいずれでも複製可能であり、工業的に利用できる。本発明のシャトルベクターによって形質転換された Rhodococcus属菌又は大腸菌、さらにその他の微生物の形質転換体は、このように有用であり、これら形質転換体も本発明に包含される。

[0048] 本発明のベクターは、本発明のシャトルベクターを用いて作製することを特徴とする。すなわち、本発明のシャトルベクターに導入したい標的 DNAが挿入されているベタターである。導入した!/、DNA及び本発明のシャトルベクターを適切な制限酵素で処理した後、両者をライゲーシヨンすることで、力かるベクターを作製することが可能である。このベクターを利用することで、所望の DNAを導入した形質転換体を得ることができる。

[0049] 挿入する DNAとしては、例えば、アミノケトン不斉還元酵素遺伝子や補酵素再生系酵素遺伝子が挙げられる。アミノケトン不斉還元酵素遺伝子は、 WO02Z07071 4に記載されているアミノケトン不斉還元酵素をコードする遺伝子であり、より具体的には、配列番号 78に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質 (R. erythropolis MA K 34株由来のアミノケトン不斉還元酵素）をコードする DNAであり、特に、配列番号 79に記載の塩基配列からなる DNAである。 WO02Z070714に記載されている内容も全て本明細書に含まれる。

[0050] アミノケトン不斉還元酵素は、 WO02Z070714に記載されている性質を有しておればよぐ配列表の配列番号 78に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、及び、前記アミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、アミノケトン不斉還元活性を有するタンパク質も含まれる。ここで、アミノケトン不斉還元活性とは、前記一般式（1)で表される α アミノケトンを基質として前記一般式（2)で表される光学活性なァミノアルコールを生成する活性をいう。

[0051] このような欠失、挿入、置換、付加を施す方法としては特に制限はなぐ公知の方法が使用できる。例えば、日本生化学会編、「続生化学実験講座 1、遺伝子研究法 II」、 ρ105 (広瀬進)、東京化学同人（1986)；日本生化学会編、「新生化学実験講座 2 、核酸 III (組換え DNA技術）」、 ρ233 (広瀬進）、東京化学同人（1992)； R. Wu, L . Grossman編， "Methods in Enzymology", Vol. 154, p. 350&p. 367, A cademic Press, New York 1,1987)； R. Wu, L. Grossman編, "Methods in Enzymology", Vol. 100, p. 457&p. 468, Academic Press, New York ( 1983)； J. A. Wellsら， "Gene", Vol. 34, p. 315 (1985)； T. Grundstroemら， "Nucleic Acids Res", Vol. 13, p. 3305 (1985)； J. Taylorら， "Nucleic Aci ds Res.，，， Vol. 13, p. 8765 (1985)； R. Wu編， "Methods in Enzymology ，，， Vol. 155, p. 568, Academic Press, New York (1987)； A. R. Oliphant ら， "Gene", Vol. 44, p. 177 (1986)に記載の方法が挙げられる。具体的には、例えば、合成オリゴヌクレオチド等を利用する位置指定変異導入法 (部位特異的変異導入法）、 Kunkel法、 dNTP [ a S]法 (Eckstein)法、亜硫酸や亜硝酸等を用いる領域指定変異導入法等の方法が挙げられる。

[0052] また、多くのタンパク質には糖鎖が付加されている場合があり、アミノ酸を 1若しくは複数置換することにより糖鎖の付加を調節することができる。従って、配列表の配列番号 78に記載のアミノ酸配列において、前記糖鎖の調節されたタンパク質も上述のアミノケトン不斉還元活性を有する限りは、本発明のアミノケトン不斉還元酵素に包含される。

[0053] さらに本発明のアミノケトン不斉還元酵素は、化学的な手法でその含有されるァミノ酸残基を修飾することもできるし、ぺプチダーゼ、例えば、ペプシン、キモトリブシン、パパイン、ブロメライン、エンドべプチダーゼ、ェキソぺプチダーゼ等の酵素を用いて修飾したり、部分分解したりしてその誘導体に改変することができる。

[0054] また、遺伝子組換え法で製造する時に融合タンパク質として発現させ、生体内あるいは生体外で天然のアミノケトン不斉還元酵素と実質的に同等の生物学的活性を有しているものに変換'加工してもよい。この場合、遺伝子工学的に常用される融合産生法を用いることができる力こうした融合タンパク質はその融合部を利用してァフィ二ティークロマトグラフィー等で精製することも可能である。タンパク質の構造の修飾' 改変等は、例えば日本生化学会編、「新生化学実験講座 1、タンパク質 VII、タンパク質工学」、東京化学同人（1993)を参考にし、そこに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法、さらにはそれらと実質的に同様な方法で行うことができる。

[0055] さらに、本発明のアミノケトン不斉還元酵素は、 1個以上のアミノ酸残基が同一性の点で天然のものと異なるもの、 1個以上のアミノ酸残基の位置が天然のものと異なるものであってもよい。本発明は、天然のアミノケトン不斉還元酵素に特有なアミノ酸残基力個以上（例えば、 1一 80個、好ましくは 1一 60個、さらに好ましくは 1一 40個、さらに好ましくは 1一 20個、特には 1一 10個等)欠けている欠失類縁体、特有のアミノ酸残基の 1個以上（例えば、 1一 80個、好ましくは 1一 60個、さらに好ましくは 1一 40個、さらに好ましくは 1一 20個、特には 1一 10個等）が他の残基で置換されている置換類縁体、 1個以上 (例えば、 1一 80個、好ましくは 1一 60個、さらに好ましくは 1一 40 個、さらに好ましくは 1一 20個、特には 1一 10個等）のアミノ酸残基が付加されている付加類縁体も包含する。天然のアミノケトン不斉還元酵素の特徴であるドメイン構造を有しているものも包含されてよい。また、同質のアミノケトン不斉還元酵素活性を有するちのち挙げられる。

[0056] 天然のアミノケトン不斉還元酵素の特徴であるドメイン構造が維持されていれば、上記のごとき変異体は、全て本発明のアミノケトン不斉還元酵素に包含される。また本発明の天然のアミノケトン不斉還元酵素と実質的に同等の一次構造コンフオメーションあるいはその一部を有して、るものも含まれてょ、と考えられ、さらに天然のァミノケトン不斉還元酵素と実質的に同等の生物学的活性を有しているものも含まれてよいと考えられる。さらに天然に生ずる変異体の一つであることもできる。こうした本発明のアミノケトン不斉還元酵素は、下記で説明するように分離'精製処理されることができる。一方では、こうして本発明は上記したポリペプチドをコードする DNA断片、そして天然の特性の全部あるいは一部を有するアミノケトン不斉還元酵素のポリべプチド、さらにその類縁体あるいは誘導体をコードする DNA断片も包含する。該アミノケトン不斉還元酵素のヌクレオチドは、修飾 (例えば、付加、除去、置換等)されることもでき、そうした修飾されたものも包含されてよい。

[0057] 本発明のアミノケトン不斉還元酵素遺伝子は、上記のアミノケトン不斉還元酵素をコードする核酸である。代表的には、配列表の配列番号 78に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸、特に配列番号 79に記載の塩基配列を有する核酸が挙げられるが、一つのアミノ酸をコードする塩基配列（コドン）は複数存在するため配列番号 78に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸は多数存在する。従って、このような核酸も本発明のアミノケトン不斉還元酵素遺伝子に包含される。ここで、「タンパク質をコードする」とは、 DNAが 2本鎖である場合には、相補 2本鎖のいずれか一方がタンパク質をコードする塩基配列を有するものを含むことを意味するため、本発明の核酸には配列番号 78に記載のアミノ酸配列を直接コードする塩基配列からなる核酸若しくはその相補的な塩基配列力なる核酸も包含される。さらに、本発明にかかるアミノケトン不斉還元酵素遺伝子は、配列番号 79と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でノ、イブリダィズし、且つアミノケトン不斉還元活性を有するタンパク質をコードする核酸であってもよい。ここで、「ストリンジヱントな条件」とは、前記定義と同一である。

[0058] 補酵素再生系酵素遺伝子は、各種脱水素酵素、すなわちグルコース脱水素酵素、グルコース 6リン酸脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、有機酸脱水素酵素及びアミノ酸脱水素酵素などが挙げられる。より具体的には、ァセトアルデヒド脱水素酵素、エタノール脱水素酵素、プロパノール脱水素酵素、グリセ口ール脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、酢酸脱水素酵素、酪酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素及びグルタミン酸脱水素酵素などが適宜利用される。

[0059] 本発明の形質転換体は、上記ベクターを含むことを特徴とする。形質転換体は、宿主細胞に上記ベクターを導入することにより得られる。ベクターの導入方法は公知の方法、例えば、リン酸カルシウム法、リポフエクシヨン法、エレクト口ポレーシヨン法、マイク口インジェクション法などで行うことが可能である。

[0060] 例えば、アミノケトン不斉還元酵素遺伝子が挿入されたベクターを含む本発明の形質転換体は、アミノケトン不斉還元活性を有しており、下記のアミノケトン不斉還元酵素の製造方法や光学活性ァミノアルコールの製造方法に応用することが可能である

[0061] 本発明のアミノケトン不斉還元酵素の製造方法は、アミノケトン不斉還元酵素遺伝子が挿入されたベクターを含む形質転換体を該形質転換体が増殖可能な培地で培養する培養工程と、前記培養工程で得られた該形質転換体からアミノケトン不斉還元酵素を精製する精製工程と、を含むことを特徴とする。

[0062] 前記培養の方法としては、使用する菌体が生育可能な条件であれば特に制限はなく公知の方法が使用でき、通常、炭素源、窒素源、その他養分を含む液体培地が使用される。培地の炭素源としては、上記菌体が利用可能であればいずれでも使用できる。具体的には、グルコース、フルクトース、シュクロース、デキストリン、デンプン、ソルビトール等の糖類、メタノール、エタノール、グリセロール等のアルコール類、フマル酸、クェン酸、酢酸、プロピオン酸等の有機酸類およびその塩類、ノラフィン等の炭化水素類、あるいはこれらの混合物等が使用できる。窒素源としては上記菌体が利用可能であればいずれでも使用できる。具体的には、塩ィ匕アンモ-ゥム、硫酸アンモ-ゥム、リン酸アンモ-ゥム等の無機酸のアンモ-ゥム塩；フマル酸アンモ-ゥム、クェン酸アンモ-ゥム等の有機酸のアンモ-ゥム塩；硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の硝酸塩；肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン等の無機または有機含窒素化合物、あるいはこれらの混合物等が使用できる。また、培地には、無機塩、微量金属塩、ビタミン類等の通常の培養に用いられる栄養源を適宜添加してもよい。また、必要に応じて、培地には、菌体の増殖を促進する物質、培地の pH保持に有効な緩衝物質等を添加してもよい。

[0063] 菌体の培養は、生育に適した条件下で行うことができる。具体的には培地の pH3— 10、好ましくは 4一 9、温度 0— 50°C、好ましくは 20— 40°Cで行うことができる。菌体の培養は、好気的または嫌気的条件下で行うことができる。培養時間は 10— 150時間が好ましいが、それぞれの菌体により適宜決められるべきである。

[0064] このようにして培養された菌体の培養液をろ過または遠心分離して、その菌体を水又は緩衝液でよく洗浄する。洗浄した菌体は適量の緩衝液に懸濁し、菌体を破砕する。破砕の方法としては特に制限はないが、例えば、乳鉢、ダイノミル、フレンチプレス、超音波破砕機等の機械的破砕法が挙げられる。得られた菌体の破砕液中より、固形物をろ過または遠心分離によって除去して得られた無細胞抽出液中のアミノケトン不斉還元酵素は酵素単離の常法によって採取される。

[0065] このような酵素単離の方法としては特に制限はなぐ公知の方法を用いることができる力例えば、硫酸アンモ-ゥム沈殿法等の塩析;セフアデックス等によるゲルろ過法；ジェチルアミノエチル基あるいはカルボキシメチル基等を持つ担体等を用いたィォン交換クロマトグラフィー法;ブチル基、ォクチル基、フエ-ル基等疎水性基を持つ担体等を用いた疎水性クロマトグラフィー法；色素ゲルクロマトグラフィー法；電気泳動法;透析；限外ろ過法；ァフィユティークロマトグラフィー法；高速液体クロマトグラフィ一法等により精製することができる。

[0066] さらに、前記酵素を固定ィ匕酵素として用いることもできる。このような方法としては特に制限はなぐ公知の方法を用いることができるが、酵素又は酵素産生細胞を固定化したものが挙げられ、共有結合法や吸着法といった担体結合法、架橋法、包括法等により固定ィ匕できる。また、ダルタルアルデヒド、へキサメチレンジイソシァネート、へキサメチレンジイソチオシァネート等の縮合剤を必要に応じて使用してもよ、。また、他の固定ィ匕法としては、例えば、モノマーを重合反応でゲルィ匕させて行うモノマー法；通常のモノマーよりも大きな分子を重合させるプレボリマー法；ポリマーをゲルイ匕させて行うポリマー法;ポリアクリルアミドを用いた固定化；アルギン酸、コラーゲン、ゼラチン、寒天、 κ一力ラギーナン等の天然高分子を用いた固定化;光硬化性榭脂、ゥレタンポリマー等の合成高分子を用いた固定ィ匕が挙げられる。

[0067] このようにして精製された酵素は、電気泳動（SDS— PAGE等）によって単一バンドが確認されれば精製が十分に行われたものと判断される。

[0068] 本発明の光学活性ァミノアルコールの製造方法は、一般式（1) :

[化 8]

(式中、

Xは同一又は異なっていてもよぐハロゲン原子、低級アルキル基、保護基で保護されて、てもよ、ヒドロキシル基、ニトロ基及びスルホ-ル基からなる群より選ばれる少なくとも一種を示し；

nは 0— 3の整数を示し；

R¹は低級アルキル基を示し； R², R³は同一又は異なっていてもよぐ水素原子及び低級アルキル基からなる群より選ばれる少なくとも一種を示し；

*は不斉炭素を示す）

で表される α—アミノケトンィ匕合物又はその塩のェナンチォマー混合物に本発明の製造方法で得られるアミノケトン不斉還元酵素を作用させて一般式 (2) :

[化 9]

(式中、 X、 n、

R²、 R³及び *は前記定義と同一）

で表される光学活性ァミノアルコールィ匕合物であって、所望の光学活性を有する該化合物を生成せしめることを特徴とする。

[0069] まず、本発明にかかる一般式（1)で表される α -アミノケトンについて説明する。

[0070] 置換基 Xにつ、て説明する。前記ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素原子などが挙げられる。

[0071] また、低級アルキル基としては炭素数 1一 6のアルキル基が好ましぐメチル基、ェチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、 s—ブチル基、 tーブチル基、ペンチル基、イソペンチル基およびへキシル基などが挙げられる。これらは、直鎖状または分枝状のいずれの構造を取っていてもよい。また、置換基として、フッ素原子や塩素原子などのハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルキル基、アミノ基またはアルコキシ基などを有して、てもよ、。

[0072] 保護基で保護されてヽてもよヽヒドロキシル基の保護基としては、水で処理して除去可能なもの、酸または弱塩基で除去可能なもの、水素添加にて除去可能なもの、ルイス酸触媒およびチォ尿素などで除去可能なものなどが挙げられ、前記保護基には、置換基を有していてもよいァシル基、置換基を有していてもよいシリル基、アルコキシアルキル基、置換基を有していてもよい低級アルキル基、ベンジル基、 p—メトキシベンジル基、 2, 2, 2—トリクロ口エトキシカルボ-ル基、ァリルォキシカルボ-ル基およびトリチル基などが含まれる。

[0073] なお、前記ァシル基には、ァセチル基、クロロアセチル基、ジクロロアセチル基、ピノロイル基、ベンゾィル基および p—二トロベンゾィル基などが含まれる。また、置換基として、ヒドロキシル基、アルキル基、アルコキシ基、ニトロ基およびハロゲン原子などを有していてもよい。前記シリル基には、トリメチルシリル基、 tーブチルジメチルシリル基およびトリアリールシリル基などが含まれる。また、置換基として、アルキル基、ァリール基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、ニトロ基およびハロゲン原子などの置換基を有していてもよい。前記アルコキシアルキル基には、メトキシメチル基および 2—メトキシエトキシメチル基などが含まれる。前記低級アルキル基には炭素数 1一 6のアルキル基が含まれ、メチル基、ェチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、 s ブチル基、 t ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基およびへキシル基などが挙げられる。これらは直鎖状または分枝状の、ずれの構造を取って、てもよ、。また、置換基として、フッ素原子や塩素原子などのハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルキル基、アミノ基およびアルコキシ基などを有して、てもよ、。

[0074] また、 Xは-トロ基またはスルホ-ル基でもよく、具体的にはメチルスルホ -ル基などが挙げられる。

[0075] さらに、 Xの数 nは 0— 3の整数であり、好ましくは 0である。

[0076] また、前記一般式（1)中の R¹は低級アルキル基を示す。このような低級アルキル基としては炭素数 1一 6のアルキル基が好ましぐメチル基、ェチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、 s ブチル基、 t ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基およびへキシル基などが挙げられる。これらは直鎖状または分枝状のヽずれの構造を取ってもよい。

[0077] R²、 R³は水素原子または低級アルキル基を示す。前記低級アルキル基には炭素数 1一 6のアルキル基が含まれ、メチル基、ェチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、 s ブチル基、 t ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基およびへキシル基などが挙げられる。これらは直鎖状または分枝状の!/、ずれの構造を取ってもよい。

[0078] また、前記 a アミノケトン化合物の塩としては、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、炭酸塩などの無機酸の塩、または、酢酸、クェン酸などの有機酸の塩が挙げられる

[0079] 前記 α アミノケトンは、対応する 1 フ二ルケトン誘導体の _α炭素をハロゲン化、例えば、ブロム化後、ブロム基などのハロゲンをァミンに置換することによって容易に合成できる（Ger. (East) , 11, 332, Mar. 12, 1956)。

[0080] 次に、本発明に力かる一般式（2)で表される光学活性ァミノアルコールについて説明する。前記一般式（2)における X、 n、

R²、 R³及び *は前記一般式（1)における定義と同一である。さらに所望の光学活性を有する j8—ァミノアルコールとしては（1 S, 2S)ァミノアルコールが挙げられる。 (IS, 2S)ァミノアルコールの具体例として、 d ースレオ— 2—メチルアミノー 1 フエ-ルプロパノール（d—プソイドエフェドリン）、 d—スレォー2—ジメチルアミノー 1 フエ-ルプロパノール（d—メチルプソイドエフェドリン）、（1S , 2S)— a— (l アミノエチル)一べンジルアルコール（d ノルプソイドエフェドリン）、 (1 S, 2S)— 1— (p—ヒドロキシフエ-ル)— 2—メチルァミノ— 1 プロパノール、（IS, 2S)— α— (1 アミノエチル) 2, 5—ジメトキシ一べンジルアルコール、（IS, 2S)— 1— (m—ヒドロキシフエ-ル)— 2—ァミノ— 1 プロパノール、（IS, 2S)— 1— (p—ヒドロキシフエ-ル )—2—アミノー 1 プロパノール、（IS, 2S)—1—フエ-ルー 2—ェチルアミノー 1—プロパノール、（IS, 2S)— 1—フエ-ルー 2—ァミノ— 1ーブタノール、（IS, 2S)— 1—フエ-ルー 2 ーメチルァミノ— 1—ブタノールなどが挙げられる。

[0081] 所望の光学活性を有する一般式（2)で表される光学活性ァミノアルコールが生成する限り、アミノケトン不斉還元酵素を作用させる条件は特に限定されないが、当該酵素の至適 pHは 8. 1であり、至適温度は 55°Cであることから、 pH7— 9及び温度 30 一 65°Cの条件で行うことが好まし！/、。

[0082] さらに、本発明の光学活性ァミノアルコールの製造方法は、一般式（1)：

[化 10]

で表される α—アミノケトンィ匕合物又はその塩のェナンチォマー混合物に本発明の形質転換体を作用させて一般式 (2)：

[化 11]

[0083] 前記反応を行う際の反応条件としては、例えば、液体培地で振盪培養した形質転換菌を集菌し、得られた菌体にアミノケトン水溶液 (0. 1— 10%濃度）を加え、 ρΗを 6 一 8に調整しながら温度 20— 40°Cで数時間から 1日反応させればよい。反応終了後、菌体を分離し、反応液中の生成物を単離することにより、光学活性ァミノアルコールを得ることができる。ここで、形質転換菌の処理菌体 (乾燥菌体ゃ固定化菌体等)や形質転換菌から得られた酵素、又は、固定ィ匕酵素等も同様にして行うことが可能である。

[0084] また、本発明の光学活性ァミノアルコールの製造方法においては、一般式（3)：

[化 12]

(式中、

Aは下記式 (Y)又は (Z)を表し、

[化 13]

[化 14]

( Z )

(ここで、 R⁵は水素原子、炭素数 1一 3のアルキル基、若しくは R⁶又は R⁹と結合してなる 1一 3個のへテロ原子を含む 5— 8員環のへテロ環状骨格を表し、 R⁶は水素原子、置換基を有していてもよい炭素数 1一 3のアルキル基、 R⁸と結合してなる炭素数 5— 1 0の炭化水素環、 R⁵又は R⁹と結合してなる 1一 3個のへテロ原子を含む 5— 8員環のヘテロ環状骨格を表し、 R⁷は水素原子、置換基を有していてもよい炭素数 1一 6のァルキル基を表す。 )； R⁸は水素原子、カルボキシル基、置換基を有していてもよい炭素数 1一 6のアルキル基、 R⁴と結合してなる 1一 3個のへテロ原子を含む 5— 8員環のヘテロ環状骨格、 R⁶と結合してなる炭素数 5— 10の炭化水素環を表し; R⁹は水素原子、置換基を有していてもよい炭素数 1一 6のアルキル基、置換基を有していてもよ V、炭素数 1一 6のアルキルォキシカルボ-ル基、置換基を有して!/、てもよ、ァシル基、R⁵又は R⁶と結合してなる 1一 3個のへテロ原子を含む 5— 8員環のへテロ環状骨格を表し; R^1C>は水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数 1一 6のアルキル基を表す。）

で表される化合物、又はその製薬学的に許容される塩あるヽは溶媒和物をさらに添加して反応を行うことにより、より効率的に光学活性ァミノアルコールの製造を行うことが可能である。 [0085] 前記一般式（3)にお、て、炭素数 1一 3のアルキル基としては、直鎖状、分枝状のいずれであってもよぐ具体的にはメチル基、ェチル基、 n プロピル基、イソプロピル基などが挙げられる。また、炭素数 1一 6のアルキル基としては、直鎖状、分枝状のいずれであってもよぐ具体的にはメチル基、ェチル基、 n プロピル基、イソプロピル基、 n -ブチル基、 i ブチル基、 s -ブチル基、 t ブチル基、ペンチル基およびへキシル基などが挙げられる。炭素数 5— 10の炭化水素環としてはシクロペンチル、シクロへキシル、シクロへプチル、シクロォクチル、シクロノ-ルおよびシクロデ力-ルなどが挙げられる。

[0086] ヘテロ原子 1一 3個を含む 5— 8員環のへテロ環状骨格において、ヘテロ原子としては窒素原子、酸素原子、硫黄原子などが挙げられ、特に好ましくは窒素原子、酸素原子が挙げられ、 5— 8員環のへテロ環状骨格としてはピロリジン、ピぺリジン、イミダゾリジン、ピぺラジン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、テトラヒドロチオフンおよびモルホリンなどが挙げられる。

[0087] また、炭素数 1一 6のアルキルォキシカルボ-ル基としてはメチルォキシカルボ-ル基、ェチルォキシカルボ-ル基、イソプロピルォキシカルボ-ル基、イソブチルォキシカルボ-ル基および t ブチルォキシカルボ-ル基などが挙げられる。ァシル基としてはホルミル基、ァセチル基、プロピオ-ル基、ブチリル基、イソブチリル基、ビバロイル基、ベンゾィル基およびバレリル基などが挙げられる。前記の炭素数 1一 3または炭素数 1一 6のアルキル基、炭素数 1一 6のアルキルォキシカルボ-ル基またはァシル基が置換基を有する場合には、置換基の種類、置換位置、及び置換基の数に限定されないが、置換基としては、例えばフッ素原子や塩素原子などのハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルキル基、カルボキシル基、アミノ基、アルコキシ基、ニトロ基およびァリール基などが挙げられる。さらに、製薬学的に許容される塩としては塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸の塩、酢酸、クェン酸などの有機酸の塩、 Na、 K、 Mg、 C a、アンモニアなどの無機塩基の塩およびトリェチルァミン、シクロへキシルァミンなどの有機塩基の塩が挙げられる。

[0088] このような一般式（3)で表される化合物としては、例えば、 1ーァセチルアミノー 2—ヒドロキシプロパン、 1ーメチルァミノ— 2—ヒドロキシプロパン、 1ーァミノ— 2—ォキソプロパン、 1 アミノー 2—ヒドロキシシクロペンタン、 1 アミノー 2, 3—ジヒドロキシプロパン、 L—トレオニン、 4ーァミノ一 3—ヒドロキシブタン酸、 1ーァミノ一 2—才キソシクロへキサン、モルホリン、 3—ヒドロキシピロリジン、 3—ヒドロキシピペリジン、 2 アミノメチノレーテトラヒドロフラン、 1— (2—ヒドロキシプロピル）アミノー 2—ヒドロキシプロパン、 1 t ブチロキシカルボニルァミノ— 2—ヒドロキシプロパン、 2—ァミノ— 3—ヒドロキシブタン、 DL—セリン、 1 —アミノー 2—ヒドロキシプロパン、 1—アミノー 2—ヒドロキシブタン、 1—アミノー 2—ヒドロキシシクロへキサンが挙げられる。これらのうち、不斉炭素原子を有する化合物においては、特に記載がない限り、光学活性体であっても、ラセミ体であってもよい。

[0089] これら活性誘導剤を培地中に添加することにより、菌体の活性が誘導され、その後の光学活性な j8—ァミノアルコールの生成は、無添カ卩時に比べ効率よく進行する。活性誘導剤は各々単独で用いてもよぐまたは複数の誘導剤の混合物で用いてもよ!ヽ。このような活性誘導剤の添加量は、培地に対し 0. 01— 10重量％が望ましい。

[0090] 本発明にかかる /3ーァミノアルコールの製造における反応方法としては、前記一般式（1)に示される α アミノケトンィ匕合物またはその塩のェナンチォマー混合物に前記菌体又は菌体力得られた酵素が作用して、対応する一般式 (2)で示される光学活性 β -ァミノアルコール化合物を生成する方法であれば特に限定されず、原料である α アミノケトンの水溶液に、緩衝液または水などで洗浄した菌体を混合することで反応を開始する。

[0091] また、反応条件は一般式（2)で示される光学活性 βーァミノアルコールィ匕合物の生成を損なわない範囲で選択できる。菌体量は、乾燥菌体として、ラセミアミノケトンに対して好ましくは 100分の 1一 1000倍、より好ましくは 10分の 1一 100倍である。また、基質であるラセミアミノケトンの濃度は好ましくは 0. 01— 20%、より好ましくは 0. 1 一 10%である。さらに、反応液の ρΗは好ましくは 5— 9、より好ましくは 6— 8であり、反応温度は好ましくは 10— 50°C、より好ましくは 20— 40°Cである。また、反応時間は 5— 150時間が好ましいが、それぞれの菌体により適宜決められるべきである。

[0092] また、反応をより効率的に進行させるために、グルコースなどの糖類、酢酸などの有機酸、グリセロールなどのエネルギー物質を添加することができる。これらは、各々単独で用いてもよぐそれらの混合物で用いてもよい。添加量は、基質に対して好ましくは 100分の 1一 10倍量である。また、補酵素等を添加することもできる。補酵素としては、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド (NAD)、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH)、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP)、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸 (NADPH)などを単独または混合物で用いることができ、添加量はラセミアミノケトンに対して好ましくは 1000分の 1一 5分の 1倍量である。また、これら補酵素に加え、補酵素再生酵素、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼを添加することができ、添加量はラセミアミノケトンに対して好ましくは 1

000分の 1一 5分の 1倍量である。また、補酵素再生酵素の基質、例えばグルコースを添加することもでき、添加量はラセミアミノケトンに対して好ましくは 100分の 1一 10 倍量である。さらに、グルコースなどの糖類、酢酸などの有機酸、グリセロールなどのエネルギー物質、補酵素、補酵素再生酵素および補酵素再生酵素の基質をそれぞれ組み合せて用いてもよい。これらは、本来、菌体中に蓄積されている力必要に応じてこれら物質を添加することにより、反応速度、収率等を上昇させることができる場合があり、適宜選択され得る。

[0093] さらに、反応液が上記になるように特定の塩を加え、その条件下で反応させると、未反応の α -アミノケトン異性体のラセミ化が促進され、菌体又は菌体から得られた酵素の基質となる鏡像異性体への変換をより効率的に進行させることができる。これにより、原料から 50%以上の高収率で目的のァミノアルコールが得られる傾向にある。

[0094] 未反応の ex -アミノケトンのラセミ化を促進する塩としては、酢酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、クェン酸塩、マロン酸塩、リン酸塩、炭酸塩、パラ-トロフエノール塩、亜硫酸塩およびホウ酸塩などの弱酸の塩であればよいが、好ましくはリン酸塩 (例えば、リン酸ニ水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二水素アンモニゥム）、炭酸塩（例えば、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸アンモニゥム）、タエン酸塩 (例えば、クェン酸ナトリウム、クェン酸カリウム、クェン酸アンモ-ゥム）などが使用される。また、これらの混合物も使用でき、 ρΗ6. 0— 8. 0の緩衝液として、最終濃度が 0. 01— 1Mとなるよう添加することが望ましい。例えば、リン酸塩の場合、リン酸二水素ナトリウム及びリン酸一水素ナトリウムを、 9対 1から 5対 95の割合で混合するとよ、。 [0095] 反応によって生成した光学活性 α—ァミノアルコールは、慣用の分離精製手段によつて精製できる。例えば、反応液から直接または菌体を分離した後、膜分離、有機溶媒 (例えばトルエン、クロ口ホルムなど)による抽出、カラムクロマトグラフィー、減圧濃縮、蒸留、晶析、再結晶などの通常の精製方法に供することにより、光学活性 )8—ァミノアルコールを得ることができる。生成した光学活性 βーァミノアルコールの光学純度は、高速液体クロマトグラフィー (HPLC)によって測定することができる。

実施例

[0096] 以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、下記の実施例は本発明の技術範囲を限定するものではな、。

[0097] (実施例 1) プラスミドの分離精製

( 1)方法

Rhodococcus属菌を 5mLの GPY培地（1 %グルコース、 0. 5%バクトペプトン、 0 . 3%イーストエキストラタト）に植菌し、 25°Cで振盪培養した。対数増殖期に lOOmg ZmLのアンピシリン溶液を 250 L添加し、 25°Cで 2時間振盪培養した。遠心分離（ 12krpm、 5分間）で集菌し、上清を取り除いた後、 ImLの 50mM Tris (pH7. 5)で懸濁し、再度、遠心分離 ( 12krpm、 5分間)で集菌し、上清を取り除いた。 TE溶液（ 10mM Tris (pH7. 5)、 lmM EDTA)に溶解した 250 Lの lOmgZmLリゾチーム溶液で懸濁し、 37°Cで 30分間放置した。その後、 100 Lの 3M食塩水と 25 Lの 10%SDSをカ卩え、—20°Cでー晚放置した。遠心分離（12krpm、 5分間）した上清に SO ^u gZmL ProteinaseK及び 50 gZmL RNaseAをそれぞれ 0. 5 μ L· 加え、 37°Cで 15分間放置した。その後、等量のフエノール/クロ口ホルム Zイソアミルアルコール溶液を添加し、遠心分離（12krpm、 5分間）を行った。上清に 2. 5倍量のエタノールをカ卩え、遠心分離（12krpm、 5分間）し、 50 Lの滅菌水に沈殿を溶解した。プラスミドの確認は、 0. 8%ァガロースゲルで電気泳動し、臭化工チジゥムで染色した後、 UV照射で行った。

[0098] (2)供試菌株及び結果

本実施例では、 Rhodococcus属及びその類縁菌である Mycobacterium属の各種入手可能な菌株力上記（1)の方法にしたがって、プラスミドの有無についてのスクリーニングを行った。

[0099] スクリーニングした菌株のうちプラスミドの保持を確認できたものを表 3に示す。すなわち、 Rhodococcus erythropolis (IAM1400 IAM1503 JCM2893 JCM2 894及び JCM2895)さら【こ、 Rhodococcus rhodnii (JCM3203)【こお!ヽて、それぞれ約 5. 4 kbp及び約 5. 8kbpのプラスミドを確認できた。これらのプラスミドを、表 3 【こ歹 U挙された名称のよう【こ、 pRET1100 pRET1200 pRET1300 pRET1400 pRET1500 pRET1600 pRET1700 pRET1800 pRET0500 pRETlOO 0と命名した (表 3)。

[0100] なお、 R. erythropolis IAM 1400及び IAM 1503は、東京大学分子細胞生物学研究所が発行した「IAM Catalogue of Strains, Third Edition, 2004」に記載されており、当該研究所力も入手することができる。また、 R. erythropolis JCM 2893 JCM2894及び JCM2895、並びに R. rhodnii JCM3203は、独立行政法人理化学研究所が発行した「JCM Catalogue of Strains, Eighth Edition 2 002」に記載されており、当該研究所力入手することができる。

[0101] [表 3]

(実施例 2) 制限酵素サイトの特定

表 3に示したプラスミドを分類するために各種制限酵素を用いて、制限酵素サイトを調べた。各プラスミドを実施例 1に記載の方法で分離した後、 EcoRI HindIII Pvul I Seal, SpHI Smal Sacl BamHI及び Kpnlで消化し、 0. 8%ァガロースゲルで電気泳動することにより DNA断片を確認した。サイズマーカーは Loading Quick DNA size Marker λ /EcoRI+Hindlll double digest (東洋紡）を使用した。サイズマーカーを基に、制限酵素で切断されるサイトの数とそのフラグメントの大きさを決定した。結果を表 4にまとめた。

[表 4]

( )内はサイズ kbp

[0104] 上記解析の結果、表 3のプラスミドは、 pRETl lOOと同様の制限酵素サイトを保持するプラスミド類、 PRET1200と同様の制限酵素サイトを保持するプラスミド類及び p RET1000の 3種類に分類された。

[0105] (実施例 3) プラスミドのシークェンス及び相同性検索

実施例 2の結果から、プラスミドが 3種類、すなわち pRET1000、 pRETl lOO及び PRET1200に分類されたので、それぞれのプラスミドのシークェンスを試みた。

[0106] まず、塩基配列を決定するために、これらプラスミド類のクローユングを行った。 Rho dococcus erythropolis (IAM 1400)につ、ては、プラスミド（pRETl 100、 pRET 1200)を分離したあと Smalと Saclで消化した。 0. 8%ァガロースゲルで電気泳動し、 DNA断片を確認したところ、約 0. 5kbp、約 1. 7kbp、約 3. 7kbp、約 4. 9kbpの DNA断片を確認できた。これらの DNA断片を GFX™ PCR DNA and Gel B and Purification Kit (アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてァガロースゲルから回収し、インサート DNAとした。一方、ベクター DNAとしては、 pBluescript II KS (一）を Smal単独で又は Smal及び Saclで消化したものを用いた。インサート D NAとベクター DN Aを Ligation high (東洋紡）を用いてライゲーシヨンし、大腸菌 J M109に开質転換した。得られた开質転換体を GKX Micro Plasmid Prep Kit (アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてスクリーニングし、各々のクローンを得た [0107] 一方、 Rhodococcus rhodnii(jCM3203)についてはプラスミド（pRETlOOO) を分離した後、 BamHIで消化した。 0. 8%ァガロースゲルで電気泳動したところ、約 2. Okbp、約 3. 8kbpの DNA断片を確認できた。これらの DNA断片を上記の Kitを用いてゲルから回収し、インサート DNAとした。ベクター DNAは pBluescriptll KS (一）を BamHIで消化したものを用いた。

[0108] プラスミドのインサートの塩基配列決定は、プライマーウォーキング法で行った。機器は ABI PRISM™ 310NT Genetic Analyzerゝ酵素は BigDye Terminat or v3. 1 Cycle Sequencing Kit (ABI製）を使用した。

[0109] まず、 P7 (M13 forward、東洋紡）プライマー及び P8 (Ml 3 reverse、東洋紡）プライマーを用いてインサートの塩基配列の一部を解読した。次に解読した配列内にプライマーを設計 (配列解析ソフトウェアである DNASIS Proを使用；日立ソフトゥエア社)し、設計したプライマー (合成オリゴ DNA)を用いてさらに塩基配列を解読した。この手順を、インサートの塩基配列が全て解読できるまで繰り返した。インサートの塩基配列解読が終了したあと、これらのインサートがどのように連結して、るかを解析するために、各々のインサートの末端にベクター方向に反応が行われるようプライマーを設計し、 Rhodococcus erythropolis (IAM1400)から分離したプラスミドを铸型として PCRを行った (KOD Plusを使用）。その PCR産物を GFX™ PCR D NA and Gel Band Purification Kitを用いて精製し、 PCRに使用したプライマーと同じプライマーを使用してシーケンスを行いインサートの整列を解析した。

[0110] シークェンスの結果、 pRETl lOOは 5444bp力らなり、その G + C含量は 59%であることが分力ゝつた。決定された全塩基配列を配列表の配列番号 73に示す。 pRET12 00ίま、 5421bp力らなり、 G + C含量 ίま 62⁰/₀であった。 pRETlOOOiま、 5813bp力らなり、 G + C含量は 67%であった。決定された全塩基配列を配列表の配列番号 74に示す。

[0111] これらの決定された塩基配列を DNASIS Proを用いて、相同性検索を行ったところ、 pRETlOOO及び pRETl lOOは新規のプラスミドであることが判明した。一方、 p RET1200は、 pN30 (Gene bank accession no. AF312210)と約 99. 6% ( pRETl 200を基に計算)相同性があった。 [0112] さらに、 pRETlOOO及び pRETl lOOについて、決定された塩基配列を基に DN A SIS Proを使用して、公知プラスミドとの比較を行った。その結果、両方のプラスミドについて、全ての制限酵素サイトが一致するプラスミドは検出されな力つた。

[0113] (実施例 4) 塩基配列の解析

pRETl lOO及び pRETlOOOの塩基配列を解析した結果を以下に示す。

[0114] pRETl lOOには以下の orfが見出された：

酉己歹 IJ番号 73に記載の塩基酉己歹 IJ上、 202番目、 238番目又 ίま 337番目力ら 480番目までの塩基配列力なる orf 1 (配列番号 1、配列番号 2又は配列番号 3)；配列番号 73に記載の塩基配列上、 477番目から 758番目までの塩基配列からなる o rf2 (配列番号 4) ;

配列番号 73に記載の塩基配列上、 862番目、 1294番目、 1450番目、 1462番目、

1486番目、 1489番目、 1513番目、 1630番目、 1645番目、 1687番目、 2224番目又は 2227番目力ら 2409番目までの塩基配列からなる orf 3 (配列番号 5、配列番号 6、配列番号 7、配列番号 8、配列番号 9、配列番号 10、配列番号 11、配列番号 1

2、配列番号 13、配列番号 14、配列番号 15又は配列番号 16)；

配列番号 73に記載の塩基配列上、 1875番目、 1734番目、 1701番目、 1674番目又は 1581番目から 1444番目までの塩基配列に相補的な塩基配列からなる orf4 ( 配列番号 17、配列番号 18、配列番号 19、配列番号 20又は配列番号 21)；配列番号 73に記載の塩基配列上、 2828番目、 2792番目、 2747番目、 2594番目又は 2540番目力ら 2406番目までの塩基配列に相補的な塩基配列からなる orf 5 ( 配列番号 22、配列番号 23、配列番号 24、配列番号 25又は配列番号 26)；酉己歹 IJ番号 73に記載の塩基酉己歹 IJ上、 2971番目又 ίま 3049番目力ら 3306番目までの塩基配列からなる orf6 (配列番号 27又は配列番号 28)；

配列番号 73に記載の塩基配列上、 3577番目又は 3571番目力 3053番目までの塩基配列に相補的な塩基配列からなる orf 7 (配列番号 29又は配列番号 30)；配列番号 73に記載の塩基配列上、 3339番目又は 3648番目からそれぞれ 3902番目までの塩基配列力もなる orf 8 (配列番号 31又は配列番号 32)；及び

酉己歹 IJ番号 73に記載の塩基酉己歹 IJ上、 4366番目又 ίま 4477番目力ら 5034番目までの塩基配列からなる orf 9 (配列番号 33又は配列番号 34)。

pRETlOOOには以下の orfが見出された：

酉己歹 IJ番号 74に記載の塩基酉己歹 IJ上、 3350番目、 3251番目、 2945番目又 ίま 2849 番目から 2412番目までの塩基配列に相補的な塩基配列力もなる orf 10 (配列番号 3 8、配列番号 39、配列番号 40又は配列番号 41)；

配列番号 74に記載の塩基配列上、 2365番目又は 2332番目力ら 2159番目までの塩基配列に相補的な塩基配列力なる orfl l (配列番号 42又は配列番号 43)；配列番号 74に記載の塩基配列上、 3197番目力も 3526番目までの塩基配列からなる orf 12 (配列番号 44)；

配列番号 74に記載の塩基配列上、 4035番目又は 3996番目力ら 3679番目までの塩基配列に相補的な塩基配列力なる orf 13 (配列番号 45又は配列番号 46)；酉己歹 U番号 74に記載の塩基酉己歹 IJ上、 4621番目、 4654番目又 ίま 4666番目力ら 483 0番目までの塩基配列からなる orf 14 (配列番号 48、配列番号 49又は配列番号 50) 配列番号 74に記載の塩基配列上、 5161番目又は 5062番目カゝら 4709番目までの塩基配列に相補的な塩基配列力なる orf 15 (配列番号 51又は配列番号 52)；配列番号 74に記載の塩基配列上、 2331番目又は 2334番目力ら 2618番目までの塩基配列からなる orf 16 (配列番号 53又は配列番号 54)；

配列番号 74に記載の塩基配列上、 2907番目力 3242番目までの塩基配列からなる orf 17 (配列番号 55)；

配列番号 74に記載の塩基配列上、 1650番目、 1689番目、 1713番目、 1827番目又は 1875番目力 2162番目までの塩基配列力もなる orf 18 (配列番号 56、配列番号 57、配列番号 58、配列番号 59又は配列番号 60)；

配列番号 74に記載の塩基配列上、 1906番目力も 2169番目までの塩基配列からなる orf 19 (配列番号 61)；

配列番号 74に記載の塩基配列上、 810番目から 553番目までの塩基配列に相補的な塩基配列力もなる orf 20 (配列番号 62)；

配列番号 74に記載の塩基配列上、 117番目、 147番目、 306番目、 456番目、 514 4番目、 5276番目又 ίま 5534番目力ら 656番目までの塩基酉己歹 IJ力らなる orf21 (酉己列番号 63、配列番号 64、配列番号 65、配列番号 66、配列番号 67、配列番号 68又は配列番号 69)。

[0116] pRETl lOOにおける DNA複製領域は、配列番号 35に記載の塩基配列（2410番目力ら 3200番目 )、酉己歹 IJ番号 36に記載の塩基酉己歹 IJ (1000番目力ら 1500番目 )又は配列番号 37に記載の塩基配列（5000番目から 500番目）で示される領域である。 PRET1000における DNA複製領域は、配列番号 70に記載の塩基配列（3355番目から 3507番目）、配列番号 71に記載の塩基配列 (4290番目力も 4350番目）又は配列番号 72に記載の塩基配列（3570番目から 3894番目）で示される領域である

[0117] pRETlOOO (配列番号 74)の塩基配列上、 5144番目力ら 656番目の塩基配列（配列番号 67)の領域及び 4381番目から 4830番目の塩基配列（配列番号 47)の領域は、 mobilization protein (接合タンパク質）と相同性があり、接合に関与することが示唆された。

[0118] さらに、 pRETlOOO (配列番号 74)の塩基配列上、 4260番目力ら 4339番目の塩基配列（配列番号 75)の領域では DNAの二次構造が推定され、上記 mobilization protein遺伝子の発現や発現したタンパク質の認識部位であることが示唆された。

[0119] 一方、 pRETl 100 (配列番号 73)の塩基配列上、 761番目力ら 868番目の塩基配列 (配列番号 76)の領域は、複製に関係するタンパク質の発現に関与するプロモーターであることが示唆された。

[0120] (実施例 5) シャトルベクターの構築

Rhodococcus属菌と大腸菌間のシャトルベクターを構築するために、 Rhodococc us属菌のプラスミド pRET1000、 pRETl 100及び pRETl 200と大腸菌のプラスミド pUC18、pHSG299及び pHSG398を使用して以下の実験を行った。

[0121] まず、 R. erythropolisのプラスミドから DNAフラグメントを調製した。すなわち、 R. erythropolis (IAM1400)からプラスミド pRETl 100及び pRET1200を取得した後、 Alw44Iを用いて pRETl 100を 37°Cで 2時間消化し、 Blunting high (東洋紡）を用いて平滑末端化することにより、一方 pRET1200は BspLUl IIを用いて 48°Cで 2 時間消化し、 Blunting highを用いて平滑末端ィ匕することにより、 R. erythropolis プラスミドの DNAフラグメントを得た。各々の DNAフラグメントを TE溶液に溶解した。

[0122] 一方、 pRETlOOOにつ!/ヽて ίま、 R. rhodnii (jCM3203)力らプラスミド pRETlOO 0を取得した後、 Drdlを用いて pRETlOOOを 37°Cで 2時間消化し、 Blunting high を用いて平滑末端ィ匕することにより pRETlOOOの DNAを得、これを TE溶液に溶解した。

[0123] 次に E. coliプラスミドから DNAフラグメントを調製した。すなわち pUC18 (アンピシリン耐性遺伝子 (Amp¹)含有）は Smalを用いて 30°Cで 2時間消化することにより、 p HSG299 (カナマイシン耐性遺伝子 (Km^r)含有)及び pHSG398 (クロラムフエ-コール耐性遺伝子 (Cm¹)含有）は Hindiを用いて 37°Cで 2時間消化することにより、 E . coliのプラスミドの DNAフラグメントを得、 TEに溶解した。

[0124] 上記のように調製した Rhodococcus属菌及び大腸菌のプラスミドからの DNAフラグメントをライゲーシヨンした後、 E. coli DH5 aに形質転換して、 30 μ Lの 0. 1M IPTG (イソプロピル βーガラタトシド）と 4%の X— gal (5—ブロモー 4 クロ口一 3—インド一ルー j8— D—ガラタトピラノシド）を塗布した、 100 gZmLのカナマイシン、 100 /z g ZmLのアンピシリン又は 30 μ gZmLのクロラムフエ-コールを含有する LB ( 1 %トリプトファン、 0. 5%イーストエキストラタト、 1 %塩ィ匕ナトリウム; pH7. 2)寒天培地にプレーティングし、 30°Cで 60時間放置した。出現したコロニーのうち白色のコロニーを選択し 100 μ gZmLのカナマイシン、 100 μ g/mLのアンピシリン又は 30 μ g/mL のクロラムフエ-コールを含有する LB液体培地で 30°C、 60時間振盪培養した。得られた培養液から GFX™ Micro Plasmid Prep Kit (アマシャムバイオサイエンス社製、商品添付資料の条件で精製)を用いて DNAを精製した。得られた DNAを 0. 8%ァガロースゲル電気泳動で確認した。得られたシャトルベクターを表 5に、 pRET 1100を用いた各シャトルベクターの作製方法を図 3— 5に示す。

[0125] [表 5] 構築した由来

シャトレベクタ一口ドコッカス属菌大腸菌

PRET1001 , pRET1001Rv PRET1000 pUC18

PRET1002, pRET1002Rv PRET1000 PHSG299

PRET1003, pRET1003Rv PRET1000 PHSG398

p ET1101 , p ET1101 v P ET1100 pUC18

p ET1102, p ET1102 v P ET1100 PHSG299

p ET1103, p ET1103 v P ET1100 PHSG398

pRET1201 , pRET1201Rv PRET1200 pUC18

pRET1202, pRET1202Rv PRET1200 PHSG299

pRET1203, pRET1203Rv PRET1200 PHSG398

[0126] pRETllOOと pUC18、 pHSG299又は pHSG398とで構成されるシャトルベクタ一を、それぞれ、 pRETllOl (配列番号 89)、 pRET1102(配列番号 90)又は pRE Tl 103 (配列番号 91)と命名した。なお、 pRETllOlはアンピシリン耐性、 pRETll 02はカナマイシン而性、 pRET1103は、クロラムフエ-コール而性を示すシャトルべクタ一である。また、 pRETllOl— 1103のそれぞれの大腸菌遺伝子と pRETllOO の結合の仕方が反対 (Rv)のシャトルベクターを、それぞれ pRETl IOIRV (配列番号 92)、 pRET1102Rv (配列番号 93)及び pRET1103Rv (配列番号 94)と命名した。

[0127] 同様に、 pRETlOOO及び pRET1200を用いて構築したシャトルベクターをそれぞれ pRETlOOl— pRET1003(配列番号 95—配列番号 97)及び pRETlOOlRv— pRET1003Rv (配列番号 98—配列番号 100)並びに pRET1201— pRET1203 及び pRETl 20 IRv— pRETl 203Rvと命名した（表 5)。

[0128] (実施例 6) R. erythropolisへの形質転換方法の検討

実施例 5で得られた Rhodococcus属菌ー E. coliのシャトルベクターを用いて、 R. ervthropolis MAK - 34株（MAK - 34；受託番号 FERM BP—7451、経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所 (現独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）にて平成 13年 2月 15日に受託)を形質転換した。遺伝子導入方法としてエレクト口ポレーシヨン法を検討した。

[0129] まず、 5mLの GPY培地に R. erythropolis MAK— 34株を植菌し、 30°Cで 36時間振盪培養した。その培養液 ImLを lOOmLの LB培地に植え継ぎ、 30°Cで 10時間、 200rpmで培養した。培養した菌体を遠心分離（12krpm、 5分間、 4°C)により回収し、回収した菌体を超純水で 2回洗浄した。洗浄し終えた菌体を遠心分離（12krpm 、 5分間、 4°C)により回収し、 2. 4mLの 10%グリセロール溶液に懸濁した。懸濁液を 300 μ Lずつ分注し、—80°Cで凍結してコンビテントセルとした。

[0130] 作製したコンビテントセル 90 μ Lとシャトルベクター（pRET1001、 pRET1002、 p RET1003、 pRET1101、 pRET1102、 pRET1103、 pRET1201、 pRET1202 及び pRET1203) 5 /z Lとを氷上で混合した。混合溶液を氷上で冷却した 0. 1cmのキュベットに静カに流し込み、 Gene Pulser II Electroporation System (BIO RAD製）【こセットした。 20kV/cmゝ 400 Ω、 25 Fでノノレスし、直ち【こ 300 μ Lの LB培地をカ卩え、 25°Cで 3時間放置した。

[0131] その菌懸濁液の一部を、抗生物質を含む LBプレート（100 gZmLのカナマイシン、 100 μ g/mLのアンピシリン又は 30 μ g/mLのクロラムフエ-コール）にプレーティングした。その結果、カナマイシン耐性遺伝子を持つ pRET1002、 pRET1102 及び PRET1202を用いた場合にコロニーが得られた。また、この得られたコロニーがプラスミドを保持してヽるかを確認するために、プラスミドを分離して確認したところ、すべてシャトルベクターを保持して!/、た。

[0132] 以上から、エレクト口ポレーシヨンによって R. erythropolisを形質転換できるということ、並びに pRET1002、 pRET1102及び pRET1202がシャトルベクターとして機能して、ることが示唆された。

[0133] (実施例 7) アミノケトン不斉還元酵素遺伝子 (mak gene)の取得

表 5に示したシャトルベクターに mak geneを挿入するために、 R. erythropolis MAK— 34株から mak geneを単離した。

[0134] 最初に、 R. erythropolis MAK— 34株のゲノム DNAの取得を行った。 5mLの G PY培地に R. erythropolis MAK— 34株を植菌し、 30°Cで 48時間振盪培養した後、その培養液を lOOmLの GPY培地に植え継ぎ、 30°Cで 10時間、 200rpmで培養した。 Genomic DNA Buffer set及び Genomic— tip 500/G (QIAGEN) を用いてゲノム DNAを取得した。

[0135] 次に、取得したゲノム DNAを铸型として KOD— plus を用いて PCRを行った。プライマ一は MAKF1 (5 ' -GAATCTTCTCGTTGATGCAGATCAGGTC-3 '；配列番号 80)と MAKR2 (5，— CTGACTCCGTAGTGTTCTGCCAGTTC— 3，；配列番号 81)、ァニール温度 68°C、伸長反応 1分 50秒で PCRを行った。得られた PCR産物をフエノール Zクロ口ホルム処理及びエタノール沈澱した後、 Smalを用いて 30°Cで 2時間消化した PUC18と混合し、 Ligation Highを用いてライゲーシヨンした。 Competent high (東洋紡）を用いて E. coli DH5 αを形質転換し、 30 Lの 0. 1M IPTGと 4%の X— galを塗布した LB寒天培地（100 μ gZmLのアンピシリンを含有）にプレーティングし、 30°Cで 60時間放置した。出現したコロニーのうち白色のコロニーを選択し 100 μ g/mLのアンピシリンを含む LB液体培地で 30°C、 60時間振盪培養した。得られた培養液から GFX™ Micro Plasmid Prep Kitを用いて DNA精製した。得られた DNAを 0. 8%ァガロースゲル電気泳動で確認した。得られたクローンを p MAK— 1と命名した。

[0136] (実施例 8) 発現ベクターの構築 1

表 5に示したシャトルベクターにプロモーター及びアミノケトン不斉還元酵素遺伝子 (mak gene)を揷入した。

[0137] まず、 mak geneの上流約 400bpを含む発現ベクター（外来プロモーター無し）のプラスミドを構築した。

[0138] pMAK— 1を、 Smalを用いて 30°Cで 2時間消化し、さらに Pstlを用いて 37°Cで 2 時間消化した。その溶液を 0. 8%ァガロースゲルで電気泳動に供した。 DNAサイズマーカーは Loading Quick DNA size Marker λ /EcoRI+Hindlll doub le digestを使用した。電気泳動後、約 1. 4kbpの DNAフラグメントを GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kitを用いて精製し、それをインサート D NAとして使用した。一方、ベクターは pRET1102を Hindi及び Pstlを用いて 37°C で 2時間消化したものを使用した。これらの DNA断片を Ligation Highを用いてラィゲーシヨンし、 Competent highを用いて E. coli DH 5 αを形質転換した。 100 μ gZmLのカナマイシンを含む LB寒天培地にプレーティングし、 30°Cで 60時間放し 7こ。

[0139] 出現したコロニーを 100 μ gZmLのカナマイシンを含む LB液体培地で 30°C、 60 時間振盪培養した。得られた培養液から GFX™ Micro Plasmid Prep Kitを用いて DNA精製した。得られた DNAを 0. 8%ァガロースゲル電気泳動で確認した。

[0140] スクリーニングは、得られた DNAを制限酵素処理して!/ヽな、もの及び Pstlを用いて 37°C2時間消化したものを 0. 8%ァガロースゲル電気泳動に供し、得られた DNAのサイズから目的のプラスミドを得た。その際、サイズマーカーは Loading Quick D NA size Marker λ /EcoRI + Hindlll double digest, pRETl 102及び Ps tlを用いて 37°C2時間消化した pRETl 102を用いた。このようにして得たプラスミドを pRETl 104と命名した。

[0141] (実施例 9) 発現ベクターの構築 2

発現ベクターの改良、遺伝子改変、形質転換効率向上及び菌体内における複製などにぉ、てベクターの縮小は有効であるため、シャトルベクターの縮小を行った。

[0142] まず、シャトルベクター pRETl 102の縮小を行った。 pRETl 102を BamHI及び Hi ncllで 2時間消化したあと 0. 8%ァガロース電気泳動に供し、約 2. 7kbpの DNA断片を GFX^TM PCR DNA and Gel Band Purification Kitを用いて回収し、 PRET1102の DNA断片を調製した。この際、サイズマーカーは Loading Quick DNA size Marker λ /EcoRI + Hindlll double digestを使用した。

[0143] 一方、大腸菌で複製する DNA断片は、 pHSG299を BamHI及び Hindiで 2時間消化したあと 0. 8%ァガロース電気泳動に供し、約 2. 7kbpの DNA断片を GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kitを用いて回収することにより調製した。

[0144] これらの DNA断片を Ligation Highを用いてライゲーシヨンし、 Competent hig hを用いて大腸菌 JM109を形質転換し、 30 /z Lの 0. 1M IPTGと 4%の X— galを塗布した 100 μ gZmLのカナマイシンを含む LB寒天培地にプレーティングし、 30°Cで 48時間放置した。

[0145] 出現したコロニーのうち白色のコロニーを選択し、 100 μ gZmLのカナマイシンを含む LB液体培地で 30°C48時間振盪培養した。得られた培養液から GFX™ Micr o Plasmid Prep Kitを用いて DNAを精製した。このようにして得た pRETl 102 の縮小シャトルベクターを pRETl 123 (約 5. 3kbp)と命名した。

[0146] 次に、シャトルベクター pRETl 202の縮小を行った。ロドコッカス属菌由来の DNA 断片は、 pRET1202を EcoRIで 2時間消化し、さらに Drainで 2時間消化した後、 B1 unting Highを用いて平滑末端ィ匕し、 0. 8%ァガロース電気泳動に供した後約 3. 7kbpの DNA断片を GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kitを用いて回収することにより調製した。この際、サイズマーカーは Loading Quick D NA size Marker λ /EcoRI + HindIII double digestを使用した。この DNA 断片を PHSG299の Hindiサイトへ挿入した。ライゲーシヨン後、 Competent high を用いて大腸菌 DH5 aを形質転換し、 30 /z Lの 0. 1M IPTGと 4%の X— galを塗布した 100 μ gZmLのカナマイシンを含む LB寒天培地にプレーティングし、 30°Cで 72時間放置した。出現したコロニーのうち白色のコロニーを選択し、 100 gZmLのカナマイシンを含む LB液体培地中、 30°Cで 72時間振盪培養した。得られた培養液力ら GFX™ Micro Plasmid Prep Kitを用いて DNA精製した。スクリーニングにより得られたプラスミドを Sacl、 BamHI、 Pstl又は EcoRIで 2時間消化したところ、すべてのクローンがロドコッカス属菌由来の領域のうち、 EcoRIサイト側が約 500bp 削られていた。このプラスミドを pRET1204 (約 5. 9kbp)と命名した。なお、ロドコッカス属菌複製領域が削れて、な、クローンにつ、ては取得できな力つた。

[0147] 同様に、シャトルベクター pRET1002の縮小をおこな!/、、 pRET1006 (約 4. 9kbp )を得た。

[0148] これら 3種類の縮小プラスミド、 pRET1006、 pRET1123及び pRET1204で R. er ythropolisを形質転換し、実施例 6記載の方法でシャトルベクターの保持の有無を確認したところ、シャトルベクターを保持していることを確認した。このことから、 3種類の縮 zJ、プラスミド、 pRET1006、 pRET1123及び pRET1204は R. erythropolisにぉ、て複製することが示唆された。 [0149] (実施例 10) 発現ベクターの構築 3

実施例 9で構築したシャトルベクターへ mak geneを挿入し発現ベクターを構築した。

[0150] プロモーターを 1段階でクローユングするために実施例 9で構築した pRETl 123の Pstlサイトを欠損させた。 pRET1123を Pstlで 2時間消化した後、 Blunting High を用いて平滑末端ィ匕し、 Ligation Highを用いてライゲーシヨンした。その溶液を C ompetent Highを用いて大腸菌 JM109を形質転換し、 100 gZmLのカナマイシンを含む LBプレートで 30°C、 36時間培養した。形成されたコロニーを 100 gZ mLのカナマイシンを含む LB液体培地に植菌し、 30°Cで 24時間培養した後、 GFX^T ^M Micro Plasmid Prep Kitを用いて DNA精製し、 pRET1 132とした。

[0151] なお、取得した pRET1132に関し、 Pstlで 1時間消化した後、 0. 8%ァガロース電気泳動に供し、 pRETl 132が Pstlで切断されないことを確認した。このときコントロールとして、 Pstl処理していない pRET1123及び pRET1132と、 Pstl処理した pRET 1123とを使用した。

[0152] (実施例 11) 発現ベクターの構築 4

前述のシャトルベクターにプロモーター及び mak geneを挿入したクローンを構築した。

[0153] プロモーターを挿入するために mak gene上流に Pstlサイトを持つクローンを構築した。アミノケトン不斉還元酵素の C末端に His— Tagが付加したクローンを得るために、以下の操作を行った。実施例 7で得られた pMAK— 1を铸型として、 MAKPstF ( 5， -GACCACTGCAGATCAATCAACTCTGATGAGGTCC-3，；配列番号 82)及び MAKHisBglllR (5，— CGCTTAGATCTCAGTTCGCCGAGCGCCATCGCCG— 3 ' ；配列番号 83)をプライマーとし、 KOD— plus を用いてァニール温度 68°C、伸長反応 1分 50秒で PCRを行った。得られた PCR産物を Bglllを用いて 37°Cで 2時間消化した PCR断片（インサート）と、 pQE70 (SpHIを用いて 37°Cで 2時間消化し、 Blunti ng highを用いて平滑末端ィ匕し、そして Bglllを用いて 37°Cで 2時間消化した）とを L igation Highを用いてライゲーシヨンし、 Competent highを用いて E. coli DH 5 aを形質転換し、 100 μ gZmLのアンピシリンを含む LB寒天培地にプレーティングし、 30°Cで 60時間放置した。出現したコロニーを 100 μ g/mLのアンピシリンを含む LB液体培地で 30°C60時間振盪培養した。培養液から GFX™ Micro Plasmid Prep Kitを用いて DNA精製した。得られた DNAを 0. 8%ァガロースゲル電気泳動で確認した。

[0154] スクリーニングは、得られた DNAを制限酵素処理して!/、な!/、もの及び Pstl及び Bgl IIを用いて 37°C2時間消化したものを 0. 8%ァガロースゲル電気泳動に供し、得られた DNAのサイズから目的のプラスミドを得た。このようにして得られたプラスミドを pM AK— 2と命名した。サイズマーカーは Loading Quick DNA size Marker λ /EcoRI +HindIII double digest、 pQE70及び Bglllを用いて 37°C2時間消ィ匕した PQE70を用いた。

[0155] このうち、 pMAK— 2の EcoRI— Pstlサイトに pRET1200の RepAプロモーター（pR ET1204のうち、ロドコッカス属菌由来 DNA断片にコードされている repAの向きが、 PHSG299にコードされているカナマイシン耐性遺伝子と同じ向きのクローンを铸型とし、 P 1200rep-Pst5195 (5'-

AGCCGCTGCAGAAGCAACACCGCATCCGCCCATTG-3 '；配列番号 84)と P7 ( 5，一 CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC— 3，；配列番号 85)をプライマーとし、ァニーリング温度 60°C、伸長反応 1分間で PCR増幅した後、 EcoRI及び Pstlを用いて 37°Cで 2時間消化したもの）を挿入したクローンを構築した (pMAK— 19と命名した）

[0156] 次に、 pMAK— 19を铸型とし、 pQE70Fl (5，—

GGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCACC— 3，；配列番号 86)及び pQE70R 1135Bm (5'— GGTTGGATCCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAG— 3 '；配列番号 87)をプライマーとし、 PCR酵素に KOD— plus—を使用してアニーリング温度 60 °C伸長反応 3分間で PCRを行った。その反応液力 GFX™ PCR DNA and G el Band Purification Kitを用いて PCR産物を精製し、精製した PCR産物を Ec oRI及び BamHIで 2時間消化した後、 0. 8%ァガロース電気泳動に供し、 DNA断片を GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kitを用いて精製した。その DNA断片をインサートとした。 [0157] 一方、発現シャトルベクターに用いるベクターは、 pRET1132をEcoRI及びBamH Iで 2時間消化した DNA断片を 0. 8%ァガロース電気泳動に供し、 GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kitを用いて精製した DNA断片を用いた。これらインサートとベクターを混合し Ligation Highを用いてライゲーシヨンした後、 Competent Highを用いて E. coli JM109を形質転換し、 100 /z gZmLのカナマイシンを含む LBプレートにプレーティングした。得られたコロニーを 100 μ g/mL のカナマイシンを含む LB液体培地で培養した後、 GFX™ Micro Plasmid Prep Kitを用いてプラスミド DNAを回収し、 0. 8%ァガロース電気泳動を行うことによりスクリーニングを行った。サイズマーカーは Loading Quick DNA size Marker λ /EcoRI +HindIII double digest及び pRETl 132を用いた。こうして得た発現ベクターを pRETl 133と命名した。

[0158] また、 pMAK— 19を EcoRI及び Hindmで 37°C、 2時間消化した後、 Blunting hi ghを用いて平滑末端ィ匕し、 0. 8%ァガロース電気泳動に供し、約 1. 6kbpの DNA 断片を GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kitを用いて精製した。この断片を pRETl 102の Hindiサイトに挿入したクローンを pRETl 114と命名した。

[0159] さらに、 pRETl 133のプロモーターの改良を行った。 pRET1133にコードされている MAK遺伝子を発現させるプロモーターは、 pRET1200の repA遺伝子のプロモ一ターで約 800bpの長さである力このプロモーターを約 200bp欠損させたプラスミドを構築した。そのクロー-ングに使用したプロモーターの調製は PCRで行った。プラスミド pRETl 200を録型とし、プライマーに PI 204rep— Ec2958 (5，一

CGCGGAATTCGACCACCACGCACGCACACCGCAC-3'；配列番号 88)及び PI 200rep-Pst5195 (5'-AGCCGCTGCAGAAGCAACACCGCATCCGCCCATTG -3'；配列番号 84)を使用し、 PCR酵素に KOD— plus—を用いて、アニーリング温度 60°C、伸長反応 50秒間で PCRを行った。 PCR産物を GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kitを用いて精製し、制限酵素 EcoRI及び Pstlで 2時間消化した後、 1. 6%ァガロース電気泳動に供し、 DNA断片を GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kitを用いて精製した。その DNA断片をインサートとした。この DNA断片に含まれるプロモーター領域の塩基配列を、配列番号 77 に示した。

[0160] 一方、ベクターについては、 pRET1133を制限酵素 EcoRI及び Pstlで 2時間消化した後、 0. 8%ァガロース電気泳動に供し、約 7. 2kbpの DNA断片を GFX™ PC R DNA and Gel Band Purification Kitを用いて精製した。サイズマーカーは Loading Quick DNA size Marker λ /EcoRI + HindIII double diges tを使用した。

[0161] このようにして得たインサートとベクターを Ligation Highを用いてライゲーシヨンし、 Competent Highを用いて E. coli JM109を形質転換し、 100 /z gZmLのカナマイシンを含む LBプレートにプレーティングした。得られたコロニーを 100 μ g/mL のカナマイシンを含む LB液体培地で培養した後、 GFX™ Micro Plasmid Prep Kitを用いてプラスミド DNAを回収し、 0. 8%ァガロース電気泳動を行うことによりスクリーニングした。サイズマーカーは Loading Quick DNA size Marker λ / EcoRI +HindIII double digest及び pRETl 133を用いた。

[0162] 更に、得られた DNAを制限酵素 EcoRI及び Pstlで 2時間消化した後、 1. 6%ァガロース電気泳動を行い、約 600bpのインサートに相当する DNA断片を確認した。サィズマーカーは lOObp DNA Ladderを使用した。このようにして得た発現ベクターを pRETl 138と命名した。

[0163] (実施例 12) 組換え R. erythropolisの形質転換及び活性測定

前述の発現ベクター pRET1102、 pRET1104、 pRET1114及び pRET1138を用いて R. erythropolis MAK— 34株及び R. erythropolis JCM2895 (独立行政法人理化学研究所より分譲)を形質転換し、活性測定を行った。 MAK— 34株から精製されるアミノケトン不斉還元酵素は、国際公開 WO02Z070714に記載のように、卜 2—メチルァミノ— 1 フエ-ルー 1 プロパノンに作用し、 d （IS, 2S)—プソイドエフェドリンを生成する能力を持っている。その他、 1 2—ジメチルァミノプロピオフエノン、 1 アミノー 2—ブタノン等にも作用し、それぞれ対応した |8—ァミノアルコールの生成が確認されている。

[0164] 活性測定は、菌量 O. D. = 5、 2%グルコース及び 0. 2Mリン酸ナトリウム緩衝液 (p H6. 0)になるように反応液を調製し、その反応中に基質として 3%の（IS, 2S)-2- (N—ェチルァミノ） 1 フエ-ルー 1 プロパノール（EAM)を含有するようにした。 EA Miま、 Am. Chem. Soc. , vol. 50, pp. 2287-2292, 1928にその合成方法力 ^ 記載されている。反応液を 30°Cで 16時間振盪反応した。反応生成物の j8—アミノアルコールである（is, 2S)—2—(N—ェチルァミノ）ー1 フエ-ルー 1 プロパノール（EP E)の確認は HPLCで行った。カラムは Inertsil PH- 3 3. O X 75mm、溶離液は 7 %ァセトニトリル水溶液及び 0. 05Mのリン酸ナトリウム緩衝液 (pH6. 0)、検出は UV (220nm)で行った。

[0165] このようにして活性測定した結果を表 6に示した。外来プロモーター領域を持たない PRET1104を導入した組換え体は、対照である mak geneを持たない pRET1102 を導入した組換え体とほぼ同じ活性を示し、組換え酵素の発現は認められなカゝつた。

[0166] MAK— 34株に pRET1114を導入した場合、 pRET1104に比べて高い比活性が認められた。このことはベクターに挿入した pRETl 200の repAプロモーター領域が、プロモーターとして機能していることが示された。

[0167] pRET1138を導入した場合、組換え R. erythropolis MAK— 34株の比活性は 3 7. 7/z gZh'mLZO. D.であり、組換え R. erythropolis JCM2895株の比活性は 34. 9 /z gZh'mLZO. D.であり、 R. erythropolis株における酵素の発現が確 f*i¾ れ。

[0168] [表 6]

比活性（単位： g Z h ■ m L / O . D . )

(実施例 13) 酵素の精製

実施例 12で得られた組換え菌体を 100 μ gZmLのカナマイシンを含有する LB培地 lOOmLで 30°C、 4日間培養し、 12000rpmで 5分間遠心分離して集菌し、 The QIAexpressionistキット（キアゲン社製）により His— tagが付カ卩されたタンパク質を精製した。具体的には、超音波処理により菌を破砕し、遠心分離によりその上清液を得、ニッケルキレートカラムによりタンパク質を精製した。得られたタンパク質を SDS— PAGEに供したところ、分子量約 28000のタンパク質バンドが認められた。この分子量は、国際公開 WO02Z070714に記載のアミノケトン不斉還元酵素の分子量とほぼ同じであり、アミノケトン不斉還元酵素が糸且換えロドコッカス菌において産生されたことが示された。

[0170] (実施例 14) 酵素による j8—ァミノアルコールの製造

実施例 13で得られた精製酵素（0. S /z gZmL) 5mM NADPH、 120mM Tri s-HCl (pH7. 5)及び 5mM EAMを含む反応液 0. 5mLを 37°Cで 16時間反応させた。基質及び生成物（EPE)の分析は HPLCで行った。カラムは Inertsil PH— 3

3. O X 75mm、溶離液は 7%ァセトニトリル水溶液及び 0. 05Mリン酸ナトリウム緩衝液 (pH6. 0)、検出は UV(220nm)で行った。その結果、 EPEが生成したことを確した ₀

[0171] 同様に、精製酵素又は実施例 13に記載の培養で得られた組換え体の破砕酵素粗抽出液を 1 2—ジメチルァミノプロピオフエノン、 1 アミノー 2—ブタノン等に作用させ、対応する β -ァミノアルコールを製造できることを確認した。

産業上の利用可能性

[0172] 以上説明したように、本発明のプラスミド及びシャトルベクターは、 Rhodococcus属菌 (特に、 Rhoaococcus erytnropolis又は Rhodococcus rhodnu)由来のものであり、これらを利用して同菌を組換えにより改変し、より効率的にアミノケトン不斉還元酵素を産生する菌株を作製することができる。また、アミノケトン不斉還元酵素を含む有用酵素を形質転換体に大量生産させることもできるようになる。

Claims

請求の範囲

[1] 配列番号 35、配列番号 36及び配列番号 37に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも 1つの塩基配列を有する DNA断片。

[2] 配列番号 35、配列番号 36及び配列番号 37に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも 1つの塩基配列を有する DNA複製領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部である DNA断片。

[3] 配列番号 1、配列番号 4、配列番号 14、配列番号 17及び配列番号 22に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも 1つの塩基配列を有する DNA断片。

[4] 配列番号 1、配列番号 4、配列番号 14、配列番号 17及び配列番号 22に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも 1つの塩基配列を有する DNA複製関連タンノク質のコード領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部である DNA断片

[5] 配列番号 1、配列番号 4、配列番号 14、配列番号 17及び配列番号 22に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも 1つの塩基配列を有する DNA複製関連タンパク質のコード領域を含み、且つ配列番号 35、配列番号 36及び配列番号 37に記載の塩基配列力なる群より選ばれる少なくとも 1つの塩基配列を有する DNA複製領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部である DNA断片。

[6] 配列番号 76に記載の塩基配列を有する DNA断片。

[7] 配列番号 76に記載の塩基配列を有するプロモーター領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部である DNA断片。

[8] 配列番号 1、配列番号 4、配列番号 14、配列番号 17及び配列番号 22に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも 1つの塩基配列を有する DNA複製関連タンパク質のコード領域を含み、配列番号 35、配列番号 36及び配列番号 37に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも 1つの塩基配列を有する DNA複製領域を含み、且つ配列番号 76に記載の塩基配列を有するプロモーター領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部である DNA断片。

[9] 請求項 1一 8のいずれか 1項に記載のプラスミド又は DNA断片を有し、制限酵素切断部位数が BamHI： 2、 EcoRI： 2、 Kpnl： 1、 PvuII： 1、 Sad： 1及び Smal： 1であり、大きさが約 5. 4kbpであることを特徴とする環状プラスミド。

[10] 配列番号 73に記載の塩基配列を有するプラスミド。

[11] Rhodococcus属菌由来であることを特徴とする請求項 1一 10の、ずれか 1項に記載のプラスミド又は DNA断片。

[12] 配列番号 70、配列番号 71及び配列番号 72に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも 1つの塩基配列を有する DNA断片。

[13] 配列番号 70、配列番号 71及び配列番号 72に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも 1つの塩基配列を有する DNA複製領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部である DNA断片。

[14] 配列番号 40、配列番号 42、配列番号 44、配列番号 45、配列番号 53、配列番号 5 5、配列番号 56、配列番号 61、配列番号 62及び配列番号 69に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも 1つの塩基配列を有する DNA断片。

[15] 配列番号 40、配列番号 42、配列番号 44、配列番号 45、配列番号 53、配列番号 5 5、配列番号 56、配列番号 61、配列番号 62及び配列番号 69に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも 1つの塩基配列を有する DNA複製関連タンパク質のコード領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部である DNA断片。

[16] 配列番号 40、配列番号 42、配列番号 44、配列番号 45、配列番号 53、配列番号 5 5、配列番号 56、配列番号 61、配列番号 62及び配列番号 69に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも 1つの塩基配列を有する DNA複製関連タンパク質のコード領域を含み、且つ配列番号 70、配列番号 71及び配列番号 72に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも 1つの塩基配列を有する DNA複製領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部である DNA断片。

[17] 配列番号 40、配列番号 42、配列番号 44、配列番号 45、配列番号 53、配列番号 5 5、配列番号 56、配列番号 61、配列番号 62及び配列番号 69に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも 1つの塩基配列を有する DNA複製関連タンパク質のコード領域を含み、配列番号 70、配列番号 71及び配列番号 72に記載の塩基配列力なる群より選ばれる少なくとも 1つの塩基配列を有する DNA複製領域を含み、且つ配列番号 76に記載の塩基配列を有するプロモーター領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部である DNA断片。

[18] 配列番号 67及び配列番号 47に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも

1つの塩基配列を有する DNA断片。

[19] 配列番号 67及び配列番号 47に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも

1つの塩基配列を有する接合タンパク質領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部である DNA断片。

[20] 配列番号 75に記載の塩基配列を有する DNA断片。

[21] 配列番号 75に記載の塩基配列を有する接合に関する領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部である DNA断片。

[22] 請求項 12— 21のいずれか 1項に記載のプラスミド又は DNA断片を有し、制限酵素切断部位数が BamHI : 2、 PvuII :4、 Sacl : 3及び Smal :4であり、大きさが約 5. 8 kbpであることを特徴とする環状プラスミド。

[23] 配列番号 74に記載の塩基配列を有するプラスミド。

[24] Rhodococcus属菌由来であることを特徴とする請求項 12— 23のいずれ力 1項に記載のプラスミド又は DNA断片。

[25] 配列番号 77に記載の塩基配列を有する DNA断片。

[26] 配列番号 77に記載の塩基配列を有するプロモーター領域を含むことを特徴とする DNA断片。

[27] 請求項 1一 26のいずれか 1項に記載のプラスミド又はその一部である DNA断片と大腸菌内で複製可能な DNA領域とを含み、 Rhodococcus属菌及び大腸菌内で複製可能なシャトルベクター。

[28] 請求項 27記載のシャトルベクターを用いて作製することを特徴とするベクター。

[29] 請求項 6、 7、 25又は 26のいずれか 1項に記載のプラスミド又は DNA断片を含むことを特徴とするベクター。

[30] アミノケトン不斉還元酵素遺伝子が挿入されてヽることを特徴とする請求項 28又は

29の!、ずれ力 1項に記載のベクター。

[31] アミノケトン不斉還元酵素遺伝子力配列番号 78に記載のアミノ酸配列力なるタンパク質をコードする核酸、又は配列番号 78のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、且つアミノケトン不斉還元活性を有するタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする請求項

30記載のベクター。

[32] アミノケトン不斉還元酵素遺伝子力配列番号 79に記載の塩基配列からなる核酸、又は配列番号 79と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジントな条件下でノ、イブリダィズし、且つアミノケトン不斉還元活性を有するタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする請求項 30記載のベクター。

[33] 請求項 28又は 29に記載のベクターを含む形質転換体。

[34] 請求項 30— 32のいずれか 1項に記載のベクターを含む形質転換体。

[35] 請求項 34記載の形質転換体を該形質転換体が増殖可能な培地中で培養する培養工程と、

を含むアミノケトン不斉還元酵素の製造方法。

[36] 一般式 (1) :

[化 1]