JPH07500247A - Ｅ．コリｍｄｈ遺伝子プロモーターのコントロールの下のｅ．コリにおけるポリペプチドの発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｅ、コリＭＤＨｉ！伝子プロモーターのコントロールの下のＥ、コリにおけるポ リペプチドの発現 技術分野 本発明は、Ｅ、コリにおけるポリペプチドを発現する方法に間し、さらにこの方 法に有用な発現ベクター並びに組換えＤＮＡ分子に関する１本発明は、さらに属 Ｔｈｅｒｍｕｓに固有（ｎａｔｉｖｅ）な遺伝子から由来されたポリペプチドを 生成する方法を提供する。

背景技術 細菌例えばＥ、コリは１組換えＤＮＡ技術により外来のポリペプチドを生成する 方法で、ｉｉＩ主生物として広く使用されている。これらの方法は、所望のポリ ペプチドがそれらの天然の源の生物から容易に得ることができないときに、特に 有用である。

過去において、微生物に外来の遺伝子のクローニング及び発現を行う技術は。

その中にベクターが導入される生物の特定の発現機構のコントロールの下所望の 外来の遺伝子のコーディング配列を含む組換え発現ベクターの構築を含んできた 。

これらの発現機構の重要な要素は、プロモーターである。これは、構造遺伝子の コーディング配列に比較的近い付近に位置するＤＮＡの領域である。プロモータ ーは、ＤＮＡポリメラーゼの結合に含まれて５転写を開始する。好適なプロモー ターの選択は、有効な発現を得るために１重要である０通常、生成ポリペプチド の高度の発現が要求される工程において１強いプロモーター即ち高度の転写を行 うものを選択する。

Ｅ、コリに基づく発現系の関係において、周知の強いプロモーターは、天然に存 在するＩａｃ及びｔｒｐプロモーター及び合成ハイブリッドｔａｃプロモーター を含む、一般に、これらのプロモーターは、コンセンサス配列を有し５以下のも のからの僅かの変化を示す。

ＴＴＧＡＣＡ−−−−−−１７ｂｐ−−−一−−ＴＡＴＡＡＴ（−３５）　（− １０＞ 利用可能なプロモーターの使用が問題を生ずる場合に１発現を高いレベルで特に 行わせるために、追加の強いプロモーターを提供量ることが、多くの研究者の目 的であった。この目的のために、プロモーター例えばｔａｃプロモーター（ｔｒ ｐプロモーター及びｌａｃプロモーターの間のハイブリッド）が構築されてきた 。

発明の開示 本発明の一つの態挿によれば、Ｅ、コリにおける遺伝子（特に、しかし池を排除 しないが、外来の遺伝子）を発現するだめの新規な発現系を提供するのが本発明 の目的である。

上記のコンセンサス配列を有しないプロモーターを含むＥ、コリ遺伝子コントロ ール配列が、高度の転写を行うことが、驚くべきことに分った。

従って１本発明の一つのｔ’！樟によれば、ＤＮＡコーディング配列（特に外来 のＤＮＡコーディング配列）によりコードされたポリペプチドをＥ、コリに発現 するための発現ベクターが提供され、該ベクターは、ｌＪｉポリペプチドについ てコーディングしそして開始コドンを含むＤＮＡ配列よりなり、該ＤＮＡ配列は 、開始コドンの上流に位置する配列に操作可能に結合しそして該ポリペプチドの 発現をコントロールでき、該上流配列は、（ａ）２８５ｉＪ基対配列ＧＣＡ　Ｔ ＧＣＡＡＡ　ＴＴＣＴＧＣＴＴＡ　ＡＡＡ　ＧＴＡ　ＡＡＴＴＡＡ　ＴＴＧ　Ｔ ＴＡ　ＴＣＡ　ＡＡＴ　ＴＧＡ　ＴＧＴ　ＴＧＴ　ＴＴＴＧＧＣＴＧＡ　ＡＣＧ 　ＧＴＡ　ＧＧＧ　ＴＡＴ　ＡＴＴ　ＧＴＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴ　ＴＧＧ　ＡＡ Ｔ　ＧＴＴ　ＧＣＧ　ＣＴＡ　ＡＴＧ　ＣＡＴＡＡＧ　ＣＧＡ　ＣＴＧ　ＴＴＡ 　ＡＴＴ　ＡＣＧ　ＴＡＡ　ＧＴＴ　ＡＧＧＴＴＣＣＴＧ　ＡＴＴ　ＡＣＧ　Ｇ ＣＡ　ＡＴＴ　ＡＡＡ　ＴＧＣＡＴＡＡＡＣＧＣＴ　ＡＡＡ　ＣＴＴ　ＧＣＧ　 ＴＧＡ　ＣＴＡ　ＣＡＣＡＴＴＣＴＴ　ＧＡＧ　ＡＴＧ　ＴＧＧ　ＴＣＡ　ＴＴ Ｇ　ＴＡＡ　ＡＣＧ　ＧＣＡＡＴＴ　ＴＴＧ　ＴＧＧ　ＡＴＴ　ＡＡＧ　ＧＴＣ ＧＣＧ　ＧＣＡ　ＧＣＧＧＡＧ　ＣＡＡ　ＣＡＴ　ＡＴＣＴＴＡ　ＧＴＴ　ＴＡ Ｔ　ＣＡＡ　ＴＡＴＡＡＴ　ＡＡＧ　ＧＡＧ　ＴＴＴ　ＣＡＴよりなるか、又は （ｂ）＃上流配列（ａ）のそれに関連するＤＮＡ配列を有する配列よりなり、前 記の関連する配列は、該ポリペプチドの発現が排除されない程度においてのみ、 特定の配列（ａ）から興なることを特徴とする。

前記の関連する配列（ｂ）が、上記の配列（ａ）と少なくとも５０％、好ましく は７５％、さらに好ましくは９５％の配列の相同性を有することが好ましい。

配列（ｂ）が正確な配列（ａ）から逸脱するとき、その逸脱は、欠失、挿入及び ／又は置換を含むことができる。ポリペプチドの高度の発現を維持するために。

非常に相対的に少数、即ちｌＯ以下、最も好ましくは５以下のこれら欠失、挿入 及び／又は置換がなされることが好ましい、一般に、僅かに１又は２個のこれら の欠失、挿入及び／又は置換がなされるべきである。

関連する配列（ｂ）が約２８５塩基を有することが好ましいが、上述したように 塩基を挿入及び欠失する可能性からみて１関連する配列（ｂ）はもし所望ならば 長さが変化できる。好ましくは、それは、長さ２００−３５０塩基である。

本発明は、又遺伝子特に外来の遺伝子によりコーディングされたＥ、コリ中にポ リペプチドを発現するための発現ベクターを提供し、それは、該ベクターが（１ ）上記の配列（ａ）及び（ｂ）から選択された該ポリペプチドの発現をコントロ ールできるＤＮＡ配列、並びに（２）発現ベクター中に該遺伝子についてコーデ ィングするＤＮＡコーディング配列の導入を行わせ、それにより該コーディング 配列が、ポリペプチドの発現を行わせる配列（ａ）又は（ｂ）に操作可能に結合 するように該配列（ａ）又は（ｂ）に関連して配置された制限酵素部位を含むこ とを特徴とする。

上記の制限酵素部位は、配列ＣＡＴＡＴＧを有するＮｄｅ　１部位であることが 好ましい、この部位は、上記の配列（ａ）の３゛−末端、、ＣＡＴに直ぐ隣接し てＡＴＧ、、で開始する５゛配列を有するＤＮＡ配列を結合することにより提供 できる、別に、もし発現ベクターが関連する配列（ｂ）を含むならば、関連する 配列が、Ｎｄｅ　１部位を提供するために、ＡＴＧに結合できる３′−末端配列 、。

ＣＡＴを有するのが好ましい。

本発明の他の態様によれば１本発明の第一の態様により規定された発現ベクター により形質転換されたＥ、コリの宿主菌株を培養することを含むＥ、コリにポリ ペプチドを発現する方法を提供する。

本発明の発現ベクターが、上記の関連する配列（ｂ）を含むとき、前記の関連す る配列は、以下のコントロール要素の少なくとも一つを含むことがさらに好まし い。

（Ｉ）プロモーター （１１）カタボライトリブレッジジン （Ｉ　ｌ　ｉ）リポソーム結合部位 前記の関連する配列は、好ましくは、少なくとも二つ、最も好ましくは三つの上 記の発現コントロール要素（ｉ）　−（ｉ　Ｉ　ｉ）を含む、　（配列（ａ）は 、上記のコントロール配列の全ての三つを含む）。

上記の配列（ａ）内に含まれる特定の配列ＴＴＧＴＡＡＡＣＧＧＣＡＡＴＴＴＴ ＧＴＧＧＡＴＴＡＡＧＧＴは、Ｅ、コリｍｄｈプロモーターを構成するとして同 定された３５ｔＪ１基対に相当する。好ましくは、上記の関連する配列（ｂ）は 、この特定の配列に高度の相同性を１通常有するであろう、従って１本発明によ る発現ベクターが、前記の特定の配列に関連する配列を有するプロモーターを含 むとき、プロモーターが、Ｅ。

コリｍｄｈ遺伝子プロモーターの特定の配列と少なくとも５０％、好ましくは少 なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列の相同性を有すること が好ましい。

そのため、好ましくは、プロモーターは、＋２−５０塩基、最も好ましくは２０ −３５塩基からなる。プロモーターは、望ましくは約２９塩基よりなる。

上記の正確な配列からの全ての逸脱は、一つ以上の１基の欠失５挿入及び／又は 置換を含むことができる。プロモーターとしての活性の損失を避けるために。

相対的に少数に過ぎない、即ち１０以下、最も好ましくは５以下のこれら欠失、 挿入及び／又は置換がなされることが好ましい、一般に、僅かに一つ又は二つの これら欠失、挿入及び／又は置換がなされるべきである。

プロモーターが、５°末端で配列ＴＴＧＴＡＡ並びに３゛末端で配列ＴＡＡＧＧ Ｔを含む塩基配列を有することがさらに好ましい、別に、プロモーターが、５゜ 末端で配列ＴＧＧＡＡＴ並びに３′末端で配列ＡＡＴＧＴＴを含む塩基配列を有 することもできる。

上記の好ましい末端配列に加えて、プロモーターが、配列ＡＣＧＧＣＡＡＴＴＴ ＴＧＴＧＧＡＴ 及びプロモーターとしての活性が本質的に保持されている程度においてのみ上記 の配列から興なる関連する配列から選択される介在配列を有することも好ましい 。

上記の正確な配列からの全ての逸脱は、１個以上の塩基の欠失、挿入及び／又は 置換を含むことができる。プロモーターとしての活性の損失を避けるために、相 対的に少数に過ぎない、即ちＩＯ以下、最も好ましくは５以下のこれら欠失、挿 入及び／又は置換がなされることが好ましい、一般に、僅かに一つ又は二つのこ れら欠失、挿入及び／又は置換がなされるべきである。

その最も好ましい形では１本発明のベクターのプロモーターは、配列ＴＴＧＴＡ ＡＡＣＧＧＣＡＡＴＴＴＴＧＴＧＧＡＴＴＡＡＧＧＴを有する。

本発明の特別の！’！様では、ＤＮＡコーディング配列によりコーディングされ たポリペプチドをＥ、コリに発現する発現ベクターは、　（１）配列ＴＴＧＴＡ ＡＡＣＧＧＣＡＡＴＴＴＴＧＴＧＧＡＴＴＡＡＧＧＴを有するＥ、コリｍｄｈ遺 伝子プロモーター、又はＥ、コリｍｄｈ遺伝子プロモーターのそれに関連するＤ ＮＡ配列を有するプロモーター（前記の関連する配列は、プロモーターが、プロ モーターとしての活性が本質的に保持されている程度においてのみ、特定の配列 から異なる）、並びに（２）ベクター中にＤＮＡコーディング配列の導入を行わ せそれにより該コーディング配列が操作可能にプロモーターに制限されるように 該プロモーターに関連して配置された制限酵素部位を含む。

この発現ベクターは、Ｅ、コリ中に所望のポリペプチドを発現するのに好適な本 発明による発現ベクターの構築に使用する有利さを有する。

池の態様では、ベクターは、プロモーターに操作可能に結合されたＤＮＡコーデ ィング配列を含み、そしてプロモーターは、ポリペプチドの発現をコントロール できる。

本発明によるベクターは、デポジット番号ＮＣＩＭＢ−４０５２０で１９９２年 １０１１２日にＮＣＩＭＢ、２３　Ｓｔ　Ｍａｃｈａｒ　Ｄｒｉｖｅ、Ａｂｅｒ ｄｅｅｎ、５ｃｏｔｌ　ａｎｄ、英国に寄託されたプラスミドｐＭＴＬ１００５ である。

ｐＭＴＬＩ００５の構築、並びにＥ、コリｍｄｈプロモーターよりなる本発明に よる他のベクターの構築は、以下に記載される。

本発明の他の態様によれば、ＤＮＡコーディング配列よりなり、さらに開始コド ンの上流の配列に操作可能に結合した開始コドンを含む組換えＤＮＡ分子が提供 され、ＤＮＡコーディング配列は、Ｅ、コリリんご酸エステルエステル脱水素酵 素以外のポリペプチドにコーディングし、該上流配列は、（ａ）２８５塩基対配 列 ＧＣＡ　ＴＧＣＡＡＡ　ＴＴＣＴＧＣＴＴＡ　ＡＡＡ　ＧＴＡ　ＡＡＴＴＡＡ　 ＴＴＧ　ＴＴＡ　ＴＣＡ　ＡＡＴ　ＴＧＡ　ＴＧＴ　ＴＧＴ　ＴＴＴＧＧＣＴＧ Ａ　ＡＣＧ　ＧＴＡ　ＧＧＧ　ＴＡＴ　ＡＴＴ　ＧＴＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴ　Ｔ ＧＧ　ＡＡＴ　ＧＴＴ　ＧＣＧ　ＣＴＡ　ＡＴＧ　ＣＡＴＡＡＧ　ＣＧＡ　ＣＴ Ｇ　ＴＴＡ　ＡＴＴ　ＡＣＧ　ＴＡＡ　ＧＴＴ　Ａ（１；ＧＴＴＣＣＴＧ　ＡＴ Ｔ　ＡＣＧ　ＧＣＡ　ＡＴＴ　ＡＡＡ　ＴＧＣＡＴＡＡＡＣＧＣＴ　ＡＡＡ　Ｃ ＴＴ　ＧＣＧ　ＴＧＡ　ＣＴＡ　ＣＡＣＡＴＴＣＴＴ　ＧＡＧ　ＡＴＧ　ＴＧＧ 　ＴＣＡ　ＴＴＧ　ＴＡＡ　ＡＣＧ　ＧＣＡＡＴＴ　ＴＴＧ　ＴＧＧ　ＡＴＴ　 ＡＡＧ　ＧＴＣＧＣＧ　ＧＣＡ　ＧＣＧＧＡＧ　ＣＡＡ　ＣＡＴ　ＡＴＣＴＴＡ 　ＧＴＴ　ＴＡＴ　ＣＡＡ　ＴＡＴＡＡＴ　ＡＡＧ　ＧＡＧ　ＴＴＴ　ＣＡＴよ りなるか、又は（ｂ）該上流配列（ａ）のそれに関連するＤＮＡ配列を有する配 列よりなり、前記の関連する配列は、該ポリペプチドの発現が排除されない程度 においてのみ、ＴＩ定の配列（ａ）から異なることをｖｆ徴とする。

上記の発現ベクターの構築に導かれる検針の間、属Ｔｈｅｒｍｕｓの耐熱性細菌 からのりんご酸エステル脱水素酵素の高度の発現が、Ｅ、コリ遺伝子プロモータ ーのコントロールの下の発現により、Ｅ、コリで達成できることが驚くべきこと に見出された。

Ｔｈｅｒｍｕｓ菌株は、グラム陰性、非胞子形成、ツノチル（ｎｏｎｏｔ目ｅ） 、好気性、かん／フィラメントとして記載され（Ｂｒｏｃｋ及びＦｒｅｅｚｅ、 １９６９）、そしてＴｏ−８０°Ｃの最適な実験室成長温度で天然の熱束で見出 される（Ｂｒｏｃｋ、１９７８）、極端な好熱菌として、Ｔｈｅｒｍｕｓ菌株は 、熱安定性ばかりでなく、有機溶媒及び高濃度の尿素及び洗剤を含む化学変性剤 に抵抗性のある蛋白及び酵素を合成する（ＩｉＪＩｍａら、１９８４、Ｓｍ１ｔ ｈ及びＳｕｎｄａｒａｍ、１９８８）、これは、その多数が精製されそして特徴 が分ったＴｈｅｒｍｕｓ菌株の熱安定性酵素に大きな関心を呼び起こした。

りんご酸エステル脱水素酵素（ＭＤＩ）は、コファクターとしてＮＡＤ　／ＮＡ ＤＨを使用するトリカルボン酸サイクルの一部として、りんご酸エステル及びオ キザロ酢酸エステルの相互転換を触媒化する。哺乳動物の真核渾からの二量体の ミトコンドリア及びサイトツルのアイソザイムは、Ｗｉ素カイネチツクス１機構 及び三次元Ｘ線構造の点で、非常に十分に特徴が分っている（Ｂｉｒｋｔｏｆｔ 及びＢａｎａｚａｋ、１９８４）、Ｔ、ａｑｕａｔ　１ｃｕｓ　Ｂからのｍｄｈ 遺伝子のヌクレオチド配列は、決定され（ＮＩｃｈｏｌｌｓら、１９９０）、そ してポリペプチドの予想されたアミノ酸配列は、Ｔ、ｆ　ｌ　ａｖｕｓ＠素に関 するそれと同じであることが分った（Ｎｌｓｈｉｙａｍａら、１９８６）、Ｔ、 ａｑｕａｔＩｃｕｓ　Ｂ　ＭＤＨは、そのＸ線構造が１．８人の分解能で決定さ れているブタのサイトツル酵素と高度にアミノ酸配列の同一性を分かち合ってい ることが分った（Ｂｌｒｋｔｏｆｔら、１９８７）、これは、ブタのサイトツル ＭＤＩに関する相関に基づいて二量体Ｔ、ａｑｕａｔｉｃｕｓ　Ｂ　ＭＤＨの三 次元構造の分子のモデル化を可能にした（ＤｕｆｆＩｅｌｄら、１９９０）、本 発明の前に、蛋白エニジニアリングにより、Ｔ、ａｑｕａｔｌｃｕｓ　ＭＤＨの 特徴、特にその高度の蛋白の熱安定性を特に研究するために、Ｅ、コリ中のＴ、 ａｑｕａｔｉｃｕｓ　ｍｄｈ遺伝子の発現のレベルを改善する要求が存在してい た。

しかし、中温宿主例えばＥ、コリ中のＴｈｅｒｍｕｓ菌株の遺伝子の発現の試み は、現在まで、僅かな発現をもたらすに過ぎなかった（Ｔａｎａｋａら、＋９８ １、ＴＩＪｉｍａら、１９８６．Ｎ１ｃｈｏｌｌｓら、＋９９０）、　この理由 は、はっきりしないが、Ｔｈｅｒｍｕｓ菌株からの二三の構造遺伝子は、クロー ンされ配列決定され、そして非常に高い（７０％）Ｇ／Ｃ含量を有することが分 り（Ｋａｇａｗａら、１９８４．Ｋｕｎａｉら、１９８６．ＮｉＮ１５ｈｉｙａ ら、１９８６）、縮重コドンの第三の位置のＧ又はＣに間して顕著な優先性（約 ９５％）を生ずる。その結果、貧弱な発現に間する一つの理由であろうＥ、コリ の相当するｔＲＮＡポピユレーションの点で、非最適コドン使用のパターンが存 在する。

Ｔｈｅｒｍｕｓ菌株の遺伝子の高度の発現が、Ｅ、コリ遺伝子の転写及び翻訳開 始信号に操作可能に結合したＴｈｅｒｍｕｓ菌株ＤＮＡコーディング配列を含む 組換え発現ベクターの使用により、Ｅ、コリで達成できることが分った。

本発明は、従ってさらに１種Ｅ、コリの形質転換された微生物を培養することよ りなる。属Ｔｈｅｒｍｕｓに固有であるか又は前記の固有の配列に関連するＤＮ Ａコーディング配列を発現することによりポリペプチドを生成する方法を提供し 、前記の形質転換された微生物は、Ｅ、コリプロモーター、又はＥ、コリプロモ ーターの配列に関連するＤＮＡ配列を有するプロモーターであるプロモーターに 操作可能に結合した該ＤＮＡ配列よりなるプラスミドを含み、前記の関連する配 列は、プロモーターとしての活性が本質的に保持され、そして該ポリペプチドが 、それが好ましくは３５％より多い可溶性の細胞蛋白、例えば３５−９０％の可 溶性の細胞蛋白、さらに好ましくは４０−５５％そして最も好ましくは約５０％ の可溶性の細胞蛋白を形成するように発現される程度においてのみ、Ｅ、コリプ ロモーターの特定の配列から異なることを特徴とする。

上記の関連するＤＮＡコーディング配列は、一つ以上の欠失、挿入及び／又は置 換により、属Ｔｈ　ｅ　ｒ　ｍｕ　ｓに固有のＤＮＡコーディング配列の配列か ら異なることができる。

上記のＤＮＡコーディング配列は、好ましくは、固有のＴｈｅｒｍｕ　ｓポリペ プチドについてコードするが１本発明は、又固有のＴｈ　ｅｒｍｕｓ蛋白から異 なるポリペプチド、例えば１０以下好ましくは５以下のアミノ酸残基で固有のも のから異なるポリペプチドが生成される方法も含む。

特に高度の発現は、コドンＡＴＧによりＴｈｅｒｍｕｓコーディング配列の通常 の開始コドン（ＧＴＧ）を置換することにより得られ、従ってＤＮＡコーディン グ配列が、配列ＡＴＧを有する開始コドンを有することが好ましい。

上記のプロモーター配列は、好ましくは１本発明の第一の態様に関して上記で規 定されたようなものである。そのため１本発明の方法において、プロモーターが 、上記のＥ、コリプロモーターに関連する配列を有するとき、プロモーターが、 Ｅ、コリ遺伝子プロモーターの配列と少なくとも５０％、好ましくは７５％、最 も好ましくは９５％の配列の相同性を有することが好ましい。

それ故、好ましくは、プロモーターは、１２−５０塩基、最も好ましくは２゜− ３５塩基よりなる。プロモーターは、最も好ましくは約２９塩基よりなる。

プロモーターが、５゛　末端で配列ＴＴＧＡＣＡ並びに３°末端で配列ＴＴＡＡ ＣＴを含む塩基配列を有することがさらに好ましい、別に、プロモーターが、５ ゛末端で配列ＴＣＡＡＴＴ並びに３°末端で配列ＡＣＡＧＴＴを含む塩基配列を 有することもできる。

上記で規定されたＴｈｅｒｍｕｓ蛋白及びそれに関連する蛋白についてコーディ ングする上記のＤＮＡコーディング配列が、リポソーム結合部位に操作可能に結 合していることが、さらに好ましい、鵞＜べきことに、コンセンサス配列５°Ｔ ＡＡＧＧＡＧＧＴＧＸＸＸ３゜ （但し、Ｘはアデニン、グアニン、シトシン又はチミン（ｒＲＮＡの３°末端に 基づく）である）と中程度の相同性を有するリポソーム結合部位を含むことが望 ましいが、高度の発現は、コンセンサス配列からｌ塩基のみの変化により逸脱す る配列を使用することよりも、２以上の塩基の変化により逸脱する配列を使用し て得られた。

これは、Ｔｈｅｒｍｕｓ及びＥ、コリ配列から由来される三つの真なる配列を使 用して得ることのできる発現のレベルを比較する、以下の表から明らかである。

本＝ｐＨＭＡ５　木本＝ｐＲＭＡＩ０２　本＊本＝ｐＲＭＡ５１図面の簡単な説 明 本発明は１図面に特に関してさらに詳細に記載される。

図１は、組換えプラスミドｐＲＭＡ！−４を発生するのに使用されるクローニン グストラテジーの図である。

図２は、ｐＲＭＡ４及びｐＲＭＡｉにおけるＴ、ａｑｕａｔｉｃｕｓ　ｍｄｈ遺 伝子の開始コドンに関するＤＮＡ配列であ４る。標本的なＳｈｉｎｅ−Ｄａ１ｇ ａｒｎｏ配列は、アンダーラインされ、Ｓ、Ｄ、と表示される。突然変異誘発指 向部位による塩基は、ｐＲＭＡ４１において太い字体で示される。予想されたＮ 末端アミノ酸配列は、、ＤＮＡ配列の下に示される。

用されるクローニングストラテジーの図である。略称、Ｐｔｒｐ、ｔｒｐ転写プ ロモーター、Ｐｅｍｄｈ、Ｅ、：７り転写プロモーター、ｔｍｄｈ、Ｔ、ａｑｕ ａｔｌｃｕｓ　ｍｄｈ遺伝子。

図４は、Ｔ、ａｑｕａｔｉｃｕｓ　ｍｄｈ遺伝子に融合したＥ、コリｍｄｈ遺伝 子の転写及び翻訳開始信号のヌクレオチド配列である。Ｔ、ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＭＤＨに間する予想されたアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列の下に示され。

終止コドンは、星印（＊）により示される。標本的なＥ、コリのリポソーム結合 部位（Ｓ、Ｄ、）、転写開始ｆｇ号（−１０及び−３５）及びｃＲＰ結合部ｆｎ （ＣＲＰ）は、アンダーラインされて示される。

図５及び６は、それぞれ、ｐＲＭＡｌ、ｐＲＭＡ４．ｐＲＭＡ４１及びｐＲＭＡ ５１からの粗製及び加熱された細胞抽出物のＳＤＳ−ｐａｇｅである。

実施例 以下の実施例は、Ｆ、、コリｍｄｈ遺伝子プロモーターにより調節されるＥ、コ リにおける外来のポリペプチドの発現方法を示し、さらにＥ、コリにおける属Ｔ ｈｅｒｍｕｓに固有のポリペプチドの発現に一般に関するＥ、コリプロモーター の使用を示す。

実施例 細菌の菌株及びベクター Ｅ、コリＴＧ−２（（Ｉ　ａ　ｃ、Ｉ　ＰｑδＭＩ５−ｐｒｏ）、５ｕｐＥ、ｔ ｈＩ、ｈｓｄＤ５／Ｆ’　、ｔｒａＤ３６．ｐｒｏＡ　Ｂ　、ｒｅｃＡ）を、全 ての組換えプラスミドについて宿主菌株として使用し、そして必要ならばＩ００ ｕｇ／ｍＬのアンピシリンの存亡下３７℃で２ｘＴＹ培地に通常の通り成長させ た。プラスミドベクターｐＫＫ２２３−３は、Ｐｈａｒｍａｃｌａがら得られ、 モしてＭ１３ｍｔ＋２２及ｐｉ）Ｍ、ＴＬ１００３は、Ｓ、Ｃｈａｍｂｅｒｓ博 士から提供された。

ＤＮＡ操作 標準の組換えＤＮＡ技術は、Ｍａｎｌａｔｆｇ、ら（１９８２＋に一載されたよ うに行われた。ヌクレオチド配列決定では、ジデオキシ鎖終止反応を、５０”Ｃ でデオキシ−７−ジアザグアノシンを使用して（Ｍｌｕｓａｗａら、１９８６） 。

用いた（Ｓａｎｇｅｒら、＋９７７）、オリゴヌクレオチド部位指向突然変異誘 発は、プライマー延長法（Ｇｌｌｌａｍ及びＳｍ１ｔｈ、１９７８）を使用して 行われた。突然変異誘発オリゴヌクレオチド（５′−ＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＡＴ ＡＴＧＡＡＧＧＣＡＣ−３’　）は、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３ ８０Ａ合成機を使用して合成された。

酵素及び蛋白のアッセイ 酵素活性は、前述したように測定された（Ｓｍｉｔｈら、＋９８２）、蛋白の濃 度は、ｒＢｉｕｒｅｔＪ法により測定された＜Ｇｏｒｎａｌｌら、１９４９）。

発現は、式 ％式％ 抽出物の比活性（Ｕ／ｍｇ） を使用することにより可溶性細胞蛋白の％として評価された。但し、精製ＭＤＩ の比活性＝１９０Ｕ／ｍｇ　（Ａｌ　１ｄｒｅａｄら、１９９１．投稿中）、粗 製細胞抽出物は、３０分間７０°Ｃで加熱処理された。

電気泳動 蛋白は、ｒＰｈａｓｔｇｅｌＪ系（Ｐｈａｒｍａｃｌａ）を使用して５０５−ポ リアクリルアミドゲル電気法！ｌｌＩ（ＳＤＳ−Ｐａｇｅ）により分析した。

組換え発現プラスミドの発生 Ｔ、ａｑｕａｔｉｃｕｓ　ｍｄｈｉｌ伝子を、３．２ｋｂのＨＩｎｄｌ　Ｉ　Ｉ フラグメントの一部として最初にクローンし、全体のヌクレオチド配列を決定し た（ＮＩｃｈｏｌｌｓら、＋９９０＞、３．２ｋｂのＨ１ｎｄｌｌｌフラグメン トは。

両方の方向にｐＫＫ２２３−３のＨｉｎｄｌ１１部位にリゲートして、それぞれ 組換えプラスミドｐＲＭＡｌ及びｐＲＭＡ２を発生させた。ｍｄｈ遺伝子を含む ２、ＯｋｂのＢａｍＨＩ／Ｐｓｔｌフラグメントは、単離されそしてプラスミド ベクターＤＫＫ２２３−３のリンカ−ＢａｍＨＩ及びＰｓｔ１部位にリゲートさ れて１組換えプラスミドｐＲＭＡ３を発生させた（図１）、ｍｄｈ遺伝子を含む フラグメントは、さらにＨｌｎｆＩによる切除により１．４ｋｂに縮められ、平 滑末端され、ｐＵＣ９のＳｍａ　１部位中にリゲートされて１組換えプラスミド のブルーホワイト選択を行わせた。遺伝子を含む１．４ｋｂのフラグメントは、 ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｌ　Ｉ　ＩによりｐＵＣ９から切除され１次にｐＫＫ２ ２３−３の対応する部位中にリゲートされ、モしてｐＲＭＡ４と命名された（図 り。

ｐＲＭＡ４からの挿入ＤＮＡは、０．５ｋｂのＥｃｏＲＩ／Ａａｔｌｌフラグメ ントとしてＭ１３ｍｔ１２２中にサブクローンされて１部位指向突然変異誘発の ための一本ｔｌｌＤＮＡを発生した。２２マーの突然変異誘発オリゴヌクレオチ ド（５°−ＧＧＡＧＧＴＧＧＣＡＴＡＴＧＡＡＧＧＣＡＣ−３°）を使用して、 Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｍｄｈ遺伝子の開始コドン（図２）を組み込んだＮｄｅ１部位 （５゜−ＣＡＴＡＴＧ−３°）を作った。突然変異した０、５ｋｂのＥ　ｃ　ｏ 　ＲＩ　／　Ａ　ａｔｌｌフラグメントの全ヌクレオチド配列を決定して、導入 されたかもしれない他の望ましくない突然変異についてチェックした。ｐＲＭＡ ４の０．５ｋｂのＥｃｏＲＩ／Ａａｔｌｌフラグメントを、突然変異した０、５ ｋｂのＥｃｏＲＩ／Ａａｔｌｌフラグメントにより置換してｐＲＭＡ４１を発生 した。エンジニアしたＴ、ａｑｕａｔｉｃｕｓ　ｍｄｈ遺伝子を含む１．４ｋｂ のＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄｌｌ［フラグメントは、ｐＲＭＡ４１から取られ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端され、ｐＭＴＬｌｏ０３のＳｍａ１部位中に リゲートされた。１換えプラスミドは、ベクターｔｒｐプロモーターからの発現 のために正確な配向でＴ、ａｑｕａｔｌｃｕｓ　ｍｄｈ遺伝子により同定され、 そしてｐＲＭＡ５と命名された。０、ＩｋｂのＮｄｅｌフラグメントは、ｐＲＭ Ａ５から欠失されて。

挿入５°　フランキング配列を最小に減少させそしてコンセンサスＥ、コリタイ プリポソーム結合部位の後に遺伝子を挿入した。得られたプラスミドは、ｐＲＭ Ａ５Ｉと命名された（図３）。

Ｅ、コリｍｄｈプロモーター及び遺伝子の一部を含む１．Ｏｋｂの５ｐｈｔ／Ｋ ｐｎｌフラグメントを、ｐＤＮ４から切除しくＮ１ｃｈｏｌｌｓら、１９８９） 、そしてＭＩ３ｍｔ１２２Ｓｐｈｒ／Ｋｐｎ１部位中にリゲートした０部位指向 突然変異誘発は、２１マーのオリゴヌクレオチド（５°−ＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣ ＡＴＡＴＧＡＡＧＧＣＡＣ−３°）を使用して行われて、Ｅ、コリｍｄｈ遺伝子 の開始コドンを組み込んだＮｄｅＴ部位を得た。突然変異した５ｐｈｌ／Ｋｐｎ ｌフラグメントは、ＤＮＡ配列決定により確認され、５ｐｈｌ／Ｋｐｎｌにより ｐＤＮ４カット中にリゲートされて、Ｎｄｅ１部位を含むｐＤＮ４を再生した。

この組換えプラスミドをｐＲＭＡＩＯと命名した。Ｅ、コリｍｄｈ遺伝子及びプ ロモーターを含む１．９ｋｂの５ｐｈｌ／５ａｌｌフラグメントを、ｐＲＭＡｌ 。

から切除し、平滑末端とし、ｐＭＴＬ２８ｐのＰｖｕ１１部位中に部位−トして （ＮＩｃｈｏｌｌｓら、１９８９）、ｐＲＭＡＩｏｌを発生させた。Ｅ６コリｍ ｄｈ遺伝子コーディング配列を、１．７ｋｂのＮｄｅｌ／Ｈ１ｎｄｌｌｌフラグ メントとしてｐＲＭＡｌｏｌかも除き、そして同様な１．３ｋｂのＮｄｅｌ／Ｈ ＩｎｄｌｌｆフラグメントとしてＴｈｅｒｍｕｓ　ｍｄｈ遺伝子コーディング配 列（ｐＲＭＡ４１から採取）により置換して、ｐＲＭＡ１０２を発生させた。こ のやり方で、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｍｄｈ遺伝子は、ｐＲＭＡＩＯ２，のＥ、コリｍ ｄｈプロモーター及びリポソーム結合部位のコントロールの下の置かれた（図３ 及び図４）。

組換えプラスミドからのＴ、ａｑｕａｔｆｃｕｓ　ＭＤＨの発現Ｅ、コリＴＧ− ２の組換えプラスミドの全てについて、Ｔ、ａｑｕａｔｉｃｕｓ　ＭＤＨの発現 レベルを、粗製及び熱処理の両者の細胞抽出物における可溶性の蛋白の％として 、比活性に基づいて評価した（表１）、３．２ｋｂのＨｉｎｄＩ夏Ｉフラグメン トとしてｐＭＴＬ２２Ｐ中にクローンされた始めのＴ、ａｑｕａｔｌｃｕｓ　ｍ ｄｈ遺伝子は、可溶性の細胞蛋白の０．４％で熱安定性ＭＤＨを発現することが 分った。熱安定性ＭＤＩは、ｐＲＭＡｌを含むＥ、コリＴＧ−２の０．１％可溶 性の細胞蛋白を構成するものと評価され、そしてｐＲＭＡ２かも発現されなかっ た（表１）、この結果は、Ｔ、ａｑｕａｔｉｃｕｓ　ｍｄｈ遺伝子の発現は、ｐ ＫＫ２２３−３転写プロモーターにより指向され、そしてベクターとしてｐＭＴ Ｌ２２Ｐを使用して得られる結果と一致している（Ｎｉｃｈ。

ＩＩｓら、１９８９）、ｐＫＫ２２３−３”Ｃフタ−系で観察された減少した発 現は、恐も（ｐＭＴＬベクターシリーズの高いコピー数及び増大した安定性によ るものである（Ｃｈａｍｂｅｒｓら、１９８８）。

組換えプラスミドｐＲＭＡ１−４からの発現は、フラグメントのサイズに間して 逆比例の関係を示すことが分った（表１）、これは、ｐＫＫ２２３−３中にクロ ーンされ゛るとき、Ｂ、ｓ−ｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈ目ｕｓ　ｌｅｔ遺伝子 と一致し、挿入ＤＮＡのサイズの減少は１発現の増大と関連した（Ｂａｒｓｔ。

Ｗら、＋９８６）、この観察に関する理由は、不明であるが、プラスミドにおけ るコピー数又は安定性の増加によるものであろう、別に１発現における増加は。

短いｍＲＭＡ種の生成におけるカイネチックの有利さによるか、又は阻止ＤＮＡ 配列の欠失によるかの阿れかにより、転写の効率における増大を反映している。

それぞれｐＲＭＡｌ、ｐＲＭＡ３及びｐＲＭＡ４の開始コドンへ５°で生ずる４ 個、２個及びｌｆ［の標本的ステムループ構造が存在する。

Ｎｄｅ　１部位のエンジニアリング及び翻訳開始コドンの変更ｐＲＭＡ４及びｐ ＲＭＡ４１の間の唯一の相違は、４個の隣接する塩基対であり、そのｌ個は、Ｇ ＴＧからＡＴＧへ翻訳開始コドンを変更した（図２）、ｐＲＭＡ４と比較したと き、ｐＲＭＡ４１がらのＴ、ａｑｕａｔｌｃｕｓＭＤＨの発現は約８倍増大した （表１及び図５）、Ｔ、ａｑｕａｔ　ｉｃｕｓＭＤＨは、恐らくプラスミドのコ ピー数又は二つのベクター間の転写プロモーターの強さの何れかの小さい差のた めに、ｐＲＭＡ４１がらよりも僅かに低いレベルでｐＲＭＡ５かも発現された（ 表１）。

Ｔ、ａｑｕ＠ｔｉｃｕｓＭＤＨは、ｍｄｈ遺伝子がＥ、コリｔｒｐプロモーター に操作可能に結合したｐＲＭＡ５１がも非常に高しルベルで発現された。同じ高 しルペルの発現は、ｍｄｈ遺伝子がＥ、コリｍｄｈプロモーターに操作可能に結 合したｐ　ＲＭＡ　１０２を使用して観察された０両方の場合に、Ｔ、ａｑｕａ ｔｌ　ｃ　ｕ　ｓ　ＭＤＨは、約５０％の可溶性の細胞蛋白として発現された（ 表１及び図５）。

Ｅ、コリにおけるＴ、ａｑｕａｔｌｃｕｓりんご酸エステル説水素酵素遺伝子の 発現が１本発明に従って部位指向突然変異誘発を使用して増大したことは、ここ で提供された結果から分る。最初に、遺伝子の発現は、比較的低レルベル（０゜ １％可溶性細胞蛋白）であり、そしてベクター１　ａｃＺ遺伝子プロモーターが らのリードスルーにより行われた１発現の小さい増大は、１ａｃＺプロモーター 及び開始コドンへの５゛の下流のＤＮＡの量を減少するためにサブクローンする ことにより達成された。Ｎｄｅｌ制限酵素部位（５’−ＣＡＴＡＴＧ−３°）を エンジニアして、ＧＴＧからＡＴＧへ変化した開始コドンを含んだ、これは、粗 製細胞抽出物において３．２％可溶性細胞蛋白に相当する発現の８倍の増大を与 えた１発現は、エンジニアされたＮｄｅ　１部位を経て二つのプラスミド発現ベ クター中にサブクローンすることによりさらに増大し、一つは、Ｅ、コリｔｒｐ プロモーターに基づき、池は、Ｅ、コリｍｄｈプロモーターを使用した０両方の 発現系では、４０−５０％の可溶性細胞蛋白のレベルを達成した。粗製細胞抽出 物の熱処理は、９０％を越える可溶性細胞蛋白にＴｈｅｒｍｕｓＭＤＨをさらに 精製した。

本発明により得られる利点に関する理論上の基礎は、完全に不明であるが、Ｅ。

コリにおけるＴ、ａｑｕａｔｌｃｕｓＭＤＨの発現を制限するのは翻訳の開始で あると現在では信しられている。

ｐＭＴＬ１００５の構築 開始コドンでエンジニアされたＮｄｅ１部位を含むＥ、コリｍｄｈｉｌｌ伝子及 びプロモーターを、１．９ｋｂの５ｐｈｌ／ＥｃｏＲＩ制限フラグメントとして ｐＲＭＡＩＯから切除した。これは、ｐＭＴＬ２１Ｐの５ｐｔｔｔ及びＥｃｏＲ ｌの部位の間にリゲートされて（Ｃｈａｍｂｅｒｓら、１９８８）、ｐＲＭＡ１ ０２１を発生した。プラスミドｐＲＭＡ１０２１は、Ｅ、コリｍｄｈ遺伝子プロ モーター配列の５°末端に近いユニークＨｉｎｄｌ１１部位を有する。ｐＲＭＡ １０２１は、先ずＨＩｎｄＩＴＩにより消化され１次にフレノウＤＮＡポリメラ ーゼを使用して平滑末端される。ｒ１１素の活性は、フェノール抽出により除か れ、平滑末端されたフラグメントは１次にＮｄｅ　Ｉにより消化された。アガロ ースゲル電気泳動後、０．３ｋｂのフラグメントを単離し、それは、平滑末端Ｈ ｉｎｄ１１１部位及びＮｄｅｌ付着末端によりフランクされた全Ｅ、コリｍｄｈ ｉｌｌ伝子プロモーターを含んだ、ベクターｐＭＴＬ１０００　（Ｂｒｅｈｍら 、＋９９２１は５Ｐｖｕｌｌ及びＮｄｅ　Ｉにより消化されて、１ａｃＺ遺伝子 プロモーターを除き、ベクターバックボーンは、アガロースゲル電気泳動後単離 された。Ｅ、コリｍｄｈ遺伝子プロモーターを含む０．３ｋｂの平滑末端Ｈ１ｎ ｄｌＩｆ／Ｎｄｅｌフラグメントは１次にコンパチブルＰｖｕｌｌ及びＮｄｅ１ 部位を使用してｐＭＴＬ１００Ｏベクターバックボーン中にリゲートされて、Ｅ ）ＭＴＬＩ００５を発生した。従って、ｐＭＴＬ　１００５の１ａｃＺ遺伝子は 、Ｅ、コリｍｄｈ遺伝子プロモーター及びリポソーム結合部位から発現される。

従って、ｐＭＴＬ１００５は、適切なＥ、コリ宿主中に形質転換されそして色素 原基質としてＸ−ゲルの存在下プレートアウトされるとき、青のコロニーを生ず る。

Ｅ、コリにおけるポリペプチドの発現のためのベクターの構築プラスミドｐＭＴ Ｌ１００５は、Ｅ、コリにおける所望のポリペプチドの発現のために１本発明に 従って他のプラスミドの製造に原料として使用できる。これは、以下の段階を含 む方法により達成できる。

（１）所望のポリペプチドをエンコーディングした目標遺伝子を同定する段階。

（２）Ｎｄｅ１部位が、所望のポリペプチドをエンコーディングした目標遺伝子 のＡＴＧ開始コドンを含むように、目標遺伝子中にＮｄｅＩ制限部位をエンジニ アする段階。

（３）ｐＭＴＬ１００５のｌ　ａｃＺ遺伝子に含まれるリンカ−領域の制限部位 の一つにマツチするように、目標遺伝子のオーブンリーディングフレームの下流 で目標遺伝子中に池の制限部位（ＮｄｅＩではない）をエンジニアする段階。

（４）ｐＭＴＬ１００５をＮｄｅ　Ｉ及び制限エンドヌクレアーゼにより消化し て上記の（３）に述べた他の制限部位を生成させ１次にアルカリ性ホスファター ゼにより処理する段階、 （５）目標遺伝子をＮｄｅｌ及び制限エンドヌクレアーゼにより消化して上記の （３）に述べた他の制限部位を生成させる段階。

（６）目標遺伝子を消化されたｐＭＴＬｌｏ０５中にリゲートしく例えば（４） 及び（５）の生成物の混合物により）、ｐＭＴＬ１００５由来プラスミドを形成 する段階、 （７）リゲーシロン混合物を好適なＥ、コリ宿主菌株中に形質転換する段階、及 び （８）所望のポリペプチドを発現する組換えｐＭＴＬ１００５由来クローンを単 離する段階。

ＤＮＡ　（恐らく目標遺伝子）がｐＭＴＬＩｏ０５中にリゲートした組換えＤＭ ＴＬ１００５由来クローンは、アンピシリン及びＸ−ゲルを含むプレート上の無 色のコロニーとして同定できる。所望のポリペプチドは１次に１６時間アンピシ リンを含む２ｘＹＴプロスに成長させ、そして所望のポリペプチドの過剰発現に ついてチェックすることにより、採取できる。

上述のように、ベクターｐＭＴＬ、１ｏ０５を使用して、それぞれプロティンＧ 及びプロティンＬをエンコーディングした遺伝子を含む２個の独立したＥ、コリ 組換えクローンを発生した。これらの組換えクローンの粗製細胞抽出物では、プ ロティンＧは、約２５％の可溶性細胞蛋白を構成するものと評価され、そしてプ ロティンＬは、約１５％の可溶性細胞蛋白を構成するものと評価された。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の７第１項）平成６年４月１５日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＤＮＡコーディング配列によりコードされたポリベブチドをＥ．コリに発現 するための発現ベクターにおいて、該ベクターは、該ポリべプチドについてコー ディングしそして開始コドンを含むＤＮＡ配列よりなり、該ＤＮＡ配列は、開始 コドンの上流に位置する配列に操作可能に結合しそして該ポリペプチドの発現を コントロールでき、該上流配列は、（ａ）２８５塩基対配列【配列があります】 よりなるか、又は（ｂ）該上流配列（ａ）のそれに関連するＤＮＡ配列を有する 配列よりなり、前記の関連する配列は、該ポリペプチドの発現が排除されない程 度においてのみ、特定の配列（ａ）から異なることを特徴とする発現ベクター。 ２．前記の関連する配列（ｂ）が、配列（ａ）と少なくとも５０％の配列の相同 性を有する請求項１の発現ベクター。 ３．前記の関連する配列（ｂ）が、配列（ａ）と少なくとも７５％の配列の相同 性を有する請求項１の発現ベクター。 ４．前記の関連する配列（ｂ）が、少なくとも９５％の配列（ａ）を有する請求 項１の発現ベクター。 ５．配列（ｂ）は、１０以下の欠失，挿入及び／又は置換により配列（ａ）から 異なる請求項１−４の何れか一つの項の発現ベクター。 ６．配列（ｂ）は、５以下の欠失、挿入及び／又は置換により配列（ａ）から異 なる請求項５の発現ベクター。 ７．配列（ｂ）は、２以下の欠失、挿入及び／又は置換により配列（ａ）から異 なる請求項５の発現ベクター。 ８．前記の関連する配列（ｂ）は，以下のコントロール要素（ｉ）プロモーター （ｉｉ）カタポライトリプレッション （ｉｉｉ）リポソーム結合部位 の少なくとも一つを含む請求項１−７の何れか一つの項の発現ベクター。 ９．前記の関連する配列（ｂ）は、前記のコントロール要素（ｉ）−（ｉｉｉ） の少なくとも二つを含む請求項８の発現ベクター。 １０．プロモーター（ｉ）が、５′末端で配列ＴＴＧＴＡＡ並びに３′末端で配 列ＴＡＡＧＧＴを含む塩基配列を有する請求項８又は９の発現ベクター。 １１．プロモーター（ｉ）が、５′末端で配列ＴＧＧＡＡＴ並びに３′末端で配 列ＡＡＴＧＴＴを含む塩基配列を有する請求項８又は９の発現ベクター。 １２．プロモーター（ｉ）が、前記の３′及び５′配列の間に位置する介在配列 を有し、該介在配列は、 【配列があります】 及びプロモーターとしての活性が本質的に保持されている程度においてのみ、上 記の配列から異なる関連する配列から選択される請求項８−１１の何れか一つの 項の発現ベクター。 １３．介在配列は、１０以下の欠失、挿入及び／又は置換により配列【配列があ ります】から異なる請求項１２の発現ベクター。 １４．介在配列は、５以下の欠失、挿入及び／又は置換により配列【配列があり ます】から異なる請求項１３の発現ベクター。 １５．介在配列は、２以下の欠失、挿入及び／又は置換により配列【配列があり ます】から異なる請求項１４の発現ベクター。 １６．プロモーター（１）は、配列 【配列があります】 を有する請求項８の発現ベクター。 １７．ＤＮＡコーディング配列によりコーディングされたポリベブチドをＥ．コ リに発現する発現ベクターにおいて、該ベクターは、（１）配列【配列がありま す】 を有するＥ．コリｍｄｈ遺伝子プロモーター、又はＥ．コリｍｄｈ遺伝子ブロモ ーターのそれに関連するＤＮＡ配列を有するプロモーターであって、前記の関連 する配列は、プロモーターが、プロモーターとしての活性が本質的に保持されて いる程度においてのみ、特定の配列から異なり、並びに（２）ベクター中にＤＮ Ａコーディング配列の導入を行わせそれにより該コーディング配列が操作可能に プロモーターに制限されるように該プロモーターに関連して配置された制限酵素 部位を含む発現ベクター。 １８．ベクター中に導入され、そしてプロモーターに操作可能に結合され、さら にプロモーターは、ポリベブチドの発現をコントロールできるＤＮＡコーディン グ配列をさらに含む請求項１７の発現ベクター。 １９．遺伝子によりコーディングしたポリペプチドをＥ．コリに発現するための 発現ベクターにおいて、該ベクターは、（１）請求項１−１６の何れか一つの項 の配列（ａ）及び（ｂ）から選択される該ポリペプチドの発現をコントロールで きるＤＮＡ配列、並びに（２）発現ベクター中に該遺伝子についてコーディング するＤＮＡコーディング配列の導入を行わせそれにより該コーディング配列が操 作可能に配列（２）又は（ｂ）に結合しポリペプチドの発現を行わせるように該 配列（ａ）又は（ｂ）に関連して配置された制限酵素部位を含む発現ベクター。 ２０．該制限酵素部位が配列ＣＡＴＡＴＧを有する請求項１９の発現ベクター。 ２１．ベクター中に導入されたＤＮＡコーデイング配列をさらに含む請求項１９ 又は２０の発現ベクター。 ２２．ＤＮＡコーディング配列よりなり、さらに開始コドンの上流の配列に操作 可能に結合した開始コドンを含む組換えＤＮＡ分子において、ＤＮＡコーディン グ配列は、Ｅ．コリりんご酸エステルエステル脱水素酵素以外のポリペプチドに コーディングし、該上流配列は、（ａ）２８５塩基対配列【配列があります】 よりなるか、又は（ｂ）該上流配列（ａ）のそれに関連するＤＮＡ配列を有する 配列よりなり、前記の関連する配列は、該ポリベブチＦの発現が排除されない程 度においてのみ、特定の配列（ａ）から異なることを特徴とする組換えＤＮＡ分 子。 ２３．請求項１−２１の何れか一つの項の発現ベクターにより形質転換されたＥ ．コリの宿主菌株を培養することよりなるポリベブチドを発現する方法。 ２４．種Ｅ．コリの形質転換された徴生物を培養することよりなる、層Ｔｈｅｒ ｍｕｓに固有であるか又は前記の固有の配列に関連するＤＮＡコーディング配列 を発現することによりポリベブチドを生成する方法において、前記の形質転換さ れた微生物は、Ｅ．コリプロモーター、又はＥ．コリプロモーターの配列に関連 するＤＮＡ配列を有するプロモーターであるプロモーターに操作可能に結合した 該ＤＮＡ配列よりなるブラスミドを含み、前記の関連する配列は、プロモーター としての活性が本質的に保持され、そして該ポリベブチドが、それが３５−６０ ％の可溶性の細胞蛋白を形成するように発現される程度においてのみ、Ｅ．コリ プロモーターの特定の配列から異なることを特徴とする方法。 ２５．該ポリベブチドが４０−５５％の可溶性細胞蛋白を形成する請求項２４の 方法。 ２６．該ポリベブチドが約５０％の可溶性細胞蛋白を形成する請求項２４の方法 。 ２７．前記の関連する配列は、それから生成されるポリベブチドが、１０個以下 のアミノ酸残基により固有のポリベブチドから異なるように、前記の固有のコー ディング配列から異なる請求項２４−２６の何れか一つの項の方法。 ２８．前記の関連する配列は、それから生成されるポリペプチドが、５個以下の アミノ酸残基により固有のポリペプチドから異なるように、前記の固有のコーデ ィング配列から異なる請求項２４−２６の何れか一つの項の方法。 ２９．該プロモーターが、Ｅ．コリプロモーターの配列と少なくとも５０％の配 列の相同性を有する請求項２４−２８の何れか一つの項の発現ベクター。 ３０．該プロモーターが、Ｅ．コリプロモーターの配列と少なくとも７５％の配 列の相同性を有する請求項２９の発現ベクター。 ３１．該プロモーターが、Ｅ．コリプロモーターの配列と少なくとも９５％の配 列の相同性を有する請求項３０の発現ベクター。 ３２．該プロモーターが１２−５０塩基よりなる請求項２４−３１の何れか一つ の項の方法。 ３３．該プロモーターが２０−３５塩基よりなる請求項３２の方法。 ３４．該プロモーターが約２９塩基よりなる請求項３３の方法。 ３５．プロモーターが、５′末端で配列【配列があります】並びに３′末端で配 列【配列があります】を含む塩基配列を有する請求項２４−３４の何れか一つの 項の方法。 ３６．プロモーター（１）が、５′末端で配列【配列があります】並びに３′末 端で配列【配列があります】を含む塩基配列を有する請求項２４−３４の何れか 一つの項の方法。 ３７．該ＤＮＡコーディング配列は、以下の配列（１）【配列があります】 （２）【配列があります】 の１個を含むリボソーム結合部位に操作可能に結合されている請求項２４−３６ の何れか一つの項の方法。 ３８．ＤＮＡコーディング配列が開始コドンＡＴＧを有する請求項２２−３５の 何れか一つの項の方法。