JPS63501687A - バイオジェネティック・カセット - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 バイオジエネティック・カセット 発明の背景 この発明は、バイオテクノロジー産業に関し、より特定的には、過剰のアミノ酸 または他の化学種を生産する菌株を調製するための方法、ならびにメタノールの ような型に嵌まらない工業用原料を代謝し得る菌株を調製するための方法に関す る。

微生物により生産されたアミノ酸は、農業および食品産業において飼料スタッフ および食品添加物として、医療用途のための様々な栄養混合物の成分として、な らびに化学産業および製薬産業における薬剤として広範な用途を見い出す。

紫外線、イオン照射および化学的な突然変異原のような種々の突然変異原を用い ることにより、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシンなどのようなア ミノ酸を生産する菌株を調製する方法が公知である。得られる微生物の突然変異 菌株は、代謝調節において遺伝学的に予め定められた特異的な欠点を有し、この 欠点がゆえに、栄養培地に特定的なアミノ酸を分泌する。微生物のこれらの突然 変異菌株は、突然変異体（オークソトロフィ　（ａｕｘｏｔｒｏｐｈｙ））の栄 養学的な特定的な欲求に基づ〈従来法、あるいは親の菌株の成長を抑制するアミ ノ酸の構造的な類似物に対する突然変異原の抵抗に基づ〈従来法により同定され 、かつ分離される（注：英国特許第１．２５８．３８０号、第１．１８６，９８ ８号、第１，３１６，８８８号および日本国特許５１−６２３７号）。（アミノ 酸類似物のような）抗代謝物ならびにコインヒビタ（特異的なアミノ酸）に対す る同時的な抵抗に基づいてアミノ酸を生産する突然変異原を調製するための方法 も知られている（注：アメリカ合衆国特許第３，７５６，９１６号）。

上述したすべての場合において、アミノ酸を生産し得る突然変異菌株は、アミノ 酸を展開する親の菌株の親の遺伝学的構造（ゲノム）において単一のまたはステ ップバイステップの突然変異を誘導することにより調製される。

また、選択されたアミノ酸の合成をコントロールし、かつこのアミノ酸合成の負 の調節を連続的に破壊するアミノ酸類似物に対する抵抗を与える突然変異を有す る遺伝子を含む（ａ）ＤＮＡ染色体断片に、（ｂ）ベクタＤＮＡ分子を結合して 、推定された遺伝子の増幅、したがって栄養培地内へのこのアミノ酸の分泌を高 めるアミノ酸類似物への抵抗を高め得る、交雑ＤＮＡ分子を形成することを備え る、アミノ酸を生産する菌株を構成するための方法が知られている。これらの方 法は、予め選択された突然変異のランダムな「ショットガン・クローニング」に 基づくものであり、突然変異遺伝子の目的とするクローニング方法に向けられて いるのに対して、ベクタＤＮＡ分子内へアミノ酸の生合成において含まれる遺伝 子の正確なゲノム形状における明確な挿入およびこの組換えＤＮＡ分子の増幅を 欠いている。

大半の遺伝学的に生産された生産物は、１次炭素源としてグルコースを用いるこ とにより製造されている。くえん酸、ペニシリンおよびアスコルビン酸は、工場 用原料としてグルコースを用いる微生物的に生産される生産物のいくつかの例で ある。しかしながら、グルコースは比較的高価な工場用原料である。

多くの場合、生産における主要な操作コストは、必要とする炭素源のコストであ る。現在、たとえば、食品および化粧品産業におけるシックナーとして用いられ ておりまたはオイルの回収を高めるために用いられている、微生物学的に生産さ れたバイオポリマーが、主な炭素源としてグルコースを用いることにより現在生 産されている。近い将来には、微生物学的に生産されたバイオポリマーが成る種 の合成樹脂に置き換わるかもしれない。これらのバイオ材料の競争力は、かなり の点において、利用する炭素源のコストに依存する。

メタノールは、微生物のための炭素源としてグルコースの代替物である。アメリ カ合衆国において販売されているグルコースは、現在のところ、ボンドあたりメ タノールの数倍高価である。現在、世界におけるメタノールの過剰生産能力は、 年あたり１億ガロンである。この過剰生産能力は、近い将来には年あたり２億ガ ロンを超えるようになるであろう。メタノールは原油から製造され得るが、天然 ガスおよび石炭から最も簡単に作られる。工場用原料として、メタノールは容易 に入手可能なものであり、高価でなく、かつ原油からの工場用原料よりも長期間 にわたる価格安定性を有する傾向がある。工場用原料としてのメタノールの競争 優位性を認識している多くの化学工業者達は、多くの化学的方法において、主要 な炭素源としてメタノールを用いる新しい生産設備を開発してきている。

メタノールから成長のためのエネルギおよび炭素を得ることのできる微生物、た とえばメチルオトロフィック（Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ）バクテリアおよ びイースト菌が天然に存在し、かつ商業的に開発されている。たとえば、メタノ ールを家禽の餌における魚粉および大豆粉代替物として用いられるべき単一細胞 の蛋白質への産業的規模で変換することが既に始まっている。この方法は、ヘキ スロース（ｈｅｘｕｌｏｓｅ）経路生物、メチロフィルス・メチロトロフス（Ｍ ｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ　ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ）を用いている。残 念ながら、Ｅ。

ｃｏｌｉにおけるヘキスロース経路遺伝子を発現することは現在まで不可能であ る。それにもかかわらず、メタノールの商業生産における潜在的な重要性は非常 に明白である。

メタノールは、バイオテクノロジー発酵方法用の原料として理想的な候補者であ る多くの特性を有する。メタノールは水に極めてよく溶ける。このことは、炭化 水素についての相転換の問題を解消する。メタンと異なり、メタノールは爆発の 危険性が高いということにも無関係である。メタノールは容易に精製される。微 生物によるメタノールの代謝は、酸素をさほど必要とせず、かつメタンの代謝は ど熱を発生しない。

したがって、この発明の目的は、炭素源としてメタノールを利用することのでき る遺伝子工学技術により生物の生産を可能とすることである。この発明の他の目 的は、成る手段を提供し、それによって技術化された生物のメタノール利用能を 容易に他の生物に移し換えることである。

この発明の他の目的は、アミノ酸生合成のような調節されていない生合成経路の ためのバイオジエネティック壷カセットを産み出すことである。

この発明のさらに他の目的は、メタノールの利用およびアミノ酸の生合成のため に結合されたバイオジエネテイツク・カセットを作り出すことである。

この発明についての本明細書中においては、次の表現および用語を用いる： 用語ｒＤＮＡＪはデオキシリボ核酸を意味する。

「プラスミド」は、染色体ＤＮＡとは無関係に細菌または酵母細胞内において増 殖する遺伝的因子である。

「複製」は、遺伝材料の再生産を意味する。

「形質転換」および「トランスフェクション」は、分離されたＤＮＡによる宿主 細胞への遺伝材料の移動を意味する。

用語「ベクター分子」は、宿主細胞およびその増殖への外部の遺伝材料の移動を 果たすプラスミドおよびファージのＤＮＡ分子を示す。

用語ＤＮＡの「組換え（交雑）分子」は、その１つがべ用語「クローン」は、成 る細胞の遺伝学的に均一な子孫を意味する。

用語「遺伝子のクローニング」　（分子クローニング）は、交雑プラスミド上に おいて前記遺伝子を含む細菌または酵母のクローンの調製を行なうことを示す。

「増幅」は、成る細胞内で遺伝子の数が増大することを意味する。

「オペロン」は、成るグループの遺伝子を含む結合的に調節されたＤＮＡ単位を 意味する。

用語「異化作用」は、飼料化合物を中間代謝物に変換する作用を意味する。

「リプレッション」は、遺伝子またはオペロンの転写を切換え遺伝子生産物の合 成を抑制することを意味する。

用語「リプレッサ」は、（通常は生合成もしくは異化経路またはこれらの誘導体 の最終生成物である）、リプレッション共通因子に関連して遺伝子の機能を停止 する調節蛋白質を示す。

用語「バイオジェネティック・カセット」は、負の調節的な特徴を有せず、特定 の工場用原料の異化作用のための完全な生化学的な経路に必要であり、あるいは 単一の交雑ＤＮＡベクタ分子上に含まれる特定的なアミノ酸もしくは他の化学種 またはこれらの双方を生産するのに遺伝学的にならびに代謝的に必要なすべての 遺伝子を含むように構成された自己増殖型のＤＮＡのプラスミド、細菌ファージ 、ウィルスまたは他の形式のものを意味する。この経路において１を超える酵素 （イソ酵素）が与えられた反応を奏し得る場合には、このバイオジエネティック ・カセットは、これらの酵素の１つのみに対する遺伝子を含むように構成され、 そこではその単一の遺伝子が存在し、同様の機能を有する他の遺伝子が存在しな いことにより、所望のアミノ酸または所望の化学種の生産が高められる。

発明の詳細な説明 この発明は、アミノ酸または他の化学種の生産を高めることにより特徴づけられ る微生物学的菌株を生産することに関する。この微生物は、所望の最終生成物の 生合成もしくは所望の工場用原料の利用またはこれらの双方に必要であるが、そ の合成を制限する負の代謝的および遺伝的調節メカニズムのすべて、もしくはほ とんどすべてを欠いている遺伝子の多重複写を含む。

この発明は、炭素源としてメタノールを利用し得る微生物菌株の生産にも関連す る。これらの微生物は、炭素源としてメタノールを利用するのに必要な遺伝子の 多重複写を含んでいてもよく、あるいは含んでいなくともよい。

この発明の一局面によれば、Ｌ−イソロイシンのようなアミノ酸を生産する微生 物が調製される。Ｌ−イソロイシンの生合成に必要なすべての遺伝子を含むＥ、 ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡの断片が、プラスミドｐＢＲ３２２のようなりＮＡのベク タ分子内への天然のゲノムの形状と同一形状に再構成され、ＤＮＡの約１５キロ ベース（ｋ　ｂ）からなる交雑プラスミドを形成する。このプラスミドおよび遺 伝性生物中の遺伝子は、Ｌ−インロイシンの生産を制限するすべての負の代謝お よび遺伝調節を欠いている。

１を超える酵素（イソ酵素）がこの経路において成る与えられた反応を奏し得る 場合には、バイオジエネティック・カセットは好ましくは、これらのイソ酵素の １つのみについての遺伝子を含むように構成されてもよい。成る場合において単 一の遺伝子が存在することならびに他のイソ酵素が存在しないことは、その代謝 もしくは遺伝調節の性質により、あるいはその基質特異性により、所望のアミノ 酸もしくは化学種の生産を高めるかもしれない。Ｌ−イソロイシンおよびＬ−バ リンの場合には、アセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＨＡＳ　Ｉ、ＡＨＡＳ　Ｉ　 Ｉ、ＡＨＳ　Ｉ　Ｉ　Ｉ）用の３個の遺伝子ＣｉＪ！ｐＢＮ、ＬｌｔｒＧＭおよ びｊ、ｌ’ｒｔ　ＨＩ　）が存在する。Ｌ−イソロイシンの生産に好ましいバイ オジェネティッ、り・カセットは、（その基質特異性によりＬ−インロイシンの 合成に好ましい）ＡＨＡＳ　Ｉ　Ｉの生産用のＬＩＰＧＭ遺伝子のみを含み、こ れに対しｔ、ＩＰＢＮおよびごノＰＨＩ遺伝子は、Ｌ−バリンの合成に好ましい ＡＨＡＳイソ酵素をコードする。

したかりて、この発明の成る一局面によれば、所望の生物学的生成物のための生 合成または代謝経路における各ステップのための少なくとも１の酵素に対してコ ードする遺伝子を含む組換えＤＮＡセグメントが提供され、ここではこの経路は 少なくとも２つのステップを有しており、好ましくは少なくとも３つのステップ を有し、そこではこの遺伝子の少なくとも１の遺伝子の（Ａ　＞乙ににおける転 写は、通常は調節にさらされ、かつ少なくとも１のこの遺伝子は、フィードバッ ク抑制に通常さらされ、そこではすべての転写調節配列順序がこのセグメントか ら除去されており、かつさもなければフィードバック−抑制酵素に対してコード するであろうセグメント内の各遺伝子は、フィードバック抑制が取り除かれるよ うに修飾されており、したがってセグメントの転写および結果として得られるＲ ＮＡの翻訳により、生合成もしくは代謝経路は調節されない。この生合成経路が 成るアミノ酸についての経路である場合には、好ましい生成物はＬ−イソロイシ ン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ス レオニンおよびＬ−フェニルアラニンを含む。

遺伝調節メカニズムを適当に考慮する場合には、セグメント中の遺伝子は天然の 染色体順序となっていることが好ましい。

Ｌ−イソロイシンの生合成に好ましい成る特定的なバイオジエネティック管カセ ットは、ム！ｘｒ　ｐｅ’ａ’Ｇ”　Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ａ’およびジノＰＹＣを含ん でおり、ここではｐはプロモータの配列順序を示し、ｅはリーグの配列順序を示 し、ａは転写減衰点の配列順序を示し、÷は活性を示し、ｄは欠失を示し、ｒは フィードバック抑制に対する抵抗を示す。

この発明の他の好ましい実施例によれば、この発明により調製されたＤＮＡセグ メントまたはバイオジェネティック・カセットは、組換えＤＮＡ転移ベクタに含 まれている。

好ましいベクタは、ファージ、他のウィルス性ベクタおよびプラスミドを含む。

このプラスミドは、好ましくは多重複写プラスミドである。

この発明のさらに他の好ましい実施例によれば、バイオジエネティック・カセッ トは、生合成経路および異化作用経路の双方に対る遺伝子を含む。メタノールを 利用する成る好ましい異化経路は、メタノールオキシダーゼをエンコードする遺 伝子と、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（ｓｙｎｔｈａｓｅ）をエンコードす る遺伝子とを要求する。

この好ましい実施例では、転写調節は、メタノールオキシダーゼおよびジヒドロ キシアセトンシンターゼをエンコードする遺伝子から上流のメタノールオキシダ ーゼおよびジヒドロキシアセトンシンターゼをエンコードする遺伝子についての プロモータの配列順序を与えることにより、除去されることができ、このプロモ ータは負の転写調節にさらされず、かつメタノールオキシダーゼをエンコードし ている遺伝子についての野生のプロモータとは異なるものである。このバイオジ ェネティック・カセットは、好ましくは、リポソーム結合サイトならびにメタノ ールオキシダーゼおよびジヒドロキシアセトンシンターゼをエンコードしている 遺伝子についての転写終結点をも含む。

この発明のさらに他の好ましい実施例は、ラクトースを利用するための結合され た生合成および異化バイオジエネティック・カセットであり、これは野生の形式 のプロモータの配列順序と異なるプロモータ配列順序により置き換えられている Ｊｃｔｃ−オペロンを含む。この、１ａ−ｃ　リプレッサ遺伝子、ノａ−ｃＬ　 は、こ好ましくは、サイト−特異性欠失により！Ｌ（／オペロンから除去される 。

この発明の他の実施例は、メタノールオキシダーゼをエンコードしている遺伝子 およびジヒドロキシアセトン　シンターゼをエンコードしている遺伝子を備えて おり、これらの双方の遺伝子はメチルオトロピツク（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｌ ｃ）生物から得られており、さらにこれらの遺伝子の転写を方向づけるプロモー タの配列順序を備えており、そこでは、このプロモータの配列順序はこれらの遺 伝子が由来する生物中のこれらの遺伝子についてのプロモータ配列順序と異なっ ている、組換えＤＮＡセグメントからなるバイオジエネティック・カセットであ る。

この発明は、少なくとも２個の、好ましくは３個のステップを有する生合成また は代謝経路に対してコードするＤＮＡを含む未調節のバイオジェネティック・カ セットの組立方法を含み、このカセットは、通常は転写調節およびフィードバッ ク抑制の双方により調節されており、かつそこではこのカセットはこの経路の各 ステップについて少なくとも１の遺伝子を含む。この方法は、通常はフィードバ ック抑制にさらされる経路内において各酵素に対しての（突然変異されたまたは 合成の遺伝子のような）修飾された遺伝子を得るステップを備え、ここでは修飾 された各遺伝子中の修飾は、フィードバック抑制を破壊し、減衰およびリプレッ ションされていないオペロンを得るための経路についての遺伝子の負の転写調節 の働きをするＤＮＡ配列順序または配・列順序群を除去し、修飾された遺伝子を 含む、この経路内の各ステップに対する少なくとも１の酵素に対してコードする すべての遺伝子を単一のＤＮＡセグメント内に組立て、かつ得られたＤＮＡセグ メントをクローニングするステップを備える。この方法は、プロモータの配列順 序を除去し、セグメント内に異なるプロモータの配列順序を挿入し、このセグメ ントをプラスミド内に挿入し、かつこのセグメントの微生物のプラスミド内にお いて増殖するステップを含んでいてもよい。好ましい実施例では、この経路の生 成物は、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−トリプトファン、 Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−スレオニン、またはＬ−フェニルアラニンのようなアミノ 酸である。他のアミノ酸もまた選択してもよい。

Ｌ−インロイシン生合成経路のためのバイオジエネテイック・カセットを作るた めの１つの特定的な好ましい方法は、ＬＪｙ　ＧＭＥＤＡオペロンから減衰点の 配列順序を除去して減衰弱されていないオペロンを形成し、野生型のδノｙＡを Ｌ−イソロイシン−抵抗性；、ｌｙｐ、”で置き換え、かつ−重鎖の重合性ＤＮ Ａ分子内において；＃−、ｐ’および　（、／ＰＹｃを含む減衰のされていない オペロンを共に組み込んでＬ−インロイシンの生合成に対してコードしているバ イオジェネティック・カセットを形成することである。

この発明の方法は、付随的には、メタノールオキシダーゼをエンコードする遺伝 子およびジヒドロキシアセトンシンターゼをエンコードする遺伝子またはＪｅｔ ｔ、オペロンのような異化経路に対してコードしている遺伝子を生合成バイオジ エネティック・カセット内に組み込むステップを含む。当然のことながら、この 方法は、微生物内にバイオジェネティック・カセットの発現を得ることをも含む 。

さらに、この発明は、メタノールを利用するためのバイオジェネティック・カセ ットを作り出すための方法をも含み、これはメチルオトロピック（ｓｅｔｈｙｌ ｏｔｒｏｐｌｃ　）生物からメタノールオキシダーゼおよびジヒドロキシアセト ンシンターゼをエンコードする遺伝子を得、この遺伝子を含むＤＮＡセグメント およびこの遺伝子についての異なるプロモータを作り出し、かつこのセグメント をウィルスまたはプラスミドのような組換えＤＮＡ転移ベクタ内に挿入するステ ップを備える。

図面の簡単な説明 第１図は、Ｌ−イソロイシンを合成するための生合成経路の図である。

第２Ａ図および第２Ｂ図は、Ｌ−インロイシンを合成のための調節されていない バイオジェネティック・カセット内に乙ノｌ遺伝子を組み込むためのクローニン グ方法を示す図である。遺伝子のＤＮＡ配列順序は、遺伝子記号の上の太線によ り表わされられており、環はＤＮＡベクタの配列順序を表わす。制限エンドヌク レアーゼ位置についての略号は、Ｈ，Ｈｉｎｄｌｌｌ；　Ｓ、Ｓｍａｌ；　Ｐ。

ＰｖｕｌＩ；　Ｋ、ＫｐｎＩ；　Ｓａ、　５ａｉｌ；Ｘ、　ＸｈｏＩ；　Ｂ、　 ＢｇｌｌＩである。

第３図は代替のクローニング方法ならびにＬ−イソロイシンの合成のための調節 されていないバイオジェネティック・カセットを形成するためのステップを表わ す図である。

遺伝子のＤＮＡ配列順序は、遺伝子記号の上方の太線により表わされており、環 はベクタの配列順序を表わす、略号は、Ｈ，ＨｉｎｄｌＩＩ；　Ｓａ、　５ａｌ Ｉ；　Ｓｕ。

５ａｕｌｌｌＡ；　Ｔ、Ｔａｑｌ；　Ｍ、Ｍｎ）ＩＨ５ｐ、　５ｐｈＩ；　Ｂｇ 、　ＢｇｌｌｌＨＨｉ、ＨｉｎｃＩＩ；　Ｘ、　Ｘｈｏｌ；　Ｂ、　ＢａｍＨＩ ；Ｒ。

ＥｃｏＲＩである。

第４Ａ図および第４Ｂ図は、メタノールを利用するためのバイオジエネティック φカセットを形成するためのクローニング方法およびステップを表わす。遺伝子 のＤＮＡ配列順序は、実線で表わされており、環はＤＮＡベクタの配列順序を表 わす。制限エンドヌクレアーゼの位置についての略号は、Ｂ、　ＢａｍＨＩ　； 　Ｈ，Ｈｌｎｄｌ　Ｉ　Ｉ　；Ｐ、　Ｐｖｕｌｌ；　Ａ、Ａｌｕｍ；　Ｈｉ、Ｈ Ｌｎｆ　Ｉ　；　Ｓａ、　５ａｕ３Ａ；　Ｒ，ＥｃｏＲＩ　Ｉ　；Ｅ、　Ｅｃｏ ＲＩ；　Ｔ、ＴａｑＩ；　Ｓｐ、　５ｐｈ１；　Ｂｓ、　ＢｓｔＥｌｌ；　Ｂａ 、　Ｂａ１ｌ；　Ｂｇ；　ＢｇｌＩＩ；　Ｎ、ＮｄｅＩ；　Ｓｍ、Ｓｍａｌ；　 Ｘ、Ｘｂａｌである。

好ましい実施例の詳細な説明 この発明は、ニジｉｔｆ、ｉ−一において複製および増殖能のある交雑ＤＮＡ分 子を調製し、次に形質転換またはトランスフェクシヨンにより、受容菌株内にこ れらの分子を導入する方法を用いる。用いられるベクタ分子は、温和なバクテリ オファージ、ウィルスまたは他の自己増殖型ＤＮＡのプラスミドＤＮＡもしくは ＤＮＡである。これらの方法の多くは、下記の出版物において詳細に述べられて いる：１、コーエン　ニス、エフ１．チヤン　エイ−シー・ワイ、、ボイヤー　 エイチ、ダブリニ、およびヘリングアール、ビー、の　ＰＦＯａ　−Ｍａｔ　＊ 　ＪＯａｄ　−！；６％　−ＥＩＳ４３２４０第７０巻第３２４０頁（１９７Ｂ ）。

２、グリーン　ビイ、ジエイ９．ベトラーシチ　エム。

ディ０．ボイヤー　エイチ、ダブリュ２．およびグツドマン　エイチ、エヌ、の Ｍａｔｈｏｔｌｓ　ｉｎ　ＭｏＬａａｕＬａｒ　Ｂｉｎ纂ｏｇｙ。

第７巻第８７頁（１９７４）。

３、タナ力　ティー、およびバイスプラム　ビーのＪ、　ＢａａｔａｒｔｅＬ　 第１２１巻３５４頁（１９７５）。

４、クラーク　エルおよびカーボン　ジエイのＰｒｏａ、　Ｍａｔ、　Ａａａｔ ！、　Ｓｅｔ、　ｌｌ５Ａ第７２巻４３６１頁（１９７５）。

５６　ポリバー　エフ、ロドリゲス　アール、エル、。

グリーン　ビー、ジエイ、、ベトラッチ　エム、シー、。

ヘイネッカー　エイチ、エル、およびボイヤー　エイチ。

ダブり二の　Ｃ工、　第２巻第９５頁（１９７７）。

６ｏ　コズロフ　ジエイ、アイ１．カリニナ　エフ。エイ０．ゲニング　エル、 ブイ２．シーベンティッシュ　ビー、エイ６．ストロンジン　エイ、ジェイ、、 ボーブッシニ　ブイ、ジー、およびデバドフ　ブイ、ジー、のＭｏＬａ６゜Ｇａ ｎ、　Ｇａｎｇｔｓａａ　第１５０巻２１１頁（１９７７）。

すべての生物中の技分かれしたアミノ酸インロイシンおよびバリンの生合成は、 複雑な生化学および遺伝的システムにより達成されており、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ ｉ）では４個の別々のオペロンおよび１１の遺伝子を備える（第１図）。これら のアミノ酸の合成の調節は、いくつかの工程により影響され、これらの工程は、 減衰点（ムノ’Ｚ’ＧＭＥＤＡおよびｔ／、ｌ！ｖ−ＢＮ）、リブレッジｔｓ＞ ＣｊノＰＨＩ、ｊノシＹ）、誘導（ム、／ＰＣ）、異化リプレッション（ｔ）Ｐ ＢＮ）、最終生成物抑制（Ｌ−インロイシンによるスレオニンデアミナーゼ、Ｌ −バリンによるアセトヒドロキシシンターゼ１および■、Ｌ−ロイシンによるイ ソプロピルマレイド）、ならびに最終生成物の活性化（Ｌ−バリンによるスレオ ニンデアミナーゼ）を含む。アミノ酸合成および調節についての最近のレビュー については、ベルマン。ケイおよびスメルビーレ、アール、エル違の「アミノ酸 、生合成と遺伝的調節Ｊ　（Ａｍｉｎｏ　Ａｃ１ｄ、　Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉ ｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｒｅｑｕｌａｔ　ｉｏｎ　（１９８３）を参照さ れたい。

Ｌ−インロイシンの生産についての１つの生合成経路では、出発材料はＬ−スレ オニンである。この経路は第１図に示されている。（ｊｌＰＡ遺伝子に対してコ ードされた）スレオニンデアミナーゼは、アミノ基およびＨ，０分子を除去して アルファーケトブチレイトを形成する。次に、アセトヒドロキシ酸シンターゼＩ Ｉ　（ｊ、／ｚ−ＧＭ）は、無性ブドウ酸塩とともにその化合物を濃縮してアル ファーアセトーベーターヒドロキシブチラーテを形成する。次のステッブでは、 アセトヒドロキシ酸インメロリダクターゼＣｔ’１ｒＣ）が、この生成物をアル ファ、ベータージヒドロキシーアルファーメチルバレラーテに変換し、これは次 にジヒドロキシ酸脱水酵素（ｊｌ’Ｐ　Ｄ）により脱水されてアルファーケトー ベーターメチルバレラーテを作る。の生成物は、第１図にすべてが示されている ように、Ｊｐ　Ｈによりコードされたアミノ酸アミノトランスファラーゼにより Ｌ−イソロイシンに変換される。

上述したように、ｔＩｌ　ＧＭＥＤＡオペロンの転写は、減衰点の配列順序によ り制御される。アセトヒドロキシ酸シンターゼＩおよび■は、Ｌ−バリンにより 負のフィードバック調節にさらされる。野生の形式の大腸菌（Ｅ、ｃ。

１１）Ｋ１２が、アセトヒドロキシ酸シンターゼ■陰性（ｔ）Ｚ−Ｇ−）である 。

スレオニンデアミナーゼは、同様にＬ−イソロイシンによるフィードバック抑制 にさらされる。ｔ、ｙｌ’ｗ　ｃの転写が、陽性の活性因子＜Ｊｖ　ｙ遺伝子の 生成物）と錯体結合することにより、その基質であるアセトヒドロキシブチラー テおよびアセドラクチイトにより誘起される。

同様に、他の生合成および異化経路においては、酵素ならびに他の遺伝的および 代謝制御物のりプレッション、減衰、陽性の活性化およびフィードバック抑制が 重要な役割を果たす。たとえば、成る異化作用オペロン、ラクトースの異化の役 割を担うＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２のＡＣオペロンは、リプレッションおよび陽性の 活性化の双方により遺伝的に調節される。栄養培地中にラクトースが存在しない 場合には１，１ｃｔｃ　リプレッサ（、Ａｃ　ｌ遺伝子の生成物）が、プロモー ターオペレータ領域内のオペレータ位置に結合し、かっＲＡＮＡ、ｉ’リメラー ゼによる。！！Ａｃオペロンの３個の遺伝子の転写を防止する。栄養培地中にラ クトースが存在する場合には、成る形態のラクトース分子が、かリプレッサがノ ＾Ｃプロモーターオペレータ領域に結合することを防止してＲＮＡポリメラーゼ によるＡ、オペロンの転写を可能とするように、このＡ０リプレッサと結合する 。

ノ妙　オペロンもまた、アラビノーズオペロンやリボースオペロン等のような他 の多くの異化作用オペロンの同様に、異化作用リプレッションにより調節される 。この調節は、ＲＮＡポリメラーゼによるこれらのオペロンの転写がこれらのオ ペロンのプロモータ領域への環状ＡＭＰ受容体蛋白質：環状ＡＭＰ錯体を結合す ることにより活性化されるという事実による。栄養培地中にグルコースが存在す る場合には、細胞内の環状ＡＭＰのレベルが低くなり、ＣＲＰ：環状ＡＭＰ錯体 は形成せず、これらのオペロンの表現は低いままである（異化作用リプレッショ ン）。グルコースが存在せず、他の炭素源（たとえばラクトース、アラビノース 、リボースなど）が存在する場合には、環状ＡＭＰのレベルは高くなり、ＣＲＰ 　：環状ＡＭＰ錯体が形成し、これらのオペロンの転写が活性化される。

生合成オペロンの他の例は、Ｅ、ｃｏｌ　ｉ　Ｋ１２のｔ／、ｒｙオペロンであ る。このオペロンは、Ｌ−トリプトファンの生合成の役割を担い、（ｋ生合成経 路のような）代謝最終生成物の抑制によるのと同様に、（Ａｃ−オペロンのよう な）リプレッションおよび減衰の双方により遺伝的に調節される。

要約すると、減衰は、オペロンの構造遺伝子に先行する位置（減衰点）における 転写終結の調節である。

減衰点に先行するリーダＲＮＡの翻訳は、終止構造（Ｕ残基のストリングが続（ Ｇ＋Ｃステムループ）がＲＮＡ転写において形成され、転写終了信号を出してい るか、あるいは先取りされており構造遺伝子内に通過転写が生じているかを決定 する。適当なアミノ酸または他の最終生成物の細胞内濃度が十分な条件の下では 、リーダＲＮＡの翻訳は終結点造の形成に都合がよく、ＲＮＡポリメラーゼは減 衰点における転写を終結する。代わりに、アミノ酸または他の生成物が制限する ならば、リポソームがリーダ領域内に埋まり、終了信号が先取りされ、ＲＮＡポ リメラーゼが構造遺伝子内への転写を続ける。

さらに、遺伝子調節メカニズムの例は多数あり、逆感作ＲＮＡ　（Ｅ、、ｃｏｌ 、ｉ　Ｋ１２のｏｍｒ　Ｆ遺伝子）、転写の反終結（バクテリオファージラムダ における前の遺伝子表現のＮ遺伝子生成物調節）ならびに翻訳を制御するため１ ：Ｍｒａｎに結合する調節蛋白質（Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２のリポソームオペロン ）による調節のような例を含み、成熟核においては、特異的なりＮＡ配列順序（ エンハンサ）が、しばしば有効な遺伝子表現についてめられる。

上述した例のすべてにおいて、これらの遺伝子の調節メカニズムは、独特の個別 のＤＮＡ配列順序により特定される。この発明では、組換えＤＮＡ法により、こ れらの特異的、なりＮＡ配列順序を正確に欠失し、突然変異させ、あるいは変化 させて負の調節を除去した。

この発明のバイオジェネティック・カセットを組立てるには、所望の最゛終生成 物の生合成または所望の基質の代謝に必要なすべての遺伝子が共に、（以下のセ クションＤで議論するように）適切に染色体の順序に従って組み込まれる。野生 の生物に存在する代謝的に負の転写調節メカニズムは、バイオジエネティック・ カセット内において欠失さ・れており、修飾されており、突然変異されており、 あるいはさもなければ破られている。Ｌ−イソロイシンカセット内では、活性の ｊｋ　ｃ十が、Ｅ、ｃｏｌｌ　Ｋ１２の野生の不活性の４に−に置き換わってお り、野生の型のｊｔｌｖ−Ａはフィードバック−抵抗性−、／ＰＡ　により置き 換えられており、誘起点ｈＹはツ与Ｃに含まれており、かつ；ノＶＧＭＥＤＡ減 衰点は欠失されており、それによってＬ−イソロイシンの調節されていない合成 のためのバイオジェネティック・カセットを生み出す。

次に、バイオジエネティック・カセットを組み込むに際して必要な特定的なステ ップを詳細に議論する。

Ａ、アロステリック調節の除去 フィードバック−抵抗性酵素についての遺伝子は、自然突然変異生成した微生物 または誘発突然変異生成した微生物のいずれかから得られたものでよい。突然変 異は、たとえば、Ｘ線もしくは紫外線照射のようなイオン照射や、亜硝酸、ヒド ロキシアミン、硫酸化エチルメタンおよびＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニト ロソグアニジン等のような化学突然変異原などを用いることにより誘発される。

スレオニンデアミナーゼ上におけるＬ−イソロイシンによるフィードバック抑制 に対する抵抗を与える　ＣｋＡ遺伝子における突然変異は、スレオニンデアミゾ アミナーゼの通常の細胞内濃度よりも高い濃度を示すことにより初めから同定さ れた自然突然変異である。この突然変異菌株のさらに他の特徴は、突然変異が６ ノ？／−Ａ遺伝子中に位置しており、かつこの菌株ｋＡ遺伝子の生成物すなわち スレオニンデアミナーゼがＬ−イソロイシンによる抑制に強い抵抗性を示すこと である。（カルホン、ディ、エイチ、クスキー、ジェイ、ニスおよびハトフィー ルド、ジー、ダブリュ、違の／、　ｊ４０Ｚ、Ｃｈｍｍ・第２５０巻第１２７頁 〜第１３１頁（１９７４））。

Ｂ、減衰点の配列順序および他の転写調節サイトの除去減衰点の配列順序は、２ つの可能な方法により除去され得る。第１の、プロモータ領域の短いセグメント が、特異的な制限エンドヌクレアーゼ断片として分離され、かつ減衰点が除去さ れていなかったら転写開始機能を保持する断片を再構成するように再結紮される 。代わりに、この減衰点の配列順序は、アール、ビー、ワレス達のＳｃ　Ｌ　ｅ ｎｃｅ第２０９巻１３９６頁〜１４００頁（１９８０）に記載されているように 位置の方向づけられた突然変異生成により除去されてもよい。この方法では、減 衰点領域を含むＤＮＡ断片が一本鎖のバクテリオファージＭ１３の複製にクロー ン化される。欠失されるべき減衰点位置の側方の約７個の塩基に相捕的な配列順 序を有する合成オリゴヌクレオチドが、１本鎖のファージＤＮＡに交雑され、か つこの１本鎖の環状ＤＮＡの鋳型上におけるＤＮＡの合成を導くためのプライマ ーとして用いられる。この合成オリゴヌクレオチドは、それによって新たに合成 された環状ＤＮＡ分子に合体され、中間に存在する減衰点記列順序が、ヘテロ２ 本鎖ＤＮＡ分子の新たに合成された鎖内で除去される。ＤＮＡの複製が後で行な われるＥ、ｃｏｌｉ内への形質転換は、このへテロ２本鎖を、突然変異体（減衰 点が欠失されたもの）および親のＤＮＡの配列順序に分解する。突然変異を合成 するのに用いられる合成オリゴヌクレオチドは、減衰点の配列順序の欠失を含む クローンに対してスクリーニングするための陽性または陰性の交雑分析のいずれ かにおいて用いることも可能である。

Ｃ０染色体順序でのオペロンおよび遺伝子の組立て遺伝子をバイオジエネティッ ク・カセット内に組み込むのに用いられる技術は、古典的な遺伝子工学技術であ り、適当な制限エンドヌクレアーゼおよびリガーゼならびにクローニング・ベク タを用いる。このクローニング・ベクタ内へ特定的な順序で遺伝子を組み込む方 法は、遺伝子内およびクローニング・ベクタ内の独特の制限位置に依存してクロ ーン化されるべき各組の遺伝子において独特であり、たとえば、クローニング・ ベクタｐＢＲ３２２内にＬ−インロイシンのバイオジェネティックーカセットの 遺伝子を組み込むために２つの方法が、第２Ａ図および第２Ｂ図ならびに第３図 において表わされており、かつセクションＥにおいて詳細に述べられる。

Ｌ−インロイシンのバイオジエネティック・カセットの場合には、ｔノＰＧＭＥ ＤＡおよびｔノ？／−ＹＣオペロンの自然の染色体順序に正確に再構成する必要 がある。これは、ｔ／！？ＧＭＥＤＡオペロンの末端の遺伝子の表現すなわちｊ ｋ　Ａは、自動調節されたＪｐＹ遺伝子からの転写に抗するように調節され得る ことによるものである。この調節は、Ｌ−イソロイシン−し−バリン生合成経路 を介してアルファーケトーブチラーテおよび無性ブドウ酸塩からの炭素の流れを 調整す、るために必要であろう。

Ｄ、プロモータの配列順序の導入 当然のことながら、様々な生体が、様々なプロモータの配列順序を認知する。こ の発明によれば、所望の調節されていないバイオジエネティツク・カセットが組 立てられた場合に、Ｅ、ｃｏｌｔプロモータの配列順序を容易に除去し、かつ様 々な宿主バクテリアまたは酵母のための適当な様々な新規なプロモータの配列順 序をベクタ内の独特の位置にバイオジェネティック・カセット上に導入し、かつ このバイオジェネティック拳カセットを様々なりローニング・ベクタに導入する 手段が提供される。たとえば、Ｌ−イソロイシンカセットの場合には、新しいプ ロモータが、ベクタｐＵｃ１９のポリリンカー（ｐｏｌｙｌｌｎｋｅｒ）領域か らｐＡＢｃ１１５の構造の間で得られるＢａｍｈｉサイトを介して導入されても よく、この領域は転写減衰点の欠失が生じた位置に位置決めされる。プラスミド 内のこのＢａｍＨＩ位置は、たとえば第１表に記載したものや例示し得ないほど 多くの他のもののような様々な適当な宿主バクテリアまたは酵母プロモータ配列 順序のいずれかを挿入するのに有用である。

（以下余白） 第１表 宿主バクテリアまたは 酵母　プロモータ　文献 コリネバクテリウム　コリネバクテリオ　ツェテン、アール、ケシブチリアス　 ベータトキシン遺伝子　１．　（１９８Ｂ）（１２どｔｐ乙ＪｂＡｓ／ｍ）　１ 　５６．　６８０　６８コリネバクチリオファ　ウェルコス、ニス、エージ　ル およびホルムズ、ア ベータ構成トキシン遺　−ル、ケイ、の伝子　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、（１ （たとえば乙χ−２’４）　９８１）３７，９４６コリネバクチリオファ　マイ ケル、ジエイ、エージ　ル達の ガンマｃトキシン遺伝　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ　（１９子　８２）４２，５１０− バシルス・サブティリス　胞子形成遺伝子　ニドキン、エム９．ディＣ＆ｃＪ！ Ｉ’＜ｔｓ　５ＪｔＪｔ、ｓ）　−違のＪ、Ｇｅｎ。

ｓｐｏ　ＩＩＡ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

（１９８５）１３１゜ ｄｎａＥ遺伝子　ワングツエル、エフ達の Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ 中、（１９８５） ２６０．３３６８−３ アスパートキナーゼ　ボンダリク、アール。

１１遺伝子　ピーおよびパウルス。

エイチの Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ ｍ、（１９８５） ２６０．５８５−５９ サブチリシンＥ遺伝子　ワング、ニス、・エル違のＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ ＳＡ　（１９８４）８１゜ ｒｒｎＢオペロン　スチワード、ジー、シーおよびポット、ケイ 、エフの Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、（１９８３） １１．６２８９−６３ アルファアミラーゼ遺　ヤマザキ、エイチ達の伝子　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉ。

（ａｍｙＲ２，’ａｍｙＥ）３２７−３３７グルタミンアミドトラ　マ力ロフ、 シー、エインスフエラーゼ遺伝子　達の Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ ｍ、２５８　１０５８ バシルス・リセニフォー　ｅｒｍＤ遺伝子　グリザン、ティー達のニス　Ｍｏ１ ．９ｅｎ、Ｇｅ 胞子形成遺伝子　ラマクリシニナ、エヌ違の Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、（１９８４） １２．１７７９−１７ ＰｅｎＰ遺伝子　マクロ−リン、ジェイ、アールの Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、　−（１９８２） １０．３９０５−３９ バシルス・スリ　結晶蛋白質遺伝子　ウォング、エイチ、シブセドモナス・ニス ・　カルボキシペブチダー　ミントスエヌ、ピービー　ゼ　達の ハンセヌラ　メタノールオキシダ　レゾボーエル、エイ、工ジヒドロキシアセト ン　ヤノヴイッッ、ゼット・シンターゼ遺伝子　、エイ達の Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、（１９８５） １３．１０４３−３０ サツ力口マイセス−セレ　ＧＡＬＩ−ＧＡＬｌｏ　ジョンストン、エムおビシア ス　遺伝子ｐｒｏｍｏｔｅ　よびディビス、アール（１９８４）４．１４ Ｈｌｓ：３　ストラール、ケイの 遺伝子プロモータ　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１゜Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ・ ＳＡ　（１９８２）７９゜ Ｈｌｓ４　ドナヒニー、ティー。

遺伝子プロモータ　エフ達の 、　Ｃｅ１ｌ　（１９８３） ３２、８９−９８ ＴＲＰ５　ザルキン、エイチおよ 遺伝子プロモータ　びヤノフスキー、シー、ジェイ Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

（１９８２）２５７゜ サツカロマイセス・ボム　ＣＹＣｃ　ラッセル、ビー、ア−ズ　ル ＡＤＨラッセル、ビー、アー ル 遺伝子プロモータ　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８３）３０１，１６７− （以下余白） たとえば、生体２、ンセヌラ・ポリモルファ（ＨａｎｓｇｎｕＬａｐｏＬｙｍｏ ｒｐｎａ　）を用いる場合には、プロモータの配列順序は、この生体のメタノー ル　オキシダーゼ遺伝子の配列順序が有利であるかもしれない： 他の例として、たとえば大腸菌（ＥａａｈａｒＺａｔａ　ｔｓｏＬｔ　）につい ては、　ｉＡ−ｃＭＥｐＡオペロンのυ？＞ｐ、ｐ。

プロモータの配列順序が有利に用いられ得る：同様に、′Ｍ１表に掲げたこの遺 伝子のプロモータの配列順序のいずれもが、それらが特定的にふされしい宿主生 体内のバイオジェネティック・カセットの遺伝子を表現するために有利に用いら れるであろう。

この発明のための宿主生体として用いられ得る他の微生物は、クロストリジウム ・ニス・ビー（ＣＺｏａｔｒｔｄｔｕｎｔ　ｍｐ。

）、セラッティアーエス・ビー（Ｓｇｒｒａｔｔａ　ｇｐ、）　Ｓエンテロバク タ−争ニス・ビー（Ｅｎｔａｒｏｂａａｔ＃Ｆａｐ、）、サルモネラ−ニス会ビ ー（！；ａＬｍｏｎａＬＬａ　ｍｐ、　）　、クードスブセドーモナスーエス・ ビー（Ｒｈｏｄｏｐａａｕｄｏｍｏｎａａａｐ−＞　［および他の光合成バクテ リア性種］、キサンタモナス・ニス・ビー（Ｘａｎｔｈａｎｓｏｎａｍ　ｇｐ、 　）ならびニ様々なメチルオトロピックバクテリア種などのようなバクテリアと 、キャンディダ・ニス・ビー（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｐ。

）、他のサッカｏｖイセスφニス拳ピー（ＳａｅａｈａＦｏｍｙｔｓａｍ叶、） 、ハンセヌラφニス・ビー（ｌａｎｍａｎｕＬａ　ａｐ、　）、ムコア・ニス会 ビー（ｌ１ｕｃ６Ｆ　ａｐ−）　（および他のフィラメント状真菌類）などのよ うな酵母とを含む。

のみならず；今や、植物細胞および動物細胞内への、ならびにたとえ成熟した植 物および動物ガに対してであっても、外部の遺伝子を導入しかつ発現させるため の十分な情報が入手可能であるため、この発明の技術をこれらの系内ヘバイオジ ェネティック・カセットを挿入するために用いることができる。

Ｅ、クローニング・ベクタの選択 バイオジエネティック・カセットを構成するためのクローニング・ベクタとして 適切な様々なプラスミドは、与えられた宿主生物のＤＮＡ複製メカニズムに適合 するような能力によって基本的に様々な宿主生物への適合性を存する。

結果、与えられた宿主生物内において、バイオジェネティック争カセットの遺伝 子の構成および発現のためにＤＮＡベクタを選択する場合において、その宿主生 物内で複製し得るベクタを選択することが必要である。また、これらのＤＮＡベ クタは、増殖し、かつバイオジェネティック・カセットを維持するためには、宿 主生物の成長および生理学的な特性と適合し得る、抗生物的抵抗または他の表現 型的に選択し得る遺伝子をも含む。多数の適切なプラスミドが公知であり、容易 に入手可能である。いずれかの特定の生物に対して、どのプラスミドが最も適切 であるかということを当業者は理解するであろう。

Ｆ、他の考慮事項 バイオジエネティック・カセットの高レベルの表現のための有効な転写の誘起な らびに遺伝子の増殖に加えて、細胞性転写装置の経済的な使用は、メツセンジャ ーＲＮＡの適切かつ有効な翻訳に必要な配列順序のみを転写することによる。す なわち、適切な転写終結、メツセンジャーＲＮＡの処理ならびにメツセンジャー ＲＮＡ翻訳信号が、バイオジエネティック・カセット内に組み込まれなければな らず、かつこれの信号は宿主生物の代謝メカニズムと適合性を有するものでなけ ればならない。のみならず、複製の源を介した転写がプラスミドの複製を相殺す るので、転写終結は高複写数のプラスミドを維持するのに重要な要素であること が示された（アダニスおよびハートフィールドのジャーナルオブバイオロジカル ケミストリー（Ｊ、Ｂ　ｉ　ｏ　１゜Ｃｈｅｍ、第２５９巻、第７３９９〜第７ ４０３頁（１９８４））。これらの信号および適切な利用法の例が述べら結信号 は十分に明確にされている。６またはそれ以上のＴＳが後に続＜Ｇ＋Ｃに富んだ 反転された繰返しを含むＤＮＡ配列順序が、有効な転写終結点であることが知ら れている。これに続く例では、ｔノ？ＧＭＥＤＡ転写減衰点の十分に特徴づけら れた終結点が用いられるであろう。他の十分に特徴づけられた有効な転写終結点 もまた用いられ得るであろう。酵母中の転写終結点も十分に理解されている。

この場合には、転写終結点は、終結されたｍＲＮＡ転写体のポリアデニレイシジ ン（ｐｏ　１　ｙａｄｅｎｙ　１　ａ　ｔ　ｉ　。

ｎ）に結合される。有効な酵母の転写終結点の例は、サツカロマイセス争セレビ セア（ＳａａａｈａＦｏｍｙａｇｚ　ａｇｐｇｕｔｓｇａ　）のＣＹＣ１遺伝子 座のそれである（ザレットおよびシャーナンのＣｅ１ｌ、第２８巻、第５６３頁 〜第５７３頁（１９８２））。より高度の成熟核生物では、転写終結のメカニズ ムは十分には理解されていない。しかしながら、ハートフィールド達の　Ｎｏｔ 、　ＣａＺＺ、　Ｍｉｏｔ。

第３巻、第１６８７頁〜第１６９３頁（１９８３））によるｌｙ　−Ｌｐｉｔｐ ｏ　の研究は、バクテリオファージ　ラムダ４Ｓ終結点が、成熟核ＲＮＡポリメ ラーゼ■により認知されるＤＮＡ配列順序と、構造遺伝子を複写するポリメラー ゼとを含むことを示した。

メツセンジャーＲＮＡの処理、現状の明白な事実は、成熟生物内の成熟核メツセ ンジャーＲＮＡのポリアゾニレ−ジョンが、メツセージ安定性に重要であり、か つ核から細胞質へのｍＲＮＡの転移にとって重要であることが示唆されている。

ボリアデニシーシジンのための信号、近傍の特徴的でない側方の配列順序を伴う ＡＡＴＡＡＡが、多くの成熟核遺伝子について示されてきた。これらの配列順序 は、アミノ酸フード領域のすぐ下流側にある構造遺伝子内に見では、シャイン、 ジェイおよびダルガーノ、エル（Ｎａｔｕｒｅ第２５４巻第３４頁〜第３８頁（ １９７５））ならびに他の多くの研究者達により、１６ＳリポソームＲＮＡの３ ′一端に相補的な配列順序が、ｍＲＮＡ上の翻訳開始コドンに先立つ約９〜１７ ヌクレオチドに位置決めされていることが示されている。Ｊｖ−Ｇ　Ｍ　Ｅ　Ｄ 　Ａオペロンのリーダポリペプチドのための十分に特徴づけられた翻訳開始配列 順序が、以下の例において用いられるであろう。他のの十分に明確にされた翻訳 開始配列順序も用いることができるであろう。翻訳開始は、成熟核においては十 分には理解されていないが、一般的な規則として、翻訳は第１番目の開始コドン で始まると思われる（コザツクのＭｉｃｒｏ。

Ｒｅｖ、第４７巻第１頁〜第４５頁（１９８５））。

上述した一般的かつ特異的な多数の検討事項に加えて、発現メカニズムは生体に よって変わることを認識しなければならない。多くのメカニズムは、この点→こ おいて解明されてきた。多数の付加的なメカニズムは、研究を継続するテーマで あり、将来においてより詳細に理解されるであろう。もちろん、当業者であれば 、バイオジエネテイツク・カセットの発現が所望され得る多数の生物のいずれか において、この発明のバイオジエネテイツク参カセットの発現を得るために、ど のＤＮＡ配列順序が必要であるかを理解するであろう。

前述した方法およびここにおいて議論するステップを用いることにより、この発 明が、広範な天然のおよび変更された生物学的生成物の双方の生産および／また は利用のための生物学的経路、代謝経路および異化作用経路に適用され得る。こ れらのステップの応用性は特定の正式の生合成もしくは異化作用経路に限定され るものではない。なぜならば、含まれている調節メカニズムおよび遺伝子は、非 常に広い範囲の天然の系に関連し、応用可能だからである。

したがって、次の実施例は、限定的なものではなく、むしろパイオシ、エネティ 、ツク・カセットが構成され得る経路の多様性を例示するものである。今や、こ の発明は、いくつかの生合成および異化作用経路の関係においてより詳細に説明 されるであろう。議論してきたように、アミノ酸の生合成に含まれる多数の調節 メカニズムが存在する。多分、調節の観点からは、最も複雑な経路は、Ｌ−イソ ロイシンについてのものである。

ここにおいて、我々は、遺伝子光学技術により除去された　コノγＧＭＤＡ転写 減衰点を有することと、突然変異のためにその生成物（スレオニンデアミナーゼ ）がＬ−イソロイシンによる最終生成物抑制に抵抗性を有する遺伝子により置き 換えられた野生の型のｔ／Ａ−Ａ遺伝子を有すること等を除いては、天然の染色 体の配向におけるＬ−インロイシン（Ｄ）ｖＧＭＥＤＡ、＝Ａ−ｙｃ）　の生合 成の必要なすべての遺伝子を含むバイオジェネティック・カセットの構成を述べ る。Ｌ−イソロイシンの生合成に必要なすべての遺伝子は、適当なりＮＡベクタ 内の適当な染色体制限エンドヌクレアーゼ断片の分離により大腸菌のＤＮＡ染色 体から得られる。この実施例において引き続き行なわれる２種の代替クローニン グ方法が、第２Ａ図および第２Ｂ図ならびに第３図において表わされている。

２ノｚｓｐｅａＧ−ＭＥ’　（ｐはプロモータ、ｅはリーグ、ａは転写減衰点） を含む４．７キロベース（Ｋｂ）のＨ１ｎｄｍ断片が、プラスミドｐＢＲ３２２ のＨｉｎｄＩＩＩ位置にクローン化されてプラスミドｐＡＢＣ５を与える。プラ スミドｐＡＢＣ５が、ローサ違のＮｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓＲｅｓ第１ｄｓＲｅｓ９ 頁〜第２３０１頁（１９７９）による文献に述べられており、そこでは指定のｐ ＲＬ５が与えられている。このプラスミドの調整が、この論文において詳細に述 べられている。２ノ’、’ＥＤＡＹ’を含む４゜８ＫｂのＨｉｎｄＩＩ［−Ｂｇ ｌｌ［断片が、ＡＢＯ３のＨＬｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を置き換えるのに用 いられ、ｐＡＢＣ５５が与えられる（ｔ〕７７−　ｐｅａＧ−ＭＥＤＡＹ’　− ９゜５Ｋｂ）。活性のｔノｖ−Ｇ遺伝子が、Ｌ−バリン抵抗性の大腸菌に１２菌 株内のいくつかの世代についてｐＡＢＣ５を成長させることにより細胞内遺伝子 組換えにより得られてｐＡＢｃｌを与える（　１ｌｌｆ　ｐ　ｅ　ａＧ”　ＭＥ ’　）。

このプラスミドｐＡＢｃ１は、ローサーの　Ｐｒｏｅ　、−ＩａｔＬ、　Ａａａ ｄ、　Ｓａｔ、　Ｅｌ！；Ａ　第７８巻、第９２２頁〜第９２５頁（１９８１） により述べられている。そこでは、これはｐＲＬｌｏｌとして同定されている。

この論文は、ｐＲＬｌｏｌの調製について詳細に述べている。

プラスミドｐＡＢＣ５５は、寄託番号６７．２２８の下にブダペスト条約の寄託 に基づくメリーランド州ロックビーレンのアメリカンタイプ・カルチャ・コレク シジン（ＡＴＣＣ）により保管されており、かつプラスミドｐＡＢＣ１は、寄託 番号６７．２３０の下にブダペスト条約による寄託に基きＡＴＣＣに保管されて いる。

ｐＡＢｃｌからのＳｍａｌ−ＨｉｎｄＩ［Ｉが、バタテリオファージｍｐ１８の 複製のＳｍａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ位置に挿入されて交雑型のｍ　Ａ　Ｂ　Ｃ１０ ２を与える。転写減衰点の３２個の塩基が、アール・ビー・ワレス違（サイエン ス、第２０９巻、第１３９６頁〜１４００頁（１９８０））のオリゴヌクレオチ ド位置の方向づけられた欠失によりｍＡＢＣ１０２から切り取られ、ｍＡＢｃ１ ０２ｄを与える。

ＪＶプロモータの転写減衰点を削除する代わりの方法では、３８４ｂｐ　Ｓａｕ ｍＡ−Ｔａｑｌ断片がｐＡＢＣ５５から分離され、大腸菌ＤＮＡ）リメラーゼの フレナラ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片とともに充填され、ベクタｐＵＣ１９のＳｍａ　 Ｉ位置内にクロン化されてｐＪＧＬＰＩＰｚを形成する。次に、転写減衰黒領域 のすぐ下流から　ｊｌＰＧの近い方の部分に延びる５ｏｏｂｐのＭｎ１ｌ−Ｓｐ ｈｌ断片が、ｐＡＢｃｌから分離され、かっＨｉｎｃＩＩ−３ｐｈＩで消化され たｐＪＧＬＰ、Ｐ２にクロン化されてｐＰＩＰ２ａｔｔ、を形成する。この構造 は、セクションＤの上の所で述べるように、Ｐ、Ｐ２プロモータ間のｐＵｃ１９ のポリリンカーからのＢａｍｈ１位置と、代わりのプロモータを挿入するのに用 いるｊｌ’ａｒｃ遺伝子の開始部分との合体をもたらす。

Ｌ−イソロイシンによるフィードバック抑制に対する抵抗性をもたらすスレオニ ンデアミナーゼにおける自然突然変異を含む大腸菌に１２菌株（Ｃｕ２Ｓ）がら 分離されたＸｈｏａｌ断片（大腸菌の染色体上の約８４ｍ１　ｎ、に位置する４ 、４Ｋｂの断片）が、［カルホン、デ仁エイチ。

クスカ、ジエイ、ニスおよびハートフィールド、ジー、ダブり二のＪ、Ｂ１１ｏ 、Ｃｈｅｍ、第２５０巻第１２７頁〜第１３１頁（１９７４）］　、スレオニン デアミナーゼ遺伝子１１ｖ−ＡがＡｃ−プロモータから転写されてｐＡＢＣｌｏ ｌ　にＡ−Ａ’　ＹＣ）を与えるような配向でｐＩｃ１９Ｒの独特のＸｈｏＩ位 置（マーシュ、ジェイ、エル違のＧｅｎｅ、第３２巻、第４８１頁〜第４８５頁 （１９８４））に挿入される。（Ｃｕ２Ｓは、寄託番号５３．５４９の下にブダ ペスト条約に基づきＡＴＣＣにより保管されている。

）このクローンが選択され、かっスミス達のＭｏＬ、　Ｇａｎ。

Ｇａｎｇｔ−１第１６９巻、第２２９頁〜第３１４頁（１９７９）に記載されて いる　２Ｊ！ｐ八−大腸菌菌株ＣＵ６２３に対する相補性によって分離される。

代わりに、その上に　ｄｖ−Ａにおけるフィードバック抵抗性突然変異が含まれ るＣｕ２Ｓからのいずれかの断片を、いずれかの従来のベクタ内に結紮し、プラ スミドのサイジングおよび制限酵素分析により分離し得るであろう。たとえば成 る代替法は、Ｃｕ２Ｓの３．９Ｋｂの５ａｌＩ−ＸｈｏＩ断片、をＳａｌ、Ｉ− ＸｈｏＩＩで消化されたｐｌｃ１９ｋにクローン化してｐＡＢｃ１０２を形成す ることである。

構成：別法１： 大腸菌のためのＬ−イソロイシンを生成するカセットは、第２Ａ図および第２Ｂ 図に現わされているように、下記のステップに基づいて組立てられる： １、　Ｓｍａｌ−ＨｉｎｄｍのＤＮＡ断片が、ｐＡＢＣ５から分離されて、ｐＢ Ｒ３２２のＰｖｕｌＩ−Ｈｉｎｄ■位置に結紮されてｐＡＢｃｌｏＢを与え、こ のｐＡＢＣ１０３はプラスミドの大きさおよび制限分析によりスクリーニングさ れかつ分離される（ＰｂｕｌＩ位置およびＳｍａＩは犠牲にされる）。

２、　ｐＡＢｃｌｏＢの結果として得られる１本鎖のＰｖｕｎ断片は、ｍＡＢｃ １０２ｄからのＰｖｕＩＩ断片で置き換えられてｐＡＢｃ１０４を与える。この クローンは、バエズ違のＭａｇｍａ、Ｇａｎ、　Ｇｇｎｇｔ、・第１６９巻・第 ２８９〜２９７頁（１９７９）により述べられているＡＨＡＳ−大腸菌菌株ＣＵ ３８８への相補性により選択される。

３、ｐＡＢＣ５５の５ａｌＩ断片が、ｐＡＢｃ１０４のＳａｌ１位置に挿入され てｐＡＢｃ１０５を与える。ｐＡＢＣ１０５は、スミス違の　ＭｏＬ、にｇｎ、 にｇｎｔｘｔ、　、第１４８巻、第１１１頁〜第１２４頁（１９７６）に述べら れている大腸菌ｉ１ｐ　Ｄ−または６ノ？Ｅ−菌株ＣＵ６２４またはスミス違の 　Ｍａｃ、　に４１ｎ、　Ｇｇｎａｔ、　第１６　ｇ巻、第２９９頁〜第３１４ 頁（１９７９）に述べらているＣＵ６９２への相補性により選択される。

４、ｐＡＢｃｌｏｌからのＸｈｏｌ断片がｐＡＢｃ１０５のＸｈｏＩ位置に結紮 さｔしてｐＡＢＣ１０６（（τｔｊｐｅ’ａｄＧ”ＭＥＤＡ’Ｙｃ　）を与エル 。

５、このカセットは、プラスミドのＥｃｏＲＵによる部分的な消化を行ない、続 いてこの位置に８塩基のＢａｍＨＩリンカ−を挿入することにより、欠失された 転写減衰点領域にリンカ−を配置することにより「モビール」とされる。また、 ＢａｍＨＩリンカ−は、部分的な消化によりオペロンに対して外部のＸｈｏ１位 置に挿入される。これらは、ｐＡＢｃ１０６内のＢａｍＨＩ位置だけである。上 流側のＢａｍＨ１位置も、新規なまたは公知のプロモータの配列順序の挿入に用 いられる。

代替の構成おいては、このカセットは第３図に現わされているように組立てられ 得る。すなわち、１、　３．ＯＫｂの５ａｌＩ断片がｐＡＢＣ５５から分離され 、５ａｌＩが消化されたｐＡＢｃｌに結紮される。

この５ａｌＩの消化されたｐＡＢｃｌは、制限酵素分析により適当な配向で５ａ ｌＩ断片の挿入のためにスクリーニングされてｐＡＢｃｌｌｌを与える。

２、ｐＰ、Ｐ２ａｔｔからの１．２ＫｂのＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩ転写減衰点減衰 失されたプロモータ断片が、ＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩＩが消化されたｐＡＢｃｌ　 １１にクローン化されｐＡＢｃ１１４を形成し、このｐＡＢｃ１１４の統合性は 、分析的な、制限酵素分析により確認される。

３、ｐＡＢｃ１０２からの３．９Ｋｂの５ａｌＩ−ＸｈｏＩ断片が部分的に５ａ ｌＩが消化されたｐＡＢｃ１１４にクロン化されてｐＡＢｃ１１５が与えられ、 この同一性は、制限酵素分析により確認される。

４、　ＢａｍＨＩリンカーが、このカセットを「モビール化」するために、ｉ、 ｅｖ−Ｙ　Ｃに離れた独特のＸｍａｍ位置に加えられる。このことは、前者の転 写減衰点領域にＢａｍＨＩ位置を与え、オペロンの末端の挿入−ベクタ接合に他 方を与える。

今や、完成された。カセットが、大腸菌または他の適当な生物において発現され 得る。Ｌ−バリンと組合わされる過剰のＬ−イソロイシンを生じる突然変異生物 と異なり、このバイオジェネティック・カセット内で用いられる経路における技 分かれ点に右ける（ＡＨＡＳ）イソ酵素選択性は、Ｌ−イソロイシンに関して生 成されたし一バリンの量を大きく低減し、それによって生成方法を用意とし、か つコストを低減する。この経路の遺伝子のいずれかを、さらに突然変異させてＬ −イソロイシン基質の選択性を高めることができるであろう。

実施例■：Ｌ−バリン用バイオジェネティック・カセット−バリンの生合成にお ける第１のステップが２個の照性ブドウ酸塩分子の縮合を含み、これに対してＬ −イソロイシンの生合成における連続的なステップは、１分子の焼成ブドウ酸塩 の１分子のアルファーケトブチラーテとの縮合を含むという点において、Ｌ−バ リンの生合成もしくは代謝経路は、Ｌ−イソロイシンの経路と異なる。この酵素 的なステップは、大腸菌内において、３個のイソ酵素すなわちＡＨＡＳＩ　（ｊ ）’２／”ＢＮ）　、ＡＨＡＳＩｆ　（；、／ｒＧＭ）、ＡＨＡＳＩ［Ｉ　に、 Ａ’ＨＩ）により触媒化される。これらのイソ酵素のうち、ＡＨＡＳｎはＬ−イ ソロイシンの合成に有利であり、ＡＨＡＳ　ＩはＬ−バリンの合成に有利である 。したがって、Ｌ−バリンのバイオジェネティック・カセットは、じノ’？／− ＧＭ遺伝子の代わりに２ノ’ｒ　Ｂ　Ｎ遺伝子を含む。ｈＧＭ遺伝子の活性を除 去するために、転写性の極性を避けるために、ｐＡＢｃ１０６またはｐＡＢＣ１ １５が、ｔ；、１ｗ　ｃ内の独特の５ｐｈＩ位置において消化され、かつＢａ１ ３１の消化により欠失されて再結紮される。正しく欠失されたこのプラスミドは 、プラスミドの大きさおよび組替えクローンの制限酵素分析により直接的に同定 されて、ｐＡＢｃ１０８を生み出す。

２ノｖ−ＢＮ遺伝子は、次の方法により、ｐＡＢｃ１０８のオペロンの末端のＢ ａｍＨＩ位置に挿入される。　（ソｒＢＮの転写減衰点が、Ｌ−イソロイシンバ イオジェネティック・カセットについて述べたように、バクテリオファージｍｐ ｌａ内へのｊｌｗ　ＢＨのサブクローニング５に位置の方向づけられたオリゴヌ クレオチド突然変異生成またはプロモータ領域の適当な制限断片再構成により、 ｐＣＨ４から欠失される。プラスミドｐＣＨ４は、ベック６アール。

、ホイザー、シー、エイ、およびハートフィールド、ジー。

ダブｙ　ユ、　ｇ）　Ｎｕｔｓ’、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ１１ｍ＠　第１３巻、第３ ９９５頁〜第４０１０頁（１９８５）により述べられており、かつ寄託番号６７ ．２！９の下にＡＴＣＣによりブダペスト条約に基づく寄託がなされている。こ れに、大腸菌菌株ＭＦ２３２４　（サトン違のＪ、Ｂａｃｔ、第１４８巻、′１ ｓ９９８〜１００１頁（１９８１））からのＬ−バリン抵抗性；ｉ！ｆＢ　Ｎオ ペロンか・らの１７１３ｂｐＮａｅ　ｌ−８ＡＣＩ断片がクロ゛ン化される。

次に、Ｊｗａ”Ｂ’　Ｍを含む（その上にＢａｍＨＩリンカ−が結紮されている ）２．４ＫＢのＲｓａｌ−Ｂｃｌ末端のＢａｍＨＩ位置シに挿入されてｐＡＢｃ １０９を形成する。

このｐＡＢｃ１０９プラスミドは、ＡＨＡＳ″″大腸菌菌株、ＣＵ３８８に対す る相補性により、または直接的な大きさおよび制限分析により、選択される。末 端のＢａｍＨ１位置が上述の構造において犠牲にされるので、Ｌ−バリン用のカ セットは、すべての遺伝子が２個の独特のＢａｍＨ１位置に結合される乏いうこ とにより可動性である。

実施例■：大腸菌によりメタノールを利用するためのバ大腸菌の細胞成分へメタ ノールの同化のための中間段階の鍵として、ジヒドロキシアセトンを含む経路が 、この生物へのメタノールを利用する交互のメタノールオキシダーゼ（ＭＯＸ） およびジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＨＡＳ）を含むバイオジエネティッ ク・カセットの導入により確立されている。好ましいメタノール利用酵母、Ｈａ ｎａｇｎｕＬαｐｏＬｙｎｓｏｒｐｈａ　、アメリカン・タイプ・カルチャーψ コレクションのカタログ番号３４４３８は、メタノールをホルムアルデヒドに変 換するメタノールオキシダーゼ酵素（ＭＯＸ）を生成する。次に、このホルムア ルデヒドは、ジヒドロキシアセトンシンターゼ酵素（ＤＨＡＳ）により、キシロ ース（ｘｙｕｌｏｓｅ）　５−リン酸塩をジヒドロキシアセトンおよびグリセル アルデヒド−３−リン酸塩に変換するのに用いられる。この生成物は、次に、解 糖作用経路に入り、かつ細胞性の代謝において用いられる。この実施例において 用いられるクローニング方法は、第４Ａ図および第４Ｂ図において図解的に現わ されている。

ＭＯＸカセットの組立てのためのクローンの構成ＭＯＸ遺伝子が、ゲノム性ＤＮ Ａの２，９ＫｂのＰｖｕｎ−Ｘｂａｌ断片として分離され、かつＳｍａｌ−Ｘｂ ａＩが消化されたｐＵｃ１８に結紮され、ｐ　Ａ　Ｂ、　Ｃ２Ｑ　１を与え、こ れの同一性は、制限酵素分析ならびに遺伝子の５′部分のＤＮＡ配列順序分析に より確認される。この遺伝子の３′の翻訳されていない領域は、Ｈｉｎｄｍによ りｐＡＢＣ２０１を消化し、Ｂａ１３１により消化を制限し、Ｈｉｎｄｍリンカ −を加え、５７５ｂｐのＢｓｔＥＩ［−ＨｌｎｄＩＩＩのフラクシヨンをｐＡＢ ｃ２０１からのＢｓ　ｔＥＩＩ−Ｈｉｎｄｍの４．５Ｋｂ断片にクローニングす ることにより欠失される。多数のクローンが、制限酵素分析により同定され、こ れらのうちのＭＯＸ遺伝子の３′部分のＤＮＡ配列順序が、Ｂａ１３１の欠失の 終点を決定するために得られる。これらのうちの１つ、ｐＡＢｃ２１０、これは ＵＡＡ終結コドンから下流側の６ｂｐで終了するものであるが、これは次の操作 のために用いられる。

５′の翻訳されていない領域を欠失するために、ｐＡＢＣ２１０からの１９９４ ｂｐＢａ　Ｉ　ｌ−Ｈｌ　ｎｄｍ断片を、Ｓｍａｌ−ＨｉｎｄＩＩＩ　ｐＵｃ１ ８に結紮させ、４．５Ｋｂの線形の結紮生成物を分離し、かつ配列順序ＣＣＡＴ ＡＴＧＧを有する合成Ｎｄｅｌリンカ−の存在の下に結紮を続ける。この方法で は、ＭＯＸをコードする領域の５′の４個のヌクレオチド、これらはＢａ１ｌの 消化により欠失されており、かつ翻訳に必要な開始メチオニンコドンＡＵＧを含 むものであるが、これらのヌクオチドは合成オリゴマー内のＡＴＧＧ配列順序に より再構成されている。制限酵素分析により同定されるいくつかの適当なりロー ンの１つ、すなわちｐＡＢｃ２１１は、次に、ＮｄｅＩにより部分的に消化され 、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのフレナラ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片により充填され 、かつＢａｍＨＩリンカ−により結紮される。２．ＯＫｂのＢａｍＨＩ−Ｈｉｎ ｄＩ［［断片が、次に分離され、かつＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄ■が消化されたｐＵ ｃ１８に結紮されてｐＡＢｃ２１２を与える。

このＤＨＡＳ遺伝子は、ゲノム性ＤＮＡの３．２ＫｂのＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄｍ 断片として分離され、ＢａｍＨＩ−Ｈｌｎｄｍの消化されたｐＵｃ１８内に挿入 され、この遺伝子の５′端の制限酵素分析およびＤＮＡ配列順序により同定され る。このクローンは、ｐＡＢｃ２０４と名付ケられる。５２１ＭのＡｌｕｌ断片 が分離され、ＢｇｌＩＩにより再消化され、３５８ｂｐのＢｇｌＩＩ−Ａｌｕｌ 断片がｐＡＢＣ２Ｑ４の５．４ＫｂのＢｇｌ、Ｉｆ−ＢａｍＨＩ内に挿入されて 戻され、このＢｇｌＩＩ−ＡＩＬ１１断片内において、ＢａｍＨ１位置が大腸菌 ＤＮＡポリメラーゼＩのフレナラ断片により充填されている。この方法では、Ｂ ａｍＨ１位置が、ＤＨＡＳ遺伝子の３′端に維持されている。

なぜならば、Ａｌｕｌ／ＢａｍＨＩ　（フレナラ）接合が、ＧＧＡＴＣＣ認知配 列順序全体を与えるからである。いくつかの適当なりローンが同定され、そのう ちの１つｐＡＢＣ２１４がさらに次の操作において用いられる。

このＤＨＡＳ遺伝子の５′の翻訳されていない領域を欠失するために、ｐＡＢｃ ２０４がＨｉｎｄｍにより消化され、Ｂａ１３１で消化を制限され、Ｈｉｎｄｍ リンカ−により結紮され、かつＢｓｔＥＩＩおよびＨｉｎｄｍにより消化される 。３８０ｂｐのＢｓｔＥＩＩ−Ｈｉｎ、ｄｍフラクションが分離され、かつｐＡ Ｂｃ２０４の４，７ＫｂのＨｉｎｄｍ−ＢｓｔＩＩ断片に結紮され、多数のクロ ーンが制限酵素分析により同定される。これらのクローンのうちの１つ、ｐＡＢ ｃ２１５におけるＢａ１３１の欠失が、位置−１において終結するためにＤＮＡ 配列順序分析により示されており、この位置−１では、ＡＴＧメチオニン開始コ ドンのＡが＋１として指定されている。このクローンからの３８０ｂｐのＨｌｎ ｄｍ−ＢｓｔＥＩ［断片がＢｓｔＥＩＩ−Ｈｉｎｄｍの消化されたｐＡＢＣ２１ ４に結紮されてｐＡＢ　Ｃ，２１６を与んる。

大腸菌におけるＭＯＸおよびＤＨＡＳの表現のために、大腸菌プロモータ、終結 点およびリポソーム結合位置が必要である。これらは、ε）かの転写減衰点領域 から得られる。この断片の終結点は、１４６ｐｂのＳ　ａ　ｕｌｌｌＡ−Ｈ１ｎ ｆＩ断片として得られ、大腸菌ｂｐＡポリメラーゼＩのフレナラ断片で充填され 、かつｐＵｃ１９のＨｉｎｃＩＩ位置にクローン化されてｐＡＢｃ２０７を形成 する。この配　゛列順序は、ポリリンカー内の位置からＢａｍＨＩ−Ｓｐｈ■の 消化されたｐＢＲ３２２にＢａｍＨＩ−Ｓｐｈｌ断片として移され’ｒｐＢＲを 形成する。プロモータおよびリボソーム結合位置が、フレナラにより充填された ＥｃｏＲ■４１５ｂｐ断片から得られ、かツｐ　Ｕ　Ｃ１９のＳａ１位置に結紮 されてｐＡＢｃ２０９を形成する。　ｔ、、／ＰリーダペプチドのＮＨ４−末端 アミノ酸残基を除去するために、ｐＡＢＣ２０９がＢａｍＨＩで消化され、Ｂａ １３１で処理され、ＢａｍＨＩリンカ−により結紮されかつＥｃｏＲｌおよびＢ ａｍＨＩにより消化される。４２０ｂｐのフラクションが分離され、ｐＢＲ３２ ２に結紮される。多数のクローンが制限酵素分析およびＤＮＡ配列順序分析によ り分離され、その１つ（ｐＡＢＣ２１９）は、ｔｌｒリーダのペプチドのメチオ ニンＡＴＧ開始コドンの上流側のＢａ１３１欠失端点４ｂ、ｐ、を有する。ｐＡ Ｂｃ２１９の４４０ｂｐのＥｃｏＲｌ−ＢａｍＨＩ断片が、Ｅ　ｃ　ｏＲｌ　− ＢａｍＨＩが消化されたＴｐＢＲにクローン化され、ｐＡＢＣ２２０を与え、こ こでは、独特のＢａｎＨ１位置がＰ。

Ｐ２および終結点の配列順序の間に存在する。

ＭＯＸバイオジエネティック・カセットの構成ＭＯＸおよびＤＨＡＳ遺伝子の翻 訳された部分は、Ｈｉｎｄｍが消化されたｐＡＢｃ２１２およびｐＡＢｃ２１６ を結紮し、ＢａｍＨＩによる結紮混合物を消化し、かつ４゜２ＫｂのＢａｍＨＩ 　ＭＯＸ−ＤＨＡＳ融合断片を分離することにより結合され、この融合断片は、 ｐＢＲＨｉｎｄＩＩ［ｄ（その内部にＨｉｎｄｍ位置が欠失されているｐＢＲ３ ２２）のＢａｍＨＩにクローン化されてｐＡＢｃ２１７を与える。

２）　ｐＡＢｃ２１９からの３０ｂ、ｐ、のフレナラで処理されたＴａｑＩ−Ｂ ａｍＨＩ断片上に含まれるリポソーム結合位置が、Ｈｉｎｄｍで消化されフレナ ラが充填されたｐＡＢｃ２１７にクローン化されて、ｐＡＢｃ２２１を与え、こ こではリポソーム結合位置の適当な配向がＤＮＡ配列順序分析により確認される 。

３）　ｐＡＢｃ２２１からのＢａｍＨＩの４．３ＫｂのＭＯＸ−ｒｂｓ−ＤＨＡ Ｓ断片が、ＢａｍＨＩの消化されたｐＡＢｃ２２０にクローン化されてｐＡＢｃ ２３０を形成する。

したがって、プロモータを完全に伴うメタノールを用いるオペロン、２個のリポ ソーム結合位置、メタノールを利用するのに必要な２個の構造遺伝子および転写 終結点が、このプラスミドｐＡＢ、ｃ２３０内に含まれており、大腸菌における これらの遺伝子の表現を容易にする。

ＭＯＸ遺伝子のだ・めのプロモータは、メタノールにより通常は正に調節され、 かつグルコースによる負に調節される。自然に発生するＭＯＸプロモータが　ｉ ｌｐ　ａ　Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ａプロモータにより置き換えられるので、すべての公知 の負の転写調節は、結果として得られるバイオジェネティック・カセットから除 去される。

実施例■：大腸菌に１２のＳＩＯオペロンのためのバイオジェネティック・カセ ット これまでの研究は、リポソーム性蛋白質Ｌ４が、それ自身のオペロンすなわち大 腸菌に１２の１１−遺伝子Ｓ１０オペロン（リンダール、エル、達のＣｅ１ｌ第 １ｌ巻第２４１頁〜第２４８頁（１９８３））の表現を特異的に抑制することを 示した。過剰のＬ４が存在する場合には、この８１０オペロンの転写は、転写開 始位置を傭ぎて１４０塩基で終結される。Ｌ４によりＳＩＯオペロンの表現のこ の転写減衰点は、一定であることを確保し、しかしながらオペロン生成物の合成 を限定する。この８１０オペロンは、転写開始のレベルにおいて働かされる成長 速度制御メカニズムによっても転写的に調節される。実施例１〜３に記載したの と同一の技術を用いて、Ｓ１０オペロンの生成物の調節されていない表現につい てのバイオジェネティック・カセットが、（実施例１におけるし一イソロイシン 　バイオジエネティック・カセットの構成におけるように）欠失された転写減衰 点位置とともに、ならびに（たとえばｔ−７ｐＳ　ｔｗ　ｐ＊ｔ：は　ｔ；Ａ− ｐ、ｐ２のようｔｔ＞　ｓ　１０プ。

モータに置き代わる新規な強いプロモータの配列順序とともに、このオペロンの １１個の遺伝子を含むＤＮＡ断片を生成し、かつこの断片を増幅可能なプラスミ ドベクタ内に挿入することにより構成される。代謝の調節はこのオペロンについ ては公知ではないので、Ｓ１０オペロンのすべての１１個の遺伝子を、１本鎖の プラスミド内に挿入されすべての公知の陰性の調節を完全にされていない１本鎖 のＤＮＡフラグメント上に含むバイオジェネティック・カセットを現わすであろ う。二のプラスミド上においてバイオジェネティック・カセットの統合性を維持 するために、組替え一欠乏（大腸菌）宿主を用いるべきである。

実施例Ｖ：ラクトースを用いるためのバイオジエネティック・カセット 実施例１〜３に記載したのと同一の技術を用いて、大腸菌に１２の、１ａ−ｃ− オペロン（ヤコブ、エフおよびモノズ。

ジェイのＪｏＭｏ　１．　Ｂ　ｉ　ｏ　１．　ｉ！３巻、第３１８頁〜３６５頁 （１９６１）ＥＪ）調節されていない表現についてのジエネティック・カセット が以下のようにして調製される：！しリプレッサをエンコードする　、＆ｃ　１ 遺伝子が、位置特異性欠失により除去、される。強力な構成プロモータのはいけ り順序で置換えらｔた天然のムオペレータープロモータ領域とともに、Ｊ＝こ　 オペロンのＪａｃ−２，、／ａしＹおよびＡＣ−Ａ遺伝子を含むＤＮＡ断片が、 増幅可能な高複写プラスミドベクタ内に配置される。それについての、特異的な プロモータお、よびベクタの配列順序が今や入手可能であり、あるいは意図にな って入手可能となるいずれかの宿主内においてこの一ジエネティック・カセット が機能し得るように、有効なラクトースの異化作用についての陰性の調節を欠く ノにオペロンのすべての遺伝子を含む該ジエネティック・カセットもまた、宿主 に特異的なプロモータおよびベクタの配列順序の挿入のためのプロモータ位置に おける独特の制限位置により（実施例１のように）調製され得る。

実施例■：異化作用および生合成カセット実施例１および実施例２は、天然の生 成物、すなわちＬ−イソロイシンおよびＬ−バリンをそれぞれ生合成するための バイオジエネティック・カセットを既述していた。実施例３および５は、天然物 すなわちメタノールおよびラクトースのそれぞれの異化作用についてのバイオジ ェネティック・カセットを既述している。成る特定の天然の生成物を他の特定の 天然の生成物に変換するためのジェネティック・カセットは、異化作用オペロン を同一のプラスミド・ベクタ内において生合成オペロンと結合することにより構 成することができる。上述の例においては、たとえば、Ｌ−イソロイシンまたは Ｌ−バリンの生成のための生合成カセットをメタノールまたはラクトースのいず れかから構成することが可能である。この同一の方法は、任意の異化作用経路お よび生合成経路の遺伝子を同一のバイオジェネティック・カセット内で結合する ことにより、適当な宿主生物内で様々な開始材料から多数の天然の生成物を生産 するのに用いられ得る。

Ｌ−ロイシンの生合成は、ノ龜Ａ　Ｂ　ＣＤオペロンの転写減衰、ならびにＬ− ロイシン経路の第１の酵素（アルファーイソプロピルマレイン酸シンターゼ、　 ＡｊＡ）の最終生成物の抑制により転写のレベルにおいて調節される。

Ａ、オペロンによっては、他のりプレッション機構または誘起構造は用いられな い。実施例１−３に記載したのと同一の技術を用いて、大腸菌に１２の、シ必オ ペロンの調節されていない表現のためのバイオジェネティック・カセットは、以 下のようにして調製される：このＡＬＡＢＣＤ転写減衰点は、位置特異性欠失を 用いる実施例１に記載したのと類似の手順により除去される。その内部において 天然のノ以プロモータ領域が強力な構成プロモータの配列順序により置き換えら れたかオペロンのン法Ａ　ＢＣＤ遺伝子を含む、大腸菌染色体上において２ｍ１ ｎ、からのＤＮＡ断片が、増幅可能な高輻射のプラスミドベクタ内に配置される 。アルファーイソプロピルマレイン酸インターゼ（ＡＬＡ）対してコードする遺 伝子は、フィードバック抵抗性のアルファーイソプロピルマレイン酸塩シンター ゼに対してコードする遺伝子により置き換えられる。

Ｌ−ロイシンの有効な生合成のための負の調節を欠いているノμオペロンのすべ ての遺伝子を含むこのバイオジエネティック・カセットが、それについての特異 的なプロモータおよびベクタ配列順序が今や入手可能であり、または入手可能と なるいずれかの宿主において機能し得るように、宿主の特異的なプロモータおよ びベクタの配列順序を挿入するためのプロモータの位置における独特な制限位置 により（実施例１のようにして）調製され得る。

実施例■：Ｌ−トリプトファンのバイオジエネティックし一トリプトファンの生 合成は、ｔｌ　リプレッサによるオペロンのりプレッションならびにＬ−）リブ トファンの経路の第１番目の酵素（すなわちアントリニラーテ（ａｎｔｈｒｉｎ ｉｌａｔｅ）シンセターゼ＜ｔｌ７＞Ｅ＞の最終生成物抑制によるのと同様に、 ｔｒｆ　ＥＤＣＢＡオペロンの転写減衰により転写のレベルにおいて調節される 。実施例１〜３において記載したのと同一の技術を用いて、大腸菌に１２のび？ 　オペロンの調節されていない表現についてバイオジェネティック・カセットが 、以下のようにして調製される＝ｔ／−／）　転写減衰点は、位置特異性欠失を 用いる実施例１において記載されたのと類似の手法により除去される。その内部 で自然のう１　リプレッサープロモータ領域が強力な構成プロモータの配列順序 により置き換えられている　シβオペロンの嘘　ＥＤＣＢＡ遺伝子を含むＤＮＡ 断片が、増幅可能な高輻射のプラスミドベクタ内に配置される。アントリニラー テ　シンセターゼ（ｔ４Ｅ）に対してコードする遺伝子が、フィードバック抵抗 性アントリニラーテシンセターゼｔ４Ｅ遺伝子に置き換えられる。Ｌ−トリプト ファンの有効な生合成のための負の調節を欠くこの゛？ｚ、ｐオペロンのすべて の遺伝子を含むこのバイオジエネティック・カセットも、（実施例１のように） 、このカセットがそれについての特異的なプロモータおよびベクタの配列順序が 今や入手可能であり、あるいは入手可能となるいずれかの宿主内で機能し得るよ うに、宿主の特異的なプロモータおよびベクタの配列順序の挿入のためのプロモ ータ位置において独特の制限位置により調製されＬ−ヒスチヂンの生合成は、Ｉ ｊｓ　ＧＤＣＢＨＡＦ　Ｉ　Ｅオペロンの転写減衰点ならびにＬ−ヒスチジンの 経路の第１番目の酵素（４！ｆＧ）の最終生成物抑制により転写のレベルにおい て調節される。実施例１〜３に記載したのと同一の技術を用いて、大腸菌に１２ のＡＱＳオペロンの調節されていない表現についてのバイオジェネティック・カ セットが次のように調製される：この一１ｊｈＧＤｃＢＨＡＦＩＥ転写減衰点は 、位置特性性欠失を用いる実施例１に記載したのと同様の手法により除去される 。強力な構成プロモータの配列順序で置き換えられた天然の７≧転写減衰点−ブ ロモータ領域を有するＩｔｚ、ｓオペロンの４．ｆＧＤＣＢＨＡＦ　Ｉ　Ｅ遺伝 子を含む大腸菌染色体上の４４ｍ　ｉｎ、からのＤＮＡ断片が、増幅可能な高輻 射のプラスミド　。

・ベクタ内に配置される。野生の形式のＸｉｓ　に遺伝子が、フィードバック抵 抗性のｌと　Ｇ遺伝子生成物に対してコードするｌひ　Ｇ遺伝子に置き換えられ る。Ｌ−ヒスチジンの有効な生合成のための負の調節を欠く７にオペロンのすべ での遺伝子を含むこのバイオジェネティックφカセットも、このカセットが、そ れについての特異的なプロモータおよびベクタの配列順序が今や入手可能であり 、またはいずれ入手可能となる任意の宿主内で機能し得るように、宿主に特異的 なプロモータおよびベクタの配列順序の挿入のためのプロモータの位置における 独特な制限位置により（実施例１のようにして）調製され得る。

実施例Ｘ：Ｌ−トレオニンのバイオジエネティック・力竺二上 Ｌ−）レオニンの生合成は、ｔＡｒ　ＡＢＣオペロンの転写減衰ならびにトレオ ニン経路の第１番目の酵素すなわちホモセリン　デヒドロゲナーゼ（！Ａ）の最 終生成物抑制により、転写のレベルにおいて調節される。実施例１〜３に記載し たのと同一の技術を用いて、大腸菌に１２のｔｂ　オペロンの調節されていない 表現についてのバイオジエネティック・カセットが次のようにして調製される： この硲ＡＢＣ転写減衰点は、位置特異性欠失を用いる実施例１において記載した のと同様の手法により除去される。涛　オペロンのｔＪ４−ｒＡＢＣ遺伝子を含 み、強力な構成プロモータの配列順序で置き換えられた天然のみ転写減衰点−プ ロモータ領域を有する大腸菌染色体上の０ｍ１ｎ、からのＤＮＡ断片が、増幅可 能な高輻射のプラスミド・ベクタ内に配置される。ホモセリン　デヒドロゲナー ゼ（’！Ａ）に対してコードする遺伝子が、フィードバック抵抗性のホモセリン デヒドロゲナーゼに置き換えられる。

Ｌ−テレオニンの有効な生合成についての負の調節を欠くこのシメ　オペロンの すべての遺伝子を含むこのバイオジェネティック・カセットも、（実施ｆｌｌＪ １のように）このカットは、それについての特異的なプロモータおよびベクタの 配列順序が今や入手可能であり、あるいはいずれ入手可能となるいずれかの宿主 内において機能し得るように、宿主に特異的なプロモータおよびベクタの配列順 序の挿入のためのプロモータ位置における独特の制限位置により調製され得る。

実施例ＸＩ：Ｌ−フェニルアラニンのバイオジエネティック争カセット 実施例１〜１０において記載したバイオジエネティック・カセットは、トリブト リ（ｔｒｉｂｕｔｏｒｙ）代謝経路の小さな摂動のみを伴う宿主生物内に挿入さ れ得る生合成もしくは異化作用経路を含む。最大の利用および効率を果たすため に、さらに宿主生物の遺伝子工学を要求するであろうバイオジェネティック・カ セットの他の多くの例が想像され得る。たとえば、Ｌ−フェニルアラニンの生合 成は、ｐｌ−ｔオペロンの転写減衰点およびＬ−フェニルアラニン経路の第１番 目の酵素の最終生成物抑制により転写のレベルで調節される。実施例１〜３に記 載したのと同一の技術を用いて、大腸菌に１２の、Ａ−／−オペロンの調節され ていない表現について・のバイオジエネティツク・カセットが次のようにして調 製される：このＰＡＪ転写減衰点は、位置特異性欠失を用いて実施例１に記載し たのと同様の手法により除去される。強力な構成プロモータ配列順序で置き換え られた天然の、／）ム　転写減衰点−プロモータ領域を有するｌＡｔオペロンの 遺伝子を含む、大腸菌染色体上の５６ｍ１ｎ、からのＤＮＡ断片が、増幅可能な 高輻射のプラスミドベクタ内に配置される。／ム　経路のフィードバック抵抗性 の第１番目の酵素についてコードするこの遺伝子は、フィードバック抵抗性酵素 をエンコードする遺伝子で置き換えられる。Ｌ−フェニルアラニンの効率的な生 合成のための負の調節を欠くこのｐムオペロンのすべての遺伝子を含む、このバ イオジエネテイツク・カセットは、該カセットが、それについての特異的なプロ モータおよびベクタの配列順序が今や入手可能であり、または入手可能となるい ずれかの宿主内で機能し得るように、宿主特異性のプロモータおよびベクタの配 列順序の挿入のためのプロモータ位置内において独特の制限位置により（実施例 １のようにして）調製され得る。しかしながら、Ｌ−フェニルアラニンは、芳香 族アミノ酸類（Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファンおよびＬ−チロシン ）の１つにすぎず、かつこれらのアミノ酸のすべてが芳香族アミノ酸のすべてに より調節にさらされる経路により合成される共通の枝分かれ黒牛間生成物（コリ スミツクｃｈｏｒｉｓｍｉｃ）酸）から合成されるので、この共通の経路の未調 節もまた、Ｌ−フェニルアラニンの効率的な生産には重要であるであろう。たと えば、この例において、コリスミツク酸経路内のフィードバックに感受性を有す るＤＨＡＰシンターゼイソ酵素についての３個の遺伝子のうちの１または２を、 フィードバックに対して感受性を有しないＤＨＡＰシンターゼについての遺伝子 により置き換えることが有効であるだろう。

この発明は、特定の実施例に関して説明してきたが、他の多くの例が、この発明 の範囲および精神の範囲内に属するものである。したがって、この特許により与 えられる保護は、次のクレームお、よびその合理的な均等物の範囲によってのみ 限定されるものである。

メタノールスキ：／９−ｔ″　シχ事η千シアｔトンシ＞２−ｆｚ’補正書の写 しく翻訳文）提出日（特許法第１８４条の７第１項）１、国際出願番号　と）− ｂρ）・ζゝ？ＰＣＴ／ＵＳ８６１０２４４０ ２、Ｒ明の名称 バイオジェネティック・カセット マツクアーサー・ブールバード、１９７３２名　称　アメリカン・バイオジェネ ティックス・コーポレーション４、代理人 住　所　大阪市東区平野町２丁目８番地の１　平野町八千代ビル２１日　４月　 １９８７年 ６、添付書類の目録 補正書の写しく翻訳文）　１通 補正された請求の範囲 １、　所望の生物学的生成物に対する生合成的または代謝経路内における各ステ ップに対する少なくとも１の酵素に対してコードしている遺伝子を含む組換えＤ ＮＡセグメントであって、 前記経路は少なくとも２個のステップを有しており、かつ　ゐ〜蝉〃における前 記遺伝子の少なくとも１の転写が、通常は調節にさらされており、かつ前記遺伝 子の少なくとも１がフィードバッグ抑制に通常さらされている酵素に対してフー ドしており、すべての転写的調節配列順序が前記セグメントから不活性にされて おり、または除去されており、かつフィードバック抑制された酵素に対してさも なければコードするであろう前記セグメント内の各遺伝子が、フィードバック抑 制が除去されるように修飾されており、その結果前記セグメント内ン□トよび得 られるＲＮＡの翻訳により、前記生合成経路または代謝経路が調節されておらず 、前記セグメントは第１の制限位置および第２の制限位置を、第１および第２の 制限位置間に位置決めされた前記遺伝子とともに有しており、前記第１および第 ２の＃限位置は前記セグメント内の他の部位では生じない、組換えＤＮＡセグメ ント。

２、　アミノ酸についての生合成経路に対してコードしている請求の範囲第１項 記載のセグメント。

３、前記アミノ酸はＬ−インロイシンである、請求の範四節２項記載のセグメン ト。

４．　前記アミノ酸はＬ−バリンである請求の範囲第２項記載のセグメント。

５、　前記遺伝子は天然の染色体順序にある、請求の範囲第１項〜第４項のいず れかに記載のセグメント。

６、　前記セグメントは、ｄｗ　ｐｅ’ａ’　Ｇ＋Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ａ”　Ｙ　Ｃを 備えており、式中、ｐはプロモータの配列順序を示し、ｅはリーダの配列順序を 示し、ａは転写減衰点の配列順序を示し、＋は活性を示し、ｄは欠失を示し、ｒ はフィードバック抑制に対する抵抗性を示す、請求の範囲第３項記載のセグメン ト。

７、　前記経路は生合成経路であり、その内部で野生の型のプロモータの配列順 序が異なるプロモータの配列順序で置き換えられており、かつそこからＡｃ−リ プレッサが位置−特異性欠失により除去されているルオベロンをさらに備える、 請求の範囲第１項記載のセグメント。

８、メタノールオキシダーゼをエンコードする遺伝子およびジヒドロキシアセト ンシンターゼをエンコードしている遺伝子を備えており、これらの遺伝子の双方 がメチロトロピック生物から得られており、前記遺伝子の転写を導くプロモータ の配列順序をさらに備えており、前記プロモータの配列順序は、前記生物内の前 記遺伝子に対するプロモータの配列順序と異なっている組換えＤＮＡセグメント 。

９、　前記遺伝子に対する転写終結点位置とリポソーム結合位置をさらに備える 、請求の範囲第８項記載のＤＮＡセグメント。

１０、前記セグメントは、請求の範囲第８項または第９項のセグメントをさらに 備える、請求の範囲第１項〜第７項のいずれかに記載のセグメント。

１１、組換えＤＮＡベクタ内に含まれている請求の範囲第１項〜第１０項のいず れかのセグメント。

１２、通常は転写調節およびフィードバック抑制にさらされている少なくとも２ 個のステップを有する生合成もしくは代謝経路に対してコードするＤＮＡを含む 第１の調節されていないバイオジェネティック・カセットを組立てるための方法 であって、前記カセットは前記経路の各ステップに対する少なくとも１の遺伝子 を含み、フィードバック抑制に通常さらされる前記経路内の各酵素に対する修飾 された遺伝子を得、前記修飾された遺伝子のそれぞれにおける修飾が前記抑制を 破壊しており、前記経路に対する遺伝子の陰性の転写調節を担うＤＮＡ配列順序 を除去して転写減衰されておらず、またはリプレッションされていないオペロン を得、 前記経路内の各ステップに対する少なくとも１の酵素に対してコードしているす べての遺伝子を組立て、前記修飾された遺伝子を、１本鎖のＤＮＡセグメント内 に含ませ、前記遺伝子の５′側に第１の制限位置を、前記遺伝子の３′側に第２ の制限位置を与え、前記第１および第２の制限位置が前記セグメントの他の部分 で生じないようにし、かつ 前記ＤＮＡセグメントをクローニングする、各ステップ備える方法。

１３、プロモータの配列順序を除去し、前記遺伝子に対する異なるプロモータの 配列順序を前記セグメント内に挿入する工程をさらに備える請求の範囲第１２項 記載の方法。

１４、　前記経路の生成物はアミノ酸である、請求の範囲第１２項または第１３ 項記載の方法。

１５、前記アミノ酸がＬ−イソロイシンである請求の範囲第１４項記載の方法。

１６、前記アミノ酸がＬ−バリンである、請求の範囲第１４項記載の方法。

１７、前記除去および組立ステップは、（ａ）　転写減衰点の配列順序をシ’、 ？ＧＭＥＤＡオペロンから除去して転写減衰されていないオペロンを形成し、（ ｂ）　野生の型のり、ｌｐ　ＡをＬ−インロイシン−抵抗性Ｊｙ　Ａ’で置き換 え、ならびに （Ｃ）　１本鎖のポリメリックＤＮＡ分子内にステップ（ｂ）のｊｔＪ！ｖＡ’ および；ｔｌｖＹｃを含むステップ（ａ）の転写減衰されていないオペロンを共 に組立てて、Ｌ−イソロイシンの生合成に対してコードするバイオジエネティッ クやカセットを形成する各ステップを備える請求の範囲第１５項記載の方法。

１８、メタノールを利用するためのバイオジェネティック・カセットを作り出す ための方法であって、メチロトロピック生物からメタノールオキシダーゼおよび ジヒドロキシアセトンシンターゼをエンコードしている遺伝子を得、 野生の型のプロモータの配列順序を前記遺伝子から除去し、 前記遺伝子を含むＤＮＡセグメントおよび前記遺伝子のための異なるプロモータ を作り出し、かつ前記セグメントを組換えＤＮＡ転移ベクタ内に挿入する各ステ ップを備える、方法。

１９、前記セグメント内にリポソーム結合位置および終結位置を含むステップを さらに備える、請求の範囲第１８項記載の方法。

２０、前記第１のバイオジェネティック・カセットを請求の範囲第１８項または 第１９項のバイオジエネテイック・カセットと組合わせる工程をさらに備える、 請求の範囲第１２項〜第１７項のいずれか記載の方法。

２１、　楼ズ生ｐ１）内？・前書乙１伝ｊをメロ９九Ｊご６ステツアと　びり暑 ；俤し４１話表句記口篤Ｉ２頑〜系２０頑相右ＫかＩ；記親９オ；九 国際調査報告 ｂ′□１□−’ＰＣＴハＩｓ　１１６１０２４４０

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．所望の生物学的生成物についての生合成もしくは代謝経路内における各ステ ップに対する少なくとも１の酵素に対してコードする遺伝子を含む組換えＤＮＡ セグメントであって、 前記経路は少なくとも２個のステップを有し、前記遺伝子の少なくとも１のｉｎ ｖｉｖｏにおける転写が通常調節にさらされており、かつ前記遺伝子の少なくと も１が、フィードバック抑制に通常さらされる酵素に対してコードしており、す べての転写的な調節の配列順序が前足セグメントから不活性化されまたは除去さ れており、フィードバック抑制された酵素に対してさもなければコードするであ ろう前記セグメント内の各遺伝子が、フィードバック抑制が除去されるように修 飾されており、そのため前記セグメントの転写および得られるＲＮＡの翻訳によ り、前記生合成もしくは代謝経路が調節されず、前記セグメントは第１の制限位 置と第２の制限位置とを、第１および第２の制限位置間に位置された前記遺伝子 とともに有しており、前記第１および第２の制限位置は前記セグメント内の他の 部位では生じない、組換えＤＮＡセグメント。
2. ２．アミノ酸についての生合成経路に対してコードする請求の範囲第１項記載の セグメント。
3. ３．前記アミノ酸がＬ−イソロイシンである、請求の範囲第２項記載のセグメン ト。
4. ４．前記アミノ酸がＬ−バリンである請求の範囲第２項記載のセグメント。
5. ５．前記遺伝子が天然の染色体順序にある、請求の範囲第１項〜第４項のいずれ かに記載のセグメント。
6. ６．前記セグメントは、ｉｌｖｐｅｄａｄＧ＋ＭＥＤＡｒＹＣを備えており、こ こにおいてｐはプロモータの配列順序を示し、ｅはリーダの配列順序を示し、ａ は転写減衰点の配列順序を示し、＋は活性を示し、ｄは欠失を示し、ｒはフィー ドバック抑制に対する抵抗性を示す、請求の範囲第３項記載のセグメント。
7. ７．前記経路は生合成経路であり、その内部で野生型のプロモータの配列順序が 異なるプロモータの配列順序で置き換えられており、かつそこからｌａｃリプレ ッサが位置−特異性欠失により除去されているｌａｃオペロンをさらに備える、 請求の範囲第１項記載のセグメント。
8. ８．メタノールオキシダーゼをエンコードする遺伝子と、ジヒドロキシアセトン シンターゼをエンコードしている遺伝子とを備え、これらの遺伝子の双方がメチ ロトロピック（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｉｃ）生物から得られており、前記遺伝 子の転写を導くプロモータの配列順序をさらに備え、前記プロモータの配列順序 は、前記生物内の前記遺伝子についてのプロモータの配列順序と異なる、組換え ＤＮＡセグメント。
9. ９．前記遺伝子に対する転写終結点位置とリボソーム結合位置とをさらに備える 、請求の範囲第８項記載のＤＮＡセグメント。
10. １０．請求の範囲第８項または第９項のセグメントをさらに備える、請求の範囲 第１項〜第７項のいずれかに記載のセグメント。
11. １１．組換えＤＮＡベクタ内に含まれている請求の範囲第１項〜第１０項のいず れかに記載のセグメント。
12. １２．転写調節およびフィードバック抑制の双方により通常調節されている少な くとも２個のステップを有する生合成もしくは代謝経路についてコードするＤＮ Ａを含む第１の調節されていないバイオジェネティック・カセットを組立てるた めの方法であって、前記カセットは前記経路の各ステップに対する少なくとも１ の遺伝子を含み、フィードバック抑制に通常さらされる前記経路内の各酵素に対 する修飾された遺伝子を得、前記修飾された遺伝子のそれぞれにおける修飾が前 記抑制を破壊し、前記経路に対する遺伝子の負の転写調節を担うＤＮＡ配列順序 を除去して転写減衰されておらず、またはリプレッションされていないオペロン を得、 前記経路の各ステップに対する少なくとも１の酵素をコードするすべての遺伝子 を組立て、前記修飾された遺伝子を１本鎖ＤＮＡセグメント内に含み、 前記遺伝子の５′側に第１の制限位置を与え、前記遺伝子の３′側に第２の制限 位置を与え、第１および第２の制限位置は前記セグメントの他の部位では生じな いように、かつ 前記ＤＮＡセグメントをクローニングする、各ステップ備える方法。
13. １３．プロモータの配列順序を除去し、前記遺伝子に対する異なるプロモータの 配列順序を前記セグメント内に挿入する工程をさらに備える請求の範囲第１２項 記載の方法。
14. １４．前記経路の生成物はアミノ酸である、請求の範囲第１２項または第１３項 記載の方法。
15. １５．前記アミノ酸がＬ−イソロイシンである請求の範囲第１４項記載の方法。
16. １６．前記アミノ酸がＬ−バリンである、請求の範囲第１４項記載の方法。
17. １７．前記除去および組立ステップは、（ａ）転写減衰点の配列順序をｉｌｖＧ ＭＥＤＡオペロンから除去して転写減衰されていないオペロンを形成し、（ｂ） 野生の型のｉｌｖＡをＬ−イソロイシン−抵抗性ｉｌｖＡｒで置き換え、ならび に （ｃ）１本鎖のポリメリックＤＮＡ分子内にステップ（ｂ）のｉｌｖＡｒおよび ｉｌｖＹＣを含むステップ（ａ）の転写減衰されていないオペロンを共に組立て て、Ｌ−イソロイシンの生合成に対してコードするパイオジェネティック・カセ ットを形成する各ステップを備える請求の範囲第１５項記載の方法。
18. １８．メタノールを利用するためのパイオジェネティック・カセットを作り出す ための方法であって、メチロトロピック生物からメタノールオキシダーゼおよび ジヒドロキシアセトンシンターゼをエンコードしている遺伝子を得、 野生の型のプロモータの配列順序を前記遺伝子から除去し、 前記遺伝子を含むＤＮＡセグメントおよび前記遺伝子のための異なるプロモータ を作り出し、かつ前記セグメントを組換えＤＮＡ転移ベクク内に挿入する各ステ ップを備える、方法。
19. １９．前記セグメント内にリボソーム結合位置および終結位置を含むステップを さらに備える、請求の範囲第１８項記載の方法。
20. ２０．前記第１のパイオジェネティック・カセットを請求の範囲第１８項または 第１９項のパイオジェネティック・カセットと組合わせる工程をさらに備える、 請求の範囲第１２項〜第１７項のいずれか記載の方法。
21. ２１．微生物内で前記遺伝子を発現させるステップをさらに備える、請求の範囲 第１２項〜第２０項のいずれかに記載の方法。