CN103233032A - 谷氨酸棒杆菌合成酶基因克隆及l183q定点突变方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高新生物技术，尤其涉及一种谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的基因克隆及L183Q定点突变方法。采用酶工程技术、分子生物学技术结合代谢工程理论和发酵工程技术等高新生物技术，利用底物结构类似物抗性突变株和苯丙氨酸、酪氨酸双营养缺陷型的谷氨酸棒杆菌为出发菌株，分别依据代谢工程理论，进行解除谷氨酸棒杆菌自身反馈调节、增强代谢流、增强色氨酸生物合成途径中关键酶的催化活性、增加底物生物合成量的研究，合理设计并改造谷氨酸棒杆菌的色氨酸生物代谢途径，得到产酸率和转化率符合合同要求的以玉米为原料生产饲料级L-色氨酸的基因工程菌。

Description

谷氨酸棒杆菌合成酶基因克隆及L183Q定点突变方法

技术领域

本发明涉及一种高新生物技术，尤其涉及一种谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的基因克隆及L183Q定点突变方法。

背景技术

DAHP合成酶是代谢流向芳香族氨基酸的第一个关键酶，编码基因为AroI，它催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和四磷酸赤藓糖(E4P)合成3-脱氧-D-阿拉伯-7磷酸庚酮糖(DAHP)，进而生成分支酸，分支酸在色氨酸操纵子和其他酶的共同参与下最终转化为色氨酸，并分泌到胞外。随着分子生物学技术的飞速发展，在蛋白质定向进化技术和基因克隆表达方法相结合的基础上，使得催化活性提高的DAHP合成酶突变基因等位替换到基因组或在工程菌中过量表达成为可能，使代谢流向有利于色氨酸合成的方向，从而提高色氨酸产量。

近年来，人们对大肠杆菌的DAHP合成酶研究较为深入，在NCBI结构数据库中已收录了该酶的晶体结构，David L等人对His180、Craig M等人对Cys61、Cys328分别做了定点突变，但催化活性都没有得到提高，国内复旦大学胡昌云等人确定了AroGL175Q、AroGL175A、AroGL175D、Phe209Ser突变体酶催化活性分别提高1.33倍、1.57倍、1.65倍、1.8倍，而对工业上生产氨基酸的主要菌种谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的研究鲜见报道，唯有Liao H-F等人报道Ser187对该酶的变构效应起到重要的作用。大肠杆菌的DAHP合成酶AroG基因150-189位与谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶Aro I基因158-197氨基酸高度保守，推断谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶L183Q突变体对该酶的催化活性也会有所提高。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供了一种谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的基因克隆及L183Q定点突变方法。

为解决上述技术问题，本发明通过以下方案来实现：谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的基因克隆及L183Q定点突变方法，所述方法所使用的材料为谷氨酸棒杆菌LG-332，大肠杆菌DH5α；

所述谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的基因克隆，该基因克隆步骤如下：

1)、谷氨酸棒杆菌LG-332基因组DNA的提取，谷氨酸棒杆菌LG-332单菌落接种于10ml LB液体培养基中，30℃摇床培养12h，次日2％接种量接入100ml LB液体培养基；

2)、谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的引物设计与合成，根据GENE BANK公布的谷氨酸棒杆菌ATCC13032 DAHP合成酶基因(aro I)核苷酸序列(GeneID：1018979)及pET-28a(+)原核表达载体的多克隆位点分析设计特异引物：上游引物P1：5’-TTTCATATGAGTTCTCCAGTCTCA CTCGAAA-3’；下游引物P2：5’-TTTCTCGAGTTACTTGGCTGCTGCTCGGC-3’，其中下滑线部分为Nde I和Xho I酶切位点；

3)、谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的PCR扩增，以谷氨酸棒杆菌基因组DNA为模板，进行降落PCR扩增：以P1，P2为引物，反应条件采用热启动PCR方式：95℃预变性4min，80℃pause加入Primer starHS酶，之后94℃30s，60℃40s，72℃120s2个循环；94℃30s，58℃40s，72℃120s2个循环；94℃30s，56℃40s，72℃120s2个循环；94℃30s，54℃40s，72℃120s2个循环；94℃30s，52℃40s，72℃120s2个循环；94℃30s，50℃40s，72℃120s20个循环后；72℃延伸20min补加0.5μl Ex Taq酶加A尾，反应结束后取5μl扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测；

4)、PCR产物的回收，采用柱离心琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，回收的DNA贮存于-20℃，目的片段与克隆载体的连接，将回收的PCR产物连接到pMD18-T-simple载体上，连接反应中各种反应组分及加样量重量比分：回收的PCR产物4.5，pMD18-T-simple载体0.5，SolutionI5，总体积10，在16℃连接过夜，用CaCl₂法制备DH5α感受态细胞制备大肠杆菌感受态细胞；

5)、重组质粒的转化和阳性克隆的筛选；

6)、重组质粒的鉴定，采用碱裂解法提取质粒DNA，进行重组质粒的酶切鉴定和PCR鉴定；

7)、重组质粒的核苷酸序列测定，对经上述步骤6)鉴定正确的阳性菌落进行过夜培养，制备成甘油菌，进行序列测定，测序正确的重组质粒命名为pMD18-T-simple-aroI；

所述L183Q定点突变，该突变过程如下：

1)、合成酶突变位点的选择，合成酶的定点引物的设计，根据所要突变的位点设计两条反向互补中间突变引物，

M1：5’-TCAGGTGCACCGCCAGCAGGCTTCTGGGATGTCTA-3’；

M2：5’-TAGACATCCCAGAAGCCTGCTGGCGGTGCACCTGA-3’，其中下滑线为突变位点；

2)、PCR扩增DAHP突变基因，以测序正确的重组质粒pMD18T-simple-AroI为模板，以突变引物高保真循环PCR扩增，按下表体系扩增：

反应条件采用热启动PCR方式：95℃预变性4min，80℃pause加入Primerstar HS酶，之后94℃30s，55℃1min，68℃8min35个循环后；72℃延伸20min。反应结束后取5μl扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测；

3)、Dpn I酶消化原始模板，PCR产物直接按下表体系加入Dpn I酶37℃消化4h，完成原始模板消化过程；

4)、转化，将带缺刻的消化产物直接转化E.coli DH5α；

5)、阳性克隆筛选，氨苄抗性(100mg/L)、蓝白斑筛选阳性克隆；

6)、重组质粒的鉴定，测序比对，测序结果与Aro I序列比对确定目的突变正确性，测序正确的重组质粒命名为pMD18T-simple-Aro I*。

在基因克隆步骤1)所述的谷氨酸棒杆菌LG-332基因组DNA的提取，其提取基因组步骤如下：

1)、100ml细菌过夜培养液，5000rpm离心10分钟，去上清液；

2)、加9.5ml TE悬浮沉淀，并加0.5ml 10％SDS，50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶K，混匀，37℃保温1小时；

3)、加1.5ml 5mol/L NaCl，混匀；

4)、加1.5ml CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温20分钟；

5)、用等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，5000rpm离心10分钟，将上清液移至干净离心管；

6)、用等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，取上清液移至干净管中；

7)、加1倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静止10分钟，沉淀DNA；

8)、70％乙醇漂洗后，吸干，溶解于1ml TE，-20℃保存，提取结束后取5μl，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测。

本发明的优点是：采用酶工程技术、分子生物学技术结合代谢工程理论和发酵工程技术等高新生物技术，利用底物结构类似物抗性突变株和苯丙氨酸、酪氨酸双营养缺陷型的谷氨酸棒杆菌LG332(Corynebacterium glutamicumLG332)为出发菌株，分别依据代谢工程理论，进行解除谷氨酸棒杆菌自身反馈调节、增强代谢流、增强色氨酸生物合成途径中关键酶的催化活性、增加底物生物合成量的研究，合理设计并改造谷氨酸棒杆菌的色氨酸生物代谢途径，得到产酸率和转化率符合合同要求的以玉米为原料生产饲料级L-色氨酸的基因工程菌。

附图说明

以下结合附图对本发明作详细说明。

图1为本发明AroG基因与Aro I基因同源比对；

图2为本发明0.8％琼脂糖电泳结果；

图3为本发明PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果。

具体实施方式

谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的基因克隆及L183Q定点突变方法，该方法通过以下方式来实现：所述方法所使用的材料为谷氨酸棒杆菌LG-332，大肠杆菌DH5α；

所述谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的基因克隆，该基因克隆步骤如下：

1)、谷氨酸棒杆菌LG-332基因组DNA的提取，谷氨酸棒杆菌LG-332单菌落接种于10ml LB液体培养基中，30℃摇床培养12h，次日2％接种量接入100ml LB液体培养基；提取基因组步骤如下：

(1)100ml细菌过夜培养液，5000rpm离心10分钟，去上清液。

(2)加9.5ml TE悬浮沉淀，并加0.5ml 10％SDS，50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶K，混匀，37℃保温1小时。

(3)加1.5ml 5mol/L NaCl，混匀。

(4)加1.5ml CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温20分钟。

(5)用等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，5000rpm离心10分钟，将上清液移至干净离心管。

(6)用等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，取上清液移至干净管中。

(7)加1倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静止10分钟，沉淀DNA。

(8)70％乙醇漂洗后，吸干，溶解于1ml TE，-20℃保存。提取结束后取5μl，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测。

2)、谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的引物设计与合成，根据GENE BANK公布的谷氨酸棒杆菌ATCC13032 DAHP合成酶基因(aro I)核苷酸序列(GeneID：1018979)及pET-28a(+)原核表达载体的多克隆位点分析设计特异引物：上游引物P1：5’-TTTCATATGAGTTCTCCAGTCTCA CTCGAAA-3’；下游引物P2：5’-TTTCTCGAGTTACTTGGCTGCTGCTCGGC-3’，其中下滑线部分为Nde I和Xho I酶切位点；

3)、谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的PCR扩增，以谷氨酸棒杆菌基因组DNA为模板，进行降落PCR扩增：以P1，P2为引物，反应体系按下表1-1进行，反应条件采用热启动PCR方式：95℃预变性4min，80℃pause加入Primer starHS酶，之后94℃30s，60℃40s，72℃120s2个循环；94℃30s，58℃40s，72℃120s2个循环；94℃30s，56℃40s，72℃120s2个循环；94℃30s，54℃40s，72℃120s2个循环；94℃30s，52℃40s，72℃120s2个循环；94℃30s，50℃40s，72℃120s20个循环后；72℃延伸20min补加0.5μl Ex Taq酶加A尾。反应结束后取5μl扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。

表1-1 PCR反应体系

Table 1-1 The system of PCR

4)、PCR产物的回收，采用TaKaRa公司柱离心琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，回收的DNA贮存于-20℃。

5)、目的片段与克隆载体的连接，将回收的PCR产物连接到pMD18-T-simple载体上(选取表1-2比例进行连接反应)。连接反应中各种反应组分及加样量参照下表，16℃连接过夜。

6)、大肠杆菌感受态细胞的制备，用CaCl₂法制备DH5α感受态细胞。

表1-2连接体系

Table 1-2 System of ligation reaction

5)、重组质粒的转化和阳性克隆的筛选；

6)、重组质粒的鉴定，采用碱裂解法提取质粒DNA，进行重组质粒的酶切鉴定和PCR鉴定；

7)、重组质粒的核苷酸序列测定，对经上述步骤6)鉴定正确的阳性菌落进行过夜培养，制备成甘油菌，进行序列测定，测序正确的重组质粒命名为pMD18-T-simple-aroI。

所述L183Q定点突变，该突变过程如下：

1)、合成酶突变位点的选择，合成酶的定点引物的设计，根据所要突变的位点设计两条反向互补中间突变引物，

M1：5’-TCAGGTGCACCGCCAGCAGGCTTCTGGGATGTCTA-3’；

M2：5’-TAGACATCCCAGAAGCCTGCTGGCGGTGCACCTGA-3’，其中下滑线为突变位点；

近年来，人们对大肠杆菌的DAHP合成酶研究较为深入，在NCBI结构数据库中已收录了该酶的晶体结构，David L等人对His180、Craig M等人对Cys61、Cys328分别做了定点突变，但催化活性都没有得到提高，国内某大学教授确定了AroGL175Q、AroGL175A、AroGL175D、Phe209Ser突变体酶催化活性分别提高了1.33倍、1.57倍、1.65倍、1.8倍，并解除了一定得反馈抑制，但目前对工业上生产氨基酸的主要菌种谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)DAHP合成酶的突变研究鲜见报道，唯有Ser187对该酶的变构效应起到重要的作用。如图1所示，大肠杆菌的DAHP合成酶AroG基因150-189位与谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶Aro I基因158-197氨基酸高度保守，推断谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶L183Q突变体对该酶的催化活性也会有所提高，本实验结论将为构建谷氨酸棒杆菌色氨酸高产菌株提供理论依据。

2)、PCR扩增DAHP突变基因，以测序正确的重组质粒pMD18T-simple-AroI为模板，以突变引物高保真循环PCR扩增，按下表体系扩增：

反应条件采用热启动PCR方式：95℃预变性4min，80℃pause加入Primerstar HS酶，之后94℃30s，55℃1min，68℃8min35个循环后；72℃延伸20min。反应结束后取5μl扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测；

3)、Dpn I酶消化原始模板，PCR产物直接按下表1-5体系加入Dpn I酶37℃消化4h，完成原始模板消化过程。

表1-5 Dpn I酶消化体系

Table.1-5 The system of Dpn I digestion

4)、转化，将带缺刻的消化产物直接转化E.coli DH5α；

5)、阳性克隆筛选，氨苄抗性(100mg/L)、蓝白斑筛选阳性克隆；

6)、重组质粒的鉴定，测序比对，测序结果与Aro I序列比对确定目的突变正确性，测序正确的重组质粒命名为pMD18T-simple-Aro I*。

综上所述之结果与分析：

1)、谷氨酸棒杆菌LG-332基因组DNA提取，按谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的基因克隆步骤1)中，0.8％琼脂糖电泳结果如图2所示。

2)、合成酶基因的PCR扩增，以LG-332基因组DNA为模板扩增的DAHP合成酶基因(AroI)片段，1％琼脂糖凝胶电泳检测如图3所示，与预期大小一致。

3)、DAHP合成酶克隆重组质粒的及突变基因的鉴定，按1.2.1.9.2、1.2.1.9.3、1.2.2.3、1.2.2.7方法进行实验，PCR产物及酶切产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，均与理论大小相符。

4)、DAHP合成酶基因的碱基测序比对，测序结果用DNA MAN软件分析及网上BLAST分析，与GENE BANK登陆的Aro I序列同源性100％。表明DAHP合成酶基因克隆成功。

5)、DAHP合成酶基因的氨基酸测序比对，测序结果经DNA MAN软件分析翻译成氨基酸后，进行BLAST分析，与GENEBANK登陆的DAHP合成酶序列比对，同源性为100％，是DAHP合成酶超级家族的一员。表明DAHP合成酶基因克隆成功。

6)、突变DAHP合成酶基因重组质粒的核苷酸测序比对，测序结果用DNA MAN软件分析，与GENE BANK登陆的Aro I序列同源性99％，与突变引物设计的完全符合，607位核苷酸T突变为A，说明DAHP合成酶基因定点突变成功。

7)、突变DAHP合成酶基因重组质粒的氨基酸测序比对，测序结果用DNA MAN软件分析，与GENE BANK登陆的Aro I氨基酸序列同源性99％，与突变引物设计的完全符合，说明DAHP合成酶基因定点L183Q突变成功。

本发明采用高保真Prime STAR HS聚合酶，利用其3′到5′核酸外切酶活性，降低错配率，提高PCR扩增的准确性，以本实验室经多重筛选得到的高产色氨酸谷氨酸棒杆菌LG-332基因组DNA为模板，克隆到的Aro I基因与GENEBANK(GeneID：1018979)登录的Aro I基因(ATCC13032)同源性达100％，这不仅说明了克隆的高保真性，同时也表明LG-332的苯丙氨酸、酪氨酸双营养缺陷型和对多种色氨酸底物类似物抗性的这些特征与DAHP酶的氨基酸组成无关。

结合克隆的保真性，采用简便、快速、经济、突变效率高的聚合酶链式反应一步介导法定点突变Aro I基因，突变位点位于引物中部，经温度循环后，引物将突变带入新生成的扩增产物中，该扩增产物为带有缺刻的不完整质粒。在整个扩增完成后，用Dpn I酶消化带甲基化的原始模板链，然后将产物转入感受态细胞，在细菌体内，连接酶可修复缺刻，生成完整质粒，后者即可在细菌中正常复制，铺板后，90％以上的克隆会带有突变。

谷氨酸棒杆菌aro I基因与大肠杆菌aroG基因同源性达54％，参考复旦大学胡昌云等人确定了AroG基因Leu175的所有突变体的比活都比野生型高，本实验对进化保守的谷氨酸棒杆菌DS基因Leu183进行突变，获得L183Q突变体。第二章将继续分析突变体对酶活力的影响。

以棒杆菌(LG-332)基因组DNA为模板，成功克隆了谷氨酸棒杆菌LG-332中DAHP合成酶基因，与GENE BANK登陆的DAHP基因序列同源性达100％。

成功对谷氨酸棒杆菌LG-332中DAHP合成酶基因进行了定点突变，获得了L183Q突变体，为后续的原核表达及基因工程菌的构建奠定基础。

以上所述仅为本发明的优选实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效方法或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (2)

1.谷氨酸棒杆菌合成酶基因克隆及L183Q定点突变方法，其特征在于：所述方法所使用的材料为谷氨酸棒杆菌LG-332及大肠杆菌DH5α；

所述谷氨酸棒杆菌合成酶的基因克隆，该基因克隆步骤如下：

1)、谷氨酸棒杆菌LG-332基因组DNA的提取，谷氨酸棒杆菌LG-332单菌落接种于10m1 LB液体培养基中，30℃摇床培养12h，次日2％接种量接入100ml LB液体培养基；

2)、谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的引物设计与合成，根据GENE BANK公布的谷氨酸棒杆菌ATCC13032 DAHP合成酶基因(aro I)核苷酸序列(GeneID：1018979)及pET-28a(+)原核表达载体的多克隆位点分析设计特异引物：上游引物P1：5’-TTTCATATGAGTTCTCCAGTCTCA CTCGAAA-3’；下游引物P2：5’-TTTCTCGAGTTACTTGGCTGCTGCTCGGC-3’，其中下滑线部分为Nde I和Xho I酶切位点；

3)、谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的PCR扩增，以谷氨酸棒杆菌基因组DNA为模板，进行降落PCR扩增：以P1，P2为引物，反应条件采用热启动PCR方式：95℃预变性4min，80℃pause加入Primer starHS酶，之后94℃30s，60℃40s，72℃120s2个循环；94℃30s，58℃40s，72℃120s2个循环；94℃30s，56℃40s，72℃120s2个循环；94℃30s，54℃40s，72℃120s2个循环；94℃30s，52℃40s，72℃120s2个循环；94℃30s，50℃40s，72℃120s20个循环后；72℃延伸20min补加0.5μl Ex Taq酶加A尾，反应结束后取5μl扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测；

4)、PCR产物的回收，采用柱离心琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，回收的DNA贮存于-20℃，目的片段与克隆载体的连接，将回收的PCR产物连接到pMD18-T-simple载体上，连接反应中各种反应组分及加样量重量比分：回收的PCR产物4.5，pMD18-T-simple载体0.5，SolutionI5，总体积10，在16℃连接过夜，用CaCl₂法制备DH5α感受态细胞制备大肠杆菌感受态细胞；

5)、重组质粒的转化和阳性克隆的筛选；

6)、重组质粒的鉴定，采用碱裂解法提取质粒DNA，进行重组质粒的酶切鉴定和PCR鉴定；

7)、重组质粒的核苷酸序列测定，对经上述步骤6)鉴定正确的阳性菌落进行过夜培养，制备成甘油菌，进行序列测定，测序正确的重组质粒命名为pMD18-T-simple-aroI；

所述L183Q定点突变，该突变过程如下：

1)、合成酶突变位点的选择，合成酶的定点引物的设计，根据所要突变的位点设计两条反向互补中间突变引物，

M1：5’-TCAGGTGCACCGCCAGCAGGCTTCTGGGATGTCTA-3’；

M2：5’-TAGACATCCCAGAAGCCTGCTGGCGGTGCACCTGA-3’，其中下滑线为突变位点；

2)、PCR扩增DAHP突变基因，以测序正确的重组质粒pMD18T-simple-AroI为模板，以突变引物高保真循环PCR扩增，按下表体系扩增：

反应条件采用热启动PCR方式：95℃预变性4min，80℃pause加入Primerstar HS酶，之后94℃30s，55℃1min，68℃8min35个循环后；72℃延伸20min。反应结束后取5μl扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测；

3)、Dpn I酶消化原始模板，PCR产物直接按下表体系加入Dpn I酶37℃消化4h，完成原始模板消化过程；

4)、转化，将带缺刻的消化产物直接转化E.coli DH5α；

5)、阳性克隆筛选，氨苄抗性(100mg/L)、蓝白斑筛选阳性克隆；

6)、重组质粒的鉴定，测序比对，测序结果与Aro I序列比对确定目的突变正确性，测序正确的重组质粒命名为pMD18T-simple-Aro I*。

2.按照权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌合成酶基因克隆及L183Q定点突变方法，其特征在于：在基因克隆步骤1)所述的谷氨酸棒杆菌LG-332基因组DNA的提取，其提取基因组步骤如下：

1)、100ml细菌过夜培养液，5000rpm离心10分钟，去上清液；

2)、加9.5ml TE悬浮沉淀，并加0.5ml 10％SDS，50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶K，混匀，37℃保温1小时；

3)、加1.5ml 5mol/L NaCl，混匀；

4)、加1.5ml CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温20分钟；

5)、用等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，5000rpm离心10分钟，将上清液移至干净离心管；

6)、用等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，取上清液移至干净管中；

7)、加1倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静止10分钟，沉淀DNA；

8)、70％乙醇漂洗后，吸干，溶解于1ml TE，-20℃保存，提取结束后取5μl，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测。

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