JP6859437B2

JP6859437B2 - Ｌ‐リジンを生産するコリネバクテリウム属微生物及びそれを用いたｌ‐リジンの生産方法

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Publication number: JP6859437B2
Application number: JP2019525939A
Authority: JP
Inventors: ジョンビョン、ヒョ; ジュンキム、ヒョン; ウォンぺ、ヒョン; リュ、ソン−ギ; チェ、ヒャン; オクムン、ジュン; イ、キョン−チャン; チェ、ユンジョン
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2016-11-15
Filing date: 2017-09-19
Publication date: 2021-04-14
Anticipated expiration: 2037-09-19
Also published as: BR112019009942A2; CN110268046B; WO2018093033A1; US20190352683A1; RU2720522C1; KR20180055010A; EP3543329A1; JP2019535271A; EP3543329A4; CN110268046A; MY189749A; KR101863456B1; US10787690B2

Description

本願は、Ｌ‐リジンを生産するコリネバクテリウム属（the genus Corynebacterium）微生物、及びそれを用いたＬ‐リジンの生産方法に関する。

Ｌ‐リジンは、動物飼料、ヒトの医薬品及び化粧品産業に用いられていて、主にコリネバクテリウム属の菌株やエシェリキア属の菌株を利用した発酵により生産されている。Ｌ‐リジンを生産するために、高効率の生産菌株及び発酵工程技術の開発のための様々な研究が行われている。具体的に、Ｌ‐リジンの生合性に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を増加させるか、または生合性に不要な遺伝子を除去するような、目的物質への特異的な接近方法が主に利用されている（特許文献１）。

本発明者らは、リジンの生産能を増加させうる有効形質を探索するために、コリネバクテリウム属微生物の内在的遺伝子をランダムに導入することによって、リジンの高濃度生産と関連された遺伝子を発掘し、コリネバクテリウム属微生物で前記遺伝子の発現量を増加させる場合、Ｌ‐リジンの生産能が増加することを確認し、本願を完成した。

韓国特許登録第１０‐０８３８０３８号韓国特許登録第０６２００９２号国際公開特許ＷＯ２００６／０６５０９５国際公開特許ＷＯ２００９／０９６６８９韓国特許登録第１０‐０３９７３２２号米国公開特許第２００３‐０１２４６８８号韓国特許登録第１０‐０９２４０６５号米国公開特許第２０１０‐０１４３９８４号韓国特許登録第１０‐００７３６１０号韓国特許登録第１０‐００５７６８４号韓国特許登録第１０‐０１５９８１２号

Binder et al., Genome Biology 2012, 13:R40

本願の一つの目的は、内在的活性に比べて増加された活性を有する配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質を含むＬ‐リジンを生産するコリネバクテリウム属（the genus Corynebacterium ）微生物を提供することにある。

本願の他の目的は、前記微生物を用いたＬ‐リジンの生産方法を提供することにある。

前記目的を達成するための本願の１つの様態は、内在的活性に比べて増加された活性を有する配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質を含む、Ｌ‐リジンを生産するコリネバクテリウム属（the genus Corynebacterium）微生物である。

これを具体的に説明すると次のとおりである。一方、本願で開示された各々の説明及び実施形態は、それぞれの異なる説明及び実施形態にも適用できる。つまり、本願で開示された多様な要素のすべての組み合わせが本願のカテゴリに属する。また、下記で記術された具体的な記述によって、本願のカテゴリが制限されるとは見ることができない。

本願において、前記配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質は「ＨＭ１５２４タンパク質」と混用して用いられてもよい。また、これは「ＨＭ１５２４遺伝子によりコードされるタンパク質」と混用して用いられてもよい。また、配列番号１のアミノ酸配列で必須的に構成されるタンパク質、もしくは配列番号１のアミノ酸配列から構成されるタンパク質という表現と混用して用いられてもよい。

また、前記タンパク質は配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％または９９％の相同性を有するポリペプチドを含んでもよい。例えば、このような相同性を有し、前記配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質と相応する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有しても、本願の範囲内に含まれるのは自明である。

また、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質と相応する活性を有する場合であれば、配列番号１のアミノ酸配列の前後の意味のない配列追加または自然的に発生しうる突然変異、もしくはそのサイレント突然変異（silent mutation）を除くことなく、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質も本願の範囲に属する。

本願で用語、「相同性」は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド部分間の同一性のパーセントを言う。与えられたアミノ酸配列または塩基配列と一致する程度を意味し、百分率として示されてもよい。本明細書で、与えられたアミノ酸配列または塩基配列と同一であるか、または同様の活性を有するその相同性配列が「％相同性」と表示される。例えば、スコア（score）、同一性（identity）及び類似度（similarity）などのパラメータ（parameter）を計算する標準ソフトウェア、具体的にＢＬＡＳＴ２．０を用いたり、定義された厳格な条件下でサザン混成化実験により配列を比較することによって確認することができ、定義される適切な混成化条件は該当技術の範囲内であり、当業者によく知られている方法（例えば、J. Sambrook et al., Molecuｌar Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecuｌar Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York）で決定されてもよい。

前記配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子は、これに制限されるものではないが、配列番号２の塩基配列を含むポリヌクレオチドであってもよく、配列番号２の塩基配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％または９９％の相同性を有するポリヌクレオチドであってもよい。コドン縮退性（codon degeneracy）により前記配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質またはそれと相同性を有するタンパク質に翻訳されうるポリヌクレオチドも含まれてもよいのは自明である。または、公知の遺伝子配列から調製されうるプローブ、例えば、前記塩基配列の全体または一部に対する相補配列と厳格な条件下でハイドリッド化して、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質の活性を有するタンパク質を暗号化する配列であれば、制限なく含まれてもよい。前記「厳格な条件」とは、ポリヌクレオチド間の特異的な混成化を可能にする条件を意味する。このような条件は、文献（例えば、J. Sambrook et al.,同上）に具体的に記載されている。例えば、相同性が高い遺伝子同士で、８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、さらに具体的には９７％以上、特に具体的には９９％以上の相同性を有する遺伝子同士でハイブリッド化し、それより相同性が低い遺伝子同士ではハイブリッド化しない条件、または通常のサザンハイブリッド化の洗浄条件である、６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には、６８℃、０.１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度で、１回、具体的には、２回〜３回洗浄する条件を列挙することができる。

混成化は、たとえ混成化の厳格度に応じて塩基間のミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）が可能としても、２つの核酸が相補的な配列を有することを要求する。用語、「相補的」は、互いに混成化が可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述するのに使用される。例えば、ＤＮＡに対して、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本願は、また実質的に類似な核酸配列だけではなく、全体の配列に相補的な単離された核酸の断片を含んでもよい。

具体的に、相同性を有するポリヌクレオチドは５５℃のＴｍ値により混成化段階を含む混成化条件を利用し、上述した条件を利用して探知することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃または６５℃であってもよいが、これに制限されるものではなく、その目的に応じて当業者により適切に調節されうる。

ポリヌクレオチドを混成化する適切な厳格度は、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野でよく知られている。

前記ハイブリッド化に用いられるプローブは、塩基配列の相補配列の一部であってもよい。このようなプローブは、公知の配列に基づいて作られたオリゴヌクレオチドをプライマーとし、このような塩基配列を含む遺伝子断片を鋳型とするＰＣＲにより作製されてもよい。前記遺伝子断片は、例えば、少なくとも約５０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、または少なくとも１００ヌクレオチドであってもよい。また、当業者は、温度及び洗浄溶液の塩濃度をプローブの長さのような要素に応じて、必要な場合は調節できる。

本願で用語、「内在的活性」は、自然的または人為的な要因による遺伝的な変異で微生物の形質が変化する場合、形質変化の前に親菌株がもともと有していた特定タンパク質の活性を言う。

本願で用語、「タンパク質の活性が内在的活性に比べて増加」することは、微生物が有するタンパク質の内在的活性または変形前の活性に比べて活性が向上されたことを意味する。前記活性の増加は、外来のＨＭ１５２４を導入することと、内在的にＨＭ１５２４の活性を強化することをすべて含んでもよい。

具体的に、本願における活性増加は、
１）前記タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドのコピー数の増加、
２）前記ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列の変形、
３）前記タンパク質の活性が強化されるように染色体上のポリヌクレオチド配列の変形、
４）前記タンパク質の活性を示す外来ポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドの導入、または、
５）これらの組み合わせによって強化されるように変形する方法などにより行われてもよいが、これに制限されない。

前記１）ポリヌクレオチドのコピー数の増加は、特にこれに制限されないが、ベクターに作動可能に連結された形態で行われるか、宿主細胞内の染色体内に挿入されることによって行われてもよい。具体的に、宿主とは関係なく複製されて機能するベクターに本願のタンパク質を暗号化するポリヌクレオチドが作動可能に連結されて宿主細胞内に導入されることによって行われるか、宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入させうるベクターに前記ポリヌクレオチドが作動可能に連結されて宿主細胞内に導入されることによって、前記宿主細胞の染色体内の前記ポリヌクレオチドのコピー数を増加する方法で行われてもよい。

次に、２）ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列の変形は、特にこれに制限されないが、前記発現調節配列の活性をさらに強化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせで配列上の変異を誘導して行ったり、より強い活性を有する核酸配列に交替することによって行われてもよい。前記発現調節配列は、特にこれに制限されないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び解読の終結を調節する配列などを含んでもよい。

前記ポリヌクレオチド発現単位の上部には、本来のプロモーターの代わりに強力な異種プロモーターが連結されてもよいが、前記強力なプロモーターの例としては、ＣＪ７プロモーター（特許文献２及び特許文献３）、ｌｙｓＣＰ１プロモーター（特許文献４）、ＥＦ‐Ｔｕプロモーター、ｇｒｏＥＬプロモーター、ａｃｅＡまたはａｃｅＢプロモーターなどがあるが、これに限定されない。また、３）染色体上のポリヌクレオチド配列の変形は、特にこれに制限されないが、前記ポリヌクレオチド配列の活性をさらに強化するように、核酸配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせで発現調節配列上の変異を誘導して行うか、より強い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列に交替することによって行われてもよい。

また、４）外来ポリヌクレオチド配列の導入は、前記タンパク質と同一／類似な活性を有するタンパク質を暗号化する外来ポリヌクレオチド、またはこのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチド宿主細胞内に導入して行われてもよい。前記外来ポリヌクレオチドは、前記タンパク質と同一／類似な活性を示す限り、その由来や配列に制限なく使用されてもよい。また、導入された前記外来ポリヌクレオチドが宿主細胞内で最適化された転写、翻訳ができるように、このコドンを最適化して宿主細胞内に導入してもよい。前記導入は、公知された形質転換方法を当業者が適切に選択して行われてもよく、宿主細胞内で前記導入されたポリヌクレオチドが発現されることによって、タンパク質が生成されその活性が増加されてもよい。

最後に５）前記１）〜４）の組み合わせによって強化されるように変形する方法は、前記タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドのコピー数の増加、その発現が増加するように発現調節配列の変形、染色体上の前記ポリヌクレオチド配列の変形及び前記タンパク質の活性を示す外来ポリヌクレオチドまたはそのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドの変形のうち、１つ以上の方法を一緒に適用して行ってもよい。

本願で用いられた用語、「ベクター」は、適合な宿主内で目的タンパク質を発現させうるように適合な調節配列に作動可能に連結された、前記目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。前記調節配列は、転写を開始できるプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適合なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含んでもよい。ベクターは、適当な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムとは関係なく複製されたり、機能することができ、ゲノムそのものに統合されてもよい。一例として、細胞内の染色体挿入用ベクターを介して、染色体内に目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを変異されたポリヌクレオチドに交替させてもよい。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界に知られている任意の方法、例えば、相同組み換えにより行われてもよいが、これに限定されない。

本願で用いられるベクターは、特に限定されなく、当業界に知られている任意のベクターを用いてもよい。通常、用いられるベクターの例としては、天然状態であるか、組み換えされた状態のプラスミド、コスミド、ウィルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとして、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いてもよく、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系とｐＥＴ系などを用いてもよい。具体的には、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いてもよい。

本願で用語、「形質転換」は、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入して宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現さえできれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なくこれらすべてを含んでもよい。また、前記ポリヌクレオチドは標的タンパク質をコードするＤＮＡ及びＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、いかなる形態で導入されても関係ない。例えば、前記ポリヌクレオチドはそれ自体で発現されるのに必要なあらゆる要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されてもよい。前記発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（promoter）、転写終結信号、リボソーム結合部位及び翻訳終結信号を含んでもよい。前記発現カセットは自己複製が可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドはそれ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよいが、これに限定されない。

また、前記で用語、「作動可能に連結」されたとは、本願の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するようにするプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されていることを意味する。

本願のベクターを形質転換させる方法は、核酸を細胞内に導入するいかなる方法も含まれ、宿主細胞に応じて当分野で公知されたように、適合した標準技術を選択して行ってもよい。例えば、電気穿孔法（electroporation）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ_４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）沈殿、微細注入法（microinjection）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ‐デキストラン法、カチオンリポソーム法、及び酢酸リチウム‐ＤＭＳＯ法などがあるが、これに制限されない。

前記宿主細胞としては、ＤＮＡの導入効率が高く、導入されたＤＮＡの発現効率が高い宿主を用いるのがよいが、例えば、コリネバクテリウム属微生物であってもよい。

本願で用語、「Ｌ‐リジン」とは、塩基性α‐アミノ酸の1つであって、体内で合成されない必須アミノ酸であり、化学式はＮＨ_２(ＣＨ_２)_４ＣＨ(ＣＨ_２)ＣＯＯＨであるＬ‐アミノ酸の一種を意味する。また、前記Ｌ‐リジンは塩の形態で存在する場合もすべて本願の範囲に含まれてもよい。

本願で用語、「Ｌ‐リジンを生産する微生物」は、本願の目的上、Ｌ‐リジンを生産しうる微生物菌株であって、具体的には、本願にかかる操作によってＬ‐リジンを高濃度で生産しうる菌株を意味する。したがって、前記微生物は、Ｌ‐リジンを生産しうる限り、その親菌株の種類に特に制限されない。つまり、本願で親菌株はＬ‐リジンの生産能がない菌株及びＬ‐リジンの生産能がある菌株をすべて含んでもよい。前記Ｌ‐リジンの生産能は自然的に発生したものまたは人為的に操作されたものをすべて含んでもよい。人為的に操作されたＬ‐リジンの生産能を有する微生物は、例えば、ＮＴＧ（nitrosoguanidine）などの突然変異を誘発する物質により変異されてＬ‐リジンの生産能を有するものであってもよく、または特定目的タンパク質の発現程度または活性を調節してＬ‐リジンの生産能を有するものであってもよいが、これに制限されるものではない。具体的に、前記特定目的タンパク質は、Ｌ‐リジン生合成経路に直接／間接的に作用する全てのタンパク質が含まれてもよく、これらの発現程度または活性を増加させるか減少させることによって、Ｌ‐リジンの生産能を有するように変異されたものであってもよく、また、これらのアミノ酸配列または塩基配列上の変異を誘導してＬ‐リジンの生産能を有するようにしたものであってもよい。上述したＮＴＧなどを用いたランダム突然変異の誘導及び特定目的タンパク質の発現調節を含む微生物の人為的な操作は、公知された技術として当業者によって適切に行われてもよい。

前記微生物は、具体的にはコリネバクテリウム属微生物であってもよい。その例として、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）またはブレビバクテリウム・ファーメンタム（Brevibacterium fermentum）などが用いられてもよいが、これに制限されない。その1つの例として、前記コリネバクテリウム属微生物はコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）を用いてもよい。しかし、これらの例に限定されることではなく、その他にも公知されたＬ‐リジンの生産能を有するコリネバクテリウム属微生物が用いられてもよい。

公知されたＬ‐リジンの生産能を有するコリネバクテリウム属の例としては、特許文献５（または特許文献６）、特許文献７（または特許文献８）、特許文献９または／及び非特許文献１に記述された微生物があり、前記文献の内容全体は本願に参考資料として、全文が含まれる。

もう1つの様態は、内在的活性に比べて増加された活性を有する配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質を含む、L‐リジンを生産するコリネバクテリウム属（the genus Corynebacterium）微生物を培地で培養する段階；及び前記培養された微生物またはその培地からL‐リジンを回収する段階を含む、L‐リジンの生産方法である。

L‐リジンを生産するコリネバクテリウム属微生物については前記で説明したとおりである。

本願で用語、「培養」は、前記微生物を適当に調節された環境条件で生育させることを意味する。本願の培養過程は、当業界で知られている適当な培地と培養条件に応じて行ってもよい。このような培養過程は、選択される菌株に応じて当業者が容易に調整して用いてもよい。前記方法において、前記微生物を培養する段階は、特にこれに制限されないが、公知された回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などによって行ってもよい。ここで、培養条件は、特にこれに限定されないが、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例えば、リン酸または硫酸）を用いて、適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５〜９、具体的には、ｐＨ６〜８、最も具体的には、ｐＨ６．８）を調節してもよい。また、培養中には脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡の生成を抑制することができ、また、培養物の好気状態を維持するために、培養物内に酸素または酸素含有気体を注入したり、嫌気及び微好気状態を維持するために気体の注入なしに、あるいは窒素、水素または二酸化炭素ガスを注入してもよい。培養温度は２０〜４５℃、具体的には２５〜４０℃を維持してもよく、培養期間は、望む有用物質の生産量が収得されるまで続けてもよく、具体的には約１０〜１６０時間培養してもよい。しかし、これに制限されるものではない。前記培養によって生産されたＬ‐リジンは培地中に分泌されるか細胞内に残留してもよい。

さらに、用いられる培養用培地は、炭素供給源として糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、澱粉及びセルロース）、油脂及び脂肪（例えば、大豆油、ひまわり油、ピーナッツ油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸）、アルコール（例えば、グリセロール及びエタノール）及び有機酸（例えば、酢酸）などを個別に使用したり、または混合して使用してもよいが、これに限定されない。窒素供給源としては、窒素含有有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆泊粉及びウレア）、または無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム）などを個別に使用したり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。リン供給源としてリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これに相応するナトリウム含有塩などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。また、培地にはその他の金属塩（例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄）、アミノ酸及びビタミンのような必須成長促進物質を含んでもよい。

本願の前記培養段階で生産されたＬ‐リジンを回収する方法は、培養方法に応じて当該分野に公知された適合の方法を用いて培養液から目的とするアミノ酸を収集してもよい。例えば、遠心分離、ろ過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化及びＨＰＬＣなどが用いられてもよく、当該分野に公知された適合の方法を用いて、培地または微生物から目的とするＬ‐リジンを回収してもよい。また、前記回収段階は、精製工程を含んでもよい。

本願のＬ‐リジンの生産能を有する微生物を用いてＬ‐リジンを高効率で生産することができる。

以下、本願を実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本願を例示的に説明するためのもので、本願の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１：コリネバクテリウム属微生物の野生型ライブラリーの製作
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２から遺伝体ＤＮＡを抽出した後、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩを処理し、アガロスゲール上で電気泳動を介してＤＮＡ切片を大きさによって分離し、３〜４ｋｂのＤＮＡ切片を選択的に獲得した。これらを制限酵素ＢａｍＨＩの末端を有するｐＥＣＣＧ１１７（特許文献１０）ベクターと連結した後、大腸菌ＤＨ５αに導入し、カナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）が含まれたＬＢ固体培地に塗抹して形質転換されたコロニーを獲得した。ランダムの１００個のコロニーから配列番号３及び４のプライマーを用いてＰＣＲを行い、これを通じて目的とした３〜４ｋｂほどのＤＮＡ切片が挿入されたベクターを含むコロニーの比率が９０％以上であることを確認した。獲得したすべてのコロニーをカナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）が含まれたＬＢ液体培地に接種して混合培養し、通常に知られているプラスミド抽出法を用いてプラスミドを抽出し、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２遺伝体のＤＮＡライブラリーを完成した。
配列番号３：５’‐ＡＣＧＡＣＧＧＧＡＴＣＡＧＴＡＣＣＧＡ‐３’
配列番号４：５’‐ＡＧＣＴＡＴＣＴＧＴＣＧＣＡＧＣＧＣＣ‐３’

実施例２：野生型ライブラリーを導入したリジン生産微生物の製作及び評価
実施例１で製作した遺伝体ＤＮＡライブラリーを電気パルス法を用いて、リジンの生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ（前記微生物はＫＦＣＣ１０８８１として公開されたが、ブダペスト条約下である国際寄託機関に再寄託されてＫＣＣＭ１１０１６Ｐとして寄託番号を付与された、特許文献１１）に導入した後、カナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）が含まれた複合平板培地に塗抹し、３０℃で２４時間培養してコロニー約２，０００個を獲得した。

＜複合平板培地＞
ブドウ糖２０ｇ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４５０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４５ｇ、Ｋ_２ＨＰＯ_４１０ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチン酸アミド２０００μｇ、寒天２０ｇ、カナマイシン２５ｍｇ（蒸留水１リットル基準）

９６ウェル細胞培養プレートの各ウェルに複合液体培地２００μｌを分注して獲得したコロニーを各々接種した後、３０℃、１２００ｒｐｍの条件で２４時間、振とう培養した。培養液を遠心分離して菌体と上澄み液に分離し、上澄み液５０μｌをリジンオキシダーゼ（lysine oxydase）を含有する反応液に混合した。

＜複合液体培地＞
ブドウ糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４４ｇ、Ｋ_２ＨＰＯ_４８ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチン酸アミド２０００μｇ、カナマイシン２５ｍｇ（蒸留水１リットル基準）

＜反応液＞
リジンオキシダーゼ（Sigma‐Aldrich）０．０２ｕｎｉｔ、ペルオキシダーゼ（peroxidase、Sigma‐Aldrich）、０．２ｕｎｉｔ、ＡＢＴＳ２ｍｇ（リン酸カリウム緩衝溶液１ｍｌ基準）

その後、３０分間、ＯＤ_４０５での吸光度を分析して対照区(ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ/ｐＥＣＣＧ１１７）より高い吸光度を示す１５種の実験区を選別した。各形質転換体のリジン生産能を確認するために、カナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）が含まれた種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種して、３０℃、２００ｒｐｍの条件で２０時間、振とう培養した。カナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）が含まれた生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種して、３７℃、２００ｒｐｍで９６時間、振とう培養した。培養を終了した後、ＨＰＬＣを用いてＬ‐リジンの濃度を分析した（表１）。

＜種培地＞
ブドウ糖２０ｇ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４５ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４４ｇ、Ｋ_２ＨＰＯ_４８ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチン酸アミド２０００μｇ（蒸留水１リットル基準）

＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖１００ｇ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４４０ｇ、大豆タンパク質２.５ｇ、トウモロコシ浸漬固形分（Corn Steep Solids）５ｇ、尿素３ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４１ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０.５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチンアミド３０００μｇ、ＣａＣＯ_３３０ｇ（蒸留水１リットル基準）

前記結果から、対照区に比べてリジンの生産能が増加した効果を示すＫＣＣＭ１１０１６Ｐ／Ｈ１５とＫＣＣＭ１１０１６Ｐ／Ｍ２４を選択して、通常に知られているプラスミド抽出法を用いてプラスミドを抽出した。ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ／Ｈ１５から由来したプラスミドは、ｐＥＣ‐Ｈ１５、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ／Ｍ２４から由来したプラスミドは、ｐＥＣ‐Ｍ２４と命名した。その後、配列番号３及び４のプライマーを用いて塩基配列分析を行った。その結果、プラスミドｐＥＣ‐Ｈ１５は配列番号１５のヌクレオチド配列が含まれ、プラスミドｐＥＣ‐Ｍ２４は配列番号１６のヌクレオチド配列が含まれていた。これによって、前記２種のプラスミドには配列番号１のアミノ酸配列をコードする配列番号２のヌクレオチド配列が共に含まれていることを確認した。ここで、配列番号１のアミノ酸配列のコード遺伝子をＨＭ１５２４と命名し、以下ＨＭ１５２４として表記した。

実施例３：ＨＭ１５２４遺伝子の過発現ベクターの製作
前記実施例２から確認されたＨＭ１５２４の効果を確認するために、該当遺伝子を過発現するためのベクターを製作した。

報告された塩基配列に基づいてＨＭ１５２４の開始コドンの上段の約２００ｂｐ部位から終結コドンの下段の約５０ｂｐを含むＤＮＡ断片を獲得するために、５’末端にＸｈｏＩの制限酵素部位が挿入されるように考案したプライマー（配列番号５）及び３’末端にＸｈｏＩの制限酵素部位が挿入されるように考案したプライマー（配列番号６）を合成し、コリネバクテリウム・グルタミカムの遺伝体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９４℃で５分間変性した後、９４℃、３０秒変性、５６℃、３０秒アニーリング、７２℃、９０秒重合を３０回繰り返した後、７２℃で７分間、重合反応を行った。
配列番号５：５’‐ＴＣＡＣＴＣＧＡＧＴＧＡＴＧＧＣＣＡＧＧＴＴＧＴＴＧＴＣ‐３’
配列番号６：５’‐ＴＣＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＴＣＡＴＡＧＧＴＡＣＴＡＧＴＴＴ‐３’

前記のＰＣＲ増幅産物を制限酵素ＸｈｏＩで処理した後、ｐＥＣＣＧ１１７ベクターを制限酵素ＸｈｏＩで処理して得たＤＮＡ切片と連結し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換してカナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）が含まれたＬＢ固体培地に塗抹した。ＰＣＲ（配列番号３及び４）を介して目的とした遺伝子が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選別した後、通常に知られているプラスミド抽出法を用いてプラスミドを獲得し、このプラスミドをｐＥＣＣＧ‐ＨＭ１５２４と命名した。

実施例４：ＨＭ１５２４遺伝子の過発現ベクターが導入された菌株のリジン生産能の分析
前記実施例３で製造したベクターｐＥＣＣＧ‐ＨＭ１５２４を電気パルス法を用いてリジン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐに導入した後、カナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）が含まれた複合平板培地に塗抹して、３０℃で２４時間培養し、コロニーを獲得した。獲得した菌株は、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ／ｐＥＣＣＧ‐ＨＭ１５２４と命名し、実施例２に示したフラスコ培養法と同様な方法で３バッチを培養し、培養液中のＬ‐リジンの濃度を分析した（表２）。

その結果、前記ＨＭ１５２４遺伝子が過発現された菌株、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ／ｐＥＣＣＧ‐ＨＭ１５２４は、親菌株であるＫＣＣＭ１１０１６Ｐに比べてリジンの生産能が６％増加されたことを確認した。

実施例５：ＨＭ１５２４遺伝子の染色体追加挿入のためのベクターの製作
前記実施例４から確認されたＨＭ１５２４遺伝子の効果を確認するために、該当遺伝子をコリネバクテリウムの染色体上にさらに挿入するためのベクターを製作した。

コリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来のＰｃｊ７プロモーター（特許文献２）を増幅するためにＰｃｊ７プロモーターの５’末端にＥｃｏＲＩの制限酵素部位が挿入されるように考案したプライマー（配列番号７）及び３’末端にＮｄｅＩの制限酵素部位が挿入されるように考案したプライマー（配列番号８）とＰｃｊ７プロモーターの５’末端にＳｐｅＩの制限酵素部位が挿入されるように考案したプライマー（配列番号９）及び３’末端にＳａｌＩの制限酵素部位が挿入されるように考案したプライマー（配列番号１０）を合成した。コリネバクテリウム・アンモニアゲネスの遺伝体ＤＮＡを鋳型にして合成したプライマー（配列番号７及び８、配列番号９及び１０）でＰＣＲを行った結果、５’末端にＥｃｏＲＩの制限酵素部位と３’末端にＮｄｅＩの制限酵素部位を含むＰｃｊ７プロモーターＤＮＡ断片と、５’末端にＳｐｅＩの制限酵素部位と３’末端にＳａｌＩの制限酵素部位を含むＰｃｊ７プロモーターＤＮＡ断片をそれぞれ獲得した。ＰＣＲ条件は、９４℃で５分間変性した後、９４℃、３０秒変性、５６℃、３０秒アニーリング、７２℃、３０秒重合を３０回繰り返した後、７２℃で７分間、重合反応を行った。

報告された塩基配列に基づいて、ＨＭ１５２４遺伝子のＯＲＦを増幅するために、開始コドンの位置にＮｄｅＩの制限酵素部位が挿入されるように考案したプライマー（配列番号１１）と終結コドンの下段にＳｐｅＩの制限酵素部位が挿入されるように考案したプライマー（配列番号１２）を合成した。コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の遺伝体ＤＮＡを鋳型にして配列番号１１及び１２のプライマーでＰＣＲを行った結果、開始コドンの位置にＮｄｅＩの制限酵素部位と終結コドンの下段にＳｐｅＩの制限酵素部位を含むＨＭ１５２４遺伝子のＤＮＡの断片を獲得した。ＰＣＲ条件は、９４℃で５分間変性した後、９４℃、３０秒変性、５６℃、３０秒アニーリング、７２℃、９０秒重合を３０回繰り返した後、７２℃で７分間、重合反応を行った。
配列番号７：５’‐ＴＣＡＧＡＡＴＴＣＴＴＣＣＴＴＣＡＧＧＣＴＡＡＴＣＴＴＴＴ‐３’
配列番号８：５’‐ＴＣＡＣＡＴＡＴＧＴＧＴＴＴＣＣＴＴＴＣＧＴＴＧＧＧＴＡＣ‐３’
配列番号９：５’‐ＴＣＡＡＣＴＡＧＴＣＴＴＣＣＴＴＣＡＧＧＣＴＡＡＴＣＴＴＴ‐３’
配列番号１０：５’‐ＴＣＡＧＴＣＧＡＣＴＧＴＴＴＣＣＴＴＴＣＧＴＴＧＧＧＴＡＣ‐３’
配列番号１１：５’‐ＴＣＡＣＡＴＡＴＧＣＧＣＧＴＡＧＣＴＡＴＧＡＴＴＴＣ‐３’
配列番号１２：５’‐ＴＣＡＡＣＴＡＧＴＴＴＡＧＣＣＧＴＧＡＴＧＣＧＴＴＴＣＡＣ‐３’

前記３つのＰＣＲ増幅産物をそれぞれ両末端に含む制限酵素で処理した後、ｐＤＺベクター（特許文献７）を制限酵素ＥｃｏＲＩとＳａｌＩで処理して得たＤＮＡ切片と連結してｐＤＺ‐Ｐｃｊ７‐ＨＭ１５２４ベクターを製作した。

実施例６：ＨＭ１５２４遺伝子の染色体追加挿入された菌株のリジン生産能の分析
前記実施例５で製作したベクターｐＤＺ‐Ｐｃｊ７‐ＨＭ１５２４を電気パルス法を用いてコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１１０１６Ｐに導入し、相同組み換えにより形質転換されたコロニーの中で染色体上のＨＭ１５２４遺伝子の終結コドンの下段にＨＭ１５２４遺伝子が挿入されたコロニーを選別した。ＰＣＲ方法でコロニーを選別するため、配列番号１３及び１４のプライマーを用いた。選別された菌株はＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：Ｐｃｊ７‐ＨＭ１５２４と命名し、実施例２に示したフラスコ培養法と同様の方法で培養して、培養液中のＬ‐リジンの濃度を分析した（表３）。
配列番号１３：５’‐ＧＴＣＧＡＡＣＡＣＧＣＣＡＧＡＡＣＡＴＴ‐３’
配列番号１４：５’‐ＴＡＣＴＣＴＣＡＣＧＡＴＣＴＣＡＣＣＣＴ‐３’

その結果、前記ＨＭ１５２４遺伝子がさらに挿入された菌株であるＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：Ｐｃｊ７‐ＨＭ１５２４は、親菌株であるＫＣＣＭ１１０１６Ｐに比べてリジン生産能が約６％増加されたことを確認した。前記ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：Ｐｃｊ７‐ＨＭ１５２４菌株をＣＡ０１‐２２９７と命名し、２０１６年８月２日付でブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Korea Culture Center of Microorganisms、KCCM）に寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１１８７６Ｐを与えられた。

実施例７：ＨＭ１５２４遺伝子がさらに挿入されたＫＣＣＭ１０７７０Ｐ由来の微生物を用いたリジンの生産
前記実施例５で製造したベクターｐＤＺ‐Ｐｃｊ７‐ＨＭ１５２４をリジン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ（特許文献７）に形質転換させた。前記コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７７０ＰはＬ‐リジンの生合成経路の関連遺伝子７種が染色体に挿入されたことを特徴とする。ＰＣＲ方法でコロニーを選択的に分離し、ＨＭ１５２４遺伝子が導入された菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ::Ｐｃｊ７‐ＨＭ１５２４と命名した。その後、実施例２で示したフラスコ培養法と同様の方法で培養し、培養液中のＬ‐リジンの濃度を分析した（表４）。

その結果、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ::Ｐｃｊ７‐ＨＭ１５２４菌株は、親菌株に比べてリジンの生産能が約５％増加されたことを確認した。

実施例８：ＨＭ１５２４遺伝子がさらに挿入されたＣＪ３Ｐ由来の微生物を用いたリジンの生産
前記実施例５で製造したベクターｐＤＺ‐Ｐｃｊ7‐ＨＭ１５２４をリジンの生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ３Ｐ（非特許文献１）に形質転換させた。コリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ３Ｐは、Ｌ‐リジンの生産能の向上に関連する遺伝子３種が染色体に挿入されたことを特徴とする。ＰＣＲ方法でコロニーを選択的に分離し、ＨＭ１５２４遺伝子が導入された菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ３Ｐ::Ｐｃｊ７‐ＨＭ１５２４と命名した。実施例２で示したフラスコ培養法と同様の方法で培養し、培養液中のＬ‐リジンの濃度を分析した（表５）。

その結果、コリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ３Ｐ::Ｐｃｊ７‐ＨＭ１５２４菌株は、親菌株に比べてリジンの生産能が約３８％増加されたことを確認した。

実施例９：ＨＭ１５２４遺伝子がさらに挿入されたＫＣＣＭ１１３４７Ｐ由来の微生物を用いたリジンの生産
前記実施例５で製造したベクターｐＤＺ‐Ｐｃｊ7‐ＨＭ１５２４をリジンの生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１３４７Ｐ（前記微生物はＫＦＣＣ１０７５０として公開されたが、ブダペスト条約下の国際寄託機関に再寄託されＫＣＣＭ１１３４７Ｐを与えられた、特許文献９）に形質転換させた。コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１３４７Ｐは、Ｌ‐リジンの生産能の向上に関連する遺伝子３種が染色体に挿入されたことを特徴とする。ＰＣＲ方法でコロニーを選択的に分離し、ＨＭ１５２４遺伝子が導入された菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１３４７Ｐ::Ｐｃｊ７‐ＨＭ１５２４と命名した。実施例２で示したフラスコ培養法と同様の方法で培養し、培養液中のＬ‐リジンの濃度を分析した（表６）。

その結果、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１３４７Ｐ::Ｐｃｊ７‐ＨＭ１５２４菌株は、親菌株に比べてリジンの生産能が約１０％増加されたことを確認した。

前記結果を総合すると、ＨＭ１５２４遺伝子の活性が内在的活性に比べて増加された菌株は、リジンの生産能が増加することが分かり、これは微生物で前記遺伝子がコードするタンパク質の活性を増加させてリジンを大量生産しうることを示唆する。

以上の説明から、本願が属する技術分野の当業者は本願がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施できることが理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的なものではないと理解するべきである。本願の範囲は、前記の詳細な説明より、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導出されるすべての変更または変形された形態が本願の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。

[受託番号]
寄託機関名：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１１８７６Ｐ
受託日：２０１６０８０２

Claims

配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質の内在的活性に比べて、前記タンパク質の増加された活性を有する、コリネバクテリウム属（the genus Corynebacterium）のＬ‐リジン生産微生物。
前記微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である、請求項１に記載のコリネバクテリウム属のＬ‐リジン生産微生物。
配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質の内在的活性に比べて、前記タンパク質の増加された活性を有する、コリネバクテリウム属のＬ‐リジン生産微生物を培地で培養する段階；及び
前記培養された微生物またはその培地からＬ‐リジンを回収する段階を含む、Ｌ‐リジンの生産方法。
前記微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である、請求項３に記載のＬ‐リジンの生産方法。