CN114630903B - 内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽及使用其生产l-苏氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及具有减少的内消旋‑二氨基庚二酸脱氢酶活性的变异多肽，以及使用其生产L‑苏氨酸的方法。

Description

内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽及使用其生产L-苏 氨酸的方法
技术领域
本公开涉及其中内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的活性被减弱的修饰多肽，以及使用其生产L-苏氨酸的方法。
背景技术
棒杆菌(Corynebacterium)属的微生物，特别是谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)，是革兰氏阳性微生物，其广泛应用于L-氨基酸和其它有用物质的生产。为了生产L-氨基酸和其它有用物质，正在进行各种研究，以开发能够高效生产这些物质的发酵工艺技术和微生物。例如，主要使用了目标物质特异性方法(例如，用于增加编码参与L-赖氨酸生物合成的酶的基因的表达的方法、用于去除L-赖氨酸生物合成非必需的基因的方法等)(美国专利号8,048,650)。
同时，在L-氨基酸中，L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸和L-甘氨酸均源自天冬氨酸，且草酰乙酸(即，天冬氨酸的前体)的合成水平可影响这些L-氨基酸的合成水平。
内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶是将微生物中赖氨酸生产期间产生的哌啶2,6-二羧酸酯(piperodeine 2,6-dicarboxylate)转化为内消旋-2,6-二氨基庚二酸，并在赖氨酸生产途径中固定氮源的重要酶。
现有文献(X Dong,Y Zhao,J Hu,Y Li,X Wang-Enzyme and microbialtechnology,2016)中报道了，由于ddh基因(即，编码内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的基因)和lysE基因(即，L-赖氨酸输出基因)的缺失，而导致生产L-苏氨酸的菌株的表型改变的有关细节。然而，由于lysE基因的缺失具有延迟菌株的生长速率和减少苏氨酸的生产量的消极作用，且由于ddh基因的缺失抑制菌株的生长，因此仍有从增加L-氨基酸的有效生产能力和菌株的生长两方面聚焦进行研究的需要。
发明内容
[技术问题]
本发明人已经做出了大量的努力在不延迟菌株的生长速率的情况下，增加L-苏氨酸的生产，同时降低L-赖氨酸的生产。结果，他们发现，当使用其中内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶活性被减弱到一定水平的新型修饰多肽时，不仅可以维持微生物的生长，而且可以增加L-苏氨酸的生产量，从而完成了本公开。
[技术方案]
本公开的目的是提供源自谷氨酸棒杆菌的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽。
本公开的另一目的是提供编码该修饰多肽的多核苷酸。
本公开的又一目的是提供棒杆菌属的微生物，其包括内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽或编码该多肽的多核苷酸。
本公开的又一目的是提供生产L-苏氨酸的方法，该方法包括在培养基中培养微生物的步骤。
本公开的又一目的是提供该微生物用于生产L-苏氨酸的用途。
[技术效果]
当使用本公开的其中内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的活性被减弱的新型修饰多肽时，可以进一步增强L-苏氨酸的生产量。在这方面，从工业方面可以预期高产率和便利性的效果。
具体实施方式
本公开详细描述如下。同时，本公开中公开的各个描述和实施方式也可应用于其它描述和实施方式。即，在本公开中公开的各种要素的所有组合落入本公开的范围内。此外，不能认为本公开的范围受到以下具体描述的限制。
为了实现上述目的，本公开的一个方面提供了源自谷氨酸棒杆菌的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽。
具体地，本公开提供了内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽，其中SEQ ID NO:1的氨基酸序列中第169个氨基酸被不同的氨基酸取代，且更具体地，提供了内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽，其中SEQ ID NO:1的氨基酸序列中第169个氨基酸被亮氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸或半胱氨酸取代。
如本文所用，术语“内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶”是指催化赖氨酸生物合成的中间过程的NADPH依赖的还原酶。内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶是将微生物中赖氨酸生产过程期间产生的哌啶2,6-二羧酸酯转化以生产内消旋-2,6-二氨基庚二酸，并在赖氨酸生产途径中固定氮源的重要酶。具体地，内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶是内消旋-2,6-二氨基庚二酸合酶，且它在赖氨酸生产途径的第三步骤中具有调节速率的作用。此外，该酶催化将氨基团固定到哌啶2,6-二羧酸酯中的反应，且从而形成内消旋-2,6-二氨基庚二酸。
在本公开中，术语“内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶”可与柠檬酸合酶、内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶和DDH互换使用。
在本公开中，可以从NCBI的GenBank中获得内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的序列，NCBI的GenBank是公共数据库。例如，内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的序列可以是源自棒杆菌属(Corynebacterium sp.)的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的序列，且更具体地，包含SEQID NO:1的氨基酸序列的多肽/蛋白质的序列，但内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的序列不限于此。另外，可以不受限制地包括具有与上述氨基酸序列的活性相同的活性的任何序列。另外，内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的氨基酸序列可以包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有80％或更多的同源性或同一性的任何氨基酸序列，但氨基酸序列不限于此。具体地，氨基酸序列可以包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列和与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更多的同源性或同一性的任何氨基酸序列。另外，明显的是，只要该氨基酸序列具有与上述蛋白质的氨基酸序列的这种同源性或同一性，并且表现出与上述蛋白质的效果相应的效果，则具有其中氨基酸序列的一部分被缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列的任何蛋白质也都可以被包括在本公开的范围内。
如本文所用，术语“变异体”是指这样的多肽，其中至少一个氨基酸因保守取代和/或修饰与所列序列的氨基酸不同，但维持了蛋白质的功能或性质。变异体不同于根据几个氨基酸取代、缺失或添加所鉴定的序列。通常，这样的变异体可以通过修饰上述多肽的氨基酸序列中的一个氨基酸并通过评价上述修饰多肽的性质来鉴定。也就是说，与其天然蛋白质的能力相比，变异体的能力可能增加、不变或减少。另外，一些变异体可以包括其中一个或多个部分(例如，N端先导序列或跨膜结构域)被移除的那些变异体。
如本文所用，术语“保守取代”是指一个氨基酸被用具有相似结构和/或化学性质的不同氨基酸取代。变异体可以具有，例如，一个或多个保守取代，同时仍然保留一种或多种生物活性。这种氨基酸取代可以通常基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性的相似性而发生。例如，带正电荷(碱性)的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；带负电荷(酸性)的氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸；芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；疏水性氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸和色氨酸。一般地，保守取代对生成的多肽的活性几乎没有影响或没有影响。
另外，变异体可以包括对多肽的性质和二级结构具有最小影响的氨基酸的缺失或添加。例如，多肽可以与共翻译地(co-translationally)或翻译后地(post-translationally)指导蛋白质转移的蛋白质的N-末端的信号(或先导)序列缀合。此外，多肽还可以与另一序列或连接子缀合，以鉴定、纯化或合成该多肽。
如本文所用，术语“内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽”是指这样的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽，其包括在具有内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶蛋白活性的多肽的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸取代，且氨基酸取代包括其中距N-末端第169个氨基酸被不同的氨基酸取代的取代。
具体地，修饰多肽包括这样的修饰多肽，其中与对应于多肽——其具有内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶蛋白的活性——的氨基酸序列中第169个氨基酸的氨基酸被不同的氨基酸取代。例如，修饰多肽包括这样的修饰多肽，其中在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中距N-末端第169位的氨基酸上发生突变。更具体地，修饰多肽可以是这样的蛋白质，其中对应于SEQID NO:1的第169个氨基酸的氨基酸被不同的氨基酸取代。
术语“被不同的氨基酸取代”不受限制，只要该氨基酸被与取代前的氨基酸不同的氨基酸取代即可。具体地，取代可以是这样的取代，其中氨基酸被选自L-赖氨酸、L-组氨酸、L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-半胱氨酸、L-酪氨酸、L-天冬酰胺和L-谷氨酰胺中的任何一种氨基酸取代。更具体地，修饰多肽可以是这样的修饰多肽，其中SEQ IDNO:1的氨基酸序列中第169个氨基酸是选自L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-谷氨酸和L-半胱氨酸的任何一个，但修饰多肽不限于此。
此外，取代的氨基酸残基不仅可以包括天然氨基酸，还可以包括非天然氨基酸。非天然氨基酸可以是，例如，D-氨基酸、同型(homo)氨基酸、β-同型氨基酸、N-甲基氨基酸、α-甲基氨基酸、不常见的氨基酸(例如，瓜氨酸、萘丙氨酸等)，但非天然氨基酸不限于此。
同时，当在本公开中表示“特定氨基酸被取代”时，显然该氨基酸被与取代前的氨基酸不同的氨基酸取代，即使其没有单独表明其被不同的氨基酸取代。
如本文所用，术语“对应于”是指位于蛋白质或肽中所列位置的氨基酸残基，或与蛋白质或肽中的该残基相同或相对应的氨基酸残基。如本文所用，术语“对应区域”通常指相关蛋白或参考蛋白中的类似位置。
在本公开中，可以对本公开中使用的多肽中的氨基酸残基位置使用特定编号。例如，通过将待比较的对象多肽与本公开的多肽序列进行比对，可以将对应于本公开的多肽的氨基酸残基位置的位置重新编号。
本公开中提供的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的变异体是使得上述内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶中特定位置的氨基酸被取代，且因此与修饰前的多肽相比，生产L-苏氨酸的能力可被增加。
修饰多肽可以是这样的修饰多肽，其中上述SEQ ID NO:1的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更多的同源性或同一性的氨基酸序列中距N-端第169个氨基酸被修饰。
另外，修饰多肽可以是这样的修饰多肽，其中上述SEQ ID NO:1的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更多的同源性或同一性的氨基酸序列中距N-端第169个氨基酸被修饰；其与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少为80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多，且小于100％的序列同源性；以及具有内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的活性。
修饰多肽的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的活性可能弱于作为野生型的具有SEQID NO:1的氨基酸序列的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的活性。
为了本公开的目的，包含内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽的微生物的特征在于，与其中不存在内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽的微生物相比，L-氨基酸的生产量增加了。内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽的特征在于，与天然野生型或未修饰的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶相比，它具有基因控制活性，以增加生产L-氨基酸的能力。具有重要意义的是通过其中引入有内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽的微生物，可以增加L-氨基酸的生产量。具体地，L-氨基酸可以是L-苏氨酸或衍生自L-苏氨酸的氨基酸，但是可以不受限制地包括可以通过引入内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽或通过包括内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽而产生的任何L-氨基酸。
衍生自L-苏氨酸的氨基酸是指可使用L-苏氨酸作为前体生物合成的氨基酸，并且只要其能从L-苏氨酸生物合成，衍生自L-苏氨酸的氨基酸就不受限制。
内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽可以是，例如，包括其中与SEQ ID NO:1的氨基酸序列中第169个氨基酸相对应的氨基酸被不同的氨基酸取代的氨基酸序列的修饰多肽，并且其可以是由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成的修饰多肽。其中与SEQ ID NO:1的氨基酸序列中第169个氨基酸相对应的氨基酸被亮氨酸取代的变异体可以是由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成的变异体，但变异体不限于此。另外，内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽可以包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有80％或更高的同源性或同一性的氨基酸序列，但内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽不限于此。具体地，本公开的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽可以包括具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的蛋白质，或与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更多的同源性或同一性的蛋白质。另外，明显的是，只要蛋白质具有具有这种同源性或同一性的氨基酸序列并表现出对应于上述蛋白质的效果，则除了对应于SEQ ID NO:1的第169个氨基酸的氨基酸之外，具有在其一些氨基酸中有缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列的任何蛋白质也都可以属于本公开的范围。
即，即使本文描述为“具有特定SEQ ID NO的氨基酸序列的蛋白质”，但明显的是，只要蛋白质具有与由对应的SEQ ID NO的氨基酸序列组成的蛋白质的效果相同或对应的效果，则具有在部分序列中具有缺失、修饰、取代、保守取代或添加的氨基酸序列的蛋白质也都可以用于本公开中。例如，只要蛋白质具有与修饰蛋白质的活性相同或对应的活性，则不排除不改变蛋白质功能的序列在氨基酸序列上游或下游的添加、自然发生的突变、沉默突变或其保守取代。明显的是，即使蛋白质具有这样的序列添加或突变，它也落入本公开的范围内。
如本文所用，术语“同源性”或“同一性”是指两个给定的氨基酸序列或核苷酸序列之间的相关性程度，并且它可以用百分比表示。
这些术语“同源性”和“同一性”可以经常互换使用。
保守的多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性可以通过标准比对算法来确定，并且可与通过正在使用的程序建立的默认空位罚值一起使用。实际上，同源性或同一性序列在中等或高度严格的条件下沿着整个序列的全长或至少约50％、60％、70％、80％、或90％或更多彼此杂交。在杂交中，也考虑包括代替密码子的简并密码子的多核苷酸。
任意两个多核苷酸序列或多肽序列是否具有同源性、相似性、或同一性可利用通过Pearson等人,(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444]引入的默认参数利用本领域已知的计算机算法(例如“FASTA”程序)来确定。或者，可使用在EMBOSS包的Needleman程序(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等人,2000,Trends Genet.16:276–277)(5.0.0或更高版本)中执行的Needleman–Wunsch算法(Needleman and Wunsch，J.Mol.Biol.48:443–453)以确定其。(包括GCG程序包(Devereux,J.等人,Nucleic Acids Research 12:387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,[S.][F.,][ET AL,J MOLEC BIOL 215]:403(1990)；Guide to Huge Computers,MartinJ.Bishop,[ED.,]Academic Press,San Diego,1994,和[CARILLOETA/.](1988)SIAM JApplied Math 48:1073)。例如，同源性、相似性、或同一性可利用美国国家生物技术信息数据库中心的BLAST或ClustalW来确定。
多核苷酸或多肽之间的同源性、相似性、或同一性可例如通过利用，如Smith andWaterman(Adv.Appl.Math(1981)2:482)公开的GAP计算机程序(如，Needleman等人,(J MolBiol.48:443(1970))引入的程序)比较给定的序列信息来确定。简言之，GAP程序将同源性、相似性、或同一性定义为相似的比对符号(即，核苷酸或氨基酸)的数量除以两序列中较短者的符号总数的值。用于GAP程序的默认参数可包括：(1)一元比较矩阵(包括用于同一性的值为1和用于非同一性的值为0)和如Schwartz and Dayhoff,eds.,(Atlas Of ProteinSequence And Structure,National Biomedical Research Foundation,pp.353-358(1979))描述的Gribskov等人,(Nucl.Acids Res.14:6745(1986)的加权比较矩阵(或EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵)；(2)每个空位的罚值为3.0，且每个空位中的每个符号为额外0.10罚值(或空位开放罚值为10和空位延伸罚值为0.5)；和(3)末端空位无罚值。因此，如本文所用，术语“同源性”或“同一性”代表序列之间的相关性。
本公开的又一方面提供了多核苷酸，其编码内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽。
如本文所用，术语“多核苷酸”是指作为核苷酸单体通过共价键连接的长链的核苷酸聚合物具有一定长度以上的DNA或RNA链，且更具体地是指编码上述修饰蛋白的多核苷酸片段。
编码本公开的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽的多核苷酸可以不受限制地包括编码本公开的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽的任何多核苷酸序列。编码本公开的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽的多核苷酸可以不受限制地包括编码修饰蛋白——其中SEQ ID NO:1的氨基酸序列中第169个氨基酸被不同的氨基酸取代——的任何多核苷酸序列。具体地，多核苷酸可以包括编码变异体的多核苷酸序列，变异体中SEQID NO:1的氨基酸序列中第169个氨基酸被亮氨酸取代。例如，编码本公开的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽的多核苷酸可以是编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸序列，但多核苷酸不限于此。更具体地，多核苷酸可以是由SEQ ID NO:4组成的多核苷酸序列组成的多核苷酸，但多核苷酸不限于此。考虑到密码子简并性和待表达蛋白质的生物有机体中优选的密码子，可以在不改变蛋白质氨基酸序列的范围内在多核苷酸的编码区进行各种修饰。因此，明显的是，本公开中还可以包括可以被翻译成由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成的多肽或与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有同源性或同一性的多肽的任何多核苷酸。
另外，可以不受限制地包括在严格条件下通过与可由已知基因序列制备的任何探针(例如，与上述核苷酸序列的全部或部分的互补序列)杂交，来编码内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽——其中SEQ ID NO:1的氨基酸序列中第169个氨基酸被不同的氨基酸取代——的任何序列。
术语“严格条件”是指能够在多核苷酸之间进行特异性杂交的条件。这些条件在参考文献(例如，J Sambrook等人，同上)中具体描述。例如，严格条件可以包括在具有高同源性或同一性(例如，80％或更多，85％或更多，具体为90％或更多，更具体为95％或更多，甚至更具体为97％或更多，且甚至更具体为99％或更多)的基因之间彼此进行杂交，而在具有比其低的同源性或同一性的基因之间彼此不进行杂交的条件；或Southern杂交的常规洗涤条件(即，在对应于60℃，1×SSC和0.1％SDS；具体地，60℃，0.1×SSC和0.1％SDS；和更具体地68℃，0.1×SSC和0.1％SDS的盐浓度和温度下，洗涤一次，且具体地，两次或三次的条件)。
虽然由于杂交的严格程度，可能发生核苷酸之间的错配，但要求两个核酸具有互补序列。术语“互补的”用于描述能够彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，关于DNA，腺苷与胸腺嘧啶互补，以及胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开不仅可包括实质上相似的核酸序列，而且包括与整个序列互补的分离的核酸片段。
具体地，可以使用包括在55℃的Tm值下的杂交步骤的杂交条件以及上述条件，来检测具有同源性或同一性的多核苷酸。另外，Tm值可以是60℃、63℃或65℃，但不限于此，并且可以由本领域普通技术人员根据目的适当地调节。
用于多核苷酸的杂交的适当严格程度取决于多核苷酸的长度和互补程度，并且这些变量在本领域中是公知的(参见Sambrook等人，同上，9.50-9.51和11.7-11.8)。
如本文所用，术语“载体”是指包括编码目标修饰蛋白的多核苷酸的核苷酸序列的DNA构建体，该核苷酸序列可操作地连接到适当的控制序列，以使目标修饰蛋白能够在适当的宿主细胞中表达。控制序列可包括能够启动转录的启动子、用于控制这种转录的任意操纵子序列、编码适当mRNA核糖体结合结构域的序列、以及控制转录和翻译的终止的序列。在载体被转化到适当的宿主细胞中后，载体可以独立于宿主基因组复制或发挥作用，和可以整合到基因组其本身中。
只要本公开中使用的载体能在宿主细胞中复制，则对其没有特别限制，并且可以使用本领域已知的任何载体。通常使用的载体的实例可包括天然或重组质粒、黏粒、病毒和噬菌体。例如，作为噬菌体载体或黏粒载体，可以使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、和Charon21A等；且作为质粒载体，可以使用基于pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL、pET等的载体。具体地，可以使用诸如pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、和pCC1BAC等载体。
例如，编码染色体中的目标修饰蛋白的多核苷酸可以通过用于细胞内染色体插入的载体用修饰的多核苷酸置换。将多核苷酸插入到染色体中可以利用本领域已知的任何方法(例如，同源重组)进行，但该方法不限于此。载体可以进一步包括选择标记以确认其成功插入到染色体中。选择标记用于选择被载体转化的细胞，即，以确认是否已经插入目标核酸分子，且可以使用提供可选择表型(例如，耐药性、辅源营养、对细胞毒剂的耐性、或表面蛋白的表达等)的标记。在被选择剂处理的情况下，只有表达选择标记的细胞才能存活或表达其它表型性状，且因此可以选择转化的细胞。
本公开的又一方面提供了微生物，其包含修饰蛋白或编码修饰蛋白的多核苷酸，且因此能够生产L-苏氨酸。具体地，包含变异蛋白或编码修饰蛋白的多核苷酸的微生物可以是通过用包含编码修饰蛋白的多核苷酸的载体转化来制备的微生物，但微生物不限于此。
如本文所用，术语“转化”是指将包含编码目标蛋白的多核苷酸的载体引入到宿主细胞中，使得由多核苷酸编码的蛋白在宿主细胞中表达。只要转化的多核苷酸可以在宿主细胞中表达，则转化的多核苷酸可被整合到宿主细胞的染色体中并位于其中、或位于染色体外、或与其无关地包括这两者。另外，多核苷酸包括编码目标蛋白的DNA和RNA。只要多核苷酸能够被引入到宿主细胞中并在其中表达，则其可以以任何形式引入。例如，可以以表达盒的形式将多核苷酸引入到宿主细胞中，表达盒是包括其自主表达所需的所有元件的基因构建体。通常，表达盒可包括可操作地连接到多核苷酸的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点、和翻译终止信号。表达盒可以是可自复制表达载体的形式。另外，多核苷酸可以是被原样引入到宿主细胞中并在宿主细胞中与表达所需的序列可操作地连接的多核苷酸，但多核苷酸不限于此。
如本文所用，术语“可操作地连接”意指启动子序列与上述基因序列功能性连接，该启动子序列启动并介导编码本公开的目标修饰蛋白的多核苷酸的转录。
本公开的又一方面提供了棒杆菌属的微生物，其包含内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽或编码该多肽的多核苷酸。
如本文所用，术语“包含内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽或编码该修饰多肽的多核苷酸的微生物”可指重组微生物，其被制备使得本公开的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽被表达。例如，它可以指这样的宿主细胞或微生物，其包含编码内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽的多核苷酸，或者其用包含编码内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽的多核苷酸的载体转化，从而能够表达该变异体。为了本公开的目的，具体地，微生物是表达内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽——其在SEQ ID NO:1的氨基酸序列内包括一个或多个氨基酸取代——的微生物，并且微生物可以是表达修饰蛋白——其中在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中距N-末端第169个氨基酸被亮氨酸取代，从而具有内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽的活性——的微生物，但微生物不限于此。
包含内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽或编码其的多核苷酸的微生物可能是包含内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽或编码其的多核苷酸从而能够生产L-氨基酸(例如，L-苏氨酸)的任何微生物，但微生物不限于此。例如，包含内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶修饰多肽或编码其的多核苷酸的微生物可以是重组微生物，重组微生物通过将编码内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽的多核苷酸引入到天然野生型微生物或生产L-氨基酸的微生物中来制备，从而能够表达内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽并增强生产L-氨基酸的能力。生产L-氨基酸的能力增强的重组微生物可以是与天然野生型微生物或未修饰微生物相比生产L-氨基酸的能力增强的微生物，且L-氨基酸可以是L-苏氨酸，但这些不限于此。
如本文所用，术语“生产L-氨基酸的微生物”包括野生型微生物和其中发生自然或人工遗传修饰的微生物，并且其可以是其中由于外源基因的插入、由于内源性基因的活性增强或失活等而减弱或增强特定机制的微生物，其中发生遗传变异或增强活性以产生期望的L-氨基酸。对应微生物可以是以下为生物：通过选自修饰多肽、编码该修饰多肽的多核苷酸和包含该多核苷酸的载体中的任何一个或多个而被基因修饰的微生物；被修饰以表达修饰多肽或编码该修饰多肽的多核苷酸的微生物；表达修饰多肽或编码该修饰多肽的多核苷酸的重组微生物；或具有修饰多肽的活性的重组微生物，但微生物不限于此。
生产L-氨基酸的微生物可以是包含修饰多肽或编码该修饰多肽的多核苷酸的微生物，或者是其中引入有包含该多核苷酸的载体以增强生产期望的L-氨基酸的能力的微生物。具体地，可以通过转化来实现引入，但不限于此。
另外，在本公开中，生产L-氨基酸的微生物或具有生产L-氨基酸能力的微生物可以是其中参与L-氨基酸生物合成途径的基因(一个或多个)的部分被增强或减弱的微生物，或者是其中参与L-氨基酸降解途径的基因(一个或多个)的部分被增强或减弱的微生物。
为了本公开的目的，微生物可以包括任何微生物，其包括修饰多肽并从而能够生产L-苏氨酸或衍生自L-苏氨酸的氨基酸。
术语“非修饰微生物”，是指天然菌株本身；不包含内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽的微生物；或未用包含编码内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽的多核苷酸的载体转化的微生物。“微生物”可以包括原核微生物或真核微生物，只要该微生物能生产L-氨基酸即可。例如，“微生物”可包括埃希氏菌(Escherichia)属、欧文氏菌(Erwinia)属、沙雷氏菌(Serratia)属、普罗威登斯菌(Providencia)属、棒杆菌属和短杆菌(Brevibacterium)属的微生物。具体地，微生物可以是棒杆菌属的微生物，且更具体地，是谷氨酸棒杆菌，但微生物不限于此。
具体地，为了增强棒杆菌属的微生物中L-苏氨酸的生物合成途径，例如，可在微生物内增强或增加以下基因的表达：编码苏氨酸合酶的thrC基因；编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的ppc基因；参与葡萄糖摄取的galP基因；编码赖氨酸敏感性天冬氨酸激酶3的lysC基因；编码高丝氨酸脱氢酶的hom基因；诱导草酰乙酸池(oxaloacetate pool)的增加的pyc基因等。
为了解除关于L-苏氨酸的反馈抑制，例如，可以将基因修饰引入到lysC基因、hom基因、thrA基因(其具有天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶1的双功能特性(Bifunctionalaspartokinase/homoserine dehydrogenase 1))等中。
为了失活减弱L-苏氨酸生物合成途径的基因，例如，在微生物中可减弱或失活以下基因的表达：参与将草酰乙酸(OAA)(即，L-苏氨酸生物合成的中间体)转化为磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的pckA基因的表达；抑制lysC基因表达的tyrR基因的表达；抑制参与葡萄糖摄取的galP基因表达的galR基因的表达；mcbR基因(即，DNA结合转录双重调节因子)的表达等。
为了增加L-苏氨酸操纵子的活性，可以将包含由编码天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶的基因组成的苏氨酸操纵子的质粒(日本专利申请公开号2005-227977)、源自大肠杆菌(E.coli)等的苏氨酸操纵子引入到微生物(TURBA E,等人,Agric.Biol.Chem.53:2269-2271,1989)中，从而增加苏氨酸操纵子在微生物内的表达。
此外，还可对L-苏氨酸类似物(例如，α-氨基-β-羟基戊酸、D,L-苏氨酸异羟肟酸等)赋予耐性。
此外，可以减弱作用于L-赖氨酸生物合成途径并与L-苏氨酸具有共同前体的基因(例如，二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)(即，4-羟基-四氢吡啶二羧酸还原酶)、二氨基庚二酸脱羧酶(lysA)和二氨基庚二酸脱氢酶(ddh))。
然而，基因表达的方法不限于此，且可以通过本领域已知的基因表达控制方法来增强生产L-苏氨酸的能力。
如本文所用，术语“增强/增加”是包括与其内源性活性相比基因活性增加的全部概念。
基因活性的这种增强或增加可以通过应用本领域公知的各种方法来实现。基因活性的增强或增加可以通过选自以下的一种或多种方法来实现：增加细胞中基因拷贝数的方法；在基因的表达控制序列上引入修饰的方法；用具有更强活性的序列置换基因的表达控制序列的方法；在对应基因上引入进一步修饰，以增强基因活性的方法；以及在微生物中引入外源基因的方法，并且可以通过这些方法的组合来实现，但方法并不特别限于此。
如本文所用，术语“失活”是概念，其包括基因的活性与其内源性活性相比被减弱的情况和基因没有活性的情况。
基因活性的这种失活或减弱可以通过应用本领域公知的各种方法来实现。这些方法的实例包括：缺失染色体上基因的全部或部分的方法，包括其中该基因的活性被移除的情况；用突变基因置换染色体上编码对应蛋白质的基因，以减少对应蛋白质活性的方法；在染色体上编码蛋白质的基因的表达控制序列上引入修饰的方法；用较弱活性或无活性的序列置换编码蛋白质的基因的表达控制序列的方法(例如，用与其内源性启动子相比具有较弱活性的启动子置换基因的启动子的方法)；缺失染色体上编码蛋白质的基因的全部或部分的方法；引入反义寡核苷酸(例如，反义RNA)的方法，该反义寡核苷酸与染色体上编码蛋白质的基因的转录物互补结合，从而抑制mRNA翻译成蛋白质；向染色体上的编码蛋白质的基因的Shine-Dalgarno(SD)序列的上游区域人工添加与SD序列互补的序列并形成二级结构，从而使核糖体无法附着的方法；逆转录工程(RTE)的方法，其中将启动子添加到待逆转录的对应序列的开放阅读框(ORF)的3’端；等。此外，基因的活性的失活或减弱可以通过这些方法的组合来实现，但方法并不特别限于此。
例如，lysC、hom和pyc基因的活性的增强可以通过以下方法来实现：增加细胞中基因拷贝数的方法；在基因的表达控制序列上引入修饰的方法；用具有更强活性的序列置换基因的表达控制序列的方法；在对应基因上引入进一步修饰，以增强基因的活性的方法；在微生物中引入外源基因的方法；等，但方法不特别限于此，且为了增强或增加基因活性，可以不受限制地使用任何已知的方法。
例如，dapA、ddh和lysA基因的活性的减弱可以通过以下方法来实现：缺失染色体上基因的全部或部分方法，包括移除该基因活性的情况；用突变基因置换染色体上编码对应蛋白质的基因，以减少对应蛋白质的活性的方法；在染色体上编码蛋白质的基因的表达控制序列上引入修饰的方法；用较弱活性或无活性的序列置换编码蛋白质的基因的表达控制序列的方法(例如，用与其内源性启动子相比具有较弱活性的启动子置换基因的启动子的方法)；缺失染色体上编码蛋白质的基因的全部或部分的方法；等，但方法不限于此，且为了减弱基因活性，可以不受限制地使用任何已知的方法。
此外，在本公开中，包含内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽的微生物可以进一步包括选自以下修饰多肽的一种或多种，或者选自编码以下修饰多肽的多核苷酸的一种或多种。
进一步包括的修饰多肽可以是选自以下的一种或多种：二氢吡啶二羧酸还原酶(dapB)(即，4-羟基-四氢吡啶二羧酸还原酶)的修饰多肽，其中SEQ ID NO:81的氨基酸序列中第13个氨基酸精氨酸被天冬酰胺取代；二氨基庚二酸脱羧酶(lysA)的修饰多肽，其中SEQID NO:82的氨基酸序列中第408个氨基酸甲硫氨酸被丙氨酸取代；以及二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)的修饰多肽，其中SEQ ID NO:83的氨基酸序列中第119个氨基酸酪氨酸被苯丙氨酸取代。
二氢吡啶二羧酸还原酶的修饰多肽的氨基酸序列——其中SEQ ID NO:81的氨基酸序列中第13个氨基酸精氨酸被天冬酰胺取代——可以是SEQ ID NO:66，但氨基酸序列不限于此。在本公开中，修饰多肽或编码修饰多肽的多核苷酸的引入可以减少赖氨酸的生产量，同时增加苏氨酸的生产量。
二氨基庚二酸脱羧酶的修饰多肽的氨基酸序列——其中SEQ ID NO:82的氨基酸序列中第408个氨基酸甲硫氨酸被丙氨酸取代——可以是SEQ ID NO:71，但氨基酸序列不限于此。二氨基庚二酸脱羧酶是作用于赖氨酸生物合成的最终酶，且第408个氨基酸由甲硫氨酸取代为丙氨酸可减少赖氨酸的生产量，同时增加了苏氨酸的生产量。
二氢吡啶二羧酸合酶的修饰多肽的氨基酸序列——其中SEQ ID NO:83的氨基酸序列中第119个氨基酸酪氨酸被苯丙氨酸取代——可以是SEQ ID NO:76，但氨基酸序列不限于此。二氢吡啶二羧酸合酶是由天冬氨酰半醛(即，赖氨酸和苏氨酸的共同前体)生物合成赖氨酸的酶，且第119个氨基酸由酪氨酸取代为苯丙氨酸可减少赖氨酸的生产量，同时增加苏氨酸的生产量。
本公开的又一方面提供了制备苏氨酸或衍生自苏氨酸的L-氨基酸的方法，其包括在培养基中培养棒杆菌属的微生物的步骤，该棒杆菌属的微生物包含具有内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶活性的修饰多肽。
衍生自苏氨酸L-氨基酸不仅可以包括衍生自苏氨酸的L-氨基酸，而且可以包括其衍生物。例如，衍生自苏氨酸的L-氨基酸可以是L-苏氨酸、L-异亮氨酸、O-乙酰基-L-高丝氨酸、O-琥珀酰-L-高丝氨酸、O-磷酸-L-高丝氨酸、L-甲硫氨酸和/或L-甘氨酸，但衍生自苏氨酸的L-氨基酸不限于此。更具体地，衍生自苏氨酸的L-氨基酸可以是L-苏氨酸、L-异亮氨酸、O-乙酰基-L-高丝氨酸、O-琥珀酰-L-高丝氨酸和/或L-甲硫氨酸，但衍生自苏氨酸的L-氨基酸不限于此。
在上述方法中，培养微生物的步骤不受特别限制，而可以通过本领域已知的分批培养法、连续培养法、补料分批培养法等进行。特别地，培养条件不受特别限制，而可以使用碱性化合物(例如，氢氧化钠、氢氧化钾或氨)或酸性化合物(例如，磷酸或硫酸)调节最适pH(例如，pH 5至9，具体地，pH 6至8，和最具体地，pH 6.8)，且可以将氧或含氧气体混合物引入到培养物以维持好氧状态，但培养条件不限于此。培养温度可维持在20℃至45℃，且具体地在25℃至40℃，且培养可进行约10小时至160小时，但这些不限于此。此外，由培养产生的L-氨基酸可以被分泌到培养基中，或可留在细胞中。
此外，作为在用于培养的培养基中待用的碳源，糖和碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、和纤维素)、油和脂肪(例如，大豆油、向日葵油、花生油和椰子油)、脂肪酸(例如，棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇(例如，甘油和乙醇)、和有机酸(例如，乙酸)等可以单独使用或组合使用，但碳源不限于此。作为氮源，含氮的有机化合物(例如，蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素)和无机化合物(例如，硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)等可以单独使用或组合使用，但氮源不限于此。作为磷源，磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、其相应的含钠盐等可以单独使用或组合使用，但磷源不限于此。此外，培养基可能包括诸如金属盐(例如，硫酸镁或硫酸铁)、氨基酸和维生素的必要的促生长物质。
培养本公开的微生物的步骤可进一步包括从培养培养基和微生物中回收L-苏氨酸或衍生自L-苏氨酸的L-氨基酸的步骤。
关于回收在培养步骤中产生的L-苏氨酸或衍生自L-苏氨酸的L-氨基酸的方法，可以根据培养方法使用本领域已知的适当方法，从培养液中收集期望的L-苏氨酸或衍生自L-苏氨酸的L-氨基酸。例如，可以使用离心、过滤、阴离子交换层析、结晶、HPLC等，并且可以使用本领域已知的适当方法从培养基或微生物中回收期望的L-苏氨酸或衍生自L-苏氨酸的L-氨基酸。
回收步骤可以包括纯化步骤，该步骤可以使用本领域已知的适当方法进行。因此，回收的L-苏氨酸或衍生自L-苏氨酸的L-氨基酸可以是纯化的形式或包含L-氨基酸的微生物的发酵液(Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering,A.J.Nair.,2008)。
本公开的又一方面提供了用于生产L-苏氨酸的组合物，其包括微生物或含有该微生物的培养液，该微生物包含具有本公开的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶活性的修饰多肽、编码该修饰多肽的多核苷酸、以及包含该多核苷酸的载体、或这些中的任何一种。
内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶、其修饰多肽、多核苷酸、载体和微生物与上述相同。
该微生物可以是棒杆菌属的微生物，且具体地是谷氨酸棒杆菌，但微生物不限于此。这与上述相同。
生产L-苏氨酸的组合物可以是指能够通过具有内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶活性的修饰多肽生产L-苏氨酸的组合物。组合物可不受限制地包括具有内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶活性的修饰多肽、或能够操作具有内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶活性的修饰多肽的构造(组成，)。具有内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶活性的修饰多肽可以处于这样的形式，其中修饰多肽被包括在载体中，以在引入有修饰多肽的宿主细胞中表达与载体可操作连接的基因。
组合物可进一步包含冻干保护剂或赋形剂。冻干保护剂或赋形剂可以是非天然存在的物质或天然存在的物质，但不限于此。在另一具体实施方式中，冻干保护剂或赋形剂可以是微生物不自然接触的物质，或者不与微生物自然地同时包含的物质，但不限于此。
本公开的又一方面提供了微生物的用于生产L-苏氨酸或衍生自L-苏氨酸的L-氨基酸的用途，该微生物包含本公开的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽、编码该修饰多肽的多核苷酸、包含该多核苷酸的载体、或这些中的任何一种。
实施例
以下，将参考以下实施例更详细地描述本公开。然而，这些实施例仅用于示例目的，并且本发明的范围不受这些实施例的限制。
实施例1：用于在ddh基因的ORF内引入修饰的载体文库的制备
为了发现其中谷氨酸棒杆菌的ddh基因的表达水平或其活性减少的变异体，通过如下所示的方法制备了文库。
首先，为了由ddh基因(963bp)组成的DNA片段(963bp)每1kb引入0至4.5个修饰，使用了GenemorphII随机突变试剂盒(GenemorphII Random Mutagenesis kit)(Stratagene)。使用谷氨酸棒杆菌ATCC13032(WT)的染色体DNA作为模板，并用SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的引物进行了易错PCR。具体地，使含有WT菌株的染色体DNA(500ng)、SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6的引物(各125ng)、Mutazyme II反应缓冲液(1X)、dNTP混合物(40mM)和Mutazyme II DNA聚合酶(2.5U)的反应液经受以下条件：在94℃下变性2分钟；25个循环(在94℃下变性1分钟，在56℃下退火1分钟，以及在72℃下聚合3分钟)；以及在72℃下聚合10分钟。
使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)将扩增的基因片段连接到pCRII载体上，以及将所得载体转化到大肠杆菌DH5α中，以及将转化体平皿接种在含有卡那霉素(25mg/L)的LB固体培养基上。选择20种转化菌落后，从转化菌落中的每种获得了质粒。分析核苷酸序列的结果，发现了在相互不同的位置上以0.5个突变/kb的频率引入了修饰。最后，收集了约10,000个转化的大肠杆菌菌落并从中提取了质粒。所得物被命名为pTOPO-ddh(mt)文库。
实施例2:ddh缺失的菌株的制备及随机诱变文库的筛选
为了确认ddh缺失对L-赖氨酸生产的影响，使用了谷氨酸棒杆菌KCCM11016P菌株(韩国专利号10-0159812)。为了制备谷氨酸棒杆菌KCCM11016P菌株(其中缺失了ddh基因)，如下制备了pDZ-Δddh载体(其中缺失了ddh基因)。
具体地，以位于ddh基因的5’和3’端的DNA片段(各600bp)各自与pDZ载体(韩国专利申请公开号2009-0094433)连接的形式制备了载体。基于报道的ddh基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)，合成了SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的引物(其中在5’片段和3’片段分别插入有限制性内切酶XbaI的识别位点)以及SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的引物(其分别与SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8相隔663bp)(表1)。使用谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA作为模板，用SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9的引物一起通过PCR制备了5’端基因片段。以同样的方法，使用SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10的引物，通过PCR制备了位于ddh基因3’端的基因片段。按照以下进行了PCR：在94℃下变性2分钟；30个循环(在94℃下变性1分钟，在56℃下退火1分钟，以及在72℃下聚合40秒)；以及在72℃下聚合10分钟。
同时，将pDZ载体(其用限制性内切酶XbaI酶切，然后在65℃下进行热处理20分钟)使用Infusion克隆试剂盒连接到通过PCR扩增的插入DNA片段，以及将所得物转化到大肠杆菌DH5α中，以及将转化体平皿接种在含有卡那霉素(25mg/L)的LB固体培养基上。选择用载体(使用SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的引物通过PCR将期望基因插入其中)转化的菌落，通过本领域公知的质粒提取方法获得了质粒，并将获得的质粒命名为pDZ-Δddh。
[表1]
SEQ ID NO 序列(5'->3')
SEQ ID NO:7 CGGGGATCCTCTAGATGACCAACATCCGCG
SEQ ID NO:8 CAGGTCGACTCTAGATTAGACGTCGCGTGCG
SEQ ID NO:9 CGGTGAAATCGGCGACATCAAAGACTG
SEQ ID NO:10 GATGTCGCCGATTTCACCGCTTCCTC
将制备的载体pDZ-Δddh通过电穿孔(Van der Rest等人,Appl.Microbiol.Biotecnol.52:541-545,1999)转化到谷氨酸棒杆菌KCCM11016P菌株中，然后通过同源染色体重组制备了其中缺失ddh基因的菌株。将制备的其中缺失ddh基因的菌株命名为谷氨酸棒杆菌WT::Δddh。
另外，通过电穿孔将上述实施例1中制备的pTOPO-ddh(mt)文库转化到KCCM11016P::Δddh菌株中，并将转化体平皿接种在含有卡那霉素(25mg/L)的复合平板培养基上，以及从中获得了约20,000个菌落。将每个菌落接种到以下选择培养基(300μL)中，然后在96深孔板中在32℃下以1,000rpm培养了约24小时。
<选择培养基(pH 8.0)>
10g葡萄糖、5.5g硫酸铵、1.2g MgSO4·7H2O、0.8g KH2PO4、16.4g K2HPO4、100μg生物素、1mg盐酸硫胺素、2mg泛酸钙、2mg烟酰胺(每1L蒸馏水)
使用茚三酮法分析了培养液中产生的L-赖氨酸的量(Moore,S.,Stein,W.H.,Photometric ninhydrin method for use in the chromatography of aminoacids.J.Biol.Chem.1948,176,367-388)。
培养完成后，将培养上清液(10μL)与茚三酮反应液(190μL)在65℃下反应了30分钟，以及使用分光光度计在570nm波长处测量了吸光度。使用WT菌株和WT::Δddh菌株作为对照组。选择了60种菌株，其与WT菌株(即，野生型)相比显示出较低的吸光度而与WT::Δddh菌株相比显示出较高吸光度。
将选择的60种菌株以与上述相同的方式再次培养，然后反复进行了茚三酮反应。结果，选择了显示与KCCM11016P::Δddh菌株相比，生产L-赖氨酸的能力增强，但与KCCM11016P菌株相比生产L-赖氨酸的能力减少的前5种突变菌株。选择的5种菌株分别被命名为KCCM11016P::ddh(mt)-1至KCCM11016P::ddh(mt)-5(表2)。
[表2]5种选择的随机突变菌株的L-赖氨酸生产的浓度
实施例3：5种ddh的修饰菌株的核苷酸序列的确认
为了确认5种选择的菌株(即，KCCM11016P::ddh(mt)-1至KCCM11016P::ddh(mt)-5)的ddh基因的核苷酸序列，使用实施例1所示的引物(SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)通过PCR扩增了染色体中包含ddh基因的DNA片段。如下进行了PCR：在94℃下变性2分钟；30个循环(在94℃下变性1分钟，在56℃下退火1分钟，以及在72℃下聚合40秒)；以及在72℃下聚合10分钟。
[表3]
SEQ ID NO 序列(5'->3')
SEQ ID NO:5 ATGACCAACATCCGCGTAGC
SEQ ID NO:6 TTAGACGTCGCGTGCGATCAG
分析扩增基因的核苷酸序列的结果，发现5种菌株为：i)变异体，其中一个修饰被引入到位于ddh基因的ORF起始密码子下游第37位的核苷酸序列中，且因此使原有序列“AAC”转变为“GAC”(即，距N-端第13个氨基酸(即，天冬酰胺)被天冬氨酸取代)；ii)变异体，其中三个修饰被引入到在包括ddh基因的ORF起始密码子下游第106至第108个核苷酸的核苷酸序列中，且因此使原有序列“CGC”转变为“ATG”(即，距N-端第36个氨基酸(即，精氨酸)被甲硫氨酸取代)；iii)变异体，其中两个修饰被引入到包括ddh基因的ORF起始密码子下游第448至第449个核苷酸的核苷酸序列中，且因此使原有序列“CAG”转变为“ATG”(即，距N-端(即，谷氨酰胺)第150个氨基酸被甲硫氨酸取代)；iv)变异体，其中两个修饰被引入到包括ddh基因的ORF起始密码子下游第505至第506个核苷酸的核苷酸序列中，且因此使原有序列“ACC”转变为“CTC”(即，距N-端第169个氨基酸(即，苏氨酸)被亮氨酸取代)；和v)变异体，其中两个修饰被引入到包括ddh基因的ORF起始密码子下游第584至第585个核苷酸的核苷酸序列中，且因此使原有序列“CGC”转变为“CAA”(即，距N-端第195个氨基酸(即，精氨酸)被谷氨酰胺取代)。
实施例4：其中引入5种ddh修饰的ATCC13032菌株的制备，及其生产苏氨酸和赖氨酸的能力的评价
对于上述实施例3中确认的5种修饰，为了最终选择其中生产L-赖氨酸的能力可再现地减少，而生产L-苏氨酸的能力增加的菌株，制备了其中引入有修饰的野生型来源的菌株。
为了在谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株中制备其中引入有修饰ddh基因的菌株，如下制备了修饰ddh基因可被引入其中的5种载体(即，pDZ::ddh m1至pDZ::ddh m5)。
具体地，以位于ddh基因的5’和3’端的DNA片段(各963bp)各自与pDZ载体(韩国专利号2009-0094433)连接的形式制备了载体。基于报道的ddh基因的核苷酸序列(SEQ IDNO:2)，合成了SEQ ID NO:11的引物(其中在5’片段和3’片段分别插入有限制性内切酶XbaI的识别位点)和SEQ ID NO:12的引物(分别与SEQ ID NO:11相隔931bp)。
使用上述实施例3中确认的KCCM11016P::ddh(mt)-1至KCCM11016P::ddh(mt)-5的染色体DNA，以及SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的引物，通过PCR制备了修饰的DNA片段。如下进行了PCR：在94℃下变性2分钟；30个循环(在94℃下变性1分钟，在56℃下退火1分钟，以及在72℃下聚合40秒)；以及在72℃下聚合10分钟。
同时，将pDZ载体(其用限制性内切酶XbaI酶切，然后在65℃下进行热处理20分钟)使用Infusion克隆试剂盒连接到通过PCR扩增的修饰的DNA片段，以及将所得物转化到大肠杆菌DH5α中，以及将转化体平皿接种在含有卡那霉素(25mg/L)的LB固体培养基上。选择用载体(使用SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的引物通过PCR将期望基因插入其中)转化的菌落，通过本领域公知的质粒提取方法获得了质粒，并将获得的质粒分别命名为pDZ::ddh(mt)1至pDZ::ddh(mt)5。
将制备的载体(即，pDZ::ddh(mt)1至pDZ::ddh(mt)5)通过电穿孔各自转化到谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株中，然后进行二次交换过程，从而获得了在染色体上每个菌株中的ddh基因的部分核苷酸序列被修饰核苷酸(一个或多个)取代的菌株。使用下列引物对通过突变等位基因特异性扩增(Mutant Allele Specific Amplification)(MASA)PCR技术(Takeda等人,Hum.Mutation,2,112-117(1993))确定了取代是否适当，其中在与修饰序列一致的SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的引物对中，首先通过选择待扩增的菌株确定了取代的适当性，以及其次通过使用SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:15的引物对分析修饰序列确认了所选菌株的ddh基因的序列分析。制备的菌株(修饰ddh基因被引入到菌株中的每个中)分别被命名为谷氨酸棒杆菌ATCC13032::ddh(mt)1至谷氨酸棒杆菌ATCC13032::ddh(mt)5。
[表4]
SEQ ID NO 序列(5'->3')
SEQ ID NO:11 CGGGGATCCTCTAGATGACCAACATCCGCG
SEQ ID NO:12 CAGGTCGACTCTAGATTAGACGTCGCGTGCG
SEQ ID NO:13 CACAATTTTGGAGGATTAC
SEQ ID NO:14 TGGGTGACCACGATCAGAT
SEQ ID NO:15 GGAAACCACACTGTTTCC
对于其中引入有5种修饰的5种菌株，为了最终选择菌株(其中生产L-赖氨酸的能力可再现地减少，而生产L-苏氨酸能力增加)，采用以下培养基进行了烧瓶培养。培养完成后，使用HPLC分析了培养液中L-赖氨酸和苏氨酸的浓度，且各突变菌株中产生的L-赖氨酸和苏氨酸的浓度如下表5和表6中所示。
<种子培养基(pH 7.0)>
20g葡萄糖、10g蛋白胨、5g酵母提取物、1.5g尿素、4g KH2PO4、8g K2HPO4、0.5gMgSO4·7H2O、100μg生物素、1mg盐酸硫胺素、2mg泛酸钙、和2mg烟酰胺(每1L蒸馏水)
<生产培养基(pH 7.0)>
100g葡萄糖、40g(NH4)2SO4、2.5g大豆蛋白、5g玉米浆固体(corn steep solids)、3g尿素、1g KH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、100μg生物素、1mg盐酸硫胺素、2mg泛酸钙、3mg烟酰胺、30g CaCO3(每1L蒸馏水)
[表5]5种选择的随机突变菌株生产的L-赖氨酸的浓度
[表6]5种选择的随机突变菌株生产的L-苏氨酸的浓度
在选择的5种突变菌株中，作为其中生产L-赖氨酸的能力显著减少而生产L-苏氨酸的能力增强的菌株，选择了ATCC13032::ddh(mt)4菌株。
实施例5：其中引入有5种ddh修饰的ATCC13869菌株的制备，及其生产苏氨酸和赖氨酸的能力的评价
对于上述实施例3中确认的5种修饰，为了最终选择菌株(其中生产L-赖氨酸的能力可再现地减少，而生产L-苏氨酸的能力增加)，制备了其中引入有修饰的野生型来源的菌株。
为了在谷氨酸棒杆菌ATCC13869菌株中制备每个菌株均引入有修饰ddh基因的菌株，通过电穿孔将实施例4中制备的载体(即，pDZ::ddh(mt)1至pDZ::ddh(mt)5)转化到谷氨酸棒杆菌ATCC13869菌株中，以及使转化体进行二次交换，从而获得了在染色体上每个菌株中的ddh基因的部分核苷酸序列被修饰核苷酸(一个或多个)取代的菌株。使用下列引物对通过突变等位基因特异性扩增(MASA)PCR技术(Takeda等人,Hum.Mutation,2,112-117(1993))确定了取代是否适当，其中在与修饰序列一致的SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的引物对中，首先通过选择待扩增的菌株来确定取代的适当性，以及其次通过使用SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:15的引物对分析修饰序列来确认了所选菌株的ddh基因的序列分析。制备的菌株(修饰ddh基因被引入菌株中的每个中)分别被命名为谷氨酸棒杆菌ATCC13869::ddh(mt)1至谷氨酸棒杆菌ATCC13869::ddh(mt)5。
对于其中引入有5种修饰的5种菌株，为了最终选择菌株(其中生产L-赖氨酸的能力可再现地减少，而生产L-苏氨酸能力增加)，采用以下培养基进行了烧瓶培养。培养完成后，使用HPLC分析了培养液中L-赖氨酸和苏氨酸的浓度，且突变菌株中生产的L-赖氨酸和苏氨酸的浓度如下表7和表8中所示。
<种子培养基(pH 7.0)>
20g葡萄糖、10g蛋白胨、5g酵母提取物、1.5g尿素、4g KH2PO4、8g K2HPO4、0.5gMgSO4·7H2O、100μg生物素、1mg盐酸硫胺素、2mg泛酸钙、2mg烟酰胺(每1L蒸馏水)
<生产培养基(pH 7.0)>
100g葡萄糖、40g(NH4)2SO4、2.5g大豆蛋白、5g玉米浆固体、3g尿素、1g KH2PO4、0.5gMgSO4·7H2O、100μg生物素、1mg盐酸硫胺素、2mg泛酸钙、3mg烟酰胺、30g CaCO3(每1L蒸馏水)
[表7]5种选择的随机突变菌株生产的L-赖氨酸的浓度
[表8]5种选择的随机突变菌株生产的L-苏氨酸的浓度
对于ATCC13869::Δddh菌株(与ATCC13869菌株(即，野生型菌株)相比其中ddh被缺失)，确认了葡萄糖消耗速率显著减少，且因此抑制了菌株的生长。相反，对于所选的5种菌株，确认了葡萄糖消耗速率维持在与野生型菌株相当的水平的同时，L-赖氨酸的生产量减少，而苏氨酸的生产量增加。
在选择的5种突变菌株中，作为其中生产L-赖氨酸的能力显著减少而生产L-苏氨酸的能力增强的菌株，如实施例4中，选择了ATCC13032::ddh(mt)4菌株。
实施例6：在具有生产L-苏氨酸的能力的棒杆菌属的微生物中制备引入修饰ddh的菌株以及评价生产L-苏氨酸的能力
从野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株中开发了生产L-苏氨酸的菌株。具体地，为了解除作为L-苏氨酸生物合成途径中第一个重要酶的天冬氨酸激酶(lysC)的反馈抑制，将lysC的第377个氨基酸(即，亮氨酸)用赖氨酸取代(SEQ ID NO:16)。
更具体地，为了制备引入有lysC(L377K)修饰的菌株，使用谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA作为模板，分别与SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的引物对或SEQ IDNO:19和SEQ ID NO:20的引物对一起进行了PCR。使用PfuUltraTM高保真DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶用于PCR反应。如下进行了PCR：28个循环(在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，以及在72℃下聚合1分钟)。
结果，对于lysC基因的修饰，分别获得了在5’上游区的515bp DNA片段和和3’下游区的538bp DNA片段。使用两个扩增的DNA片段作为模板，与SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:20的引物一起进行了PCR。如下进行了PCR：在95℃下变性5分钟；28个循环(在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，以及在72℃下聚合2分钟)；以及在72℃下聚合5分钟。
[表9]
SEQ ID NO 序列(5'->3')
SEQ ID NO:17 TCGAGCTCGGTACCCGCTGCGCAGTGTTGAATAC
SEQ ID NO:18 TGGAAATCTTTTCGATGTTCACGTTGACAT
SEQ ID NO:19 ATGTCAACGTGAACATCGAAAAGATTTCCA
SEQ ID NO:20 CTCTAGAGGATCCCCGTTCACCTCAGAGACGATT
结果，扩增了1023bp的DNA片段，该片段包括编码天冬氨酸激酶变异体(其中第377个氨基酸(即，亮氨酸)被赖氨酸取代)的lysC基因的修饰。将扩增产物使用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化，并将其用作用于制备载体的插入DNA片段。同时，如下制备了用于将L377K修饰引入到染色体中的pDZ-L377K载体：将pDZ载体(其用限制性内切酶SmaI酶切，然后在65℃下进行热处理20分钟)和插入DNA片段(其通过上述PCR被扩增)以1:2的摩尔浓度比(M)组合，以及使用Infusion克隆试剂盒(TaKaRa)按提供的说明书进行了克隆。
通过电穿孔将制备的载体转化到ATCC13032菌株中，以及使转化的菌株进行二次交换，以及从而获得了其中在染色体上各核苷酸被修饰核苷酸取代的菌株。该菌株被命名为CJP1。CJP1被命名为CA01-2307，并于2017年3月29日保藏于布达佩斯条约下的国际保藏机构韩国微生物保藏中心(KCCM)，并且被分配保藏号KCCM12000P。
为了解除作为L-苏氨酸生产中的第二个重要酶高丝氨酸脱氢酶(hom)的反馈抑制，将hom的第407个氨基酸(即，精氨酸)用组氨酸取代(SEQ ID NO:21)。
更具体地，为了制备每个菌株中引入有hom(R407H)修饰的菌株，使用谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA作为模板，分别与SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23的引物对或SEQID NO:24和SEQ ID NO:25的引物对一起进行了PCR。采用PfuUltraTM高保真DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶用于PCR反应。如下进行了PCR：28个循环(在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，以及在72℃下聚合1分钟)。
[表10]
结果，对于hom基因的修饰，分别获得了在5’上游区的533bp DNA片段和3’下游区的512bp DNA片段。使用两个扩增的DNA片段作为模板，与用SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:25的引物一起进行了PCR。如下进行了PCR：在95℃下变性5分钟；28个循环(在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，以及在72℃下聚合2分钟)；以及在72℃下聚合5分钟。
结果，扩增了1018bp的DNA片段，该片段包括编码天冬氨酸激酶变异体(其中第407个氨基酸(即，精氨酸)被组氨酸取代)的hom基因的修饰。将扩增产物使用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)来纯化，并将其用作用于制备载体的插入DNA片段。同时，如下制备了用于将R407H修饰引入到染色体中的pDZ-R407H载体：将pDZ载体(其用限制性内切酶SmaI酶切，然后在65℃下进行热处理20分钟)和插入DNA片段(其通过上述PCR被扩增)以1:2的摩尔浓度比(M)组合，以及使用Infusion克隆试剂盒(TaKaRa)按提供的说明书进行了克隆。
通过电穿孔将制备的载体转化到CJP1菌株中，以及使转化的菌株进行二次交换，以及从而获得了其中在染色体上各核苷酸被修饰核苷酸取代的菌株。该菌株命名为CA09-0900(保藏号KCCM12418P)。
为了清楚地确认上述菌株的L-苏氨酸和L-赖氨酸生产的变化，在其中引入了T169L修饰，对编码内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶(DDH)的基因，T169L修饰在实施例5和6中显示出最高的L-苏氨酸生产和减少最多的L-赖氨酸生产。具体地，为了将T169L修饰引入到CA09-0900菌株中，通过电穿孔将实施例5中制备的pDZ::ddh(mt)4载体转化到CA09-0900菌株中，并以与实施例4中相同的方式使转化的菌株进行二次交换，以及从而获得了其中在染色体上核苷酸被修饰核苷酸取代的菌株。所得菌株被命名为CA09-0904。
CA09-0904菌株于2019年4月25日被保藏于布达佩斯条约下的国际保藏机构韩国微生物保藏中心(KCCM)，并被分配保藏号KCCM12503P。
[表11]制备菌株的生产L-苏氨酸和L-赖氨酸的能力的确认
结果，与CA09-0900菌株(对照组)相比，引入有修饰的菌株显示出L-赖氨酸的生产量降低了1.09g/L，而苏氨酸的生产量增加了0.85g/L(表11)，因此，确认了Ddh活性显著减少了，以及L-赖氨酸生产途径的减弱对L-苏氨酸的生产是积极的。
实施例7：其中用不同氨基酸取代ddh基因的第169个氨基酸(即，天冬酰胺)的各种菌株的制备
通过实施例6中制备的CA09-0904菌株，确认了减少L-赖氨酸生产的菌株对L-苏氨酸生产有积极影响。试图确认是否ddh基因中第169个氨基酸(即，苏氨酸)被野生型苏氨酸以外的蛋白原氨基酸的任何取代都可以增加苏氨酸生产。
为了引入包括实施例6中确认的T169L修饰的19种异种(异质，)核苷酸取代的修饰，如下制备了每种重组载体。
首先，使用从WT菌株提取的基因组DNA作为模板合成了引物(SEQ ID NO:26和SEQID NO:27)，其中在距ddh基因第505至第506个核苷酸的下游和上游相隔约600bp的位置处，将限制性内切酶(XbaI)的识别位点分别插入到5’片段和3’片段中。为了引入19种异种核苷酸取代的修饰，合成了用于取代ddh基因的核苷酸序列中第505至第506个核苷酸的引物(SEQ ID NO:28至SEQ ID NO:65)(表12)。
具体地，以位于ddh基因的5’和3’端的DNA片段(各600bp)与pDZ载体(韩国专利号2009-0094433)连接的形式制备了pDZ-ddh(T169A)质粒。使用WT菌株的染色体DNA作为模板，与SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:28的引物一起，通过PCR制备了ddh基因的5’端基因片段。如下进行了PCR：在94℃下变性2分钟；30个循环(在94℃下变性1分钟，在56℃下退火1分钟，以及在72℃下聚合40秒)；以及在72℃下聚合10分钟。同样，使用SEQ ID NO:27和SEQ IDNO:29的引物，通过PCR制备了ddh基因的3’端基因片段。将扩增的DNA片段使用PCR纯化试剂盒(Qiagen)来纯化，并将其用作用于制备载体的插入DNA片段。
同时，将通过PCR扩增的插入DNA片段和pDZ载体(其用限制性内切酶(XbaI)酶切，然后在65℃下进行热处理20分钟)使用Infusion克隆试剂盒连接，然后转化到大肠杆菌DH5α中。将所得菌株平皿接种在含有卡那霉素(25mg/L)的固体LB培养基上。选择了转化的菌落(其中使用SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27的引物，通过PCR将目的基因插入到载体中)，然后使用常规已知的质粒提取方法获得了质粒，并将其命名为pDZ-ddh(T169A)。
同样地，如下制备了质粒：使用引物(SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:30以及SEQ IDNO:27和SEQ ID NO:31)制备了pDZ-ddh(T169V)；使用引物(SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:32以及SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:33)制备了pDZ-ddh(T169Q)；使用引物(SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:34以及SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:35)制备了pDZ-ddh(T169H)；使用引物(SEQID NO:26和SEQ ID NO:36以及SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:37)制备了pDZ-ddh(T169R)；使用引物(SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:38以及SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:39)制备了pDZ-ddh(T169P)；使用引物(SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:40以及SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:41)制备了pDZ-ddh(T169L)；使用引物(SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:42以及SEQ ID NO:27和SEQID NO:43)制备了pDZ-ddh(T169Y)；使用引物(SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:44以及SEQ IDNO:27和SEQ ID NO:45)制备了pDZ-ddh(T169S)；使用引物(SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:46以及SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:47)制备了pDZ-ddh(T169K)；使用引物(SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:48以及SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:49)制备了pDZ-ddh(T169M)；使用引物(SEQID NO:26和SEQ ID NO:50以及SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:51)制备了pDZ-ddh(T169I)；使用引物(SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:52以及SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:53)制备了pDZ-ddh(T169E)；使用引物(SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:54以及SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:55)制备了pDZ-ddh(T169D)；使用引物(SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:56以及SEQ ID NO:27和SEQID NO:57)制备了pDZ-ddh(T169G)；使用引物(SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:58以及SEQ IDNO:27和SEQ ID NO:59)制备了pDZ-ddh(T169W)；使用引物(SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:60以及SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:61)制备了pDZ-ddh(T169C)；使用引物(SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:62以及SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:63)制备了pDZ-ddh(T169F)；以及使用引物(SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:64以及SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:65)制备了pDZ-ddh(T169N)。
[表12]
通过电穿孔将制备的载体转化到CA09-0901菌株的每个中。将异种核苷酸取代的修饰引入ddh基因的19种菌株被命名如下：CA09-0900::ddh(T169A)、CA09-0900::ddh(T169V)、CA09-0900::ddh(T169Q)、CA09-0900::ddh(T169H)、CA09-0900::ddh(T169R)、CA09-0900::ddh(T169P)、CA09-0900::ddh(T169L)、CA09-0900::ddh(T169Y)、CA09-0900::ddh(T169S)、CA09-0900::ddh(T169K)、CA09-0900::ddh(T169M)、CA09-0900::ddh(T169I)、CA09-0900::ddh(T169E)、CA09-0900::ddh(T169D)、CA09-0900::ddh(T169G)、CA09-0900::ddh(T169W)、CA09-0900::ddh(T169C)、CA09-0900::ddh(T169F)、和CA09-0900::ddh(T169N)。
通过实施例2中使用的方法缺失了CA09-0900菌株中的ddh基因，且将所得的菌株命名为CA09-0900::Δddh。CA09-0900和CA09-0900Δddh菌株被用作对照组，并将选择的19种菌株通过如下显示的方法进行了培养，并测量了赖氨酸和苏氨酸的浓度及其葡萄糖消耗速率。
[表13]生产赖氨酸的能力、生产苏氨酸的能力和葡萄糖消耗速率的测量
在ddh基因缺失的菌株中，与其亲本菌株相比，苏氨酸浓度增加了1.24g/L，且赖氨酸浓度减少了1.37g/L。考虑到葡萄糖减少了46.1％P，在由于ddh基因缺失而无DDH活性的情况下，虽然THR生产增加了且赖氨酸生产减少，但菌株的生长被抑制，因此使得难以工业化使用菌株。在包含修饰多肽的菌株(在每种菌株中SEQ ID NO:1的第169个氨基酸被不同的氨基酸取代)的情况下，在菌株的生长维持在可适用于工业的水平的同时，降低了LYS的生产并增加了THR的生产。即，确认了当ddh基因被减弱时，有助于在降低LYS生产的同时增加THR生产，且ddh基因是由于SEQ ID NO:1的第169个氨基酸的变化而被减弱(表13)。另外，对于第169个氨基酸的修饰，其中苏氨酸被赖氨酸取代的修饰导致赖氨酸生产减幅的和THR生产增幅的显著增加，且葡萄糖消耗速率处于商业可利用水平，并且因此被确定为最有效的。
实施例8：在具有生产L-苏氨酸的能力的棒杆菌属的微生物菌株中引入修饰ddh和修饰dapB的菌株的制备和评价
从实施例6中制备的CA09-0904菌株中，确认了其中减少L-赖氨酸生产的菌株对L-苏氨酸的生产有积极的影响。为了确认通过进一步减弱上述菌株中的L-赖氨酸的生物合成途径，是否能进一步增强生产L-苏氨酸的能力，开发了菌株。
具体地，为了减弱参与L-赖氨酸生物合成途径第二反应的酶(即，4-羟基-四氢吡啶二羧酸还原酶(dapB))的活性，将dapB的第13个氨基酸(即，精氨酸)用天冬酰胺取代(SEQID NO:66)。
更具体地，为了制备其中引入有dapB(R13N)修饰的菌株，使用ATCC13032菌株的染色体DNA作为模板，分别与SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:68的引物对或SEQ ID NO:69和SEQID NO:70的引物对一起进行了PCR。使用PfuUltraTM高保真DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶用于PCR反应。如下进行了PCR：28个循环(在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，以及在72℃下聚合1分钟)。
结果，对于dapB基因的修饰，分别获得了5’上游区的512bp DNA片段和3’下游区的514bp DNA片段。使用两个扩增的DNA片段作为模板，与SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:70的引物一起进行了PCR。如下进行了PCR：在95℃下变性5分钟；28个循环(在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，以及在72℃下聚合2分钟)；以及在72℃下聚合5分钟。
结果，扩增了1001bp的DNA片段，该片段包括编码4-羟基-四氢吡啶二羧酸还原酶变异体(其中第13个氨基酸(即，精氨酸)被天冬酰胺取代)的dapB基因的修饰。扩增产物使用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)来纯化，并将其用作用于制备载体的插入DNA片段。同时，如下制备了用于将R13N修饰引入到染色体中的pDZ-R13N载体：将pDZ载体(其用限制性内切酶SmaI酶切，然后在65℃下进行热处理20分钟)和插入DNA片段(其通过上述PCR被扩增)以1:2的摩尔浓度比(M)组合，以及使用Infusion克隆试剂盒(TaKaRa)按提供的说明书进行了克隆。
通过电穿孔将制备的载体转化到CA09-0904菌株中，以及使转化的菌株进行二次交换，从而获得了其中在染色体上各核苷酸被修饰核苷酸取代的菌株。菌株被命名为CA09-0904-R13N。
[表14]制备的菌株的生产L-苏氨酸和L-赖氨酸的能力确认
结果，引入有修饰的菌株，与CA09-0900菌株(对照组)相比显示出L-赖氨酸生产量降低了1.62g/L且L-苏氨酸生产量增加了1.51g/L，而与CA09-0904菌株相比显示出L-赖氨酸生产量降低了0.48g/L且L-苏氨酸生产量增加了0.62g/L(表14)。因此，确认了L-赖氨酸生产途径的减弱对L-苏氨酸的生产是积极的。
实施例9：在具有生产L-苏氨酸能力的棒杆菌属的微生物菌株中引入修饰ddh和修饰lysA的菌株的制备和评价
从实施例6中制备的CA09-0904菌株中，确认了其中减少L-赖氨酸生产的菌株对L-苏氨酸的生产有积极的影响。为了确认通过进一步减弱上述菌株中的L-赖氨酸的生物合成途径，是否能进一步增强生产L-苏氨酸的能力，开发了菌株。
具体地，为了减弱参与L-赖氨酸生物合成途径的最终反应的酶(即，二氨基庚二酸脱羧酶(lysA))的活性，将lysA的第408个氨基酸(即，甲硫氨酸)用丙氨酸取代(Biochemical and Biophysical Research Communications,Volume 495,Issue 2,8January 2018)(SEQ ID NO:71)。
更具体地，为了制备其中引入有lysA(M408A)修饰的菌株，使用ATCC13032菌株的染色体DNA作为模板，分别与SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:73的引物对或SEQ ID NO:74和SEQID NO:75的引物对一起进行了PCR。使用PfuUltraTM高保真DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶用于PCR反应。如下进行了PCR：28个循环(在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，以及在72℃下聚合1分钟)。
结果，对于lysA基因的修饰，分别获得了5’上游区的534bp DNA片段和3’下游区的527bp DNA片段。使用两个扩增的DNA片段作为模板，与SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:75的引物一起进行了PCR。如下进行了PCR：在95℃下变性5分钟；28个循环(在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，以及在72℃下聚合2分钟)；以及在72℃下聚合5分钟。
[表15]
SEQ ID NO 序列(5'->3')
SEQ ID NO:72 TCGAGCTCGGTACCCGTTGGGCCTGTACTCACAG
SEQ ID NO:73 TAGCGGGAGCTCGCGGCGTAGCAGTATGCGCC
SEQ ID NO:74 TACTGCTACGCCGCGAGCTCCCGCTACAACGC
SEQ ID NO:75 CTCTAGAGGATCCCGTGCAAGGTGAACCAACTG
结果，扩增了1035bp的DNA片段，该片段包括编码二氨基庚二酸脱羧酶变异体(其中第408个氨基酸(即，甲硫氨酸)被丙氨酸取代)的lysA基因的修饰。扩增产物使用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)来纯化，并将其用作用于制备载体的插入DNA片段。同时，如下制备了用于将M408A修饰引入到染色体中的pDZ-M408A载体：将pDZ载体(其用限制性内切酶SmaI酶切，然后在65℃下进行热处理20分钟)和插入DNA片段(其通过上述PCR被扩增)以1:2的摩尔浓度比(M)组合，以及用Infusion克隆试剂盒(TaKaRa)按提供的说明书进行了克隆。
通过电穿孔将制备的载体转化到CA09-0904菌株中，以及使转化的菌株进行二次交换，从而获得了其中在染色体上各核苷酸被修饰核苷酸取代的菌株。菌株被命名为CA09-0904-M408A。
[表16]制备菌株的生产L-苏氨酸和L-赖氨酸的能力的确认
结果，引入有修饰的菌株，与CA09-0900菌株(对照组)相比显示出L-赖氨酸生产量降低了1.41g/L且L-苏氨酸生产量增加了1.33g/L，而与CA09-0904菌株相比显示出L-赖氨酸生产量降低了0.42g/L且L-苏氨酸生产量增加了0.35g/L(表16)。因此，确认了L-赖氨酸生产途径的减弱对L-苏氨酸的生产是积极的。
实施例10：在具有生产L-苏氨酸能力的棒杆菌属的微生物菌株中引入修饰ddh和修饰dapA的菌株的制备和评价
从实施例6中制备的CA09-0904菌株中，确认了其中减少L-赖氨酸生产的菌株对L-苏氨酸的生产有积极的影响。为了确认通过进一步减弱上述菌株中的L-赖氨酸的生物合成途径，是否能进一步增强生产L-苏氨酸的能力，开发了菌株。
具体地，为了减弱参与L-赖氨酸生物合成途径的第二反应的酶(即，4-羟基-四氢吡啶二羧酸合酶(dapA))的活性，将dapA的第119个氨基酸(即，酪氨酸)用苯丙氨酸取代(Journal of Molecular biology,Volume 338,Issue 2,23April 2004))(SEQ ID NO:76)。
更具体地，为了制备其中引入有dapA(Y119F)修饰的菌株，使用ATCC13032菌株的染色体DNA作为模板，分别与SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78的引物对或SEQ ID NO:79和SEQID NO:80的引物对一起进行了PCR。使用PfuUltraTM高保真DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶用于PCR反应。如下进行了PCR：28个循环(在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，以及在72℃下聚合1分钟)。
结果，对于dapA基因的修饰，分别获得了5’上游区的538bp DNA片段和3’下游区的528bp DNA片段。使用两个扩增的DNA片段作为模板，与SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:80的引物一起进行了PCR。如下进行了PCR：在95℃下变性5分钟；28个循环(在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，以及在72℃下聚合2分钟)；以及在72℃下聚合5分钟。
[表17]
SEQ ID NO 序列(5'->3')
SEQ ID NO:77 TCGAGCTCGGTACCCTTCATATAGTTAAGACAAC
SEQ ID NO:78 CGGCTTGGAGAAATAAGGAGTTACAACTAAAAG
SEQ ID NO:79 TAACTCCTTATTTCTCCAAGCCGAGCCAAGAG
SEQ ID NO:80 CTCTAGAGGATCCCGAGCCTCAAGTTCCTGCTC
结果，扩增了1000bp的DNA片段，该片段包括编码4-羟基-四氢吡啶二羧酸合酶变异体(其中第119个氨基酸(即，酪氨酸)被苯丙氨酸取代)的dapA基因的修饰。扩增产物使用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)来纯化，并将其用作用于制备载体的插入DNA片段。同时，如下制备了用于将dapA(Y119F)修饰引入到染色体中的pDZ-Y119F载体：将pDZ载体(其用限制性内切酶SmaI酶切，然后在65℃下进行热处理20分钟)和插入DNA片段(其通过上述PCR被扩增)以1:2的摩尔浓度比(M)组合，以及用Infusion克隆试剂盒(TaKaRa)按提供的说明书进行了克隆。
通过电穿孔将制备的载体转化到CA09-0904菌株中，以及使转化的菌株进行二次交换，从而获得了其中在染色体上各核苷酸都被修饰核苷酸取代的菌株。菌株被命名为CA09-0904-Y119F。
[表18]制备菌株的生产L-苏氨酸和L-赖氨酸的能力的确认
结果，引入有修饰的菌株，与CA09-0900菌株(对照组)相比显示出L-赖氨酸生产量降低了1.86g/L且L-苏氨酸生产量增加了1.83g/L；而与CA09-0904菌株相比显示出L-赖氨酸生产量降低了0.75g/L且L-苏氨酸生产量增加了0.79g/L(表18)。因此，确认了L-赖氨酸生产途径的减弱对L-苏氨酸的生产是积极的。
上述结果表明，包含内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽(其中本公开的SEQID NO:1的氨基酸序列中第169个氨基酸被亮氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸或半胱氨酸取代)的菌株，通过降低L-赖氨酸生产量和增加L-苏氨酸生产量而最终具有与未修饰的菌株相比增强的生产L-苏氨酸的能力。
从前述，本公开所属领域的普通技术人员将能够理解，本公开可以在不修改本公开的技术概念或必要特征的情况下以其它具体形式实施。就这一点而言，本文公开的示例性实施方式仅用于说明目的，并且不应被解释为限制本公开的范围。相反，本公开旨在不仅覆盖示例性实施方式，而且覆盖可包括在如由所附权利要求限定的本公开的精神和范围内的各种替代、修改、等同物和其它实施方式。
/>
<110> CJ第一制糖株式会社
<120> 内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽及使用其生产L-苏氨酸的方法
<130> OPA20112-PCT
<150> KR 10-2019-0119058
<151> 2019-09-26
<160> 83
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 320
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> DDH(内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶)
<400> 1
Met Thr Asn Ile Arg Val Ala Ile Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg
1 5 10 15
Ser Val Glu Lys Leu Ile Ala Lys Gln Pro Asp Met Asp Leu Val Gly
20 25 30
Ile Phe Ser Arg Arg Ala Thr Leu Asp Thr Lys Thr Pro Val Phe Asp
35 40 45
Val Ala Asp Val Asp Lys His Ala Asp Asp Val Asp Val Leu Phe Leu
50 55 60
Cys Met Gly Ser Ala Thr Asp Ile Pro Glu Gln Ala Pro Lys Phe Ala
65 70 75 80
Gln Phe Ala Cys Thr Val Asp Thr Tyr Asp Asn His Arg Asp Ile Pro
85 90 95
Arg His Arg Gln Val Met Asn Glu Ala Ala Thr Ala Ala Gly Asn Val
100 105 110
Ala Leu Val Ser Thr Gly Trp Asp Pro Gly Met Phe Ser Ile Asn Arg
115 120 125
Val Tyr Ala Ala Ala Val Leu Ala Glu His Gln Gln His Thr Phe Trp
130 135 140
Gly Pro Gly Leu Ser Gln Gly His Ser Asp Ala Leu Arg Arg Ile Pro
145 150 155 160
Gly Val Gln Lys Ala Val Gln Tyr Thr Leu Pro Ser Glu Asp Ala Leu
165 170 175
Glu Lys Ala Arg Arg Gly Glu Ala Gly Asp Leu Thr Gly Lys Gln Thr
180 185 190
His Lys Arg Gln Cys Phe Val Val Ala Asp Ala Ala Asp His Glu Arg
195 200 205
Ile Glu Asn Asp Ile Arg Thr Met Pro Asp Tyr Phe Val Gly Tyr Glu
210 215 220
Val Glu Val Asn Phe Ile Asp Glu Ala Thr Phe Asp Ser Glu His Thr
225 230 235 240
Gly Met Pro His Gly Gly His Val Ile Thr Thr Gly Asp Thr Gly Gly
245 250 255
Phe Asn His Thr Val Glu Tyr Ile Leu Lys Leu Asp Arg Asn Pro Asp
260 265 270
Phe Thr Ala Ser Ser Gln Ile Ala Phe Gly Arg Ala Ala His Arg Met
275 280 285
Lys Gln Gln Gly Gln Ser Gly Ala Phe Thr Val Leu Glu Val Ala Pro
290 295 300
Tyr Leu Leu Ser Pro Glu Asn Leu Asp Asp Leu Ile Ala Arg Asp Val
305 310 315 320
<210> 2
<211> 963
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> DDH(内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶)的基因
<400> 2
atgaccaaca tccgcgtagc tatcgtgggc tacggaaacc tgggacgcag cgtcgaaaag 60
cttattgcca agcagcccga catggacctt gtaggaatct tctcgcgccg ggccaccctc 120
gacacaaaga cgccagtctt tgatgtcgcc gacgtggaca agcacgccga cgacgtggac 180
gtgctgttcc tgtgcatggg ctccgccacc gacatccctg agcaggcacc aaagttcgcg 240
cagttcgcct gcaccgtaga cacctacgac aaccaccgcg acatcccacg ccaccgccag 300
gtcatgaacg aagccgccac cgcagccggc aacgttgcac tggtctctac cggctgggat 360
ccaggaatgt tctccatcaa ccgcgtctac gcagcggcag tcttagccga gcaccagcag 420
cacaccttct ggggcccagg tttgtcacag ggccactccg atgctttgcg acgcatccct 480
ggcgttcaaa aggcagtcca gtacaccctc ccatccgaag acgccctgga aaaggcccgc 540
cgcggcgaag ccggcgacct taccggaaag caaacccaca agcgccaatg cttcgtggtt 600
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taa 963
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 修饰DDH(内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶)
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gttggctacg aagtcgaagt caacttcatc gacgaagcaa ccttcgactc cgagcacacc 720
ggcatgccac acggtggcca cgtgattacc accggcgaca ccggtggctt caaccacacc 780
gtggaataca tcctcaagct ggaccgaaac ccagatttca ccgcttcctc acagatcgct 840
ttcggtcgcg cagctcaccg catgaagcag cagggccaaa gcggagcttt caccgtcctc 900
gaagttgctc catacctgct ctccccagag aacttggacg atctgatcgc acgcgacgtc 960
taa 963
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
atgaccaaca tccgcgtagc 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
ttagacgtcg cgtgcgatca g 21
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 7
cggggatcct ctagatgacc aacatccgcg 30
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
caggtcgact ctagattaga cgtcgcgtgc g 31
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
cggtgaaatc ggcgacatca aagactg 27
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 10
gatgtcgccg atttcaccgc ttcctc 26
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 11
cggggatcct ctagatgacc aacatccgcg 30
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 12
caggtcgact ctagattaga cgtcgcgtgc g 31
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 13
cacaattttg gaggattac 19
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 14
tgggtgacca cgatcagat 19
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
ggaaaccaca ctgtttcc 18
<210> 16
<211> 421
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 修饰LysC(赖氨酸敏感性天冬氨酸激酶3)
<400> 16
Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala
1 5 10 15
Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala
20 25 30
Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
35 40 45
Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg
50 55 60
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu
65 70 75 80
Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr
85 90 95
Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
100 105 110
Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
115 120 125
Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
130 135 140
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala
145 150 155 160
Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val
165 170 175
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys
180 185 190
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
195 200 205
Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn
210 215 220
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu
225 230 235 240
Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr
245 250 255
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile
260 265 270
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
275 280 285
Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu
290 295 300
Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg
305 310 315 320
Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr
325 330 335
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
340 345 350
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
355 360 365
Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Lys Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg
370 375 380
Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala
385 390 395 400
Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
405 410 415
Ala Gly Thr Gly Arg
420
<210> 17
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 17
tcgagctcgg tacccgctgc gcagtgttga atac 34
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
tggaaatctt ttcgatgttc acgttgacat 30
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 19
atgtcaacgt gaacatcgaa aagatttcca 30
<210> 20
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 20
ctctagagga tccccgttca cctcagagac gatt 34
<210> 21
<211> 445
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 修饰Hom(高丝氨酸脱氢酶)
<400> 21
Met Thr Ser Ala Ser Ala Pro Ser Phe Asn Pro Gly Lys Gly Pro Gly
1 5 10 15
Ser Ala Val Gly Ile Ala Leu Leu Gly Phe Gly Thr Val Gly Thr Glu
20 25 30
Val Met Arg Leu Met Thr Glu Tyr Gly Asp Glu Leu Ala His Arg Ile
35 40 45
Gly Gly Pro Leu Glu Val Arg Gly Ile Ala Val Ser Asp Ile Ser Lys
50 55 60
Pro Arg Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Leu Thr Glu Asp Ala Phe Ala
65 70 75 80
Leu Ile Glu Arg Glu Asp Val Asp Ile Val Val Glu Val Ile Gly Gly
85 90 95
Ile Glu Tyr Pro Arg Glu Val Val Leu Ala Ala Leu Lys Ala Gly Lys
100 105 110
Ser Val Val Thr Ala Asn Lys Ala Leu Val Ala Ala His Ser Ala Glu
115 120 125
Leu Ala Asp Ala Ala Glu Ala Ala Asn Val Asp Leu Tyr Phe Glu Ala
130 135 140
Ala Val Ala Gly Ala Ile Pro Val Val Gly Pro Leu Arg Arg Ser Leu
145 150 155 160
Ala Gly Asp Gln Ile Gln Ser Val Met Gly Ile Val Asn Gly Thr Thr
165 170 175
Asn Phe Ile Leu Asp Ala Met Asp Ser Thr Gly Ala Asp Tyr Ala Asp
180 185 190
Ser Leu Ala Glu Ala Thr Arg Leu Gly Tyr Ala Glu Ala Asp Pro Thr
195 200 205
Ala Asp Val Glu Gly His Asp Ala Ala Ser Lys Ala Ala Ile Leu Ala
210 215 220
Ser Ile Ala Phe His Thr Arg Val Thr Ala Asp Asp Val Tyr Cys Glu
225 230 235 240
Gly Ile Ser Asn Ile Ser Ala Ala Asp Ile Glu Ala Ala Gln Gln Ala
245 250 255
Gly His Thr Ile Lys Leu Leu Ala Ile Cys Glu Lys Phe Thr Asn Lys
260 265 270
Glu Gly Lys Ser Ala Ile Ser Ala Arg Val His Pro Thr Leu Leu Pro
275 280 285
Val Ser His Pro Leu Ala Ser Val Asn Lys Ser Phe Asn Ala Ile Phe
290 295 300
Val Glu Ala Glu Ala Ala Gly Arg Leu Met Phe Tyr Gly Asn Gly Ala
305 310 315 320
Gly Gly Ala Pro Thr Ala Ser Ala Val Leu Gly Asp Val Val Gly Ala
325 330 335
Ala Arg Asn Lys Val His Gly Gly Arg Ala Pro Gly Glu Ser Thr Tyr
340 345 350
Ala Asn Leu Pro Ile Ala Asp Phe Gly Glu Thr Thr Thr Arg Tyr His
355 360 365
Leu Asp Met Asp Val Glu Asp Arg Val Gly Val Leu Ala Glu Leu Ala
370 375 380
Ser Leu Phe Ser Glu Gln Gly Ile Ser Leu Arg Thr Ile Arg Gln Glu
385 390 395 400
Glu Arg Asp Asp Asp Ala His Leu Ile Val Val Thr His Ser Ala Leu
405 410 415
Glu Ser Asp Leu Ser Arg Thr Val Glu Leu Leu Lys Ala Lys Pro Val
420 425 430
Val Lys Ala Ile Asn Ser Val Ile Arg Leu Glu Arg Asp
435 440 445
<210> 22
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 22
tcgagctcgg taccccggat gatgtgtact gcg 33
<210> 23
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 23
gaccacgatc agatgtgcat catcatcgcg c 31
<210> 24
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 24
gatgatgatg cacatctgat cgtggtcacc c 31
<210> 25
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 25
ctctagagga tccccgagtc agcgggaaat ccg 33
<210> 26
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 26
cggggatcct ctagaatgac caacatccgc gtag 34
<210> 27
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 27
caggtcgact ctagattaga cgtcgcgtgc gatc 34
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 28
tccagtacgc tctcccatcc gaagacgccc 30
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 29
ggatgggaga gcgtactgga ctgccttttg 30
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 30
tccagtacgt cctcccatcc gaagacgccc 30
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 31
ggatgggagg acgtactgga ctgccttttg 30
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 32
tccagtacca gctcccatcc gaagacgccc 30
<210> 33
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 33
ggatgggagc tggtactgga ctgccttttg 30
<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 34
tccagtacca cctcccatcc gaagacgccc 30
<210> 35
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 35
ggatgggagg tggtactgga ctgccttttg 30
<210> 36
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 36
tccagtaccg actcccatcc gaagacgccc 30
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 37
ggatgggagt cggtactgga ctgccttttg 30
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 38
tccagtaccc tctcccatcc gaagacgccc 30
<210> 39
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 39
ggatgggaga gggtactgga ctgccttttg 30
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 40
tccagtactt actcccatcc gaagacgccc 30
<210> 41
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 41
ggatgggagt aagtactgga ctgccttttg 30
<210> 42
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 42
tccagtacta cctcccatcc gaagacgccc 30
<210> 43
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 43
ggatgggagg tagtactgga ctgccttttg 30
<210> 44
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 44
tccagtactc cctcccatcc gaagacgccc 30
<210> 45
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 45
ggatgggagg gagtactgga ctgccttttg 30
<210> 46
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 46
tccagtacaa gctcccatcc gaagacgccc 30
<210> 47
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 47
ggatgggagc ttgtactgga ctgccttttg 30
<210> 48
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 48
tccagtacat gctcccatcc gaagacgccc 30
<210> 49
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 49
ggatgggagc atgtactgga ctgccttttg 30
<210> 50
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 50
tccagtacat cctcccatcc gaagacgccc 30
<210> 51
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 51
ggatgggagg atgtactgga ctgccttttg 30
<210> 52
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 52
tccagtacga actcccatcc gaagacgccc 30
<210> 53
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 53
ggatgggagt tcgtactgga ctgccttttg 30
<210> 54
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 54
tccagtacga tctcccatcc gaagacgccc 30
<210> 55
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 55
ggatgggaga tcgtactgga ctgccttttg 30
<210> 56
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 56
tccagtacgg tctcccatcc gaagacgccc 30
<210> 57
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 57
ggatgggaga ccgtactgga ctgccttttg 30
<210> 58
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 58
tccagtactg gctcccatcc gaagacgccc 30
<210> 59
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 59
ggatgggagc cagtactgga ctgccttttg 30
<210> 60
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 60
tccagtactg cctcccatcc gaagacgccc 30
<210> 61
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 61
ggatgggagg cagtactgga ctgccttttg 30
<210> 62
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 62
tccagtactt cctcccatcc gaagacgccc 30
<210> 63
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 63
ggatgggagg aagtactgga ctgccttttg 30
<210> 64
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 64
tccagtacaa cctcccatcc gaagacgccc 30
<210> 65
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 65
ggatgggagg ttgtactgga ctgccttttg 30
<210> 66
<211> 248
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 修饰DapB (二氢吡啶二羧酸还原酶)
<400> 66
Met Gly Ile Lys Val Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Asn Val Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ile Val Ala Ala Val Asn Glu Ser Asp Asp Leu Glu Leu Val Ala
20 25 30
Glu Ile Gly Val Asp Asp Asp Leu Ser Leu Leu Val Asp Asn Gly Ala
35 40 45
Glu Val Val Val Asp Phe Thr Thr Pro Asn Ala Val Met Gly Asn Leu
50 55 60
Glu Phe Cys Ile Asn Asn Gly Ile Ser Ala Val Val Gly Thr Thr Gly
65 70 75 80
Phe Asp Asp Ala Arg Leu Glu Gln Val Arg Asp Trp Leu Glu Gly Lys
85 90 95
Asp Asn Val Gly Val Leu Ile Ala Pro Asn Phe Ala Ile Ser Ala Val
100 105 110
Leu Thr Met Val Phe Ser Lys Gln Ala Ala Arg Phe Phe Glu Ser Ala
115 120 125
Glu Val Ile Glu Leu His His Pro Asn Lys Leu Asp Ala Pro Ser Gly
130 135 140
Thr Ala Ile His Thr Ala Gln Gly Ile Ala Ala Ala Arg Lys Glu Ala
145 150 155 160
Gly Met Asp Ala Gln Pro Asp Ala Thr Glu Gln Ala Leu Glu Gly Ser
165 170 175
Arg Gly Ala Ser Val Asp Gly Ile Pro Val His Ala Val Arg Met Ser
180 185 190
Gly Met Val Ala His Glu Gln Val Ile Phe Gly Thr Gln Gly Gln Thr
195 200 205
Leu Thr Ile Lys Gln Asp Ser Tyr Asp Arg Asn Ser Phe Ala Pro Gly
210 215 220
Val Leu Val Gly Val Arg Asn Ile Ala Gln His Pro Gly Leu Val Val
225 230 235 240
Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu
245
<210> 67
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 67
tcgagctcgg taccccgacg gggaacccaa cgg 33
<210> 68
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 68
gtttgaccaa cgttgccttt ggctccgaga ac 32
<210> 69
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 69
gagccaaagg caacgttggt caaactattg tg 32
<210> 70
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 70
ctctagagga tccccttgcg ccacgggaac cc 32
<210> 71
<211> 445
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 修饰LysA(二氨基庚二酸脱羧酶)
<400> 71
Met Ala Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu Leu Pro Ala His Val Trp Pro
1 5 10 15
Arg Asn Ala Val Arg Gln Glu Asp Gly Val Val Thr Val Ala Gly Val
20 25 30
Pro Leu Pro Asp Leu Ala Glu Glu Tyr Gly Thr Pro Leu Phe Val Val
35 40 45
Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe
50 55 60
Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala Ser Lys Ala Phe Leu Thr Lys
65 70 75 80
Thr Ile Ala Arg Trp Val Asp Glu Glu Gly Leu Ala Leu Asp Ile Ala
85 90 95
Ser Ile Asn Glu Leu Gly Ile Ala Leu Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser
100 105 110
Arg Ile Thr Ala His Gly Asn Asn Lys Gly Val Glu Phe Leu Arg Ala
115 120 125
Leu Val Gln Asn Gly Val Gly His Val Val Leu Asp Ser Ala Gln Glu
130 135 140
Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Ala Ala Gly Glu Gly Lys Ile Gln Asp
145 150 155 160
Val Leu Ile Arg Val Lys Pro Gly Ile Glu Ala His Thr His Glu Phe
165 170 175
Ile Ala Thr Ser His Glu Asp Gln Lys Phe Gly Phe Ser Leu Ala Ser
180 185 190
Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ala Ala Asn Asn Ala Glu Asn Leu
195 200 205
Asn Leu Val Gly Leu His Cys His Val Gly Ser Gln Val Phe Asp Ala
210 215 220
Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg Val Leu Gly Leu Tyr Ser Gln
225 230 235 240
Ile His Ser Glu Leu Gly Val Ala Leu Pro Glu Leu Asp Leu Gly Gly
245 250 255
Gly Tyr Gly Ile Ala Tyr Thr Ala Ala Glu Glu Pro Leu Asn Val Ala
260 265 270
Glu Val Ala Ser Asp Leu Leu Thr Ala Val Gly Lys Met Ala Ala Glu
275 280 285
Leu Gly Ile Asp Ala Pro Thr Val Leu Val Glu Pro Gly Arg Ala Ile
290 295 300
Ala Gly Pro Ser Thr Val Thr Ile Tyr Glu Val Gly Thr Thr Lys Asp
305 310 315 320
Val His Val Asp Asp Asp Lys Thr Arg Arg Tyr Ile Ala Val Asp Gly
325 330 335
Gly Met Ser Asp Asn Ile Arg Pro Ala Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr Asp
340 345 350
Ala Arg Val Val Ser Arg Phe Ala Glu Gly Asp Pro Val Ser Thr Arg
355 360 365
Ile Val Gly Ser His Cys Glu Ser Gly Asp Ile Leu Ile Asn Asp Glu
370 375 380
Ile Tyr Pro Ser Asp Ile Thr Ser Gly Asp Phe Leu Ala Leu Ala Ala
385 390 395 400
Thr Gly Ala Tyr Cys Tyr Ala Ala Ser Ser Arg Tyr Asn Ala Phe Thr
405 410 415
Arg Pro Ala Val Val Ser Val Arg Ala Gly Ser Ser Arg Leu Met Leu
420 425 430
Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp Ile Leu Ser Leu Glu Ala
435 440 445
<210> 72
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 72
tcgagctcgg tacccgttgg gcctgtactc acag 34
<210> 73
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 73
tagcgggagc tcgcggcgta gcagtatgcg cc 32
<210> 74
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 74
tactgctacg ccgcgagctc ccgctacaac gc 32
<210> 75
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 75
ctctagagga tcccgtgcaa ggtgaaccaa ctg 33
<210> 76
<211> 301
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 修饰DapA(二氢吡啶二羧酸合酶)
<400> 76
Met Ser Thr Gly Leu Thr Ala Lys Thr Gly Val Glu His Phe Gly Thr
1 5 10 15
Val Gly Val Ala Met Val Thr Pro Phe Thr Glu Ser Gly Asp Ile Asp
20 25 30
Ile Ala Ala Gly Arg Glu Val Ala Ala Tyr Leu Val Asp Lys Gly Leu
35 40 45
Asp Ser Leu Val Leu Ala Gly Thr Thr Gly Glu Ser Pro Thr Thr Thr
50 55 60
Ala Ala Glu Lys Leu Glu Leu Leu Lys Ala Val Arg Glu Glu Val Gly
65 70 75 80
Asp Arg Ala Lys Leu Ile Ala Gly Val Gly Thr Asn Asn Thr Arg Thr
85 90 95
Ser Val Glu Leu Ala Glu Ala Ala Ala Ser Ala Gly Ala Asp Gly Leu
100 105 110
Leu Val Val Thr Pro Tyr Phe Ser Lys Pro Ser Gln Glu Gly Leu Leu
115 120 125
Ala His Phe Gly Ala Ile Ala Ala Ala Thr Glu Val Pro Ile Cys Leu
130 135 140
Tyr Asp Ile Pro Gly Arg Ser Gly Ile Pro Ile Glu Ser Asp Thr Met
145 150 155 160
Arg Arg Leu Ser Glu Leu Pro Thr Ile Leu Ala Val Lys Asp Ala Lys
165 170 175
Gly Asp Leu Val Ala Ala Thr Ser Leu Ile Lys Glu Thr Gly Leu Ala
180 185 190
Trp Tyr Ser Gly Asp Asp Pro Leu Asn Leu Val Trp Leu Ala Leu Gly
195 200 205
Gly Ser Gly Phe Ile Ser Val Ile Gly His Ala Ala Pro Thr Ala Leu
210 215 220
Arg Glu Leu Tyr Thr Ser Phe Glu Glu Gly Asp Leu Val Arg Ala Arg
225 230 235 240
Glu Ile Asn Ala Lys Leu Ser Pro Leu Val Ala Ala Gln Gly Arg Leu
245 250 255
Gly Gly Val Ser Leu Ala Lys Ala Ala Leu Arg Leu Gln Gly Ile Asn
260 265 270
Val Gly Asp Pro Arg Leu Pro Ile Met Ala Pro Asn Glu Gln Glu Leu
275 280 285
Glu Ala Leu Arg Glu Asp Met Lys Lys Ala Gly Val Leu
290 295 300
<210> 77
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 77
tcgagctcgg tacccttcat atagttaaga caac 34
<210> 78
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 78
cggcttggag aaataaggag ttacaactaa aag 33
<210> 79
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 79
taactcctta tttctccaag ccgagccaag ag 32
<210> 80
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 80
ctctagagga tcccgagcct caagttcctg ctc 33
<210> 81
<211> 248
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> DapB(二氢吡啶二羧酸还原酶)
<400> 81
Met Gly Ile Lys Val Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Arg Val Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ile Val Ala Ala Val Asn Glu Ser Asp Asp Leu Glu Leu Val Ala
20 25 30
Glu Ile Gly Val Asp Asp Asp Leu Ser Leu Leu Val Asp Asn Gly Ala
35 40 45
Glu Val Val Val Asp Phe Thr Thr Pro Asn Ala Val Met Gly Asn Leu
50 55 60
Glu Phe Cys Ile Asn Asn Gly Ile Ser Ala Val Val Gly Thr Thr Gly
65 70 75 80
Phe Asp Asp Ala Arg Leu Glu Gln Val Arg Asp Trp Leu Glu Gly Lys
85 90 95
Asp Asn Val Gly Val Leu Ile Ala Pro Asn Phe Ala Ile Ser Ala Val
100 105 110
Leu Thr Met Val Phe Ser Lys Gln Ala Ala Arg Phe Phe Glu Ser Ala
115 120 125
Glu Val Ile Glu Leu His His Pro Asn Lys Leu Asp Ala Pro Ser Gly
130 135 140
Thr Ala Ile His Thr Ala Gln Gly Ile Ala Ala Ala Arg Lys Glu Ala
145 150 155 160
Gly Met Asp Ala Gln Pro Asp Ala Thr Glu Gln Ala Leu Glu Gly Ser
165 170 175
Arg Gly Ala Ser Val Asp Gly Ile Pro Val His Ala Val Arg Met Ser
180 185 190
Gly Met Val Ala His Glu Gln Val Ile Phe Gly Thr Gln Gly Gln Thr
195 200 205
Leu Thr Ile Lys Gln Asp Ser Tyr Asp Arg Asn Ser Phe Ala Pro Gly
210 215 220
Val Leu Val Gly Val Arg Asn Ile Ala Gln His Pro Gly Leu Val Val
225 230 235 240
Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu
245
<210> 82
<211> 445
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> LysA(二氨基庚二酸脱羧酶)
<400> 82
Met Ala Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu Leu Pro Ala His Val Trp Pro
1 5 10 15
Arg Asn Ala Val Arg Gln Glu Asp Gly Val Val Thr Val Ala Gly Val
20 25 30
Pro Leu Pro Asp Leu Ala Glu Glu Tyr Gly Thr Pro Leu Phe Val Val
35 40 45
Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe
50 55 60
Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala Ser Lys Ala Phe Leu Thr Lys
65 70 75 80
Thr Ile Ala Arg Trp Val Asp Glu Glu Gly Leu Ala Leu Asp Ile Ala
85 90 95
Ser Ile Asn Glu Leu Gly Ile Ala Leu Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser
100 105 110
Arg Ile Thr Ala His Gly Asn Asn Lys Gly Val Glu Phe Leu Arg Ala
115 120 125
Leu Val Gln Asn Gly Val Gly His Val Val Leu Asp Ser Ala Gln Glu
130 135 140
Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Ala Ala Gly Glu Gly Lys Ile Gln Asp
145 150 155 160
Val Leu Ile Arg Val Lys Pro Gly Ile Glu Ala His Thr His Glu Phe
165 170 175
Ile Ala Thr Ser His Glu Asp Gln Lys Phe Gly Phe Ser Leu Ala Ser
180 185 190
Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ala Ala Asn Asn Ala Glu Asn Leu
195 200 205
Asn Leu Val Gly Leu His Cys His Val Gly Ser Gln Val Phe Asp Ala
210 215 220
Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg Val Leu Gly Leu Tyr Ser Gln
225 230 235 240
Ile His Ser Glu Leu Gly Val Ala Leu Pro Glu Leu Asp Leu Gly Gly
245 250 255
Gly Tyr Gly Ile Ala Tyr Thr Ala Ala Glu Glu Pro Leu Asn Val Ala
260 265 270
Glu Val Ala Ser Asp Leu Leu Thr Ala Val Gly Lys Met Ala Ala Glu
275 280 285
Leu Gly Ile Asp Ala Pro Thr Val Leu Val Glu Pro Gly Arg Ala Ile
290 295 300
Ala Gly Pro Ser Thr Val Thr Ile Tyr Glu Val Gly Thr Thr Lys Asp
305 310 315 320
Val His Val Asp Asp Asp Lys Thr Arg Arg Tyr Ile Ala Val Asp Gly
325 330 335
Gly Met Ser Asp Asn Ile Arg Pro Ala Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr Asp
340 345 350
Ala Arg Val Val Ser Arg Phe Ala Glu Gly Asp Pro Val Ser Thr Arg
355 360 365
Ile Val Gly Ser His Cys Glu Ser Gly Asp Ile Leu Ile Asn Asp Glu
370 375 380
Ile Tyr Pro Ser Asp Ile Thr Ser Gly Asp Phe Leu Ala Leu Ala Ala
385 390 395 400
Thr Gly Ala Tyr Cys Tyr Ala Met Ser Ser Arg Tyr Asn Ala Phe Thr
405 410 415
Arg Pro Ala Val Val Ser Val Arg Ala Gly Ser Ser Arg Leu Met Leu
420 425 430
Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp Ile Leu Ser Leu Glu Ala
435 440 445
<210> 83
<211> 300
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> DapA(二氢吡啶二羧酸合酶)
<400> 83
Met Ser Thr Gly Leu Thr Ala Lys Thr Gly Val Glu His Phe Gly Thr
1 5 10 15
Val Gly Val Ala Met Val Thr Pro Phe Thr Glu Ser Gly Asp Ile Asp
20 25 30
Ile Ala Ala Gly Arg Glu Val Ala Ala Tyr Leu Val Asp Lys Gly Leu
35 40 45
Asp Ser Leu Val Leu Ala Gly Thr Thr Gly Glu Ser Pro Thr Thr Thr
50 55 60
Ala Ala Glu Lys Leu Glu Leu Leu Lys Ala Val Arg Glu Glu Val Gly
65 70 75 80
Asp Arg Ala Lys Leu Ile Ala Gly Val Gly Thr Asn Asn Thr Arg Thr
85 90 95
Ser Val Glu Leu Ala Glu Ala Ala Ala Ser Ala Gly Ala Asp Gly Leu
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Leu Val Val Thr Pro Tyr Tyr Ser Lys Pro Ser Gln Glu Gly Leu Leu
115 120 125
Ala His Phe Gly Ala Ile Ala Ala Ala Thr Glu Val Pro Ile Cys Leu
130 135 140
Tyr Asp Ile Pro Gly Arg Ser Gly Ile Pro Ile Glu Ser Asp Thr Met
145 150 155 160
Arg Arg Leu Ser Glu Leu Pro Thr Ile Leu Ala Val Lys Asp Ala Lys
165 170 175
Gly Asp Leu Val Ala Ala Thr Ser Leu Ile Lys Glu Thr Gly Leu Ala
180 185 190
Trp Tyr Ser Gly Asp Asp Pro Leu Asn Leu Val Trp Leu Ala Leu Gly
195 200 205
Gly Ser Gly Phe Ile Ser Val Ile Gly His Ala Ala Pro Thr Ala Leu
210 215 220
Arg Glu Leu Tyr Thr Ser Phe Glu Glu Gly Asp Leu Val Arg Ala Arg
225 230 235 240
Glu Ile Asn Ala Lys Leu Ser Pro Leu Val Ala Ala Gln Gly Arg Leu
245 250 255
Gly Gly Val Ser Leu Ala Lys Ala Ala Leu Arg Leu Gln Gly Ile Asn
260 265 270
Val Gly Asp Pro Arg Leu Pro Ile Met Ala Pro Asn Glu Gln Glu Leu
275 280 285
Glu Ala Leu Arg Glu Asp Met Lys Lys Ala Gly Val
290 295 300

Claims (10)

1.修饰多肽，其由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成，其中SEQ ID NO:1的第169个氨基酸被亮氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸取代，并且所述修饰多肽具有内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的活性，
其中所述修饰多肽的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的活性弱于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的野生型内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的活性。
2.多核苷酸，其编码根据权利要求1所述的修饰多肽。
3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸由SEQ ID NO:4的核苷酸序列组成。
4.棒杆菌属(Corynebacterium)的微生物，其包含：
修饰多肽，其由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成，其中SEQ ID NO:1的第169个氨基酸被亮氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸取代，并且所述修饰多肽具有内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的活性；或包含所述修饰多肽的多核苷酸，
其中所述修饰多肽的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的活性弱于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的野生型内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的活性。
5.根据权利要求4所述的微生物，其中所述棒杆菌属的微生物进一步包含选自下面显示的(1)至(3)的修饰多肽中的一种或多种：
(1)修饰多肽，其中二氢吡啶二羧酸还原酶(dapB)的活性减弱；
(2)修饰多肽，其中二氨基庚二酸脱羧酶(lysA)的活性减弱；和
(3)修饰多肽，其中二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)的活性减弱。
6.根据权利要求5所述的微生物，其中所述修饰多肽包含选自下面显示的(1)至(3)的修饰多肽中的一种或多种：
(1)二氢吡啶二羧酸还原酶(dapB)的修饰多肽，其中SEQ ID NO:81的氨基酸序列中第13个氨基酸精氨酸(R)被天冬酰胺(N)取代；
(2)二氨基庚二酸脱羧酶(lysA)的修饰多肽，其中SEQ ID NO:82的氨基酸序列中第408个氨基酸甲硫氨酸(M)被丙氨酸(A)取代；以及
(3)二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)的修饰多肽，其中SEQ ID NO:83的氨基酸序列中第119个氨基酸酪氨酸(T)被苯丙氨酸(F)取代。
7.根据权利要求4所述的微生物，其中与未修饰的菌株相比，所述微生物的生产L-苏氨酸的能力增强了。
8.根据权利要求4所述的微生物，其中所述微生物是谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。
9.制备L-苏氨酸的方法，其包括在培养基中培养包含修饰多肽的棒杆菌属微生物的步骤，所述修饰多肽由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成，所述修饰多肽中SEQ ID NO:1的第169个氨基酸被亮氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸取代，并且所述修饰具有内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的活性，
其中所述修饰多肽的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的活性弱于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的野生型内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的活性。
10.根据权利要求9所述的方法，其中培养所述微生物的步骤进一步包括从培养的培养基和微生物中回收L-苏氨酸的步骤。
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