JP7308296B2 - メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチド及びそれを用いたｌ－トレオニン生産方法 - Google Patents

メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチド及びそれを用いたｌ－トレオニン生産方法 Download PDF

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Description

KCCM KCCM12503P
本出願は、メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（meso-diaminopimelate dehydrogenase）の活性が弱化した変異型ポリペプチド及びそれを用いてＬ－トレオニン（threonine）を生産する方法に関する。
コリネバクテリウム属（the genus Corynebacterium）微生物、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）は、Ｌ－アミノ酸及びその他の有用物質の生産に多く用いられているグラム陽性微生物である。前記Ｌ－アミノ酸及びその他の有用物質を生産すべく、高効率生産微生物及び発酵工程技術の開発のために様々な研究が行われている。例えば、Ｌ－リシンの生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を増加させたり、Ｌ－リシン生合成に不要な遺伝子を除去するなどの標的物質特異的アプローチ方法が主に用いられている（特許文献１）。
一方、Ｌ－アミノ酸のうちＬ－リシン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－グリシンは、アスパラギン酸由来アミノ酸であり、アスパラギン酸の前駆体であるオキサロ酢酸（oxaloacetate）の合成レベルが前記Ｌ－アミノ酸の合成レベルに影響を及ぼす。
メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（meso-diaminopimelate dehydrogenase）は、微生物のリシン生産過程において生成されるピペリデイン２，６－ジカルボキシレート（piperodeine 2,6-dicarboxylate）をメソ－２，６－ジアミノピメリン酸（meso-2, 6-diaminopimelate）に変換し、リシン生産経路において窒素源を固定する重要な酵素である。メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするｄｄｈ遺伝子及びＬ－リシン排出遺伝子であるｌｙｓＥの欠損によるＬ－トレオニン生産菌株の表現型（phenotype）の変化に関する内容は、先行技術文献で報告されている（非特許文献１）。しかし、ｌｙｓＥ遺伝子の欠損においては菌株の生長速度の遅延やトレオニン生産量の減少という否定的な効果があり、ｄｄｈ遺伝子の欠損においても菌株の生長が阻害されるので、効果的なＬ－アミノ酸生産能の向上と菌株の生長を共に考慮した研究が依然として求められている現状である。
米国特許第８０４８６５０号明細書 特開平０５－２２７９７７号公報 韓国登録特許第１０－０１５９８１２号公報 韓国公開特許第２００９－００９４４３３号公報
X Dong, Y Zhao, J Hu, Y Li, X Wang - Enzyme and microbial technology, 2016 Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444 Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277 Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453 Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984) Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990) Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979) Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745 Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 TURBA E, et al, Agric. Biol. Chem. 53:2269～2271, 1989 Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair., 2008 Van der Rest et al., Appl. Microbiol. Biotecnol. 52:541-545, 1999 Moore, S., Stein, W.H., Photometric ninhydrin method for use in the chromatography of amino acids. J. Biol. Chem.1948,176, 367-388 Takeda et al., Hum. Mutation, 2, 112-117 (1993) Biochemical and Biophysical Research Communications, Volume 495, Issue 2, 8 January 2018 Journal of Molecular biology, Volume 338, Issue 2, 23 April 2004
本発明者らは、菌株成長速度を遅延させることなく、Ｌ－リシンの生産量を減少させ、かつＬ－トレオニンの生産量を増加させるべく鋭意努力した結果、特定のレベルにメソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性を弱化させた新規な変異型ポリペプチドを用いると、微生物の成長が維持されるだけでなく、Ｌ－トレオニンの生産量が増加することを確認し、本出願を完成するに至った。
本出願は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）由来のメソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（meso-diaminopimelate dehydrogenase）変異型ポリペプチドを提供することを目的とする。
また、本出願は、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することを目的とする。
さらに、本出願は、前記メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドを含むコリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）微生物を提供することを目的とする。
さらに、本出願は、前記微生物を培地で培養するステップを含むＬ－トレオニン（L-threonine）生産方法を提供することを目的とする。
さらに、本出願は、Ｌ－トレオニンを生産するための前記微生物の使用を提供することを目的とする。
本出願のメソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性を弱化させた新規な変異型ポリペプチドを用いると、Ｌ－トレオニンの生産量をさらに増加させることができる。よって、産業的な面から生産収率や利便性が向上するという効果が期待される。
以下、これらを具体的に説明する。なお、本出願で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本出願で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本出願に含まれる。また、以下の具体的な記述に本出願が限定されるものではない。
上記目的を達成するための本出願の一態様は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）由来のメソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（meso-diaminopimelate dehydrogenase）変異型ポリペプチドを提供する。
具体的には、配列番号１のアミノ酸配列において１６９番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたメソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチドを提供し、より具体的には、配列番号１のアミノ酸配列において１６９番目のアミノ酸がロイシン（leucine）、フェニルアラニン（phenylalanine）、グルタミン酸（glutamate）又はシステイン（cystein）に置換されたメソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチドを提供する。
本出願における「メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（meso-diaminopimelate dehydrogenase）」とは、ＮＡＤＰＨ依存性レダクターゼであって、リシン生合成のための中間過程を触媒するものである。前述した酵素は、微生物のリシン生産過程で生成されるピペリデイン２，６－ジカルボキシレート（pipeerodeine 2,6-dicarboxylate）を変換してメソ－２，６－ジアミノピメリン酸（meso-2, 6-diaminomelate）を生成する酵素であり、リシン生産経路において窒素源を固定する重要な酵素である。具体的には、メソ－２，６－ジアミノピメリン酸シンターゼとしてリシン生産経路の３番目のステップで速度調節の役割を果たす。また、前記酵素は、ピペリデイン２，６－ジカルボキシレートにアンモニア基を固定する反応を触媒し、メソ－２，６－ジアミノピメリン酸を形成する。
本出願における「メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ」は、クエン酸シンターゼ、ｍｅｓｏ－ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｌａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ又はＤＤＨと混用される。
本出願における前記メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼは、公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋからその配列が得られる。例えば、コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）由来のメソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼであってもよく、より具体的には配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド／タンパク質であるが、これらに限定されるものではない。また、前記アミノ酸配列と同じ活性を有する配列であればいかなるものを含んでもよい。さらに、配列番号１のアミノ酸配列又はそれと８０％以上の相同性（homology）もしくは同一性（identity）を有するアミノ酸配列を含んでもよいが、これらに限定されるものではない。具体的には、前記アミノ酸には、配列番号１及び配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％以上の相同性もしくは同一性を有するアミノ酸が含まれてもよい。また、このような相同性もしくは同一性を有して前記タンパク質に相当する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も本出願に含まれることは言うまでもない。
本出願における「変異型（variant）」とは、少なくとも１つのアミノ酸の保存的置換（conservative substitution）及び／又は改変（modification）により上記列挙した配列（the recited sequence）とは異なるが、前記タンパク質の機能（functions）又は特性（properties）が維持されるポリペプチドを意味する。変異型ポリペプチドは、数個のアミノ酸置換、欠失又は付加により識別される配列（identified sequence）とは異なる。このような変異型は、一般に前記ポリペプチド配列の１つを改変し、その改変したポリペプチドの特性を評価することにより識別することができる。すなわち、変異型の能力は、本来のタンパク質（native protein）より向上するか、変わらないか又は低下する。このような変異型は、一般に前記ポリペプチド配列の１つを改変し、改変したポリペプチドの反応性を評価することにより識別することができる。また、一部の変異型には、Ｎ末端リーダー配列や膜貫通ドメイン（transmembrane domain）などの少なくとも１つの部分が除去された変異型も含まれる。他の変異型には、成熟タンパク質（mature protein）のＮ及び／又はＣ末端から一部分が除去された変異型も含まれる。
本出願における「保存的置換（conservative substitution）」とは、あるアミノ酸が類似した構造的及び／又は化学的性質を有する他のアミノ酸に置換されることを意味する。前記変異型は、少なくとも１つの生物学的活性を依然として有する状態で、例えば少なくとも１つの保存的置換を有する。このようなアミノ酸置換は、一般に残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性（amphipathic nature）における類似性に基づいて発生し得る。例えば、正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシン及びヒスチジンが挙げられ、負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、グルタミン酸及びアスパラギン酸が挙げられ、芳香族アミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンが挙げられ、疎水性アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、グリシン及びトリプトファンが挙げられる。通常、保存性置換は、生成されたポリペプチドの活性にほとんど又は全く影響を及ぼさない。
また、変異型は、ポリペプチドの特性と二次構造に最小限の影響を及ぼすアミノ酸の欠失又は付加を含んでもよい。例えば、ポリペプチドは、翻訳と同時に（co-translationally）又は翻訳後に（post-translationally）タンパク質の移転（transfer）に関与するタンパク質のＮ末端のシグナル（又はリーダー）配列に結合されてもよい。また、前記ポリペプチドは、ポリペプチドを確認、精製又は合成できるように、他の配列又はリンカーに結合されてもよい。
本出願における「メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチド」とは、メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼタンパク質活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸置換を含むメソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチドであり、前記アミノ酸置換には、Ｎ末端から１６９番目の位置のアミノ酸の他のアミノ酸への置換が含まれる。
具体的には、メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼタンパク質活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列において１６９番目のアミノ酸に相当する位置のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異型ポリペプチドが含まれる。例えば、前記変異型ポリペプチドには、配列番号１のアミノ酸配列においてＮ末端から１６９番目の位置に変異が起こった変異型ポリペプチドが含まれる。より具体的には、前記変異型ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列において１６９番目のアミノ酸に相当する位置のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたタンパク質であってもよい。
前記「他のアミノ酸への置換」は、置換前のアミノ酸とは異なるアミノ酸に置換されるものであればいかなるものでもよい。具体的には、Ｌ－リシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－バリン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－システイン、Ｌ－チロシン、Ｌ－アスパラギン及びＬ－グルタミンのいずれかのアミノ酸に置換されたものである。より具体的には、前記変異型ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列において１６９番目のアミノ酸がＬ－ロイシン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－グルタミン酸及びＬ－システインのいずれかであるが、これらに限定されるものではない。
また、前述したように置換されたアミノ酸残基には、天然アミノ酸だけでなく、非天然アミノ酸も含まれる。前記非天然アミノ酸は、例えばＤ－アミノ酸、ホモ（Homo）アミノ酸、β－ホモ（Beta-homo）アミノ酸、Ｎ－メチルアミノ酸、α－メチルアミノ酸、非通常アミノ酸（例えば、シトルリン、ナフチルアラニンなど）であるが、これらに限定されるものではない。なお、本出願における「特定アミノ酸が置換された」とは、他のアミノ酸に置換されたと表記していなくても、置換前のアミノ酸とは異なるアミノ酸に置換されたことを意味することは言うまでもない。
本出願における「相当する（corresponding to）」ものとは、タンパク質もしくはペプチドにおいて列挙される位置のアミノ酸残基、又はタンパク質もしくはペプチドにおいて列挙される残基と類似、同一もしくは相同なアミノ酸残基を意味する。本出願における「相当領域」とは、一般に関連タンパク質又は参照タンパク質における類似の位置を意味する。
本出願に用いられるポリペプチド内のアミノ酸残基の位置には、特定ナンバリングが用いられてもよい。例えば、比較する対象ポリペプチドと本出願のポリペプチド配列を整列することにより、本出願のポリペプチドのアミノ酸残基に相当する位置に対して再ナンバリングすることができる。
本出願において提供するメソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼの変異体は、前述したメソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼにおいて特異的位置のアミノ酸が置換されるので、Ｌ－トレオニンの生産能が変異前のポリペプチドに比べて向上する。
前記変異型ポリペプチドは、前述した配列番号１及び／又は配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％以上の相同性もしくは同一性を有するアミノ酸においてＮ末端から１６９番目の位置のアミノ酸が変異したものであってもよい。
また、前記変異型ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列及び／又は配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％以上の相同性もしくは同一性を有するアミノ酸においてＮ末端から１６９番目の位置のアミノ酸が変異したものであってもよく、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上、１００％未満の配列相同性を有し、メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼの活性を有するものであってもよい。
前記変異型ポリペプチドのメソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼの活性は、野生型である配列番号１のアミノ酸配列を有するメソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼの活性より弱化したものであってもよい。
本出願の目的上、前記メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチドを含む微生物は、前記メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチドが存在しない微生物より、Ｌ－アミノ酸生産量が増加することを特徴とする。前記メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチドは、天然の野生型又は非変異メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼよりＬ－アミノ酸生産能が向上するように、遺伝子調節活性を有することを特徴とする。これは、本出願のメソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチドが導入された微生物によりＬ－アミノ酸生産量が増加するということに意義がある。具体的には、Ｌ－アミノ酸は、Ｌ－トレオニン及びＬ－トレオニン由来のアミノ酸であってもよいが、前記メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチドが導入されたＬ－アミノ酸や、前記メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチドを含むように生産されたＬ－アミノ酸であればいかなるものでもよい。
前記Ｌ－トレオニン由来のアミノ酸とは、Ｌ－トレオニンを前駆体として生合成されるアミノ酸を意味し、Ｌ－トレオニンから生合成される物質であればいかなるものでもよい。
前記メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチドは、例えば配列番号１で表されるアミノ酸配列において１６９番目の位置に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含む変異型ポリペプチドであって、配列番号３で表されるものであってもよい。配列番号１のアミノ酸配列において１６９番目の位置に相当するアミノ酸がロイシン（leucine）に置換された変異体は、配列番号３で表されるものであるが、これに限定されるものではない。また、前記メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列又はそれと８０％以上の相同性もしくは同一性を有するアミノ酸配列を含むが、これらに限定されるものではない。具体的には、本出願の前記メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチドは、配列番号３及び配列番号３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％以上の相同性もしくは同一性を有するタンパク質を含んでもよい。また、このような相同性もしくは同一性を有して前記タンパク質に相当する効能を示すアミノ酸配列であれば、１６９番目の位置に相当するアミノ酸以外に、一部のアミノ酸が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も本出願に含まれることは言うまでもない。
すなわち、本出願において「特定配列番号で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質」と記載されていても、当該配列番号のアミノ酸配列からなるタンパク質と同一又は相当する活性を有するものであれば、一部の配列が欠失、改変、置換、保存的置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であっても本出願に用いられることは言うまでもない。例えば、前記変異型タンパク質と同一又は相当する活性を有するものであれば、前記アミノ酸配列の前後へのタンパク質の機能を変更しない配列の付加や、自然に発生し得る突然変異、その非表現突然変異（silent mutation）又は保存的置換を除外するものではなく、そのような配列の付加や突然変異を有するものも本出願に含まれることは言うまでもない。
本出願における「相同性（homology）」又は「同一性（identity）」とは、２つの与えられたアミノ酸配列又は塩基配列が互いに関連する程度を意味し、百分率で表される。
本出願における相同性及び同一性は、しばしば相互交換的に用いられる。
保存されている（conserved）ポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列相同性又は同一性は標準的な配列アルゴリズムにより決定され、用いられるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に用いられてもよい。実質的には、相同性を有するか（homologous）又は同じ（identical）配列は、中程度又は高いストリンジェントな条件（stringent conditions）下において、一般に配列全体又は全長の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％以上ハイブリダイズすることができる。そのハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドがコドンの代わりに縮退コドンを有するようにするものであってもよい。
任意の２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列が相同性、類似性又は同一性を有するか否かは、例えば非特許文献２のようなデフォルトパラメーターと「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの公知のコンピュータアルゴリズムを用いて決定することができる。あるいは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 非特許文献３）（バージョン５．０．０又はそれ以降のバージョン）で行われるように、ニードルマン＝ウンシュ（Needleman-Wunsch）アルゴリズム（非特許文献４）を用いて決定することができる（ＧＣＧプログラムパッケージ（非特許文献５）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（非特許文献６，７，８）を含む）。例えば、国立生物工学情報センターのＢＬＡＳＴ又はＣｌｕｓｔａｌＷを用いて相同性、類似性又は同一性を決定することができる。
ポリヌクレオチド又はポリペプチドの相同性、類似性又は同一性は、例えば非特許文献９に開示されているように、例えば非特許文献４などＧＡＰコンピュータプログラムを用いて、配列情報を比較することにより決定することができる。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうち短いものにおける記号の総数で、類似する配列記号（すなわち、ヌクレオチド又はアミノ酸）の数を割った値と定義している。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメーターは、（１）一進法比較マトリックス（同一性は１、非同一性は０の値をとる）及び非特許文献１０に開示されているように、非特許文献１１の加重比較マトリックス（又はＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）と、（２）各ギャップに３．０のペナルティ、及び各ギャップの各記号に追加の０．１０ペナルティ（又はギャップオープンペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）と、（３）末端ギャップに無ペナルティとを含む。よって、本出願における「相同性」又は「同一性」は、配列間の関連性（relevance）を示す。
本出願の他の態様は、前記メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
本出願における「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド単量体（monomer）が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体（polymer）であって、所定の長さより長いＤＮＡ又はＲＮＡ鎖であり、より具体的には前記変異型タンパク質をコードするポリヌクレオチド断片を意味する。
本出願のメソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本出願のメソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であればいかなるものを含んでもよい。前記メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１のアミノ酸配列において１６９番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異型タンパク質をコードする配列であればいかなるものを含んでもよい。具体的には、配列番号１のアミノ酸配列において１６９番目のアミノ酸がロイシンに置換された変異体をコードするポリヌクレオチド配列であってもよい。例えば、本出願のメソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列であるが、これに限定されるものではない。より具体的には、配列番号４で表されるポリヌクレオチド配列からなるものであるが、これに限定されるものではない。前記ポリヌクレオチドは、コドンの縮退（degeneracy）により、又は前記タンパク質を発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮して、タンパク質のアミノ酸配列が変化しない範囲でコード領域に様々な改変を行うことができる。よって、コドンの縮退（codon degeneracy）により、配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又はそれと相同性もしくは同一性を有するポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチドも含まれることは言うまでもない。
また、公知の遺伝子配列から製造されるプローブ、例えば前記塩基配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることにより、配列番号１のアミノ酸配列において１６９番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたメソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチドをコードする配列であればいかなるものでもよい。
前記「ストリンジェントな条件（stringent condition）」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は、文献（例えば、非特許文献１２）に具体的に記載されている。例えば、相同性（homology）もしくは同一性（identity）の高い遺伝子同士、８０％以上、８５％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、さらに具体的には９７％以上、特に具体的には９９％以上の相同性もしくは同一性を有する遺伝子同士をハイブリダイズし、それより相同性もしくは同一性の低い遺伝子同士をハイブリダイズしない条件、又は通常のサザンハイブリダイゼーション（southern hybridization）の洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度において、１回、具体的には２回～３回洗浄する条件が挙げられる。
ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションの厳格さに応じて塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することが求められる。「相補的」とは、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を表すために用いられるものである。例えば、ＤＮＡにおいて、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。よって、本出願には、実質的に類似する核酸配列だけでなく、全配列に相補的な単離された核酸フラグメントが含まれてもよい。
具体的には、相同性又は同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーションステップが行われるハイブリダイゼーション条件と前述した条件を用いて検知することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃又は６５℃であってもよいが、これらに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節される。
ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切な厳格さはポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野で公知である（非特許文献１２参照）。
本出願における「ベクター」とは、好適な宿主内で標的変異型タンパク質を発現させることができるように、好適な調節配列に作動可能に連結された前記標的変異型タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ産物を意味する。前記調節配列には、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれる。ベクターは、好適な宿主細胞内に形質転換されると、宿主ゲノムに関係なく複製及び機能することができ、ゲノム自体に組み込まれる。
本出願に用いられるベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されるものではなく、当該技術分野で公知の任意のベクターが用いられる。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしては、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、ｐＥＴ系などを用いることができる。具体的にはｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いることができる。
例えば、細胞内染色体導入用ベクターにより、染色体内で標的変異型タンパク質をコードするポリヌクレオチドを変異したポリヌクレオチドに置換することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体への挿入は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば相同組換え（homologous recombination）により行うことができるが、これに限定されるものではない。前記染色体に挿入されたか否かを確認するための選択マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選択、すなわち標的核酸分子が挿入されたか否かを確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性、表面変異型タンパク質の発現などの選択可能表現型を付与するマーカーが用いられる。選択剤（selective agent）で処理した環境においては、選択マーカーを発現する細胞のみ生存するか、異なる表現形質を示すので、形質転換された細胞を選択することができる。
本出願のさらに他の態様は、前記変異型タンパク質を含むか、前記変異型タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、Ｌ－トレオニンを生産する微生物を提供する。具体的には、変異型タンパク質及び／又は前記変異型タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む微生物は、変異型タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換することにより製造される微生物であってもよいが、これに限定されるものではない。
本出願における「形質転換」とは、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入することにより、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現させることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現するものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、いかなるものでもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡやＲＮＡを含むものである。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現するものであれば、いかなる形態で導入されるものでもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自ら発現する上で必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入される。通常、前記発現カセットは、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含む。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。
また、前記「作動可能に連結」されたものとは、本出願の標的変異型タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されたものを意味する。
本出願のさらに他の態様は、前記メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドを含むコリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）微生物を提供する。
本出願における「メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む微生物」とは、本出願のメソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチドが発現するように組換えた微生物を意味する。例えば、メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むか、又はメソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換されることにより、前記変異体を発現する宿主細胞又は微生物を意味する。本出願の目的上、具体的には、前記微生物は、配列番号１のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸置換を含むメソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチドを発現する微生物であって、前記アミノ酸置換は、Ｎ末端から１６９番目のアミノ酸がロイシンに置換されるものであり、メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチド活性を有し、変異型タンパク質を発現する微生物であってもよいが、これに限定されるものではない。
前記メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む微生物は、前記メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドを含み、Ｌ－アミノ酸、例えばＬ－トレオニンを生産する微生物であればいかなるものでもよい。例えば、前記メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む微生物は、天然の野生型微生物又はＬ－アミノ酸を生産する微生物にメソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されることによりメソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチドが発現し、Ｌ－アミノ酸生産能が向上した組換え微生物であってもよい。前記Ｌ－アミノ酸生産能が向上した組換え微生物は、天然の野生型微生物又は非改変微生物よりＬ－アミノ酸生産能が向上した微生物であり、前記Ｌ－アミノ酸は、Ｌ－トレオニンであってもよいが、これらに限定されるものではない。
本出願における「Ｌ－アミノ酸を生産する微生物」とは、野生型微生物や自然に又は人為的に遺伝的改変が行われた微生物が全て含まれるものであり、外部遺伝子が挿入されるか、内在性遺伝子の活性が強化又は不活性化されるなどの原因により、特定機序が弱化又は強化された微生物であって、目的とするＬ－アミノ酸生産のために遺伝的変異を起こすか、活性を強化した微生物である。当該微生物は、前記変異型ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターの少なくとも１つにより遺伝的に改変された微生物、前記変異型ポリペプチドもしくはそれをコードするポリヌクレオチドを発現するように改変された微生物、前記変異型ポリペプチドもしくはそれをコードするポリヌクレオチドを発現する組換え微生物、又は前記変異型ポリペプチド活性を有する組換え微生物であってもよいが、これらに限定されるものではない。
前記Ｌ－アミノ酸を生産する微生物は、前記変異型ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドを含むか、前記ポリヌクレオチドを含むベクターが導入されることにより、目的とするＬ－アミノ酸の生産能が向上したものである。具体的には、前記導入は、形質転換により行われてもよいが、これに限定されるものではない。
また、本出願におけるＬ－アミノ酸を生産する微生物又はＬ－アミノ酸生産能を有する微生物は、Ｌ－アミノ酸生合成経路における遺伝子の一部が強化又は弱化するか、Ｌ－アミノ酸分解経路における遺伝子の一部が強化又は弱化した微生物であってもよい。
本出願の目的上、前記微生物は、前記変異型ポリペプチドを含み、Ｌ－トレオニン又はＬ－トレオニン由来のアミノ酸を生産する微生物であればいかなるものでもよい。
前記「非改変微生物」とは、天然菌株自体や、前記メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチドを含まない微生物、又は前記メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換されていない微生物を意味する。前記「微生物」は、Ｌ－アミノ酸を生産する微生物であれば、原核微生物や真核微生物のいかなるものであってもよい。例えば、エシェリキア（Escherichia）属、エルウィニア（Erwinia）属、セラチア（Serratia）属、プロビデンシア（Providencia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属及びブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属する微生物菌株が挙げられる。具体的には、コリネバクテリウム属微生物であってもよく、より具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）であるが、これらに限定されるものではない。
前記コリネバクテリウム属微生物は、具体的には、前記Ｌ－トレオニンの生合成経路を強化するために、例えばトレオニン合成酵素をコードするｔｈｒＣ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするｐｐｃ遺伝子、グルコース取り込みに関与するｇａｌＰ遺伝子、リシン感受性アスパルトキナーゼ３（lysine-sensitive aspartokinase 3）をコードするｌｙｓＣ遺伝子、ホモセリンデヒドロゲナーゼ（homoserine dehydrogenase）をコードするｈｏｍ遺伝子、オキサロ酢酸（Oxaloacetate）ｐｏｏｌ増加を誘導するｐｙｃ遺伝子などの発現を微生物中で強化又は増加させてもよい。
前記Ｌ－トレオニンに対するフィードバック阻害を解除するために、例えばｌｙｓＣ遺伝子、ｈｏｍ遺伝子、アスパルトキナーゼとホモセリンデヒドロゲナーゼ１の二官能性を有する（Bifunctional aspartokinase/homoserine dehydrogenase 1）ｔｈｒＡ遺伝子などの遺伝子変異を導入してもよい。
前記Ｌ－トレオニンの生合成経路を弱化させる遺伝子を不活性化するために、例えばＬ－トレオニン生合成の中間体であるオキサロ酢酸（ＯＡＡ）のホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）への変換に関与するｐｃｋＡ遺伝子、ｌｙｓＣ遺伝子を抑制するｔｙｒＲ遺伝子、グルコース取り込みに関与するｇａｌＰ遺伝子の発現を抑制するｇａｌＲ遺伝子、ＤＮＡ－結合転写二重調節因子（DNA-binding transcriptional dual regulator）であるｍｃｂＲ遺伝子などの発現を微生物中で弱化又は不活性化させてもよい。
前記Ｌ－トレオニンオペロンの活性を増加させるために、アスパルトキナーゼ（aspartokinase）、ホモセリンデヒドロゲナーゼ（homoserine dehydrogenase）、ホモセリンキナーゼ（homoserine kinase）及びトレオニンシンターゼ（threonine synthase）をコードする遺伝子から構成されるトレオニンオペロン（特許文献２）を含むプラスミド、大腸菌由来のトレオニンオペロンなどを微生物に導入し（非特許文献１３）、微生物中でトレオニンオペロン発現を増加させてもよい。
また、Ｌ－トレオニンアナログであるα－アミノ－β－ヒドロキシ吉草酸、Ｄ，Ｌ－トレオニンヒドロキサメートなどに対する耐性を付与してもよい。
さらに、Ｌ－トレオニンと共通の前駆体を有するＬ－リシンの生合成経路に作用する遺伝子であるｄａｐＡ（ジヒドロジピコリン酸シンターゼ：dihydrodipicolinate synthase）、ｌｙｓＡ（ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ：Diaminopimelate decarboxylase）、ｄｄｈ（ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ：diaminopimelate dehydrogenase）遺伝子を弱化させてもよい。
しかし、これらに限定されるものではなく、当該技術分野で公知の遺伝子発現調節方法によりＬ－トレオニン生産能を強化することができる。
本出願における「強化／増加」は、内在性活性に比べて活性が増加することが全て含まれる概念である。
このような遺伝子の活性の強化又は増加は、当該分野で周知の様々な方法を適用することにより達成することができる。前記方法の例として、遺伝子の細胞内コピー数を増加させる方法、遺伝子の発現調節配列に変異を導入する方法、遺伝子の発現調節配列を活性が強力な配列に置換する方法、遺伝子の活性が強化されるように当該遺伝子に変異をさらに導入する方法、及び微生物に外来遺伝子を導入する方法からなる群から選択される少なくとも１つの方法が挙げられ、それらの組み合わせによっても達成することができるが、上記例に特に限定されるものではない。
本出願における「不活性化」は、内在性活性に比べて活性が弱化することや、活性がなくなることが全て含まれる概念である。
このような遺伝子の活性の不活性化又は弱化は、当該分野で周知の様々な方法を適用することにより達成することができる。前記方法の例として、前記遺伝子の活性を除去する場合をはじめとして、染色体上の遺伝子の全部又は一部を欠失させる方法、当該タンパク質の活性が低下するように突然変異させた遺伝子により染色体上の前記タンパク質をコードする遺伝子を代替する方法、前記タンパク質をコードする染色体上の遺伝子の発現調節配列に変異を導入する方法、前記タンパク質をコードする遺伝子の発現調節配列を活性が弱い配列や活性のない配列に置換する方法（例えば、前記遺伝子のプロモーターを内在性プロモーターより弱いプロモーターに置換する方法）、前記タンパク質をコードする染色体上の遺伝子の全部又は一部を欠失させる方法、前記染色体上の遺伝子の転写産物に相補的に結合させて前記ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）を導入する方法、前記タンパク質をコードする遺伝子のＳＤ配列の前にＳＤ配列と相補的な配列を人為的に付加することにより２次構造物を形成させてリボソーム（ribosome）の付着を不可能にする方法、当該配列のＯＲＦ（open reading frame）の３’末端に逆転写するようにプロモーターを付加するＲＴＥ（Reverse transcription engineering）方法などが挙げられ、それらの組み合わせによっても達成することができるが、上記例に特に限定されるものではない。
例えば、ｌｙｓＣ、ｈｏｍ、ｐｙｃの活性強化は、遺伝子の細胞内コピー数を増加させる方法、遺伝子の発現調節配列に変異を導入する方法、遺伝子の発現調節配列を活性が強力な配列に置換する方法、遺伝子の活性が強化されるように当該遺伝子に変異をさらに導入する方法、微生物に外来遺伝子を導入する方法などにより行われるが、これらに限定されるものではなく、活性強化又は増加のために公知のいかなる方法を用いてもよい。
例えば、ｄａｐＡ、ｄｄｈ、ｌｙｓＡの活性弱化は、前記遺伝子の活性を除去する場合をはじめとして、染色体上の遺伝子の全部又は一部を欠失させる方法、当該タンパク質の活性が低下するように突然変異させた遺伝子により染色体上の前記タンパク質をコードする遺伝子を代替する方法、前記タンパク質をコードする染色体上の遺伝子の発現調節配列に変異を導入する方法、前記タンパク質をコードする遺伝子の発現調節配列を活性が弱い配列や活性のない配列に置換する方法（例えば、前記遺伝子のプロモーターを内在性プロモーターより弱いプロモーターに置換する方法）、前記タンパク質をコードする染色体上の遺伝子の全部又は一部を欠失させる方法などにより行われるが、これらに限定されるものではなく、活性弱化のために公知のいかなる方法を用いてもよい。
また、本出願における前記メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチドを含む微生物は、次の変異型ポリペプチドの１つ以上、又は次の変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの１つ以上をさらに含んでもよい。
前述したようにさらに含まれる変異型ポリペプチドは、配列番号８１のアミノ酸配列において１３番目のアミノ酸がアルギニンからアスパラギンに置換されたジヒドロジピコリン酸リダクターゼ（dihydrodipicolinate reductase; dapB）変異型ポリペプチド、配列番号８２のアミノ酸配列において４０８番目のアミノ酸がメチオニンからアラニンに置換されたジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（diaminopimelate decarboxylase; lysA）変異型ポリペプチド、及び配列番号８３のアミノ酸配列において１１９番目のアミノ酸がチロシンからフェニルアラニンに置換されたジヒドロジピコリン酸シンターゼ（dihydrodipicolinate synthase; dapA）変異型ポリペプチドから選択される１つ以上であってもよい。
配列番号８１のアミノ酸配列において１３番目のアミノ酸がアルギニンからアスパラギンに置換されたジヒドロジピコリン酸リダクターゼ変異型ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号６６で表されるが、これに限定されるものではない。本出願における前記変異型ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドを導入することにより、リシンの生産量を減少させることができ、トレオニンの生産量を増加させることができる。
配列番号８２のアミノ酸配列において４０８番目のアミノ酸がメチオニンからアラニンに置換されたジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ変異型ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号７１で表されるが、これに限定されるものではない。ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼは、リシン生合成に作用する最後の酵素であり、前記４０８番目のアミノ酸がメチオニンからアラニンに置換されることにより、リシンの生産能を低下させることができ、トレオニンの生産量を増加させることができる。
配列番号８３のアミノ酸配列において１１９番目のアミノ酸がチロシンからフェニルアラニンに置換されたジヒドロジピコリン酸シンターゼ変異型ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号７６で表されるが、これに限定されるものではない。前記ジヒドロジピコリン酸シンターゼは、リシンとトレオニンの共通の前駆体であるアスパルチルセミアルデヒド（aspartyl semialdehyde）からリシンを生合成するための酵素であり、前記１１９番目のアミノ酸配列がチロシンからフェニルアラニンに置換されることにより、リシンの生産能を低下させることができ、トレオニンの生産量を増加させることができる。
本出願のさらに他の態様は、前記メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する変異型ポリペプチドを含むコリネバクテリウム属微生物を培地で培養するステップを含む、トレオニン又はトレオニン由来Ｌ－アミノ酸の生産方法を提供する。
トレオニン由来Ｌ－アミノ酸には、トレオニン由来Ｌ－アミノ酸だけでなく、その誘導体も含まれる。例えば、Ｌ－トレオニン、Ｌ－イソロイシン、Ｏ－アセチル－Ｌ－ホモセリン、Ｏ－スクシニル－Ｌ－ホモセリン、Ｏ－ホスホ－Ｌ－ホモセリン、Ｌ－メチオニン及び／又はＬ－グリシンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。より具体的には、Ｌ－トレオニン、Ｌ－イソロイシン、Ｏ－アセチル－Ｌ－ホモセリン、Ｏ－スクシニル－Ｌ－ホモセリン及び／又はＬ－メチオニンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
前記方法における前記微生物を培養するステップは、特に限定されるものではないが、公知の回分培養方法、連続培養方法、流加培養方法などにより行うことができる。ここで、培養条件は、特にこれらに限定されるものではないが、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又はアンモニア）又は酸性化合物（例えば、リン酸又は硫酸）を用いて適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５～９、具体的にはｐＨ６～８、最も具体的にはｐＨ６．８）に調節し、酸素又は酸素含有ガス混合物を培養物に導入して好気性条件を維持してもよい。培養温度は２０～４５℃、具体的には２５～４０℃に維持し、約１０～１６０時間培養してもよいが、これらに限定されるものではない。上記培養により生産されたＬ－アミノ酸は、培地中に分泌されるか、又は細胞内に残留してもよい。
また、用いられる培養用培地は、炭素供給源として糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、モラセス、デンプン及びセルロース）、油脂（例えば、大豆油、ヒマワリ油、落花生油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸）、アルコール（例えば、グリセリン及びエタノール）、有機酸（例えば、酢酸）などを個別に又は混合して用いることができるが、これらに限定されるものではない。窒素供給源としては、窒素含有有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆粕及び尿素）、無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム）などを個別に又は混合して用いることができるが、これらに限定されるものではない。リン供給源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、それらに相当するナトリウム含有塩などを個別に又は混合して用いることができるが、これらに限定されるものではない。また、培地は、その他金属塩（例えば、硫酸マグネシウム又は硫酸鉄）、アミノ酸、ビタミンなどの必須成長促進物質を含んでもよい。
本出願の前記微生物を培養するステップに加えて、培養した培地及び微生物からＬ－トレオニン又はＬ－トレオニン由来Ｌ－アミノ酸を回収するステップをさらに含んでもよい。
前記培養ステップで生産されたＬ－トレオニン又はＬ－トレオニン由来Ｌ－アミノ酸を回収する方法は、培養方法に応じて、当該分野で公知の好適な方法を用いて培養液から目的とするＬ－トレオニン又はＬ－トレオニン由来Ｌ－アミノ酸を回収（collect）することができる。例えば、遠心分離、濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化、ＨＰＬＣなどが用いられ、当該分野で公知の好適な方法を用いて培地又は微生物から目的とするＬ－トレオニン又はＬ－トレオニン由来Ｌ－アミノ酸を回収することができる。
また、前記回収ステップは、精製工程を含んでもよく、当該分野で公知の好適な方法を用いて行うことができる。よって、前述したように回収されるＬ－トレオニン又はＬ－トレオニン由来Ｌ－アミノ酸は、精製された形態であってもよく、Ｌ－アミノ酸を含有する微生物発酵液であってもよい（非特許文献１４）。
本出願のさらに他の態様は、本出願のメソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する変異型ポリペプチド、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、又はそれらの１つ以上を含む、微生物又はその培養液を含むＬ－トレオニン生産用組成物を提供する。
前記メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、その変異型ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター及び微生物については前述した通りである。
前記微生物は、コリネバクテリウム属であり、具体的にはコリネバクテリウム・グルタミカムであってもよいが、これらに限定されるものではない。それについては前述した通りである。
前記Ｌ－トレオニン生産用組成物とは、本出願のメソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する変異型ポリペプチドによりＬ－トレオニンを生産する組成物を意味する。前記組成物には、前記メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する変異型ポリペプチド、又は前記メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する変異型ポリペプチドを作動させることのできる構成が全て含まれる。前記メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する変異型ポリペプチドは、導入された宿主細胞において作動可能に連結された遺伝子を発現させることができるようにベクターに含まれる形態であってもよい。
前記組成物は、凍結保護剤又は賦形剤をさらに含んでもよい。前記凍結保護剤又は賦形剤は、非自然発生（non-naturally occurring）の物質、又は自然発生の物質であってもよいが、これらに限定されるものではない。他の具体例として、前記凍結保護剤又は賦形剤は、前記微生物が自然に接触しない物質、又は前記微生物と自然に同時に含まれない物質であってもよいが、これらに限定されるものではない。
本出願のさらに他の態様は、前記本出願のメソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチド、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、又はそれらの１つ以上を含む微生物のＬ－トレオニン又はＬ－トレオニン由来Ｌ－アミノ酸の生産における使用を提供する。
以下、実施例を挙げて本出願をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本出願を例示するものにすぎず、本出願がこれらの実施例に限定されるものではない。
ｄｄｈ遺伝子ＯＲＦ内変異導入用ベクターライブラリーの作製
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）のｄｄｈ遺伝子の発現量又はその活性が低下した変異体を見出すために、次の方法でライブラリーを作製した。
まず、ｄｄｈ（９６３ｂｐ）遺伝子を含むＤＮＡ断片（９６３ｂｐ）に１ｋｂ当たり０～４．５個の変異を導入するために、ＧｅｎｅｍｏｒｐｈＩＩＲａｎｄｏｍＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（Stratagene）を用いた。コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２（ＷＴ）の染色体を鋳型とし、プライマー配列番号５及び６を用いてＥｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅＰＣＲを行った。具体的には、ＷＴ菌株の染色体（５００ｎｇ）、プライマー５及び６（それぞれ１２５ｎｇ）、ＭｕｔａｚｙｍｅＩＩｒｅａｃｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ（１Х）、ｄＮＴＰｍｉｘ（４０ｍＭ）、ＭｕｔａｚｙｍｅＩＩＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．５Ｕ）を含む反応液を用いて、９４℃で２分間の変性後、９４℃で１分間の変性、５６℃で１分間のアニーリング、７２℃で３分間の重合を２５サイクル行い、次いで７２℃で１０分間の重合反応を行った。
ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、増幅した遺伝子断片をｐＣＲＩＩベクターに連結し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含むＬＢ固体培地に塗抹した。形質転換したコロニー２０種を選択し、プラスミドを得て塩基配列を分析した結果、０．５ｍｕｔａｔｉｏｎｓ／ｋｂの頻度で異なる位置に変異が導入されたことが確認された。最終的に約１０，０００個の形質転換した大腸菌コロニーを得てプラスミドを抽出し、これをｐＴＯＰＯ－ｄｄｈ（ｍｔ）ライブラリーと命名した。
ｄｄｈ欠損株の作製及びランダム突然変異ライブラリーのスクリーニング
ｄｄｈ欠損によるＬ－リシン生産への影響を確認するために、Ｌ－リシンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ（特許文献３）を用いた。コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ（特許文献３）菌株からｄｄｈ遺伝子が欠損した菌株を作製するために、次のようにｄｄｈ遺伝子が欠損したベクターｐＤＺ－Δｄｄｈを作製した。
具体的には、ｄｄｈ遺伝子の５’及び３’末端に位置するＤＮＡ断片（それぞれ６００ｂｐ）がｐＤＺベクター（特許文献４）に連結された形態に作製した。報告されているｄｄｈ遺伝子の塩基配列（配列番号２）に基づいて、５’断片及び３’断片に制限酵素ＸｂａＩ認識部位を挿入したプライマー配列番号７及び８と、それらからそれぞれ６６３ｂｐ離れた位置のプライマー配列番号９及び１０を合成した（表１）。コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型とし、５’末端の遺伝子断片は、プライマー配列番号７及び９を用いて、ＰＣＲにより作製した。同様に、ｄｄｈ遺伝子の３’末端に位置する遺伝子断片は、配列番号８及び１０を用いて、ＰＣＲにより作製した。ＰＣＲ条件は、９４℃で２分間の変性後、９４℃で１分間の変性、５６℃で１分間のアニーリング、７２℃で４０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で１０分間の重合反応を行うものとした。
一方、制限酵素ＸｂａＩで処理し、その後６５℃で２０分間熱処理したｐＤＺベクターと、前記ＰＣＲにより増幅した挿入ＤＮＡ断片をＩｎｆｕｓｉｏｎＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔで連結し、次いで大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含むＬＢ固体培地に塗抹した。プライマー配列番号７及び８を用いたＰＣＲにより、標的遺伝子が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選択し、その後周知のプラスミド抽出法によりプラスミドを得て、このプラスミドをｐＤＺ－Δｄｄｈと命名した。
Figure 0007308296000001
前述したように作製したベクターｐＤＺ－Δｄｄｈをコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ菌株に電気パルス法（非特許文献１５）で形質転換し、相同染色体組換えによりｄｄｈ遺伝子が欠損した菌株を作製した。このようにｄｄｈ遺伝子が欠損した菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＷＴ：：Δｄｄｈと命名した。
また、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ（）：：Δｄｄｈ菌株を対象に、実施例１で作製したｐＴＯＰＯ－ｄｄｈ（ｍｔ）ライブラリーを電気パルス法で形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含む複合平板培地に塗抹して約２００００個のコロニーを確保した。それぞれ３００μｌの次の選択培地に接種し、９６ディープウェルプレート（96-deep well plate）にて３２℃、１０００ｒｐｍで約２４時間培養した。
＜選択培地（ｐＨ８．０）＞
グルコース１０ｇ，硫酸アンモニウム（ammonium sulfate）５．５ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ１．２ｇ，ＫＨ２ＰＯ４０．８ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４１６．４ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ１ｍｇ，パントテン酸カルシウム２ｍｇ，ニコチンアミド２ｍｇ（蒸留水１リットル中）
培養液中に生産されたＬ－リシンの生産量を分析するためにニンヒドリン法を用いた（非特許文献１６）。
培養終了後に、培養上清１０μｌとニンヒドリン反応溶液１９０μｌを６５℃で３０分間反応させ、次いで分光光度計（spectrophotometer）にて波長５７０ｎｍで吸光度を測定した。ＷＴ及びＷＴ：：Δｄｄｈ菌株を対照群として用いた。野生型であるＷＴ菌株と比較して吸光度が減少し、かつＷＴ：：Δｄｄｈ菌株より高い吸光度を示す６０種の菌株を選択した。
前述したように選択した約６０種の菌株を上記と同様に再び培養し、その後ニンヒドリン反応を繰り返し行い、最終的にＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：Δｄｄｈ菌株よりＬ－リシン生産能が向上するが、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ菌株よりＬ－リシン生産能が低下した上位５種の突然変異株を選択した。前述したように選択した５種の菌株をＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｄｄｈ（ｍｔ）－１～５と命名した（表２）。
Figure 0007308296000002
５種のｄｄｈ変異株の塩基配列の確認
５種の選択菌株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｄｄｈ（ｍｔ）－１～５のｄｄｈ遺伝子の塩基配列を確認するために、実施例１のプライマー（配列番号５及び６）を用いて、染色体にｄｄｈ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ条件は、９４℃で２分間の変性後、９４℃で１分間の変性、５６℃で１分間のアニーリング、７２℃で４０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で１０分間の重合反応を行うものとした。
Figure 0007308296000003
増幅した遺伝子の塩基配列を分析した結果、５種の菌株は、ｉ）ｄｄｈ遺伝子のＯＲＦの開始コドンから下流３７ｂｐに位置する塩基配列に１個の変異が導入されて従来のＡＡＣからＧＡＣに置換され、Ｎ末端から１３番目のアミノ酸であるアスパラギンがアスパラギン酸に置換された形態、ｉｉ）下流１０６～１０８ｂｐに位置する塩基配列に３個の変異が導入されて従来のＣＧＣからＡＴＧに置換され、Ｎ末端から３６番目のアミノ酸であるアルギニンがメチオニンに置換された形態、ｉｉｉ）下流４４８～４４９ｂｐに位置する塩基配列に２個の変異が導入されて従来のＣＡＧからＡＴＧに置換され、Ｎ末端から１５０番目のアミノ酸であるグルタミンがメチオニンに置換された形態、ｉｖ）下流５０５～５０６ｂｐに位置する塩基配列に２個の変異が導入されて従来のＡＣＣからＣＴＣに置換され、Ｎ末端から１６９番目のアミノ酸であるトレオニンがロイシンに置換された形態、ｖ）下流５８４～５８５ｂｐに位置する塩基配列に２個の変異が導入されて従来のＣＧＣからＣＡＡに置換され、Ｎ末端から１９５番目のアミノ酸であるアルギニンがグルタミンに置換された形態のメソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ＤＤＨ）変異体であることが確認された。
５種のｄｄｈ変異が導入されたＡＴＣＣ１３０３２菌株の作製及びトレオニン、リシン生産能の評価
実施例３で確認した５種の変異について、再現性を有してＬ－リシン生産能が減少し、Ｌ－トレオニンが増加する菌株を最終選択するために、野生型菌株由来の変異導入菌株を作製した。
野生型のコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２から変異型ｄｄｈ遺伝子が導入された菌株を作製するために、次のように変異型ｄｄｈ遺伝子を導入する５種のベクターｐＤＺ：：ｄｄｈｍ１－５を作製した。
具体的には、ｄｄｈ遺伝子の５’及び３’末端に位置するＤＮＡ断片（それぞれ９６３ｂｐ）がｐＤＺベクター（特許文献４）に連結された形態に作製した。報告されているｄｄｈ遺伝子の塩基配列（配列番号２）に基づいて、５’断片及び３’断片に制限酵素ＸｂａＩ認識部位を挿入したプライマー配列番号１１と、それらからそれぞれ９３１ｂｐ離れた位置のプライマー配列番号１２を合成した。実施例３で確認したＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｄｄｈ（ｍｔ）－１～５の染色体を鋳型とし、プライマー配列番号１１及び１２を用いて、ＰＣＲにより変異型ＤＮＡ断片を作製した。ＰＣＲ条件は、９４℃で２分間の変性後、９４℃で１分間の変性、５６℃で１分間のアニーリング、７２℃で４０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で１０分間の重合反応を行うものとした。
一方、制限酵素ＸｂａＩで処理し、その後６５℃で２０分間熱処理したｐＤＺベクターと、上記ＰＣＲにより増幅した変異型ＤＮＡ断片をＩｎｆｕｓｉｏｎＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔで連結し、次いで大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含むＬＢ固体培地に塗抹した。プライマー配列番号１１及び１２を用いたＰＣＲにより、標的遺伝子が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選択し、その後周知のプラスミド抽出法によりプラスミドを得て、このプラスミドをｐＤＺ：：ｄｄｈ（ｍｔ）１～５と命名した。
作製したベクターｐＤＺ：：ｄｄｈ（ｍｔ）１～５をエレクトロポレーションによりコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に形質転換し、２次交差過程を経て、染色体上でそれぞれ変異型塩基に置換された菌株を得た。適切に置換されたか否かは、次に挙げるプライマーセットを用いて、ＭＡＳＡ（Mutant Allele Specific Amplification）ＰＣＲ法(非特許文献１７）により、変異型配列に一致するプライマーセット（配列番号１３及び１４）から増幅された菌株を選択することにより１次決定した。選択した菌株のｄｄｈ配列分析は、配列番号１３及び１５のプライマーセットを用いて、変異型配列分析を行うことにより、２次確認した。このように変異型ｄｄｈ遺伝子が導入された菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２：：ｄｄｈ（ｍｔ）１～ＡＴＣＣ１３０３２：：ｄｄｈ（ｍｔ）５と命名した。
Figure 0007308296000004
５種の変異を導入した菌株５種について、再現性を有してＬ－リシン生産能が減少し、Ｌ－トレオニンが増加する菌株を最終選択するために、次の培地を用いたフラスコ培養を行った。培養終了後に、ＨＰＬＣを用いて、培養液中のＬ－リシン及びトレオニン濃度を分析した。各突然変異株のＬ－リシン及びトレオニン生産濃度を表５及び表６に示す。
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４８ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ１ｍｇ，パントテン酸カルシウム２ｍｇ，ニコチンアミド２ｍｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース１００ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４４０ｇ，大豆タンパク質２．５ｇ，コーンスティープソリッド（Corn Steep Solids）５ｇ，尿素３ｇ，ＫＨ２ＰＯ４１ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミン塩酸塩１ｍｇ，パントテン酸カルシウム２ｍｇ，ニコチンアミド３ｍｇ，ＣａＣＯ３３０ｇ（蒸留水１リットル中）
Figure 0007308296000005
Figure 0007308296000006
前述したように選択した５種の突然変異株のうち、Ｌ－リシン生産能が有意に減少し、Ｌ－トレオニンが向上する菌株として、ＡＴＣＣ１３０３２：：ｄｄｈ（ｍｔ）４を選択した。
ｄｄｈ変異５種を導入したＡＴＣＣ１３８６９菌株の作製及びトレオニン、リシン生産能の評価
実施例３で選択した５種の変異について、再現性を有してＬ－リシン生産能が減少し、Ｌ－トレオニンが増加する菌株を最終選択するために、野生型菌株由来の変異導入菌株を作製した。
野生型のコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９から変異型ｄｄｈ遺伝子が導入された菌株を作製するために、実施例４で作製したベクターｐＤＺ：：ｄｄｈ（ｍｔ）１～５をエレクトロポレーションによりコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９に形質転換し、２次交差過程を経て、染色体上でそれぞれ変異型塩基に置換された菌株を得た。適切に置換されたか否かは、次に挙げるプライマーセットを用いて、ＭＡＳＡ（Mutant Allele Specific Amplification）ＰＣＲ技法（非特許文献１７）により、変異型配列に一致するプライマーセット（配列番号１３及び１４）から増幅された菌株を選択することにより１次決定した。選択した菌株のｄｄｈ配列分析は、配列番号１３及び１５のプライマーセットを用いて、変異型配列分析を行うことにより、２次確認した。このように変異型ｄｄｈ遺伝子が導入された菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９：：ｄｄｈ（ｍｔ）１～５と命名した。
５種の変異を導入した菌株５種について、再現性を有してＬ－リシン生産能が減少し、Ｌ－トレオニンが増加する菌株を最終選択するために、次の培地を用いたフラスコ培養を行った。培養終了後に、ＨＰＬＣを用いて、培養液中のＬ－リシン及びトレオニン濃度を分析した。各突然変異株のＬ－リシン及びトレオニン生産濃度を表７及び表８に示す。
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４８ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ１ｍｇ，パントテン酸カルシウム２ｍｇ，ニコチンアミド２ｍｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース１００ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４４０ｇ，大豆タンパク質２．５ｇ，コーンスティープソリッド（Corn Steep Solids）５ｇ，尿素３ｇ，ＫＨ２ＰＯ４１ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミン塩酸塩１ｍｇ，パントテン酸カルシウム２ｍｇ，ニコチンアミド３ｍｇ，ＣａＣＯ３３０ｇ（蒸留水１リットル中）
Figure 0007308296000007
Figure 0007308296000008
野生型のＡＴＣＣ１３８６９に比べて、ｄｄｈが欠損したＡＴＣＣ１３８６９：：Δｄｄｈ菌株は、糖消費速度が著しく低下し、菌株の生長が阻害されることが確認された。それに対して、選択した菌株５種は、野生型菌株と同等レベルの糖消費速度を維持し、Ｌ－リシン生産量は減少し、Ｌ－トレオニン生産量は増加することが確認された。
前述したように選択した５種の突然変異株のうち、Ｌ－リシン生産能が有意に減少し、Ｌ－トレオニンが向上する菌株として、実施例４と同一のＡＴＣＣ１３０３２：：ｄｄｈ（ｍｔ）４を最終選択した。
Ｌ－トレオニン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物菌株からの変異型ｄｄｈ導入菌株の作製及び評価
野生種コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２からＬ－トレオニン生産菌株を開発した。具体的には、トレオニン生合成経路において第一の重要な酵素として作用するａｓｐａｒｔａｔｅｋｉｎａｓｅ（ｌｙｓＣ）のフィードバック阻害（feedback inhibition）を解除するために、ｌｙｓＣの３７７番目のアミノ酸であるロイシン（Leucine）をリシン（Lysine）に置換した（配列番号１６）。
より具体的には、ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）変異を導入した菌株を作製するために、ＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型とし、配列番号１７及び１８又は配列番号１９及び２０のプライマーを用いてＰＣＲをそれぞれ行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしては、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。ＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合反応を２８サイクル行うものとした。
その結果、ｌｙｓＣ遺伝子の変異を中心に、５’末端上流の５１５ｂｐのＤＮＡ断片と、３’末端下流の５３８ｂｐのＤＮＡ断片がそれぞれ得られた。増幅された２つのＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号１７及び２０のプライマーでＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２分間の重合を２８サイクル行い、次いで７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。
Figure 0007308296000009
その結果、３７７番目のロイシンがリシンに置換されたアスパルトキナーゼ変異体をコードするｌｙｓＣ遺伝子の変異を含む１０２３ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。ＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔを用いて増幅産物を精製し、ベクター作製のための挿入ＤＮＡ断片として用いた。一方、制限酵素ｓｍａＩで処理し、その後６５℃で２０分間熱処理したｐＤＺベクターと、上記ＰＣＲにより増幅した挿入ＤＮＡ断片のモル濃度（Ｍ）の比が１：２になるように、タカラ（TaKaRa）のＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、提供されたマニュアルに従ってクローニングすることにより、Ｌ３７７Ｋ変異を染色体上に導入するためのベクターｐＤＺ－Ｌ３７７Ｋを作製した。
作製したベクターをエレクトロポレーションによりＡＴＣＣ１３０３２に形質転換し、２次交差過程を経て、染色体上で各塩基変異が変異型塩基に置換された菌株を得た。これをＣＪＰ１と命名した。前記ＣＪＰ１をＣＡ０１－２３０７と命名し、２０１７年３月２９日付けでブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に受託番号ＫＣＣＭ１２０００Ｐとして寄託した。
Ｌ－トレオニン生産において第二の重要な酵素として作用するｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ｈｏｍ）のフィードバック阻害（feedback inhibition）を解除するために、ｈｏｍの４０７番目のアミノ酸であるアルギニン（Arginine）をヒスチジン（Histidine）に置換した（配列番号２１）。
より具体的には、ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）変異を導入した菌株を作製するために、ＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型とし、配列番号２２及び２３又は配列番号２４及び２５のプライマーを用いてＰＣＲをそれぞれ行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしては、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。ＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合反応を２８サイクル行うものとした。
Figure 0007308296000010
その結果、ｈｏｍ遺伝子の変異を中心に、５’末端上流の５３３ｂｐのＤＮＡ断片と、３’末端下流の５１２ｂｐのＤＮＡ断片がそれぞれ得られた。増幅された２つのＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号２２及び２５のプライマーでＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２分間の重合を２８サイクル行い、次いで７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。
その結果、４０７番目のアルギニンがヒスチジンに置換されたアスパルトキナーゼ変異体をコードするｈｏｍ遺伝子の変異を含む１０１８ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。ＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔを用いて増幅産物を精製し、ベクターの作製のための挿入ＤＮＡ断片として用いた。一方、制限酵素ｓｍａＩで処理し、その後６５℃で２０分間熱処理したｐＤＺベクターと、上記ＰＣＲにより増幅した挿入ＤＮＡ断片のモル濃度（Ｍ）の比が１：２になるように、タカラ（TaKaRa）のＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、提供されたマニュアルに従ってクローニングすることにより、Ｒ４０７Ｈ変異を染色体上に導入するためのベクターｐＤＺ－Ｒ４０７Ｈを作製した。
作製したベクターをエレクトロポレーションによりＣＪＰ１に形質転換し、２次交差過程を経て、染色体上で各塩基変異が変異型塩基に置換された菌株を得た。これをＣＡ０９－０９００（受託番号ＫＣＣＭ１２４１８Ｐ）と命名した。
前記菌株のＬ－トレオニン及びＬ－リシン生産の変化を明確に確認するために、メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ＤＤＨ）をコードする遺伝子に、実施例５及び６においてＬ－トレオニン生産に最も優れ、Ｌ－リシン低減が最も大きかったＴ１６９Ｌ変異を導入した。具体的には、Ｔ１６９Ｌ変異をＣＡ０９－０９００菌株に導入するために、実施例５で作製したｐＤＺ：：ｄｄｈ（ｍｔ）４ベクターをエレクトロポレーションによりＣＡ０９－０９００に形質転換し、実施例４と同様に２次交差過程を経て、染色体上で塩基変異が変異型塩基に置換された菌株を得た。変異型塩基に置換（Ｔ１６９Ｌ）された菌株をＣＡ０９－０９０４と命名した。
菌株ＣＡ０９－０９０４は、２０１９年４月２５日付けでブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託番号ＫＣＣＭ１２５０３Ｐとして国際寄託した。
Figure 0007308296000011
その結果、変異を導入した菌株は、対照群であるＣＡ０９－０９００菌株に比べて、Ｌ－リシン生産量が１．０９ｇ／Ｌ減少し、Ｌ－トレオニン生産量が０．８５ｇ／Ｌ増加した（表１１）。よって、Ｄｄｈの活性が大幅に減少したので、Ｌ－リシン生産経路の弱化はＬ－トレオニン生産に肯定的であることが確認された。
ｄｄｈ遺伝子の１６９番目のアミノ酸であるアスパラギンが他のアミノ酸に置換された様々な菌株の作製
実施例６で作製したＣＡ０９－０９０４により、Ｌ－リシン生産を低減させた菌株はＬ－トレオニン生産に肯定的な影響を及ぼすことが確認された。アミノ酸配列１において１６９番目のアミノ酸の位置に、野生型が有するトレオニンを除く他のｐｒｏｔｅｏｇｅｎｉｃアミノ酸への置換を行い、トレオニン生産にさらに優れる変異があるか否かの確認を試みた。
実施例６で確認した変異であるＴ１６９Ｌを含む１９種の異種塩基置換変異を導入するために、各組換えベクターを次の方法で作製した。
まず、ＷＴ菌株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ｄｄｈ遺伝子の５０５～５０６番目の位置から前後にそれぞれ約６００ｂｐ離れた位置の５’断片及び３’断片に制限酵素ＸｂａＩ認識部位を挿入したプライマー配列番号２６及び２７を合成した。１９種の異種塩基置換変異を導入するために、ｄｄｈ遺伝子の５０５～５０６番目の塩基配列を置換するためのプライマー配列番号２８～６５を合成した（表１２）。
具体的には、ｐＤＺ－ｄｄｈ（Ｔ１６９Ａ）プラスミドは、ｄｄｈ遺伝子の５’及び３’末端に位置するＤＮＡ断片（それぞれ６００ｂｐ）がｐＤＺベクター（特許文献４）に連結された形態に作製した。ＷＴ菌株の染色体を鋳型とし、プライマー配列番号２６及び２８を用いたＰＣＲにより５’末端の遺伝子断片を作製した。ＰＣＲ条件は、９４℃で２分間の変性後、９４℃で１分間の変性、５６℃で１分間のアニーリング、７２℃で４０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で１０分間の重合反応を行うものとした。同様に、配列番号２７及び２９を用いたＰＣＲにより、ｄｄｈ遺伝子の３’末端に位置する遺伝子断片を作製した。増幅したＤＮＡ断片をＱｕｉａｇｅｎ社のＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔで精製し、ベクターの作製のための挿入ＤＮＡ断片として用いた。
一方、制限酵素ＸｂａＩで処理し、その後６５℃で２０分間熱処理したｐＤＺベクターと、前記ＰＣＲにより増幅した挿入ＤＮＡ断片をＩｎｆｕｓｉｏｎＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔで連結し、次いで大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。前記菌株をカナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含むＬＢ固体培地に塗抹した。プライマー配列番号２６及び２７を用いたＰＣＲにより、標的遺伝子が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選択し、その後周知のプラスミド抽出法によりプラスミドを得た。前記プラスミドをｐＤＺ－ｄｄｈ（Ｔ１６９Ａ）と命名した。
同様に、プライマー配列番号２６及び３０、２７及び３１を用いてｐＤＺ－ｄｄｈ（Ｔ１６９Ｖ）を作製し、プライマー配列番号２６及び３２、２７及び３３を用いてｐＤＺ－ｄｄｈ（Ｔ１６９Ｑ）を作製し、プライマー配列番号２６及び３４、２７及び３５を用いてｐＤＺ－ｄｄｈ（Ｔ１６９Ｈ）を作製し、プライマー配列番号２６及び３６、２７及び３７を用いてｐＤＺ－ｄｄｈ（Ｔ１６９Ｒ）を作製し、プライマー配列番号２６及び３８、２７及び３９を用いてｐＤＺ－ｄｄｈ（Ｔ１６９Ｐ）を作製し、プライマー配列番号２６及び４０、２７及び４１を用いてｐＤＺ－ｄｄｈ（Ｔ１６９Ｌ）を作製し、プライマー配列番号２６及び４２、２７及び４３を用いてｐＤＺ－ｄｄｈ（Ｔ１６９Ｙ）を作製し、プライマー配列番号２６及び４４、２７及び４５を用いてｐＤＺ－ｄｄｈ（Ｔ１６９Ｓ）を作製し、プライマー配列番号２６及び４６、２７及び４７を用いてｐＤＺ－ｄｄｈ（Ｔ１６９Ｋ）を作製し、プライマー配列番号２６及び４８、２７及び４９を用いてｐＤＺ－ｄｄｈ（Ｔ１６９Ｍ）を作製し、プライマー配列番号２６及び５０、２７及び５１を用いてｐＤＺ－ｄｄｈ（Ｔ１６９Ｉ）を作製し、プライマー配列番号２６及び５２、２７及び５３を用いてｐＤＺ－ｄｄｈ（Ｔ１６９Ｅ）を作製し、プライマー配列番号２６及び５４、２７及び５５を用いてｐＤＺ－ｄｄｈ（Ｔ１６９Ｄ）を作製し、プライマー配列番号２６及び５６、２７及び５７を用いてｐＤＺ－ｄｄｈ（Ｔ１６９Ｇ）を作製し、プライマー配列番号２６及び５８、２７及び５９を用いてｐＤＺ－ｄｄｈ（Ｔ１６９Ｗ）を作製し、プライマー配列番号２６及び６０、２７及び６１を用いてｐＤＺ－ｄｄｈ（Ｔ１６９Ｃ）を作製し、プライマー配列番号２６及び６２、２７及び６３を用いてｐＤＺ－ｄｄｈ（Ｔ１６９Ｆ）を作製し、プライマー配列番号２６及び６４、２７及び６５を用いてｐＤＺ－ｄｄｈ（Ｔ１６９Ｎ）を作製した。
Figure 0007308296000012
Figure 0007308296000013
Figure 0007308296000014
作製された各ベクターをＣＡ０９－０９０１に電気パルス法で形質転換した。このようにｄｄｈ遺伝子に異種塩基置換変異が導入された菌株１９種をＣＡ０９－０９００：：ｄｄｈ（Ｔ１６９Ａ）、ＣＡ０９－０９００：：ｄｄｈ（Ｔ１６９Ｖ）、ＣＡ０９－０９００：：ｄｄｈ（Ｔ１６９Ｑ）、ＣＡ０９－０９００：：ｄｄｈ（Ｔ１６９Ｈ）、ＣＡ０９－０９００：：ｄｄｈ（Ｔ１６９Ｒ）、ＣＡ０９－０９００：：ｄｄｈ（Ｔ１６９Ｐ）、ＣＡ０９－０９００：：ｄｄｈ（Ｔ１６９Ｌ）、ＣＡ０９－０９００：：ｄｄｈ（Ｔ１６９Ｙ）、ＣＡ０９－０９００：：ｄｄｈ（Ｔ１６９Ｓ）、ＣＡ０９－０９００：：ｄｄｈ（Ｔ１６９Ｋ）、ＣＡ０９－０９００：：ｄｄｈ（Ｔ１６９Ｍ）、ＣＡ０９－０９００：：ｄｄｈ（Ｔ１６９Ｉ）、ＣＡ０９－０９００：：ｄｄｈ（Ｔ１６９Ｅ）、ＣＡ０９－０９００：：ｄｄｈ（Ｔ１６９Ｄ）、ＣＡ０９－０９００：：ｄｄｈ（Ｔ１６９Ｇ）、ＣＡ０９－０９００：：ｄｄｈ（Ｔ１６９Ｗ）、ＣＡ０９－０９００：：ｄｄｈ（Ｔ１６９Ｃ）、ＣＡ０９－０９００：：ｄｄｈ（Ｔ１６９Ｆ）、ＣＡ０９－０９００：：ｄｄｈ（Ｔ１６９Ｎ）とそれぞれ命名した。
実施例２で用いた方法によりＣＡ０９－０９００菌株のｄｄｈ遺伝子を欠損させ、その菌株をＣＡ０９－０９００：：Δｄｄｈと命名した。ＣＡ０９－０９００、ＣＡ０９－０９００Δｄｄｈ菌株を対照群として用い、選択菌株１９種を次の方法で培養し、リシン、トレオニン濃度及び糖消費速度を測定した。
Figure 0007308296000015
Figure 0007308296000016
Figure 0007308296000017
ｄｄｈ遺伝子が欠損した菌株において、親株に比べてトレオニン濃度は約１．２４ｇ／Ｌ増加し、リシン濃度は１．３７Ｌ減少した。糖は４６．１％Ｐ減少したので、ｄｄｈ遺伝子が欠失してＤＤＨ活性がほとんどない場合、ＴＨＲは増加し、ＬＹＳは減少するが、菌株の生長が抑制されるため、産業上利用することは困難であろうと考えられる。配列番号１の１６９番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異型ポリペプチドを含む全ての菌株において、菌株の生長は産業上利用可能なレベルに維持され、ＬＹＳは減少し、ＴＨＲは増加した。すなわち、ｄｄｈを弱化させると、ＬＹＳが減少し、ＴＨＲが増加するようにサポートするので、ｄｄｈの１６９番目のアミノ酸の変化によりｄｄｈが弱化したことが確認された（表１３）。また、１６９番目のアミノ酸においてトレオニンをリシンに置換する変異がリシン減少幅及びトレオニン増加幅が大きく、かつ糖消費速度が商業上利用できるレベルであるので、最も有効であると判断した。
Ｌ－トレオニン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物菌株からの変異型ｄｄｈ及びｄａｐＢ導入菌株の作製及び評価
実施例６で作製したＣＡ０９－０９０４により、Ｌ－リシン生産を低減させた菌株はＬ－トレオニン生産に肯定的な影響を及ぼすことが確認された。前記菌株においてＬ－リシン経路をさらに弱化させることによりＬ－トレオニン生産能がさらに向上するか否かを確認するために、菌株を開発した。
具体的には、リシン生合成経路において第２の反応に関与する酵素である４－ｈｙｄｒｏｘｙ－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｄｉｐｉｃｏｌｉｎａｔｅｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ｄａｐＢ）の活性を弱化させるために、ｄａｐＢの１３番目のアミノ酸であるアルギニン（Arginine）をアスパラギン（Aspargine）に置換した（配列番号６６）。
より具体的には、ｄａｐＢ（Ｒ１３Ｎ）変異を導入した菌株を作製するために、ＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型とし、配列番号６７及び６８又は配列番号６９及び７０のプライマーを用いてＰＣＲをそれぞれ行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしては、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。ＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合反応を２８サイクル行うものとした。
その結果、ｄａｐＢ遺伝子の変異を中心に、５’末端上流の５１２ｂｐのＤＮＡ断片と、３’末端下流の５１４ｂｐのＤＮＡ断片がそれぞれ得られた。増幅された２つのＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号６７及び７０のプライマーでＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２分間の重合を２８サイクル行い、次いで７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。
その結果、１３番目のアルギニンがアスパラギンに置換されたヒドロキシ－テトラヒドロジピコリン酸リダクターゼ変異体をコードするｄａｐＢ遺伝子の変異を含む１００１ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。ＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔを用いて増幅産物を精製し、ベクター作製のための挿入ＤＮＡ断片として用いた。一方、制限酵素ｓｍａＩで処理し、その後６５℃で２０分間熱処理したｐＤＺベクターと、上記ＰＣＲにより増幅した挿入ＤＮＡ断片のモル濃度（Ｍ）の比が１：２になるように、タカラ（TaKaRa）のＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、提供されたマニュアルに従ってクローニングすることにより、Ｒ１３Ｎ変異を染色体上に導入するためのベクターｐＤＺ－Ｒ１３Ｎを作製した。
作製したベクターをエレクトロポレーションによりＣＡ０９－０９０４に形質転換し、２次交差過程を経て、染色体上で各塩基変異が変異型塩基に置換された菌株を得た。これをＣＡ０９－０９０４－Ｒ１３Ｎと命名した。
Figure 0007308296000018
その結果、変異を導入した菌株は、対照群であるＣＡ０９－０９００菌株に比べて、Ｌ－リシン生産量が１．６２ｇ／Ｌ減少し、Ｌ－トレオニン生産量が１．５１ｇ／Ｌ増加し、ＣＡ０９－０９０４菌株に比べて、Ｌ－リシン生産量が０．４８ｇ／Ｌ減少し、Ｌ－トレオニン生産量が０．６２ｇ／Ｌ増加した（表１４）。よって、Ｌ－リシン生産経路の弱化はＬ－トレオニン生産に肯定的であることが確認された。
Ｌ－トレオニン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物菌株からの変異型ｄｄｈ及びｌｙｓＡ導入菌株の作製及び評価
実施例６で作製したＣＡ０９－０９０４により、Ｌ－リシン生産を低減させた菌株はＬ－トレオニン生産に肯定的な影響を及ぼすことが確認された。前記菌株においてＬ－リシン経路をさらに弱化させることによりＬ－トレオニン生産がさらに増加するか否かを確認するために、菌株を開発した。
具体的には、リシン生合成経路において最後に関与する酵素であるｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｌａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（ｌｙｓＡ）の活性を弱化させるために、ｌｙｓＡの４０８番目のアミノ酸であるメチオニン（Methionine）をアラニン（Alanine）に置換した（非特許文献１８）（配列番号７１）。
より具体的には、ｌｙｓＡ（Ｍ４０８Ａ）変異を導入した菌株を作製するために、ＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型とし、配列番号７２及び７３又は配列番号７４及び７５のプライマーを用いてＰＣＲをそれぞれ行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしては、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。ＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合反応を２８サイクル行うものとした。
その結果、ｌｙｓＡ遺伝子の変異を中心に、５’末端上流の５３４ｂｐのＤＮＡ断片と、３’末端下流の５２７ｂｐのＤＮＡ断片がそれぞれ得られた。増幅された２つのＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号７２及び７５のプライマーでＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２分間の重合を２８サイクル行い、次いで７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。
Figure 0007308296000019
その結果、４０８番目のメチオニンがアラニンに置換されたジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ変異体をコードするｌｙｓＡ遺伝子の変異を含む１０３５ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。ＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔを用いて増幅産物を精製し、ベクター作製のための挿入ＤＮＡ断片として用いた。一方、制限酵素ｓｍａＩで処理し、その後６５℃で２０分間熱処理したｐＤＺベクターと、上記ＰＣＲにより増幅した挿入ＤＮＡ断片のモル濃度（Ｍ）の比が１：２になるように、タカラ（TaKaRa）のＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、提供されたマニュアルに従ってクローニングすることにより、Ｍ４０８Ａ変異を染色体上に導入するためのベクターｐＤＺ－Ｍ４０８Ａを作製した。
作製したベクターをエレクトロポレーションによりＣＡ０９－０９０４に形質転換し、２次交差過程を経て、染色体上で各塩基変異が変異型塩基に置換された菌株を得た。これをＣＡ０９－０９０４－Ｍ４０８Ａと命名した。
Figure 0007308296000020
その結果、変異を導入した菌株は、対照群であるＣＡ０９－０９００菌株に比べて、Ｌ－リシン生産量が１．４１ｇ／Ｌ減少し、Ｌ－トレオニン生産量が１．３３ｇ／Ｌ増加し、ＣＡ０９－０９０４菌株に比べて、Ｌ－リシン生産量が０．４２ｇ／Ｌ減少し、Ｌ－トレオニン生産量が０．３５ｇ／Ｌ増加した（表１６）。よって、Ｌ－リシン生産経路の弱化はＬ－トレオニン生産に肯定的であることが確認された。
Ｌ－トレオニン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物菌株からの変異型ｄｄｈ及びｄａｐＡ導入菌株の作製及び評価
実施例６で作製したＣＡ０９－０９０４により、Ｌ－リシン生産を低減させた菌株はＬ－トレオニン生産に肯定的な影響を及ぼすことが確認された。前記菌株においてＬ－リシン経路をさらに弱化させることによりＬ－トレオニン生産がさらに増加するか否かを確認するために、菌株を開発した。
具体的には、リシン生合成経路において第２の反応に関与する酵素である４－ｈｙｄｒｏｘｙ－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｄｉｐｉｃｏｌｉｎａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ（ｄａｐＡ）の活性を弱化させるために、ｄａｐＡの１１９番目のアミノ酸であるチロシン（Tyrosine）をフェニルアラニン（Phenylalanine）に置換した（非特許文献１９）（配列番号７６）。
より具体的には、ｄａｐＡ（Ｙ１１９Ｆ）変異を導入した菌株を作製するために、ＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型とし、配列番号７７及び７８又は配列番号７９及び８０のプライマーを用いてＰＣＲをそれぞれ行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしては、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。ＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合反応を２８サイクル行うものとした。
その結果、ｄａｐＡ遺伝子の変異を中心に、５’末端上流の５３８ｂｐのＤＮＡ断片と、３’末端下流の５２８ｂｐのＤＮＡ断片がそれぞれ得られた。増幅された２つのＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号７７及び８０のプライマーでＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２分間の重合を２８サイクル行い、次いで７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。
Figure 0007308296000021
その結果、１１９番目のチロシンがフェニルアラニンに置換されたヒドロキシ－テトラヒドロジピコリン酸シンターゼ変異体をコードするｄａｐＡ遺伝子の変異を含む１０００ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。ＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔを用いて増幅産物を精製し、ベクター作製のための挿入ＤＮＡ断片として用いた。一方、制限酵素ｓｍａＩで処理し、その後６５℃で２０分間熱処理したｐＤＺベクターと、上記ＰＣＲにより増幅した挿入ＤＮＡ断片のモル濃度（Ｍ）の比が１：２になるように、タカラ（TaKaRa）のＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、提供されたマニュアルに従ってクローニングすることにより、ｄａｐＡ（Ｙ１１９Ｆ）変異を染色体上に導入するためのベクターｐＤＺ－Ｙ１１９Ｆを作製した。
作製したベクターをエレクトロポレーションによりＣＡ０９－０９０４に形質転換し、２次交差過程を経て、染色体上で各塩基変異が変異型塩基に置換された菌株を得た。これをＣＡ０９－０９０４－Ｙ１１９Ｆと命名した。
Figure 0007308296000022
その結果、変異を導入した菌株は、対照群であるＣＡ０９－０９００菌株に比べて、Ｌ－リシン生産量が１．８６ｇ／Ｌ減少し、Ｌ－トレオニン生産量が１．８３ｇ／Ｌ増加し、ＣＡ０９－０９０４菌株に比べて、Ｌ－リシン生産量が０．７５ｇ／Ｌ減少し、Ｌ－トレオニン生産量が０．７９ｇ／Ｌ増加した（表１８）。よって、Ｌ－リシン生産経路の弱化はＬ－トレオニン生産に肯定的であることが確認された。
これらの結果は、本出願の配列番号１のアミノ酸配列において１６９番目のアミノ酸がロイシン、フェニルアラニン、グルタミン酸又はシステインに置換されたメソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ変異型ポリペプチドを含む菌株において、Ｌ－リシン生産量が減少し、Ｌ－トレオニン生産量が増加することにより、結果として非改変菌株よりＬ－トレオニン生産能が増加することを示唆するものである。
以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
Figure 0007308296000023

Claims (10)

  1. 変異型ポリペプチドであって、
    前記変異型ポリペプチドにおいて、配列番号１の１６９番目の位置に相当するアミノ酸がロイシン（leucine）、フェニルアラニン（phenylalanine）、グルタミン酸（glutamate）又はシステイン（cystein）に置換されており、前記変異型ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上かつ１００％未満の配列同一性を有し、かつメソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（meso-diaminopimelate dehydrogenase）活性を有するとともに、
    前記変異型ポリペプチドのメソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性は、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性より弱化している、変異型ポリペプチド。
  2. 請求項１に記載の変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  3. 前記ポリヌクレオチドは、配列番号４の塩基配列からなる、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
  4. コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）微生物であって、
    前記コリネバクテリウム属微生物は変異型ポリペプチド又はそれを含むポリヌクレオチドを含み、前記変異型ポリペプチドにおいて、配列番号１の１６９番目の位置に相当するアミノ酸がロイシン（leucine）、フェニルアラニン（phenylalanine）、グルタミン酸（glutamate）もしくはシステイン（cystein）に置換されており、前記変異型ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上かつ１００％未満の配列同一性を有し、かつメソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するとともに、
    前記変異型ポリペプチドのメソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性は、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性より弱化している、コリネバクテリウム属微生物。
  5. 前記コリネバクテリウム属微生物は、下記（１）～（３）の変異型ポリペプチドから選択される少なくとも１つをさらに含む、請求項４に記載のコリネバクテリウム属微生物;
    （１）ジヒドロジピコリン酸リダクターゼ（dihydrodipicolinate reductase; dapB）活性が弱化した変異型ポリペプチド
    （２）ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（diaminopimelate decarboxylase; lysA）活性が弱化した変異型ポリペプチド
    （３）ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（dihydrodipicolinate synthase; dapA）活性が弱化した変異型ポリペプチド。
  6. 前記変異型ポリペプチドは、（１）～（３）の変異型ポリペプチドから選択される少なくとも１つを含む、請求項５に記載のコリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）微生物;
    （１）配列番号８１のアミノ酸配列において１３番目のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）からアスパラギン（Ｎ）に置換されたジヒドロジピコリン酸リダクターゼ（dihydrodipicolinate reductase; dapB）変異型ポリペプチド
    （２）配列番号８２のアミノ酸配列において４０８番目のアミノ酸がメチオニン（Ｍ）からアラニン（Ａ）に置換されたジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（diaminopimelate decarboxylase; lysA）変異型ポリペプチド
    （３）配列番号８３のアミノ酸配列において１１９番目のアミノ酸がチロシン（Ｔ）からフェニルアラニン（Ｆ）に置換されたジヒドロジピコリン酸シンターゼ（dihydrodipicolinate synthase; dapA）変異型ポリペプチド。
  7. 前記微生物は、非改変菌株に比べてＬ－トレオニン（L-threonine）生産能が向上したものである、請求項４に記載のコリネバクテリウム属微生物。
  8. 前記微生物はコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である、請求項４に記載の微生物。
  9. Ｌ－トレオニン生産方法であって、前記Ｌ－トレオニン生産方法は変異型ポリペプチドを含むコリネバクテリウム属微生物を培地で培養するステップを含み、
    前記変異型ポリペプチドにおいて、配列番号１の１６９番目の位置に相当するアミノ酸がロイシン（leucine）、フェニルアラニン（phenylalanine）、グルタミン酸（glutamate）又はシステイン（cystein）に置換されており、前記変異型ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上かつ１００％未満の配列同一性を有し、かつメソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するとともに、
    前記変異型ポリペプチドのメソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性は、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型メソ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性より弱化している、Ｌ－トレオニン生産方法。
  10. 前記微生物を培養するステップで培養した培地及び微生物からＬ－トレオニンを回収するステップをさらに含む、請求項９に記載のＬ－トレオニン生産方法。
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