JP2024502989A - ａｒｏＧアルドラーゼ変異体及びそれを用いた分枝鎖アミノ酸生産方法 - Google Patents

Abstract

本出願は、ａｒｏＧアルドラーゼ（Phospho-2-dehydro-3-deoxyheptonate aldolase）変異体、それを含む微生物、及びそれを用いたアミノ酸生産方法に関する。

Description

本出願は、ａｒｏＧアルドラーゼ（Phospho-2-dehydro-3-deoxyheptonate aldolase）変異体及びそれを用いた分枝鎖アミノ酸生産方法に関する。

Ｌ－アミノ酸は、タンパク質の基本構成単位であり、薬品原料や食品添加剤、動物飼料、栄養剤、殺虫剤、殺菌剤などの重要素材として用いられる。よって、アミノ酸を産業的に生産することは、経済的に重要な産業工程となっている。

アミノ酸を効率的に生産するための様々な研究、例えばアミノ酸高効率生産微生物や発酵工程技術を開発するための努力がなされている。具体的には、コリネバクテリウム属菌株においてアミノ酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を増加させたり、アミノ酸生合成に不要な遺伝子を除去するような標的物質に特異的なアプローチが開発されており（特許文献１）、これらの方法以外に、アミノ酸生産に関与しない遺伝子を除去する方法、アミノ酸生産において具体的に機能が知られていない遺伝子を除去する方法も活用されている。

一方、アミノ酸のうち、分枝鎖アミノ酸（branched-chain amino acid）とは、バリン、ロイシン、イソロイシンの３種を示し、主に筋肉で代謝され、活動時にエネルギー源として用いられることが知られている。分枝鎖アミノ酸が活動時の筋肉維持及び増量に重要な役割を果たすことが知られるにつれ、その使用量が増加してきている。しかし、分枝鎖アミノ酸生合成経路において副産物が大量に生成されるので、分枝鎖アミノ酸を高収率、高純度で生産するためには、副産物の生成量を低減することが重要である。

米国特許第９１０９２４２号明細書 米国特許第７６６２９４３号明細書 米国特許第１０５８４３３８号明細書 米国特許第１０２７３４９１号明細書 韓国公開特許第１０－２０２０－０１３６８１３号公報 韓国登録特許第１０－２１４３９６４号公報 米国特許出願公開第２０２０／０３４００２２号明細書 米国特許第８４６５９６２号明細書 韓国登録特許第１０－００５７６８４号公報 韓国公開特許第１０－２０１８－００７７００８号公報

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本出願者らは、新たに見出したａｒｏＧアルドラーゼ変異体を導入した微生物が分枝鎖アミノ酸を高収率及び高純度で作製できることを確認し、本出願を完成するに至った。

本出願は、配列番号１のアミノ酸配列においてＮ末端から２１７番目、３１０番目、４０３番目及び４６２番目の位置に相当するアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたａｒｏＧアルドラーゼ（Phospho-2-dehydro-3-deoxyheptonate aldolase）変異体を提供することを目的とする。

また、本出願は、前記変異体をコードするポリヌクレオチド及びそれを含むベクターを提供することを目的とする。

さらに、本出願は、前記変異体、ポリヌクレオチド及びベクターの少なくとも１つを含むコリネバクテリウム属微生物を提供することを目的とする。

さらに、本出願は、前記微生物を培地で培養するステップを含む分枝鎖アミノ酸生産方法を提供することを目的とする。

本出願のａｒｏＧアルドラーゼ変異体を用いると、それを用いない場合に比べて、副産物生産量が低減し、高収率で分枝鎖アミノ酸を生産することができる。

以下、これらを具体的に説明する。なお、本出願で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本出願で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本出願に含まれる。また、以下の具体的な記述に本出願が限定されるものではない。

また、当該技術分野における通常の知識を有する者であれば、通常の実験のみを用いて本出願に記載された本出願の特定の態様の多くの等価物を認識し、確認することができるであろう。さらに、その等価物も本出願に含まれることが意図されている。

本出願の一態様は、配列番号１のアミノ酸配列においてＮ末端から２１７番目、３１０番目、４０３番目及び４６２番目の位置に相当するアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたａｒｏＧアルドラーゼ（Phospho-2-dehydro-3-deoxyheptonate aldolase）変異体を提供する。

前記ａｒｏＧアルドラーゼ変異体とは、ａｒｏＧアルドラーゼ活性を有するポリペプチド又はａｒｏＧアルドラーゼにおいて配列番号１のａｒｏＧアルドラーゼのＮ末端から２１７番目、３１０番目、４０３番目及び４６２番目の位置に相当するアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異体を意味する。

本出願における「ａｒｏＧアルドラーゼ」とは、次の反応を触媒する酵素を意味する。

本出願のａｒｏＧアルドラーゼは、本出願において提供するａｒｏＧアルドラーゼ変異体を作製するために改変されたａｒｏＧアルドラーゼ又はａｒｏＧアルドラーゼ活性を有するポリペプチドであってもよい。具体的には、自然に発生するポリペプチド又は野生型ポリペプチドであってもよく、その成熟ポリペプチドであってもよく、その変異体又は機能的フラグメントを含んでもよく、本出願のａｒｏＧアルドラーゼ変異体の母体（parent）となるものであれば、いかなるものでもよい。

本出願における前記ａｒｏＧアルドラーゼは、これに限定されるものではないが、配列番号１のポリペプチドである。一実施例において、配列番号１のポリペプチドと約６０％、７０％、７５％。８０％。８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドであってもよく、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同一又は相当する活性を有するものであれば、いかなるものでもａｒｏＧアルドラーゼに含まれる。

本出願のａｒｏＧアルドラーゼは、公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋからその配列が得られる。具体的には、ａｒｏＧ遺伝子によりコードされるポリペプチドであるが、これに限定されるものではない。

本出願における「変異体」とは、少なくとも１つのアミノ酸の保存的置換（conservative substitution）及び／又は改変（modification）により前記変異体の変異前のアミノ酸配列とは異なるが、機能（functions）又は特性（properties）が維持されるポリペプチドを意味する。このような変異体は、一般に前記ポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸を改変し、その改変したポリペプチドの特性を評価することにより同定（identify）することができる。すなわち、変異体の能力は、変異前のポリペプチドより向上するか、変わらないか又は低下する。また、一部の変異体には、Ｎ末端リーダー配列や膜貫通ドメイン（transmembrane domain）などの少なくとも１つの部分が除去された変異体も含まれる。他の変異体には、成熟タンパク質（mature protein）のＮ及び／又はＣ末端から一部分が除去された変異体も含まれる。前記「変異体」は、変異型、改変、変異型ポリペプチド、変異したタンパク質、変異など（英語表現では、modification、modified polypeptide、modified protein、mutant、mutein、divergentなど）と混用されるが、変異を意味する用語であればいかなるものでもよい。

また、変異体は、ポリペプチドの特性と二次構造に最小限の影響を及ぼすアミノ酸の欠失又は付加を含んでもよい。例えば、変異体のＮ末端には、翻訳と同時に（co-translationally）又は翻訳後に（post-translationally）タンパク質の移動（translocation）に関与するシグナル（又はリーダー）配列が結合されてもよい。また、前記変異体は、確認、精製又は合成できるように、他の配列又はリンカーに結合されてもよい。

本出願において提供する変異体は、配列番号１のアミノ酸配列においてＮ末端から２１７番目、３１０番目、４０３番目及び４６２番目の位置に相当するアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたａｒｏＧアルドラーゼ変異体であってもよい。例えば、上記位置の少なくとも２つ、少なくとも３つ又は４つのアミノ酸の全てが置換されたものである。しかし、これらに限定されるものではない。

配列番号１のアミノ酸配列においてＮ末端から２１７番目の位置に相当するアミノ酸はアルギニンであってもよく、３１０番目のアミノ酸に相当するアミノ酸はリシンであってもよく、４０３番目のアミノ酸に相当するアミノ酸はアルギニンであってもよく、かつ／又は４６２番目のアミノ酸に相当するアミノ酸はグルタミン酸であってもよい。

本出願において提供する変異体は、配列番号１のアミノ酸配列においてＮ末端から２１７番目の位置に相当するアミノ酸のアルギニン以外のアミノ酸への置換、３１０番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のリシン以外のアミノ酸への置換、４０３番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のアルギニン以外のアミノ酸への置換、及び４６２番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のグルタミン酸以外のアミノ酸への置換の少なくとも１つの置換を含むものであるが、これに限定されるものではない。

前記「他のアミノ酸」は、置換前のアミノ酸とは異なるアミノ酸であればいかなるものでもよい。なお、本出願における「特定アミノ酸が置換された」とは、他のアミノ酸に置換されたと表記していなくても、置換前のアミノ酸とは異なるアミノ酸に置換されたことを意味することは言うまでもない。

一実施例において、本出願の変異体は、参照（reference）タンパク質である配列番号１のアミノ酸配列において２１７番目、３１０番目、４０３番目及び４６２番目の位置に相当するアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸が疎水性（hydrophobic）アミノ酸又は脂肪族（Aliphatic）アミノ酸のうち、置換前のアミノ酸とは異なるアミノ酸に置換された変異体であってもよい。

具体的には、前記変異体は、配列番号１のアミノ酸配列において２１７番目、３１０番目、４０３番目及び４６２番目の位置に相当するアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸が疎水性（非極性）アミノ酸又は脂肪族アミノ酸のいずれかのアミノ酸に置換された変異体であってもよい。前記脂肪族アミノ酸は、例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンからなる群から選択されるアミノ酸であるが、これらに限定されるものではない。前記疎水性（非極性）アミノ酸は、例えばグリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸であるが、これらに限定されるものではない。

一実施例において、本出願の変異体は、配列番号１のアミノ酸配列において２１７番目、３１０番目、４０３番目及び４６２番目の位置に相当するアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸がサイズ（size）の小さいアミノ酸のうち、置換前のアミノ酸とは異なるアミノ酸に置換された変異体であるが、これらに限定されるものではない。

本出願における「サイズの小さいアミノ酸」とは、２０種のアミノ酸のうち、相対的にサイズの小さいアミノ酸であるグリシン、アラニン、セリン、トレオニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン及びアスパラギンが含まれるものであり、具体的にはグリシン、アラニン、セリン、トレオニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びプロリンを意味するが、これらに限定されるものではなく、より具体的にはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン及びトレオニンを意味するが、これらに限定されるものではない。

さらに具体的には、本出願の変異体における他のアミノ酸への置換は、アラニンへの置換であるが、これに限定されるものではない。

本出願における「相当する（corresponding to）」とは、ポリペプチドにおいて列挙される位置のアミノ酸残基であるか、又はポリペプチドにおいて列挙される残基に類似、同一もしくは相当するアミノ酸残基であることを意味する。相当する位置のアミノ酸を確認することは、特定配列を参照する配列の特定アミノ酸を決定することになる。本出願における「相当領域」とは、一般に関連タンパク質又は比較（reference）タンパク質における類似又は対応する位置を意味する。

例えば、任意のアミノ酸配列を配列番号１とアラインメント（align）すると、それに基づいて、前記アミノ酸配列の各アミノ酸残基は、配列番号１のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基の数、位置を参照してナンバリングすることができる。例えば、本出願における配列アラインメントアルゴリズムは、クエリー配列（「参照配列」ともいう）と比較すると、アミノ酸の位置、又は置換、挿入、欠失などの改変が生じる位置を確認することができる。

このようなアラインメントには、例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（非特許文献１）、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 非特許文献２）などを用いることができるが、これらに限定されるものではなく、当該技術分野で公知の配列アラインメントプログラム、ペアワイズ配列（pairwise sequence）比較アルゴリズムなどを適宜用いることができる。

一実施例において、本出願の変異体は、配列番号１のポリペプチドと約６０％、７０％、７５％。８０％。８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の配列同一性を有し、配列番号１の２１７番目、３１０番目、４０３番目及び４６２番目の位置に相当するアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたものであってもよい。

一実施例において、本出願の変異体は、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号２３又は配列番号２５で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％又は９９．９％以上の相同性又は同一性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。

具体的には、本出願の変異体は、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号２３又は配列番号２５で表されるアミノ酸配列を有する（having）ものであってもよく、前記アミノ酸配列を含む（comprising）ものであってもよく、前記アミノ酸配列からなる（consisting of）ものであってもよく、前記アミノ酸配列から必須に構成される（essentially consisting of）ものであってもよい。

一実施例において、本出願の変異体は、配列番号１のアミノ酸配列において２１７番目、３１０番目、４０３番目及び４６２番目の位置に相当するアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸がアラニンであり、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号２３又は配列番号２５で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％又は９９．９％以上の相同性又は同一性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。また、このような相同性又は同一性を有し、本出願の変異体に相当する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換、保存的置換又は付加されたアミノ酸配列を有する変異体も本出願に含まれることは言うまでもない。

例えば、アミノ酸配列のＮ末端、Ｃ末端及び／又は内部における本出願の変異体の機能を変更しない配列の付加もしくは欠失、自然に発生し得る突然変異、非表現突然変異（silent mutation）又は保存的置換を有するものが挙げられる。

前記「保存的置換（conservative substitution）」とは、あるアミノ酸が類似した構造的及び／又は化学的性質を有する他のアミノ酸に置換されることを意味する。このようなアミノ酸置換は、一般に残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性（amphipathic nature）における類似性に基づいて発生し得る。通常、保存的置換は、タンパク質又はポリペプチドの活性にほとんど又は全く影響を及ぼさない。

本出願における「相同性（homology）」又は「同一性（identity）」とは、２つの与えられたアミノ酸配列又は塩基配列が類似する程度を意味し、百分率で表すことができる。相同性及び同一性は、しばしば互換的に用いられる。

保存されている（conserved）ポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列相同性又は同一性は標準配列アルゴリズムにより決定され、用いられるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に用いられてもよい。実質的には、相同性を有するか（homologous）又は同じ（identical）配列は、中程度又は高いスト
リンジェントな条件（stringent conditions）下において、一般に配列全部又は一部分とハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーションには、ポリヌクレオチドにおいて一般のコドン又はコドン縮退を考慮したコドンを有するポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションも含まれることは言うまでもない。

任意の２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列が相同性、類似性又は同一性を有するか否かは、例えば非特許文献３のようなデフォルトパラメーターと「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの公知のコンピュータアルゴリズムを用いて決定することができる。あるいは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 非特許文献２）（バージョン５．０．０又はそれ以降のバージョン）で行われるように、ニードルマン＝ウンシュ（Needleman-Wunsch）アルゴリズム（非特許文献１）を用いて決定することができる（ＧＣＧプログラムパッケージ（非特許文献４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（非特許文献５、６及び７）を含む）。例えば、国立生物工学情報センターのＢＬＡＳＴ又はＣｌｕｓｔａｌ Ｗを用いて相同性、類似性又は同一性を決定することができる。

ポリヌクレオチド又はポリペプチドの相同性、類似性又は同一性は、例えば非特許文献８に開示されているように、非特許文献１などのＧＡＰコンピュータプログラムを用いて、配列情報を比較することにより決定することができる。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうち短いものにおける記号の総数で、類似する配列記号（すなわち、ヌクレオチド又はアミノ酸）の数を割った値と定義している。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメーターは、（１）二進法比較マトリックス（同一性は１、非同一性は０の値をとる）及び非特許文献９に開示されているように、非特許文献１０の加重比較マトリックス（又はＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）と、（２）各ギャップに３．０のペナルティ、及び各ギャップの各記号に追加の０．１０ペナルティ（又はギャップオープンペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）と、（３）末端ギャップに無ペナルティとを含む。

一実施例において、本出願の変異体は、ａｒｏＧアルドラーゼ活性を有するものである。一実施例において、本出願の変異体は、野生型又は非変異ａｒｏＧアルドラーゼに比べて、分枝鎖アミノ酸生産能を向上させる活性を有するものである。一実施例において、本出願の変異体は、野生型又は非変異ａｒｏＧアルドラーゼに比べて、分枝鎖アミノ酸生産経路の副産物生産レベルを低下させる活性を有するものである。一実施例において、本出願の変異体は、野生型又は非変異ａｒｏＧアルドラーゼに比べて、弱化された活性を有するものである。しかし、これらに限定されるものではない。

本出願の他の態様は、本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドを提供する。

本出願における「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド単量体（monomer）が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体（polymer）であって、所定の長さより長いＤＮＡ又はＲＮＡ鎖を意味し、より具体的には前記変異体をコードするポリヌクレオチド断片を意味する。

本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号２３又は配列番号２５で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものであってもよい。本出願の一例として、本出願のポリヌクレオチドは、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号２４又は配列番号２６の配列を有するものであってもよく、前記配列を含むものであってもよい。また、本出願のポリヌクレオチドは、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号２４又は配列番号２６の配列からなるものであってもよく、前記配列から必須に構成されるものであってもよい。

本出願のポリヌクレオチドは、コドンの縮退（degeneracy）により、又は本出願の変異体を発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮して、本出願の変異体のアミノ酸配列が変化しない範囲でコード領域に様々な改変を行うことができる。具体的には、本出願のポリヌクレオチドは、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号２４もしくは配列番号２６の配列と相同性もしくは同一性が７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、及び１００％未満である塩基配列を有するものであるか、前記塩基配列を含むものであるか、又は配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号２４もしくは配列番号２６の配列と相同性もしくは同一性が７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、及び１００％未満である塩基配列からなるものであるか、前記塩基配列から必須に構成されるものであるが、これらに限定されるものではない。

ここで、前記相同性もしくは同一性を有する配列において、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号２４もしくは配列番号２６の２１７番目、３１０番目、４０３番目及び４６２番目の位置に相当するアミノ酸をコードするコドンは、アラニンをコードするコドンの１つであってもよい。

また、本出願のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子配列から調製されるプローブ、例えば本出願のポリヌクレオチド配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列であればいかなるものでもよい。前記「ストリンジェントな条件（stringent condition）」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は、文献（非特許文献１１、１２参照）に具体的に記載されている。例えば、相同性もしくは同一性の高いポリヌクレオチド同士、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上の相同性もしくは同一性を有するポリヌクレオチド同士をハイブリダイズし、それより相同性もしくは同一性の低いポリヌクレオチド同士をハイブリダイズしない条件、又は通常のサザンハイブリダイゼーション（southern hybridization）の洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度において、１回、具体的には２回～３回洗浄する条件が挙げられる。

ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することが求められる。「相補的」とは、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を表すために用いられるものである。例えば、ＤＮＡにおいて、アデニンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。よって、本出願のポリヌクレオチドには、実質的に類似する核酸配列だけでなく、全配列に相補的な単離された核酸フラグメントが含まれてもよい。

具体的には、本出願のポリヌクレオチドと相同性又は同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーションステップが行われるハイブリダイゼーション条件と前述した条件を用いて検知することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃又は６５℃であってもよいが、これらに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節される。

前記ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切なストリンジェンシーはポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野で公知である（例えば、非特許文献１１）。

本出願のさらに他の態様は、本出願のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。前記ベクターは、前記ポリヌクレオチドを宿主細胞において発現させるための発現ベクターであるが、これに限定されるものではない。

本出願における「ベクター」とは、好適な宿主内で標的ポリペプチドを発現させることができるように、好適な発現調節領域（又は発現調節配列）に作動可能に連結された前記標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含むＤＮＡ産物を意味する。前記発現調節領域には、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれる。ベクターは、好適な宿主細胞に形質転換されると、宿主ゲノムに関係なく複製及び機能することができ、ゲノム自体に組み込まれる。

本出願に用いられるベクターは、特に限定されるものではなく、当該技術分野で公知の任意のベクターが用いられる。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしては、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしては、ｐＤＣ系、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、ｐＥＴ系などを用いることができる。具体的には、ｐＤＣ、ｐＤＣＭ２、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いることができる。

例えば、細胞内染色体導入用ベクターにより、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを染色体内に挿入することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば相同組換え（homologous recombination）により行うことができるが、これに限定されるものではない。前記染色体に導入されたか否かを確認するための選択マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。前記選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選択、すなわち標的核酸分子が挿入されたか否かを確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性、表面ポリペプチドの発現などの選択可能表現型を付与するマーカーが用いられる。選択剤（selective agent）で処理した環境においては、選択マーカーを発現する細胞のみ生存するか、異なる表現形質を示すので、形質転換された細胞を選択することができる。

本出願における「形質転換」とは、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞又は微生物内に導入することにより、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを発現させることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現するものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、いかなるものでもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、標的ポリペプチドをコードするＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含むものである。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現するものであれば、いかなる形態で導入されるものでもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自ら発現する上で必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されるものでもよい。通常、前記発現カセットは、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含む。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリ
ヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。

また、前記「作動可能に連結」されたものとは、本出願の標的変異体をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するプロモーター配列と前記ポリヌクレオチド配列が機能的に連結されたものを意味する。

本出願のさらに他の態様は、本出願の変異体、本出願のポリヌクレオチド、及び本出願のベクターの少なくとも１つを含むコリネバクテリウム属微生物を提供する。

本出願の微生物は、本出願の変異型ポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は本出願のポリヌクレオチドを含むベクターを含むものであってもよい。

本出願における「微生物」又は「菌株」とは、野生型微生物や自然に又は人為的に遺伝的改変が行われた微生物が全て含まれるものであり、外部遺伝子が挿入されるか、内在性遺伝子の活性が強化又は不活性化されるなどの原因により、特定機序が弱化又は強化された微生物であって、目的とするポリペプチド、タンパク質又は産物の生産のために遺伝的改変（modification）が行われた微生物である。

本出願の菌株は、本出願の変異体、本出願のポリヌクレオチド、及び本出願のポリヌクレオチドを含むベクターの少なくとも１つを含む菌株、本出願の変異体、もしくは本出願のポリヌクレオチドを発現するように改変された菌株、本出願の変異体、もしくは本出願のポリヌクレオチドを発現する菌株（例えば、組換え菌株）、又は本出願の変異体の活性を有する菌株（例えば、組換え菌株）であるが、これらに限定されるものではない。

本出願の菌株は、分枝鎖アミノ酸生産能を有する菌株であってもよい。

本出願の菌株は、自然にａｒｏＧアルドラーゼもしくは分枝鎖アミノ酸生産能を有する微生物、又はａｒｏＧアルドラーゼもしくは分枝鎖アミノ酸生産能のない親株に、本出願の変異体もしくはそれをコードするポリヌクレオチド（又は前記ポリヌクレオチドを含むベクター）が導入され、かつ／もしくは分枝鎖アミノ酸生産能が付与された微生物であるが、これらに限定されるものではない。

例えば、本出願の菌株は、本出願のポリヌクレオチド、又は本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換され、本出願の変異体を発現する細胞又は微生物であり、本出願の目的上、本出願の菌株は、本出願の変異体を含み、分枝鎖アミノ酸を生産する微生物であればいかなるものでもよい。例えば、本出願の菌株は、天然の野生型微生物又は分枝鎖アミノ酸を生産する微生物に本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドを導入することにより、ａｒｏＧアルドラーゼ変異体が発現し、分枝鎖アミノ酸生産能が向上した組換え菌株であってもよい。前記分枝鎖アミノ酸生産能が向上した組換え菌株は、天然の野生型微生物又はａｒｏＧアルドラーゼ非改変微生物（すなわち、野生型ａｒｏＧアルドラーゼを発現する微生物）に比べて分枝鎖アミノ酸生産能が向上した微生物であるが、これらに限定されるものではない。

一例として、前記分枝鎖アミノ酸生産能が向上したか否かを比較する対象菌株であるａｒｏＧアルドラーゼ非改変微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２菌株であってもよい。他の例として、前記分枝鎖アミノ酸生産能が向上したか否かを比較する対象菌株であるａｒｏＧアルドラーゼ非改変微生物は、ＣＪＬ－８１０９、ＫＣＣＭ１２７３９Ｐ（ＣＡ１０－３１０１）、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐであるが、これに限定されるものではない。

一例として、前記組換え菌株は、変異前の親株又は非改変微生物の分枝鎖アミノ酸生産能に比べて、約１％以上、具体的には約３％、約５％以上向上したものであるが、変異前の親株又は非改変微生物の生産能に比べて、＋値の増加量を示すものであれば、いかなるものでもよい。

他の例として、前記組換え菌株は、変異前の親株又は非改変微生物に比べて、分枝鎖アミノ酸生産経路において生成される副産物の生産量が約５０％以下、具体的には約３０％以下、約１０％以下に低下したものであるか、又は副産物が生産されないものであるが、これらに限定されるものではない。

前記「約（about）」とは、±０．５、±０．４、±０．３、±０．２、±０．１などが全て含まれる範囲であり、約という用語の後に続く数値と同等又は同程度の範囲の数値であればいかなるものでもよいが、これらに限定されるものではない。

本出願における「分枝鎖アミノ酸」とは、側鎖に分岐アルキル基を有するアミノ酸を意味し、バリン、ロイシン及びイソロイシンが含まれるものである。具体的には、本出願における前記分枝鎖アミノ酸は、Ｌ－分枝鎖アミノ酸であり、前記Ｌ－分枝鎖アミノ酸は、Ｌ－バリン、Ｌ－ロイシン及びＬ－イソロイシンから選択される少なくとも１つであるが、これらに限定されるものではない。

本出願における分枝鎖アミノ酸生産経路において生成される副産物とは、分枝鎖アミノ酸以外の物質を意味し、具体的には芳香族（aromatic）アミノ酸、より具体的にはＬ－チロシン及びＬ－フェニルアラニンから選択される少なくとも１つである。しかし、これらに限定されるものではない。

本出願における「非改変微生物」とは、微生物に自然に発生し得る突然変異を含む菌株を除外するものではなく、野生型菌株もしくは天然菌株自体、又は自然要因もしくは人為的要因により遺伝的に変異して形質が変化する前の菌株を意味する。例えば、前記非改変微生物とは、本出願のａｒｏＧアルドラーゼ変異体が導入されていないか、導入される前の菌株を意味する。前記「非改変微生物」は、「改変前の菌株」、「改変前の微生物」、「非変異菌株」、「非改変菌株」、「非変異微生物」又は「基準微生物」と混用される。

一実施例において、本出願の微生物は、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）、コリネバクテリウム・クルジラクチス（Corynebacterium crudilactis）、コリネバクテリウム・デセルティ（Corynebacterium deserti）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・シングラレ（Corynebacterium singulare）、コリネバクテリウム・ハロトレランス（Corynebacterium halotolerans）、コリネバクテリウム・ストリアツム（Corynebacterium striatum）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム・ポルティソリ（Corynebacterium pollutisoli）、コリネバクテリウム・イミタンス（Corynebacterium imitans）、コリネバクテリウムテス・テスツディノリス（Corynebacterium testudinoris）又はコリネバクテリウム・フラベッセンス（Corynebacterium flavescens）であってもよい。

本出願の微生物は、分枝鎖アミノ酸生産能を向上させる変異をさらに含むものであってもよい。

一実施例において、本出願の微生物は、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、トレオニンデヒドラターゼ、分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、クエン酸シンターゼの少なくとも１つの活性変化を含むものであってもよい。

一実施例において、本出願の微生物は、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（isopropylmalate synthase）、分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（branched amino acid aminotransferase）、ホモセリンデヒドロゲナーゼ（homoserine dehydrogenase）及びトレオニンデヒドラターゼ（threonine dehydratase）の少なくとも１つの活性がさらに強化された微生物であってもよい。

一実施例において、本出願の微生物は、クエン酸シンターゼ（citrate synthase）の活性がさらに弱化された微生物であってもよい。

しかし、上記内容に限定されるものではなく、生産しようとする分枝鎖アミノ酸に応じて、当業者であれば、微生物が含むさらなる改変を適宜選択することができる。

本出願におけるポリペプチド活性の「強化」とは、ポリペプチドの活性を内在性活性に比べて向上させることを意味する。前記強化は、活性化（activation）、上方調節（up-regulation）、過剰発現（overexpression）、向上（increase）などと混用される。ここで、活性化、強化、上方調節、過剰発現、向上には、本来なかった活性を示すようになることや、内在性活性又は改変前の活性に比べて活性が向上することが全て含まれる。前記「内在性活性」とは、自然要因又は人為的要因により遺伝的に変異して形質が変化する場合に、形質変化の前の親株又は非改変微生物が本来有していた特定ポリペプチドの活性を意味する。これは、「改変前の活性」と混用される。ポリペプチドの活性が内在性活性に比べて「強化」、「上方調節」、「過剰発現」又は「向上」するとは、形質変化の前の親株又は非改変微生物が本来有していた特定ポリペプチドの活性及び／又は濃度（発現量）に比べて向上することを意味する。

前記強化は、外来ポリペプチドの導入により達成してもよく、内在性ポリペプチドの活性強化及び／又は濃度（発現量）増加により達成してもよい。前記ポリペプチドの活性が強化されたか否かは、当該ポリペプチドの活性の程度、発現量、又は当該ポリペプチドから生産される産物の量の増加により確認することができる。

前記ポリペプチドの活性の強化には、当該分野で周知の様々な方法を適用することができ、標的ポリペプチドの活性を改変前の微生物より強化できるものであればいかなるものでもよい。具体的には、分子生物学における通常の方法であり、当該技術分野における通常の知識を有する者に周知の遺伝子工学及び／又はタンパク質工学を用いたものであるが、これらに限定されるものではない（例えば、非特許文献１３、１４など）。

具体的には、本出願のポリペプチドの強化は、１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数を増加させること、２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子の発現調節領域を活性が強力な配列に置換すること、３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写産物の開始コドン又は５’ＵＴＲ領域をコードする塩基配列を改変すること、４）ポリペプチドの活性が強化されるように前記ポリペプチドのアミノ酸配列を改変すること、５）ポリペプチドの活性が強化されるように前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を改変すること（例えば、ポリペプチドの活性が強化されるように改変されたポリペプチドをコードするように前記ポリペプチド遺伝子のポリヌクレオチド配列を改変すること）、６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリペプチドもしくはそれをコードする外来ポリヌクレオチドを導入すること、７）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドンを最適化すること、８）ポリペプチドの三次構造を分析し、露出部分を選択して改変すること、もしくは化学的に修飾すること、又は９）前記１）～８）から選択される２つ以上の組み合わせにより行われるが、特にこれらに限定されるものではない。

より具体的には、前記１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数を増加させることは、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主に関係なく複製されて機能するベクターを宿主細胞内に導入することにより行われる。あるいは、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞内の染色体に１コピー又は２コピー以上導入することにより行われてもよい。前記染色体への導入は、宿主細胞内の染色体に前記ポリヌクレオチドを挿入することのできるベクターを宿主細胞内に導入することにより行われるが、これに限定されるもの
ではない。前記ベクターについては前述した通りである。

前記２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子の発現調節領域（又は発現調節配列）を活性が強力な配列に置換することは、例えば前記発現調節領域の活性がさらに強化されるように、欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を発生させるか、より高い活性を有する配列に置換することにより行われる。前記発現調節領域には、特にこれらに限定されるものではないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び翻訳の終結を調節する配列などが含まれる。例えば、本来のプロモーターを強力なプロモーターに置換することにより行われるが、これに限定されるものではない。

公知の強力なプロモーターの例としては、ｃｊ１～ｃｊ７プロモーター（特許文献２）、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ＳＰＬ７プロモーター、ＳＰＬ１３（ｓｍ３）プロモーター（特許文献３）、Ｏ２プロモーター（特許文献４）、ｔｋｔプロモーター、ｙｃｃＡプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

前記３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写産物の開始コドン又は５’ＵＴＲ領域をコードする塩基配列を改変することは、例えば内在性開始コドンに比べてポリペプチドの発現率が高い他の開始コドンをコードする塩基配列に置換することにより行われるが、これに限定されるものではない。

前記４）及び５）のアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列を改変することは、ポリペプチドの活性が強化されるように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列又は前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を発生させるか、より高い活性を有するように改良されたアミノ酸配列もしくはポリヌクレオチド配列、又は活性が向上するように改良されたアミノ酸配列もしくはポリヌクレオチド配列に置換することにより行われるが、これらに限定されるものではない。具体的には、前記置換は、相同組換えによりポリヌクレオチドを染色体に挿入することにより行われるが、これに限定されるものではない。ここで、用いられるベクターは、染色体に挿入されたか否かを確認するための選択マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。前記選択マーカーについては前述した通りである。

前記６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリヌクレオチドを導入することは、前記ポリペプチドと同一／類似の活性を示すポリペプチドをコードする外来ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入することにより行われる。前記外来ポリヌクレオチドは、前記ポリペプチドと同一／類似の活性を示すものであれば、その由来や配列はいかなるものでもよい。前記導入は、公知の形質転換方法を当業者が適宜選択して行うことができ、宿主細胞内で前述したように導入したポリヌクレオチドが発現することにより、ポリペプチドが生成されてその活性が向上する。

前記７）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドンを最適化することは、宿主細胞内で転写又は翻訳が増加するように、内在ポリヌクレオチドのコドンを最適化するか、宿主細胞内で最適化された転写、翻訳が行われるように、外来ポリヌクレオチドのコドンを最適化することにより行われる。

前記８）ポリペプチドの三次構造を分析し、露出部分を選択して改変すること、もしくは化学的に修飾することは、例えば分析しようとするポリペプチドの配列情報を既知のタンパク質の配列情報が保存されているデータベースと比較し、配列の類似性の程度に応じて鋳型タンパク質の候補を決定し、それを基に構造を確認し、改変又は化学的に修飾する露出部分を選択して改変又は修飾することにより行われる。

このようなポリペプチド活性の強化は、対応するポリペプチドの活性又は濃度、発現量を野生型や改変前の微生物菌株で発現するポリペプチドの活性又は濃度に比べて向上させるか、当該ポリペプチドから生産される産物の量を増加させることにより行われるが、これらに限定されるものではない。

本出願の微生物において、ポリヌクレオチドの一部又は全部の改変は、（ａ）微生物中の染色体導入用ベクターを用いた相同組換え、もしくは遺伝子はさみ（engineered nuclease, e.g., CRISPR-Cas9）を用いたゲノム編集、並びに／又は（ｂ）紫外線や放射線などの光及び／もしくは化学物質処理により誘導することができるが、これらに限定されるものではない。前記遺伝子の一部又は全部の改変方法には、ＤＮＡ組換え技術による方法が含まれる。例えば、標的遺伝子と相同性のあるヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチド配列又はベクターを前記微生物に導入して相同組換え（homologous recombination）を起こすことにより遺伝子の一部又は全部の欠失が行われる。この導入されるヌクレオチド配列又はベクターには、優性選択マーカーが含まれてもよいが、これに限定されるものではない。

本出願におけるポリペプチド活性の「弱化」とは、内在性活性に比べて活性が低下することや、活性がなくなることが全て含まれる概念である。前記弱化は、不活性化（inactivation）、欠乏（deficiency）、下方調節（down-regulation）、減少（decrease）、低下（reduce）、減衰（attenuation）などと混用される。

前記弱化には、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの変異などによりポリペプチド自体の活性が本来微生物が有するポリペプチドの活性に比べて減少又は除去される場合が含まれ、それをコードするポリヌクレオチドの遺伝子の発現阻害やポリペプチドへの翻訳（translation）阻害などにより細胞内での全体的なポリペプチド活性の程度及び／又は濃度（発現量）が天然菌株に比べて低下する場合が含まれ、前記ポリヌクレオチドの発現が全くない場合が含まれ、かつ／又はポリヌクレオチドが発現したとしてもポリペプチドの活性がない場合が含まれる。前記「内在性活性」とは、自然要因又は人為的要因により遺伝的に変異して形質が変化する場合に、形質変化の前の親株、野生型又は非改変微生物が本来有していた特定ポリペプチドの活性を意味する。これは、「改変前の活性」と混用される。ポリペプチドの活性が内在性活性に比べて「不活性化、欠乏、減少、下方調節、低下、減衰」するとは、形質変化の前の親株又は非改変微生物が本来有していた特定ポリペプチドの活性に比べて低下することを意味する。

このようなポリペプチドの活性の弱化は、これらに限定されるものではなく、当該分野で周知の様々な方法を適用することにより達成することができる（例えば、非特許文献１４、１５など）。

具体的には、本出願のポリペプチドの弱化は、１）ポリペプチドをコードする遺伝子の全部又は一部を欠失させること、２）ポリペプチドをコードする遺伝子の発現が減少するように発現調節領域（又は発現調節配列）を改変すること、３）ポリペプチドの活性が欠失又は弱化されるように前記ポリペプチドを構成するアミノ酸配列を改変すること（例えば、アミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸を欠失／置換／付加すること）、４）ポリペプチドの活性が欠失又は弱化されるように前記ポリペプチドをコードする遺伝子配列を改変すること（例えば、ポリペプチドの活性が欠失又は弱化されるように改変されたポリペプチドをコードするように前記ポリペプチド遺伝子の核酸塩基配列の１つ以上の核酸塩基を欠失／置換／付加すること）、５）ポリペプチドをコードする遺伝子転写産物の開始コドン又は５’ＵＴＲ領域をコードする塩基配列を改変すること、６）ポリペプチドをコードする前記遺伝子転写産物に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）を導入すること、７）リボソーム（ribosome）の付着を不可能にする２次構造物が形成されるようにポリペプチドをコードする遺伝子のシャイン・ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列の前にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列を付加すること、８）ポリペプチドをコードする遺伝子配列のＯＲＦ（open reading frame）の３’末端に逆転写するようにプロモーターを付加すること（Reverse transcription engineering, RTE）、又は９）前記１）～８）から選択される２つ以上の組み合わせにより行われるが、特にこれらに限定されるものではない。

例えば、前記１）ポリペプチドをコードする前記遺伝子の一部又は全部を欠失させることは、染色体内の内在性標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド全体を欠失させること、一部のヌクレオチドが欠失したポリヌクレオチド又はマーカー遺伝子に置換することにより行われてもよい。

また、前記２）発現調節領域（又は発現調節配列）を改変することは、欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより発現調節領域（又は発現調節配列）上の変異を発生させるか、より低い活性を有する配列に置換することにより行われてもよい。前記発現調節領域には、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。

また、前記５）ポリペプチドをコードする遺伝子転写産物の開始コドン又は５’ＵＴＲ領域をコードする塩基配列を改変することは、例えば内在性開始コドンに比べてポリペプチドの発現率が低い他の開始コドンをコードする塩基配列に置換することにより行われるが、これに限定されるものではない。

さらに、前記３）及び４）のアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列を改変することは、ポリペプチドの活性が弱化されるように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列又は前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を発生させるか、より低い活性を有するように改良されたアミノ酸配列もしくはポリヌクレオチド配列、又は活性がなくなるように改良されたアミノ酸配列もしくはポリヌクレオチド配列に置換することにより行われるが、これらに限定されるものではない。例えば、ポリヌクレオチド配列に変異を導入して終止コドンを形成することにより、遺伝子の発現を阻害又は弱化させることができるが、これらに限定されるものではない。

前記６）ポリペプチドをコードする前記遺伝子転写産物に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）を導入することは、例えば、非特許文献１６のように行われてもよい。

前記７）リボソーム（ribosome）の付着を不可能にする２次構造物が形成されるようにポリペプチドをコードする遺伝子のシャイン・ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列の前にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列を付加することは、ｍＲＮＡ翻訳を不可能にするか、速度を低下させることにより行われてもよい。

前記８）ポリペプチドをコードする遺伝子配列のＯＲＦ（open reading frame）の３’末端に逆転写するようにプロモーターを付加すること（Reverse transcription engineering, RTE）は、前記ポリペプチドをコードする遺伝子転写産物に相補的なアンチセンスヌクレオチドを作成して活性を弱化させることにより行われてもよい。

本出願の微生物における変異体、ポリヌクレオチド、ベクター及び分枝鎖アミノ酸については前述した通りである。

本出願のさらに他の態様は、本出願のコリネバクテリウム属微生物を培地で培養するステップを含む分枝鎖アミノ酸生産方法を提供する。

本出願における「培養」とは、本出願のコリネバクテリウム属微生物を適宜調節した環境条件で生育させることを意味する。本出願の培養過程は、当該技術分野で公
知の好適な培地と培養条件で行うことができる。このような培養過程は、当業者であれば選択される菌株に応じて容易に調整して用いることができる。具体的には、前記培養は、回分、連続及び／又は流加培養であるが、これらに限定されるものではない。

本出願における「培地」とは、本出願のコリネバクテリウム属微生物を培養するために必要な栄養物質を主成分として混合した物質を意味し、生存及び発育に不可欠な水をはじめとする栄養物質や発育因子などを供給する。具体的には、本出願のコリネバクテリウム属微生物の培養に用いられる培地及び他の培養条件は、通常の微生物の培養に用いられる培地であればいかなるものでもよく、好適な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び／又はビタミンなどを含有する通常の培地中で好気性条件下にて温度、ｐＨなどを調節して本出願のコリネバクテリウム属微生物を培養することができる。

具体的には、コリネバクテリウム属微生物に対する培養培地は、非特許文献１７に開示されている。

本出願における前記炭素源としては、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、スクロース、マルトースなどの炭水化物、マンニトール、ソルビトールなどの糖アルコール、ピルビン酸、乳酸、クエン酸などの有機酸、グルタミン酸、メチオニン、リシンなどのアミノ酸などが挙げられる。また、デンプン加水分解物、糖蜜、ブラックストラップ糖蜜、米糠、キャッサバ、バガス、トウモロコシ浸漬液などの天然の有機栄養源を用いることができ、具体的には、グルコースや殺菌した前処理糖蜜（すなわち、還元糖に変換した糖蜜）などの炭水化物を用いることができ、その他適量の炭素源であればいかなるものでも用いることができる。これらの炭素源は、単独で用いることもでき、２種以上を組み合わせて用いることもできるが、これらに限定されるものではない。

前記窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源と、グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのアミノ酸、ペプトン、ＮＺ－アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類又はその分解生成物、脱脂大豆ケーキ又はその分解生成物などの有機窒素源とを用いることができる。これらの窒素源は、単独で用いることもでき、２種以上を組み合わせて用いることもできるが、これらに限定されるものではない。

前記リン源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム又はそれらに相当するナトリウム含有塩などが挙げられる。無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどを用いることができ、それ以外に、アミノ酸、ビタミン及び／又は好適な前駆体などを用いることができる。これらの構成成分又は前駆体は、培地に回分式又は連続式で添加することができる。しかし、これらに限定されるものではない。

また、本出願のコリネバクテリウム属微生物の培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などの化合物を培地に好適な方法で添加し、培地のｐＨを調整してもよい。さらに、培養中に脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡生成を抑制してもよい。さらに、培地の好気状態を維持するために、培地中に酸素又は酸素含有気体を注入してもよく、嫌気及び微好気状態を維持するために、気体を注入しなくてもよく、窒素、水素又は二酸化炭素ガスを注入してもよいが、これらに限定されるものではない。

本出願の培養において、培養温度は２０～４５℃、具体的には２５～４０℃に維持し、約１０～１６０時間培養するが、これらに限定されるものではない。

本出願の培養により生産された分枝鎖アミノ酸は、培地中に分泌されるか、細胞内に残留する。

本出願の分枝鎖アミノ酸生産方法は、本出願のコリネバクテリウム属微生物を準備するステップ、前記菌株を培養するための培地を準備するステップ、又はそれらの組み合わせ（任意の順序，in any order）を、例えば前記培養するステップの前にさらに含んでもよい。

本出願の分枝鎖アミノ酸生産方法は、前記培養に用いた培地（培養が行われた培地）又は本出願のコリネバクテリウム属微生物から分枝鎖アミノ酸を回収するステップをさらに含んでもよい。前記回収するステップは、前記培養するステップの後にさらに含んでもよい。

前記回収は、本出願の微生物の培養方法、例えば回分、連続、流加培養方法などに応じて、当該技術分野で公知の好適な方法を用いて目的とする分枝鎖アミノ酸を回収（collect）するものであってもよい。例えば、遠心分離、濾過、結晶化、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、抽出、超音波破砕、限外濾過、透析法、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ又はそれらの組み合わせが用いられ、当該分野で公知の好適な方法を用いて培地又は微生物から目的とする分枝鎖アミノ酸を回収することができる。

また、本出願の分枝鎖アミノ酸生産方法は、精製ステップをさらに含んでもよい。前記精製は、当該技術分野で公知の好適な方法により行うことができる。例えば、本出願の分枝鎖アミノ酸生産方法が回収ステップと精製ステップの両方を含む場合、前記回収ステップと前記精製ステップは、順序に関係なく異時的（又は連続的）に行ってもよく、同時に又は１つのステップとして統合して行ってもよいが、これらに限定されるものではない。

本出願の方法における変異体、ポリヌクレオチド、ベクター、微生物などについては前述した通りである。

本出願のさらに他の態様は、本出願の変異体、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、もしくは本出願のポリヌクレオチドを含むコリネバクテリウム属微生物を含むか、それを培養した培地を含むか、又はそれらの２つ以上の組み合わせを含む分枝鎖アミノ酸生産用組成物を提供する。

本出願の組成物は、分枝鎖アミノ酸生産用組成物に通常用いられる任意の好適な賦形剤をさらに含んでもよい。このような賦形剤としては、例えば保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本出願の組成物における変異体、ポリヌクレオチド、ベクター、菌株、培地、分枝鎖アミノ酸などについては前述した通りである。

本出願のさらに他の態様は、本出願のａｒｏＧアルドラーゼ変異体の分枝鎖アミノ酸生産用途を提供する。

本出願のさらに他の態様は、本出願のａｒｏＧアルドラーゼ変異体、前記ａｒｏＧアルドラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターの少なくとも１つを含む微生物の分枝鎖アミノ酸生産用途を提供する。

本出願の用途における変異体、ポリヌクレオチド、ベクター、微生物などについては前述した通りである。

以下、実施例を挙げて本出願をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本出願を例示するものにすぎず、本出願がこれらの実施例に限定されるものではない。これは、本出願の属する技術分野における通常の知識を有する者にとって自明であろう。

ａｒｏＧアルドラーゼ変異の発見 実施例１－１．ａｒｏＧアルドラーゼを含むベクターの作製 Ｐｈｏｓｐｈｏ－２－ｄｅｈｙｄｒｏ－３－ｄｅｏｘｙｈｅｐｔｏｎａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅの活性を有するａｒｏＧアルドラーゼ変異ライブラリーを作製するために、まずａｒｏＧアルドラーゼを含む組換えベクターを作製した。野生型コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）由来のａｒｏＧアルドラーゼ（配列番号１，KEGG ID: NCgl2098）をコードするａｒｏＧ遺伝子（配列番号２）を増幅するために、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２野生株の染色体を鋳型とし、配列番号１１及び１２のプライマーを用いて、９４℃で１分間の変性、５８℃で３０秒間の結合、７２℃で１分間のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼによる重合を２５サイクル行うことによりＰＣＲを行った。用いたプライマーの具体的な配列を表１に示す。上記増幅産物をＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Invitrogen）により大腸菌ベクターｐＣＲ２．１にクローニングして「ｐＣＲ－ａｒｏＧ」を得た。

実施例１－２．ａｒｏＧアルドラーゼ変異ライブラリーの作製 実施例１－１で作製したベクターに基づいて、ｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ ｋｉｔ（clontech Diversify（登録商標） PCR Random Mutagenesis Kit）を用いてａｒｏＧアルドラーゼ変異ライブラリーを作製した。１０００ｂｐ当たり０～３つの変異が起こる条件で、配列番号１１及び配列番号１２をプライマーとしてＰＣＲ反応を行った。具体的には、９４℃で３０秒間のプレヒーティング（pre-heating）後、９４℃で３０秒間、６８℃で１分３０秒間の過程を２５サイクル（cycle）行うことによりＰＣＲ反応を行った。ここで、得られたＰＣＲ産物をｍｅｇａｐｒｉｍｅｒ（５０～１２５ｎｇ）として、９５℃で５０秒間、６０℃で５０秒間、６８℃で１２分間の過程を２５サイクル行い、その後ＤｐｎＩで処理し、大腸菌ＤＨ５αに熱ショック法により形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢ固体培地に塗抹した。形質転換したコロニー２０種を選択してプラスミドを得て、塩基配列を分析したところ、２ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ／ｋｂの頻度で異なる位置に変異が導入されたことが確認された。約２０，０００個の形質転換した大腸菌コロニーを採取してプラスミドを抽出した。これを「ｐＴＯＰＯ－ａｒｏＧ－ｌｉｂｒａｒｙ」と命名した。

作製したライブラリーの評価及び変異体の選択 実施例２－１．Ｌ－ロイシン生産量が増加した変異菌株の選択 実施例１－２で作製したｐＴＯＰＯ－ａｒｏＧ－ｌｉｂｒａｒｙを野生型コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２にエレクトロポレーションにより形質転換し、その後カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有する栄養培地（表２）に塗抹して変異遺伝子が挿入された菌株１０，０００個のコロニーを選択した。選択した各コロニーをＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ａｒｏＧ（ｍｔ）１～ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ａｒｏＧ（ｍｔ）１０，０００と命名した。

確保した１０，０００個のコロニーのうち、Ｌ－ロイシン生産が増加し、芳香族アミノ酸であるＬ－チロシン及びＬ－フェニルアラニンが減少したコロニーを確認するために、各コロニーに対して次の方法で発酵力価評価を行った。

加圧殺菌した生産培地（表２）２５ｍｌと２５ｕｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各コロニーを白金耳で接種し、その後３０℃、２００ｒｐｍで６０時間振盪培養した。培養終了後に、高速液体クロマトグラフィー（HPLC, SHIMAZDU LC20A）を用いた方法により、Ｌ－ロイシン並びに芳香剤アミノ酸であるＬ－チロシン及びＬ－フェニルアラニンを測定した。

確保した１０，０００個のコロニーのうち、野生型コリネバクテリウム・グルタミカム菌株（ＡＴＣＣ１３０３２）に比べてＬ－ロイシン生産能が最も向上した菌株４種（ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ａｒｏＧ（ｍｔ）２２５６，ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ａｒｏＧ（ｍｔ）６５３１，ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ａｒｏＧ
（ｍｔ）８３１６，ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ａｒｏＧ（ｍｔ）９４２６）を選択した。選択した菌株から生産されたＬ－ロイシン（Ｌｅｕ）、Ｌ－チロシン（Ｔｙｒ）、Ｌ－フェニルアラニン（Ｐｈｅ）の濃度を表３に示す。

表３に示すように、ａｒｏＧ遺伝子に変異のあるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ａｒｏＧ（ｍｔ）２２５６は、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に比べて、Ｌ－ロイシン生産能が約１．４倍に向上することが確認された。ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ａｒｏＧ（ｍｔ）６５３１、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ａｒｏＧ（ｍｔ）８３１６、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ａｒｏＧ（ｍｔ）９４２６は、親株に比べて、Ｌ－ロイシン生産量がそれぞれ約１．４倍に向上することが確認された。ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ａｒｏＧ（ｍｔ）２２５６、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ａｒｏＧ（ｍｔ）６５３１、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ａｒｏＧ（ｍｔ）８３１６、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ａｒｏＧ（ｍｔ）９４２６の４種は、全てＬ－チロシンが２．４～８．５分の１、Ｌ－フェニルアラニンが３～１０分の１に減少することが確認された。

実施例２－２．Ｌ－ロイシン生産量が増加し、芳香剤アミノ酸生産量が減少した変異菌株の変異の確認 選択した変異菌株４種のａｒｏＧ遺伝子変異を確認するために、表１に示す配列番号１１と配列番号１２のプライマーを用いて、各変異菌株のＤＮＡを鋳型とし、９４℃で５分間の変性後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分３０秒間を３０サイクル行い、次いで７２℃で５分間の条件でＰＣＲを行い、ＤＮＡシーケンシングを行った。

シーケンシングの結果、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ａｒｏＧ（ｍｔ）２２５６菌株は、ａｒｏＧ遺伝子の６４９番目、６５０番目、６５１番目のヌクレオチドであるＣＧＣがＧＣＧに置換されていることが確認された。これは、ａｒｏＧアルドラーゼの２１７番目のアミノ酸であるアルギニンがアラニンに置換された変異体（以下、Ｒ２１７Ａという）をコードすることを意味するものである。ａｒｏＧアルドラーゼ変異体（Ｒ２１７Ａ）のアミノ酸配列及びそれをコードするａｒｏＧアルドラーゼ変異体の塩基配列を配列番号３及び４に示す。

また、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ａｒｏＧ（ｍｔ）６５３１菌株は、ａｒｏＧ遺伝子の９２８番目、９２９番目のヌクレオチドであるＡＡがＧＣに置換されていることが確認された。これは、ａｒｏＧアルドラーゼの３１０番目のアミノ酸であるリシンがアラニンに置換された変異体（以下、Ｋ３１０Ａという）をコードすることを意味するものである。ａｒｏＧアルドラーゼ変異体（Ｋ３１０Ａ）のアミノ酸配列及びそれをコードするａｒｏＧアルドラーゼ変異体の塩基配列を配列番号５及び６に示す。

ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ａｒｏＧ（ｍｔ）８３１６菌株は、ａｒｏＧ遺伝子の１２０７番目～１２０９番目のヌクレオチドであるＣＧＣがＧＣＧに置換されていることが確認された。これは、ａｒｏＧアルドラーゼの４０３番目のアミノ酸であるアルギニンがアラニンに置換された変異体（以下、Ｒ４０３Ａという）をコードすることを意味するものである。ａｒｏＧアルドラーゼ変異体（Ｒ４０３Ａ）のアミノ酸配列及びそれをコードするａｒｏＧアルドラーゼ変異体の塩基配列を配列番号７及び８に示す。

ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ａｒｏＧ（ｍｔ）９４２６菌株は、ＤＡＨＰ遺伝子の１３８５番目、１３８６番目のヌクレオチドであるＡＡがＣＧに置換されていることが確認された。これは、ａｒｏＧアルドラーゼの４６２番目のアミノ酸であるグルタミン酸がアラニンに置換された変異体（以下、Ｅ４６２Ａという）をコードすることを意味するものである。ａｒｏＧアルドラーゼ変異体（Ｅ４６２Ａ）のアミノ酸配列及びそれをコードするａｒｏＧアルドラーゼ変異体の塩基配列を配列番号９及び１０に示す。

以下の実施例においては、上記変異（Ｒ２１７Ａ，Ｋ３１０Ａ，Ｒ４０３Ａ，Ｅ４６２Ａ）がコリネバクテリウム属微生物のＬ－ロイシン及び芳香族アミノ酸生産に影響を及ぼすか否かについて確認する。

選択した変異菌株のＬ－ロイシン、Ｌ－チロシン、Ｌ－フェニルアラニン生産能の確認 実施例３－１．ａｒｏＧアルドラーゼ変異を含む挿入ベクターの作製 実施例２で選択した変異を菌株に導入するために、挿入用ベクターを作製した。ａｒｏＧ（Ｒ２１７Ａ，Ｋ３１０Ａ，Ｒ４０３Ａ，Ｅ４６２Ａ）変異導入用ベクターの作製には、部位特異的突然変異誘発（Site directed mutagenesis）方法を用いた。コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２野生型の染色体を鋳型とし、Ｒ２１７Ａ変異を生成するために、配列番号１３及び１４のプライマー対、配列番号１５及び１６のプライマー対を用い、Ｋ３１０Ａ変異を生成するために、配列番号１３及び１７のプライマー対、配列番号１５及び１８のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。Ｒ４０３Ａ変異を生成するために、配列番号１３及び１９のプライマー対、配列番号１５及び２０のプライマー対を用い、Ｅ４６２Ａ変異を生成するために、配列番号１３及び２１のプライマー対、配列番号１５及び２２のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。具体的には、９４℃で５分間の変性後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分３０秒間を３０サイクル行い、次いで７２℃で５分間の条件でＰＣＲを行った。用いたプライマーの具体的な配列を表４に示す。

結果として得られたＰＣＲ産物をＳｍａＩ制限酵素で切断した線状のｐＤＣＭ２ベクター（特許文献５）とＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ酵素を用いて、ＤＮＡ断片間の末端１５ ｂａｓｅの相同配列をｆｕｓｉｏｎさせてクローニングし、ａｒｏＧのアミノ酸を置換するベクター「ｐＤＣＭ２－ａｒｏＧ（Ｒ２１７Ａ）」、「ｐＤＣＭ２－ａｒｏＧ（Ｋ３１０Ａ）」、「ｐＤＣＭ２－ａｒｏＧ（Ｒ４０３Ａ）」及び「ｐＤＣＭ２－ａｒｏＧ（Ｅ４６２Ａ）」を作製した。また、変異体を組み合わせることにより、ａｒｏＧの２１７番目、３１０番目、４０３番目及び４６２番目のアミノ酸を置換するベクター「ｐＤＣＭ２－ａｒｏＧ（Ｒ２１７Ａ，Ｋ３１０Ａ，Ｅ４６２Ａ）」、「ｐＤＣＭ２－ａｒｏＧ（Ｒ２１７Ａ，Ｋ３１０Ａ，Ｒ４０３Ａ，Ｅ４６２Ａ）」を作製した。ａｒｏＧアルドラーゼ変異体（Ｒ２１７Ａ，Ｋ３１０Ａ，Ｅ４６２Ａ）のアミノ酸配列及びそれをコードするａｒｏＧアルドラーゼ変異体の塩基配列を配列番号２３及び２４に示す。また、ａｒｏＧアルドラーゼ変異体（Ｒ２１７Ａ，Ｋ３１０Ａ，Ｒ４０３Ａ，Ｅ４６２Ａ）のアミノ酸配列及びそれをコードするａｒｏＧアルドラーゼ変異体の塩基配列を配列番号２５及び２６に示す。

実施例３－２．ＡＴＣＣ１３０３２菌株への変異体の導入及び評価 実施例３－１で作製したｐＤＣＭ２－ａｒｏＧ（Ｒ２１７Ａ）、ｐＤＣＭ２－ａｒｏＧ（Ｋ３１０Ａ）、ｐＤＣＭ２－ａｒｏＧ（Ｒ４０３Ａ）、ｐＤＣＭ２－ａｒｏＧ（Ｅ４６２Ａ）、ｐＤＣＭ２－ａｒｏＧ（Ｒ２１７Ａ，Ｋ３１０Ａ，Ｅ４６２Ａ）、ｐＤＣＭ２－ａｒｏＧ（Ｒ２１７Ａ，Ｋ３１０Ａ，Ｒ４０３Ａ，Ｅ４６２Ａ）ベクターをＡＴＣＣ１３０３２にエレクトロポレーションにより形質転換し、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有する培地から、相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株を選択した。選択した１次菌株は、さらに２次交差（cross-over）を経て、目標遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に形質転換した菌株にａｒｏＧ遺伝子変異が導入されたか否かは、表１に示す配列番号１１と配列番号１２のプライマーを用いてＰＣＲを行い、その後塩基配列を分析することにより判断し、菌株に変異が導入されたことが確認された。作製した菌株は全５種であり、ＡＴＣＣ１３０３２＿ａｒｏＧ＿Ｒ２１７Ａ、ＡＴＣＣ１３０３２＿ａｒｏＧ＿Ｋ３１０Ａ、ＡＴＣＣ１３０３２＿ａｒｏＧ＿Ｒ４０３Ａ、ＡＴＣＣ１３０３２＿ａｒｏＧ＿Ｅ４６２Ａ、ＡＴＣＣ１３０３２＿ａｒｏＧ＿（Ｒ２１７Ａ，Ｋ３１０Ａ，Ｅ４６２Ａ）、ＡＴＣＣ１３０３２＿ａｒｏＧ＿（Ｒ２１７Ａ，Ｋ３１０Ａ，Ｒ４０３Ａ，Ｅ４６２Ａ）と命名した。

前述したように作製した全６種の菌株のＬ－ロイシン及び芳香族アミノ酸生産能を評価するために、フラスコ発酵力価評価を行った。生産培地２５ｍｌをそれぞれ含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２、及び前述したように作製したＡＴＣＣ１３０３２＿ａｒｏＧ＿Ｒ２１７Ａ、ＡＴＣＣ１３０３２＿ａｒｏＧ＿Ｋ３１０Ａ、ＡＴＣＣ１３０３２＿ａｒｏＧ＿Ｒ４０３Ａ、ＡＴＣＣ１３０３２＿ａｒｏＧ＿Ｅ４６２Ａ、ＡＴＣＣ１３０３２＿ａｒｏＧ＿（Ｒ２１７Ａ，Ｋ３１０Ａ，Ｅ４６２Ａ）、ＡＴＣＣ１３０３２＿ａｒｏＧ＿（Ｒ２１７Ａ，Ｋ３１０Ａ，Ｒ４０３Ａ，Ｅ４６２Ａ）をそれぞれ１白金耳接種し、その後３０℃、２００ｒｐｍで６０時間振盪培養してＬ－ロイシンを生産した。培養終了後に、ＨＰＬＣによりＬ－ロイシン、Ｌ－チロシン及びＬ－フェニルアラニンの生産量を測定した。実験を行った各菌株における培養液中のロイシン濃度を表５に示す。

表５に示すように、ＡＴＣＣ１３０３２＿ａｒｏＧ＿Ｒ２１７Ａ、ＡＴＣＣ１３０３２＿ａｒｏＧ＿Ｋ３１０Ａ、ＡＴＣＣ１３０３２＿ａｒｏＧ＿Ｒ４０３Ａ、ＡＴＣＣ１３０３２＿ａｒｏＧ＿Ｅ４６２Ａ、ＡＴＣＣ１３０３２＿ａｒｏＧ＿（Ｒ２１７Ａ，Ｋ３１０Ａ，Ｅ４６２Ａ）、ＡＴＣＣ１３０３２＿ａｒｏＧ＿（Ｒ２１７Ａ，Ｋ３１０Ａ，Ｒ４０３Ａ，Ｅ４６２Ａ）は、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に比べて、Ｌ－ロイシンの収率が約１．３５～１．５５倍に向上することが確認された。また、Ｌ－チロシンの収率が２．５～８．５分の１に減少し、Ｌ－フェニルアラニンが約３．５～１４分の１に減少することが確認された。

ロイシン生産株におけるａｒｏＧ選択変異のロイシン、チロシン及びフェニルアラニン生産能の確認 コリネバクテリウム属野生型の菌株は、ロイシンを生産したとしても極微量を生産するにすぎない。よって、ＡＴＣＣ１３０３２由来のロイシン生産菌株を作製し、選択した変異を導入してロイシン、チロシン及びフェニルアラニン生産能を確認する実験を行った。具体的には次の通りである。

実施例４－１．Ｌ－ロイシン生産株ＣＪＬ－８１０９菌株の作製 高濃度のＬ－ロイシン生産のための菌株として、（１）ｌｅｕＡ遺伝子の１６７３番目のヌクレオチドであるＧがＡに置換され、ＬｅｕＡタンパク質の５５８番目のアミノ酸であるアルギニンがヒスチジンに置換される変異（Ｒ５５８Ｈ）、（２）ｌｅｕＡ遺伝子の１６８２番目、１６８３番目のヌクレオチドであるＧＣがＡＴに置換され、５６１番目のアミノ酸であるグリシンがアスパラギン酸に置換される変異（Ｇ５６１Ｄ）、及び（３）ｌｅｕＡ遺伝子の７３９番目、７４０番目のヌクレオチドであるＣＣがＴＧに置換され、２４７番目のアミノ酸であるプロリンがシステインに置換される変異（Ｐ２４７Ｃ）を含むＡＴＣＣ１３０３２由来の菌株を作製した。

具体的には、前記ｌｅｕＡ遺伝子変異を含むｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｐ２４７Ｃ，Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）ベクターをコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２にエレクトロポレーションにより形質転換し、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有する培地から、相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株を選択した。選択した１次菌株は、さらに２次交差（cross-over）を経て、ｌｅｕＡ遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に形質転換した菌株に変異が導入されたか否かは、表６の配列番号２７と配列番号２８のプライマーを用いてＰＣＲ（９４℃で５分間、その後９４℃で３０秒間／５５℃で３０秒間／７２℃で９０秒間を３０サイクル行い、次いで７２℃で５分間）を行い、塩基配列を分析することにより判断し、Ｐ２４７Ｃ、Ｒ５５８Ｈ、Ｇ５６１Ｄ変異が導入されたことが確認された。ｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｐ２４７Ｃ，Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）ベクターで形質転換されたＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡ＿（Ｐ２４７Ｃ，Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）菌株を「ＣＪＬ－８１０５」と命名した。

作製したＣＪＬ－８１０５菌株においてＬ－ロイシン生産能を向上させるために、分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（branched-chain amino acid aminotransferase）をコードする遺伝子であるｉｌｖＥ変異体（Ｖ１５６Ａ）を導入した菌株を作製した（特許文献６）。具体的には、前記ｉｌｖＥ遺伝子変異を含むｐＤＣＭ２－ｉｌｖＥ（Ｖ１５６Ａ）ベクターをコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪＬ－８１０５にエレクトロポレーションにより形質転換し、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有する培地から、相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株を選択した。選択した１次菌株は、さらに２次交差（cross-over）を経て、ｉｌｖＥ遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に形質転換した菌株に変異が導入されたか否かは、表７の配列番号２９と配列番号３０のプライマーを用いてＰＣＲ（９４℃で５分間、その後９４℃で３０秒間／５５℃で３０秒間／７２℃で９０秒間を３０サイクル行い、次いで７２℃で５分間）を行い、塩基配列を分析することにより判断し、Ｖ１５６Ａ変異が導入されたことが確認された。ｐＤＣＭ２－ｉｌｖＥ（Ｖ１５６Ａ）ベクターで形質転換された菌株を「ＣＪＬ－８１０８」と命名した。

作製したＣＪＬ－８１０８菌株においてＬ－ロイシン生産能を向上させるために、クエン酸シンターゼ（Citrate Synthase）活性を弱化させたｇｌｔＡ変異体（Ｍ３１２Ｉ；配列番号４１）を導入した菌株を作製した。具体的には、前記ｇｌｔＡ遺伝子変異を含むｐＤＣＭ２－ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）ベクターをコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪＬ－８１０８にエレクトロポレーションにより形質転換し、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有する培地から、相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株を選択した。選択した１次菌株は、さらに２次交差（cross-over）を経て、ｇｌｔＡ遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に形質転換した菌株に変異が導入されたか否かは、表８の配列番号３１と配列番号３２のプライマーを用いてＰＣＲ（９４℃で５分間、その後９４℃で３０秒間／５５℃で３０秒間／７２℃で９０秒間を３０サイクル行い、次いで７２℃で５分間）を行い、塩基配列を分析することにより判断し、Ｍ３１２Ｉ変異が導入されたことが確認された。ｐＤＣＭ２－ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）ベクターで形質転換された菌株を「ＣＪＬ－８１０９」と命名した。

実施例４－２．ＣＪＬ－８１０９菌株へのａｒｏＧアルドラーゼ変異体の導入及び評価 ロイシン生産菌株であるＣＪＬ－８１０９を実施例３－１で作製したｐＤＣＭ２－ａｒｏＧ（Ｒ２１７Ａ）、ｐＤＣＭ２－ａｒｏＧ（Ｋ３１０Ａ）、ｐＤＣＭ２－ａｒｏＧ（Ｒ４０３Ａ）、ｐＤＣＭ２－ａｒｏＧ（Ｅ４６２Ａ）、ｐＤＣＭ２－ａｒｏＧ（Ｒ２１７Ａ，Ｋ３１０Ａ，Ｅ４６２Ａ）、ｐＤＣＭ２－ａｒｏＧ（Ｒ２１７Ａ，Ｋ３１０Ａ，Ｒ４０３Ａ，Ｅ４６２Ａ）ベクターで形質転換し、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有する培地から、相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株を選択した。選択した１次菌株は、さらに２次交差（cross-over）を経て、目標遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に形質転換した菌株にａｒｏＧ遺伝子変異が導入されたか否かは、配列番号１１と配列番号１２のプライマーを用いてＰＣＲを行い、その後塩基配列を分析することにより判断し、菌株にａｒｏＧアルドラーゼ変異が導入されたことが確認された。作製したＣＪＬ－８１０９＿ａｒｏＧ＿Ｒ２１７ＡをＣＪＬ－８１１０と命名し、ＣＪＬ－８１０９＿ａｒｏＧ＿Ｋ３１０ＡをＣＪＬ－８１１１と命名し、ＣＪＬ－８１０９＿ａｒｏＧ＿Ｒ４０３ＡをＣＪＬ－８１１２と命名し、ＣＪＬ－８１０９＿ａｒｏＧ＿Ｅ４６２ＡをＣＪＬ－８１１３と命名し、ＣＪＬ－８１０９＿ａｒｏＧ＿（Ｒ２１７Ａ，Ｋ３１０Ａ，Ｅ４６２Ａ）をＣＡ１３－８１１４と命名し、ＣＪＬ－８１０９＿ａｒｏＧ＿（Ｒ２１７Ａ，Ｋ３１０Ａ，Ｒ４０３Ａ，Ｅ４６２Ａ）をＣＪＬ－８１１５と命名した。

前述したように作製したＣＪＬ－８１１０、ＣＪＬ－８１１１、ＣＪＬ－８１１２、ＣＪＬ－８１１３、ＣＡ１３－８１１４、ＣＪＬ－８１１５、及びＡＴＣＣ１３０３２、ＣＪＬ－８１０９菌株のロイシン生産能を評価した。実施例２と同様にフラスコ培養を行い、培養終了後に、ＨＰＬＣを用いた方法によりロイシン及び芳香族アミノ酸生産量を測定した。培養結果を表９に示す。

表９に示すように、ａｒｏＧ遺伝子にＲ２１７Ａ、Ｋ３１０Ａ、Ｒ４０３Ａ、Ｅ４６２Ａ変異をさらに含むＬ－ロイシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪＬ－８１１０、ＣＪＬ－８１１１、ＣＪＬ－８１１２、ＣＪＬ－８１１３、ＣＡ１３－８１１４、ＣＪＬ－８１１５は、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に比べて、Ｌ－ロイシン生産能が約４～５倍に向上することが確認された。また、Ｌ－ロイシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪＬ－８１１０、ＣＪＬ－８１１１、ＣＪＬ－８１１２、ＣＪＬ－８１１３、ＣＡ１３－８１１４、ＣＪＬ－８１１５は、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪＬ－８１０９に比べて、Ｌ－ロイシン生産能が約１．２～１．６倍に向上し、Ｌ－チロシン及びＬ－フェニルアラニンが約１０～２０分の１に減少することが確認された。これらの結果から、ａｒｏＧアルドラーゼのアミノ酸配列における２１７番目、３１０番目、４０３番目、４６２番目の位置のアミノ酸がＬ－ロイシン生産及び芳香族アミノ酸であるＬ－チロシン及びＬ－フェニルアラニン生産に重要な位置であることが確認される。

前述したように作製した菌株ＣＡ１３－８１１４は、２０２１年１月１８日付けでブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託番号ＫＣＣＭ１２９３１Ｐとして国際寄託した。

イソロイシン生産株におけるａｒｏＧ選択変異のロイシン、チロシン及びフェニルアラニン生産能の確認 ロイシンと同じく代表的な分枝鎖アミノ酸であるイソロイシンに対しても選択した変異が効果を発揮するか否かを確認するために、コリネバクテリウム属イソロイシン生産菌株に導入してイソロイシン生産能を確認する実験を行った。具体的には次の通りである。

実施例５－１．Ｌ－イソロイシン生産株ＣＡ１０－３１０１菌株の作製 野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２からＬ－イソロイシン生産菌株を開発した。具体的には、生合成経路においてイソロイシンの前駆体であるトレオニンのフィードバック阻害を解除するために、ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であるｈｏｍの４０７番目のアミノ酸であるアルギニン（Arginine）をヒスチジン（Histidine）に置換した（特許文献７）。より具体的には、ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）変異を導入した菌株を作製するために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型とし、配列番号３３及び配列番号３４、又は配列番号３５及び配列番号３６のプライマーを用いてＰＣＲをそれぞれ行った。ここで用いたプライマー配列を表１０に示す。

ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしては、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用い、ＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合反応を２８サイクル行うものとした。その結果、ｈｏｍ遺伝子の変異を中心に、５’末端上流の１０００ｂｐのＤＮＡ断片と、３’末端下流の１０００ｂｐのＤＮＡ断片がそれぞれ得られた。増幅された２つのＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号３４及び配列番号３５のプライマーでＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２分間の重合を２８サイクル行い、次いで７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。

その結果、４０７番目のアルギニンがヒスチジンに置換されたホモセリンデヒドロゲナーゼ変異体をコードするｈｏｍ遺伝子の変異を含む２ｋｂのＤＮＡ断片が増幅された。ＰＣＲ精製キット（PCR Purification kit, QUIAGEN）を用いて増幅産物を精製し、ベクター作製のための挿入ＤＮＡ断片として用いた。精製した増幅産物を制限酵素ｓｍａＩで処理し、その後６５℃で２０分間熱処理したｐＤＣＭ２ベクターと、前記増幅産物である挿入ＤＮＡ断片のモル濃度（Ｍ）の比が１：２になるように、インフュージョンクローニングキット（Infusion Cloning Kit, TaKaRa）を用いて、提供されたマニュアルに従ってクローニングすることにより、ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）変異を染色体上に導入するためのベクターｐＤＣＭ２－Ｒ４０７Ｈを作製した。

作製したベクターをエレクトロポレーションによりコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に形質転換し、２次交差過程を経て、染色体上でｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）変異を含む菌株を得た。これをコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）と命名した。

Ｌ－イソロイシンに対するフィードバック阻害の解除と活性向上のために、作製したＡＴＣＣ１３０３２ ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）菌株に、Ｌ－トレオニンデヒドラターゼをコードする遺伝子であるｉｌｖＡ変異体（Ｔ３８１Ａ，Ｆ３８３Ａ）を導入した菌株を作製した。より具体的には、ｉｌｖＡ（Ｔ３８１Ａ，Ｆ３８３Ａ）変異を導入した菌株を作製するために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型とし、配列番号３７及び配列番号３８、又は配列番号３９及び配列番号４０のプライマーを用いてＰＣＲをそれぞれ行った。ここで用いたプライマー配列を表１１に示す。

ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしては、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用い、ＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合反応を２８サイクル行うものとした。その結果、ｉｌｖＡ遺伝子の変異を中心に、５’末端上流の１１２６ｂｐのＤＮＡ断片と、３’末端下流の２８６ｂｐのＤＮＡ断片がそれぞれ得られた。増幅された２つのＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号３７及び配列番号４０のプライマーでＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２分間の重合を２８サイクル行い、次いで７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。

その結果、３８１番目のトレオニンがアラニンに置換され、３８３番目のフェニルアラニンがアラニンに置換されたトレオニンデヒドラターゼ変異体をコードするｉｌｖＡ遺伝子の変異を含む１．４ｋｂのＤＮＡ断片が増幅された。ＰＣＲ精製キット（PCR Purification kit, QAIGEN）を用いて増幅産物を精製し、ベクター作製のための挿入ＤＮＡ断片として用いた。精製した増幅産物を制限酵素ｓｍａＩで処理し、その後６５℃で２０分間熱処理したｐＤＣＭ２ベクターと、前記増幅産物である挿入ＤＮＡ断片のモル濃度（Ｍ）の比が１：２になるように、インフュージョンクローニングキット（Infusion Cloning Kit, TaKaRa）を用いて、提供されたマニュアルに従ってクローニングすることにより、ｉｌｖＡ（Ｔ３８１Ａ，Ｆ３８３Ａ）変異を染色体上に導入するためのベクターｐＤＣＭ２－ｉｌｖＡ（Ｔ３８１Ａ，Ｆ３８３Ａ）を作製した。作製したベクターをエレクトロポレーションによりコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）に形質転換し、２次交差過程を経て、染色体上でｉｌｖＡ（Ｔ３８１Ａ，Ｆ３８３Ａ）変異を含む菌株を得た。これをコリネバクテリウム・グルタミカムＣＡ１０－３１０１と命名した。

実施例５－２．ＣＡ１０－３１０１菌株へのａｒｏＧアルドラーゼ変異体の導入及び評価 Ｌ－イソロイシン生産菌株であるＣＡ１０－３１０１を実施例３－１で作製したｐＤＣＭ２－ａｒｏＧ（Ｒ２１７Ａ）、ｐＤＣＭ２－ａｒｏＧ（Ｋ３１０Ａ）、ｐＤＣＭ２－ａｒｏＧ（Ｒ４０３Ａ）、ｐＤＣＭ２－ａｒｏＧ（Ｅ４６２Ａ）、ｐＤＣＭ２－ａｒｏＧ（Ｒ２１７Ａ，Ｋ３１０Ａ，Ｅ４６２Ａ）、ｐＤＣＭ２－ａｒｏＧ（Ｒ２１７Ａ，Ｋ３１０Ａ，Ｒ４０３Ａ，Ｅ４６２Ａ）ベクターで形質転換し、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有する培地から、相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株を選択した。選択した１次菌株は、さらに２次交差（cross-over）を経て、目標遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に形質転換した菌株にａｒｏＧ遺伝子変異が導入されたか否かは、配列番号１１と配列番号１２のプライマーを用いてＰＣＲを行い、その後塩基配列を分析することにより判断し、菌株にａｒｏＧアルドラーゼ変異が導入されたことが確認された。

作製した菌株をＣＡ１０－３１０１＿ａｒｏＧ＿Ｒ２１７Ａ、ＣＡ１０－３１０１＿ａｒｏＧ＿Ｋ３１０Ａ、ＣＡ１０－３１０１＿ａｒｏＧ＿Ｒ４０３Ａ、ＣＡ１０－３１０１＿ａｒｏＧ＿Ｅ４６２Ａ、ＣＡ１０－３１０１＿ａｒｏＧ＿（Ｒ２１７Ａ，Ｋ３１０Ａ，Ｅ４６２Ａ）、ＣＡ１０－３１０１＿ａｒｏＧ＿（Ｒ２１７Ａ，Ｋ３１０Ａ，Ｒ４０３Ａ，Ｅ４６２Ａ）と命名した。

前述したように作製したＣＡ１０－３１０１＿ａｒｏＧ＿Ｒ２１７Ａ、ＣＡ１０－３１０１＿ａｒｏＧ＿Ｋ３１０Ａ、ＣＡ１０－３１０１＿ａｒｏＧ＿Ｒ４０３Ａ、ＣＡ１０－３１０１＿ａｒｏＧ＿Ｅ４６２Ａ、ＣＡ１０－３１０１＿ａｒｏＧ＿（Ｒ２１７Ａ，Ｋ３１０Ａ，Ｅ４６２Ａ）、ＣＡ１０－３１０１＿ａｒｏＧ＿（Ｒ２１７Ａ，Ｋ３１０Ａ，Ｒ４０３Ａ，Ｅ４６２Ａ）、及びＡＴＣＣ１３０３２、ＣＡ１０－３１０１菌株のＬ－イソロイシン生産能を評価した。イソロイシン生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに親株及び前記ａｒｏＧアルドラーゼ変異株を接種し、その後３２℃、２００ｒｐｍで６０時間振盪培養してＬ－イソロイシンを作製した。

本実施例において用いた生産培地の組成は次の通りである。 ＜生産培地＞ グルコース１０％，酵母抽出物０．２％，硫酸アンモニウム１．６％，リン酸二水素カリウム０．１％，硫酸マグネシウム７水和物０．１％，硫酸鉄７水和物１０ｍｇ／ｌ，硫酸マンガン１水和物１０ｍｇ／ｌ，ビオチン２００μｇ／ｌ，ｐＨ７．２

培養終了後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いてＬ－イソロイシン及び副産物の生産量を測定した。実験した各菌株における培養液中のＬ－イソロイシン及び副産物の濃度を表１２に示す。

表１２に示すように、ａｒｏＧ遺伝子にＲ２１７Ａ、Ｋ３１０Ａ、Ｒ４０３Ａ、Ｅ４６２Ａ変異をさらに含むＬ－イソロイシン生産菌株は、親株であるコリネグルタミカムＣＡ１０－３１０１に比べて、Ｌ－イソロイシン生産能が約１．１～１．２倍に向上し、Ｌ－チロシン及びＬ－フェニルアラニンが減少することが確認された。

これらの結果から、ａｒｏＧアルドラーゼのアミノ酸配列における２１７番目、３１０番目、４０３番目、４６２番目の位置のアミノ酸がＬ－イソロイシン生産及び芳香族アミノ酸であるＬ－チロシン及びＬ－フェニルアラニン生産に重要な位置であることが確認される。

バリン生産株におけるａｒｏＧ選択変異のバリン生産能の確認 ロイシンと同じく代表的な分枝鎖アミノ酸であるＬ－バリンに対しても選択した変異が効果を発揮するか否かを確認するために、コリネバクテリウム属バリン生産菌株であるＫＣＣＭ１１２０１Ｐにも選択した変異を導入してバリン生産能を確認する実験を行った。具体的には次の通りである。

実施例６－１．ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ菌株へのａｒｏＧアルドラーゼ変異体の導入及び評価 当該変異がバリン生産能の向上に効果があるか否かを確認するために、Ｌ－バリン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ（特許文献８）菌株を用いた。バリン生産菌株であるＫＣＣＭ１１２０１Ｐを実施例３－１で作製したｐＤＣＭ２－ａｒｏＧ（Ｒ２１７Ａ）、ｐＤＣＭ２－ａｒｏＧ（Ｋ３１０Ａ）、ｐＤＣＭ２－ａｒｏＧ（Ｒ４０３Ａ）、ｐＤＣＭ２－ａｒｏＧ（Ｅ４６２Ａ）、ｐＤＣＭ２－ａｒｏＧ（Ｒ２１７Ａ，Ｋ３１０Ａ，Ｅ４６２Ａ）、ｐＤＣＭ２－ａｒｏＧ（Ｒ２１７Ａ，Ｋ３１０Ａ，Ｒ４０３Ａ，Ｅ４６２Ａ）ベクターで形質転換し、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有する培地から、相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株を選択した。選択した１次菌株は、さらに２次交差（cross-over）を経て、目標遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に形質転換した菌株にａｒｏＧ遺伝子変異が導入されたか否かは、配列番号１１と配列番号１２のプライマーを用いてＰＣＲを行い、その後塩基配列を分析することにより判断し、菌株にａｒｏＧアルドラーゼ変異が導入されたことが確認された。作製した菌株をＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－ａｒｏＧ（Ｒ２１７Ａ）、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－ａｒｏＧ（Ｋ３１０Ａ）、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－ａｒｏＧ（Ｒ４０３Ａ）、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－ａｒｏＧ（Ｅ４６２Ａ）、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－ａｒｏＧ（Ｒ２１７Ａ，Ｋ３１０Ａ，Ｅ４６２Ａ）及びＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－ａｒｏＧ（Ｒ２１７Ａ，Ｋ３１０Ａ，Ｒ４０３Ａ，Ｅ４６２Ａ）とそれぞれ命名した。

前述したように作製したＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－ａｒｏＧ（Ｒ２１７Ａ）、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－ａｒｏＧ（Ｋ３１０Ａ）、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－ａｒｏＧ（Ｒ４０３Ａ）、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－ａｒｏＧ（Ｅ４６２Ａ）、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－ａｒｏＧ（Ｒ２１７Ａ，Ｋ３１０Ａ，Ｅ４６２Ａ）及びＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－ａｒｏＧ（Ｒ２１７Ａ，Ｋ３１０Ａ，Ｒ４０３Ａ，Ｅ４６２Ａ）菌株のバリン生産能を評価した。実施例２と同様にフラスコ培養を行い、培養終了後に、ＨＰＬＣを用いた方法によりバリン生産量を測定した。培養結果を表１３に示す。

表１３に示すように、ａｒｏＧ遺伝子にＲ２１７Ａ、Ｋ３１０Ａ、Ｒ４０３Ａ、Ｅ４６２Ａ変異をさらに含むＬ－バリン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－ａｒｏＧ（Ｒ２１７Ａ）、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－ａｒｏＧ（Ｋ３１０Ａ）、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－ａｒｏＧ（Ｒ４０３Ａ）、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－ａｒｏＧ（Ｅ４６２Ａ）、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－ａｒｏＧ（Ｒ２１７Ａ，Ｋ３１０Ａ，Ｅ４６２Ａ）及びＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－ａｒｏＧ（Ｒ２１７Ａ，Ｋ３１０Ａ，Ｒ４０３Ａ，Ｅ４６２Ａ）は、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐに比べて、バリン生産能が最大で１．１１倍に向上し、Ｌ－チロシン及びＬ－フェニルアラニンが約１０～２０分の１に減少することが確認された。

これらの結果から、ａｒｏＧアルドラーゼのアミノ酸配列における２１７番目、３１０番目、４０３番目、４６２番目の位置のアミノ酸がＬ－バリン生産及び芳香族アミノ酸であるＬ－チロシン及びＬ－フェニルアラニン生産に重要な位置であることが確認される。

参考例１：ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）変異がロイシン生産に及ぼす効果の確認 参考例１－１．ｇｌｔＡ変異を含む挿入ベクターの作製 ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ；配列番号４１）変異導入用ベクターの作製には、部位特異的突然変異誘発（Site directed mutagenesis）方法を用いた。

コリネバクテリウム・グルタミカム野生型の染色体を鋳型とし、配列番号４３及び４４のプライマー対、配列番号４５及び４６のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で５分間の変性後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分３０秒間を３０サイクル行い、次いで７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。結果として得られた遺伝子断片をＳｍａＩ制限酵素で切断した線状のｐＤＣＭ２ベクターとインフュージョン（In-Fusion）酵素を用いて、ＤＮＡ断片間の末端１５塩基の相同配列を結合させてクローニングし、３１２番目のアミノ酸であるメチオニンをイソロイシンに置換するベクターｐＤＣＭ２－ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）を作製した。

参考例１－２．ＡＴＣＣ１３０３２菌株への変異体の導入及び評価 参考例１－１で作製したｐＤＣＭ２－ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）ベクターを野生型ＡＴＣＣ１３０３２に形質転換し、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有する培地から、相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株を選択した。選択した１次菌株は、さらに２次交差（cross-over）を経て、目標遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に形質転換した菌株にｇｌｔＡ遺伝子変異が導入されたか否かは、配列番号３１及び配列番号３２（実施例４－１，表８）のプライマーを用いてＰＣＲを行い、その後塩基配列を分析することにより判断し、菌株に変異（配列番号４２）が導入されたことが確認された。作製した菌株をＡＴＣＣ１３０３２＿ｇｌｔＡ＿Ｍ３１２Ｉと命名した。

前述したように作製したＡＴＣＣ１３０３２＿ｇｌｔＡ＿Ｍ３１２Ｉ菌株のロイシン生産能を評価するために、フラスコ発酵力価評価を行った。生産培地２５ｍｌをそれぞれ含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２、及び前述したように作製したＡＴＣＣ１３０３２＿ｇｌｔＡ＿Ｍ３１２Ｉをそれぞれ１白金耳接種し、その後３０℃、２００ｒｐｍで６０時間振盪培養してロイシンを生産した。培養終了後に、ＨＰＬＣによりロイシンの生産量を測定した。実験を行った各菌株における培養液中のロイシン濃度を表１５に示す。 ・生産培地：グルコース１００ｇ，（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ ４０ｇ，大豆タンパク質（Soy Protein）２．５ｇ，コーンスティープソリッド（Corn Steep Solids）５ｇ，尿素３ｇ，ＫＨ_２ＰＯ_４ １ｇ，ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミン塩酸塩１０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド３０００μｇ，ＣａＣＯ_３ ３０ｇ（蒸留水１リットル中），ｐＨ７．０

これらの結果から、ｇｌｔＡのＭ３１２Ｉ置換がロイシン生産の増加に有効な変異であることが確認される。

参考例２：ｉｌｖＡ（Ｔ３８１Ａ，Ｆ３８３Ａ）変異がイソロイシン生産に及ぼす効果の確認 参考例２－１：ｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＡ（Ｆ３８３Ａ）の作製 トレオニンデヒドラターゼ（配列番号４７）をコードする遺伝子であるｉｌｖＡ（配列番号４８）を増幅するために、既知のＦ３８３Ａ変異を導入したｉｌｖＡ配列（非特許文献１８）に基づいて、プロモーター部位（開始コドンの上流約３００ｂｐ）からターミネーター部位（終止コドンの下流約１００ｂｐ）までを増幅するためのプライマー（配列番号４９及び配列番号５０）の両末端にＢａｍＨＩ制限酵素部位を挿入した。また、ｉｌｖＡにＦ３８３Ａ変異を導入するためのプライマー（配列番号５１及び配列番号５２）を用いた。ここで用いたプライマー配列を表１６に示す。

野生型コリネバクテリウム・グルタミカム（wild type Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型とし、配列番号４９及び配列番号５２、配列番号５０及び配列番号５１のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で９０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。

その結果、ｉｌｖＡ遺伝子の変異を中心に、５’末端上流の１４６０ｂｐのＤＮＡ断片と、３’末端下流の２７６ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。

増幅された２つのＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号４９及び配列番号５０のプライマーでＰＣＲを行った。

その結果、３８３番目のフェニルアラニンがアラニンに置換されたｉｌｖＡ変異を含む１５３１ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。ｐＥＣＣＧ１１７（特許文献９）ベクターとｉｌｖＡ ＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩで処理し、ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、その後クローニングすることによりプラスミドを得た。これをｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＡ（Ｆ３８３Ａ）と命名した。

参考例２－２：ｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＡ（Ｆ３８３Ａ）へのランダム変異の追加導入 Ｌ－トレオニンデヒドラターゼをコードする遺伝子の変異体を得るために、ランダム突然変異キット（random mutagenesis kit, Agilent Technologies, 米国）を用いてｉｌｖＡ変異体遺伝子プラスミドを作製した。参考例２－１のｉｌｖＡ（Ｆ３８３Ａ）染色体を鋳型とし、配列番号４９及び配列番号５０のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で２分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で９０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で１０分間の重合反応を行うものとした。

その結果、３８３番目のフェニルアラニンがアラニンに置換される変異以外に、さらなるランダム変異を有するＬ－トレオニンデヒドラターゼをコードするｉｌｖＡ変異体である１５３１ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。ｐＥＣＣＧ１１７ベクターとｉｌｖＡ変異体ＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩで処理し、ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、その後クローニングすることによりプラスミド群を得た。

参考例２－３：ＣＪＩＬＥ－３０１菌株の作製 コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）菌株にｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＡ（Ｆ３８３Ａ）を導入した。作製したプラスミドを導入した菌株をＡＴＣＣ１３０３２ ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）／ｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＡ（Ｆ３８３Ａ）と命名した。また、参考例２－２で得られた変異体プラスミド群をコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）菌株に導入し、最小培地に塗抹して死滅率を測定したところ、死滅率は７０％であった。生存した細胞を種培地に接種して培養し、最終的にＡＴＣＣ１３０３２ ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）／ｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＡ（Ｆ３８３Ａ）対照群に比べて優れたイソロイシン生産能を示す変異株を選択し、コリネバクテリウム・グルタミカムＣＪＩＬＥ－３０１（Corynebacterium glutamicum, CJILE-301）と命名した。

ＣＪＩＬＥ－３０１菌株からプラスミドを分離してｉｌｖＡ遺伝子をシーケンシングしたところ、ｉｌｖＡ遺伝子の１１４１番目の塩基配列がＡからＧに置換され、ｉｌｖＡタンパク質の３８３番目のＦがＡに置換される変異以外に、さらに３８１番目のＴがＡに置換された変異タンパク質をコードすることが確認された。これを配列番号５４に示す。

参考例２－４：ｉｌｖＡ変異体（Ｔ３８１Ａ，Ｆ３８３Ａ）の導入 ｉｌｖＡ変異体（Ｔ３８１Ａ，Ｆ３８３Ａ）を野生型菌株に導入するために、配列番号４９及び配列番号５２（実施例５－１，表１６）のプライマーを作製した。

ｉｌｖＡ変異体（Ｔ３８１Ａ，Ｆ３８３Ａ）を導入した菌株を作製するために、ＣＪＩＬＥ－３０１菌株から抽出したプラスミドＤＮＡを鋳型とし、配列番号４９及び配列番号５２のプライマーを用いてＰＣＲを行った。

ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしては、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。ＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２分間の重合反応を２８サイクル行うものとした。

その結果、１３１１ｂｐのｉｌｖＡ遺伝子の約１００ｂｐのターミネーター部位を含む１４１１ｂｐの遺伝子断片がそれぞれ得られた。

ＰＣＲ精製キットを用いて増幅産物を精製し、ベクター作製のための挿入ＤＮＡ断片として用いた。精製した増幅産物を制限酵素ｓｍａＩで処理し、その後６５℃で２０分間熱処理したｐＤＣＭ２ベクターと、前記増幅産物である挿入ＤＮＡ断片のモル濃度（Ｍ）の比が１：２になるように、インフュージョンクローニングキットを用いて、提供されたマニュアルに従ってクローニングすることにより、Ｔ３８１Ａ、Ｆ３８３Ａ変異を染色体上に導入するためのベクターｐＤＣＭ２－Ｔ３８１Ａ＿Ｆ３８３Ａを作製した。

作製したベクターをエレクトロポレーションによりコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）に形質転換し、２次交差過程を経て、染色体上でｉｌｖＡ（Ｔ３８１Ａ，Ｆ３８３Ａ；配列番号５３）変異を含む菌株を得た。これをＣＡ１０－３１０１と命名した。

前記菌株ＣＡ１０－３１０１は、２０２０年５月２７日付けでブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託番号ＫＣＣＭ１２７３９Ｐとして国際寄託した。

イソロイシン生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに前記ＫＣＣＭ１２７３９Ｐ菌株を接種し、その後３２℃、２００ｒｐｍで６０時間振盪培養してＬ－イソロイシンを作製した。用いた生産培地の組成は次の通りである。 ＜生産培地＞ グルコース１０％，酵母抽出物０．２％，硫酸アンモニウム１．６％，リン酸二水素カリウム０．１％，硫酸マグネシウム７水和物０．１％，硫酸鉄７水和物１０ｍｇ／Ｌ，硫酸マンガン１水和物１０ｍｇ／Ｌ，ビオチン２００μｇ／Ｌ，ｐＨ７．２

培養終了後に、高性能液体クロマトグラフィー（high-performance liquid chromatography, HPLC）を用いて、培養液中のＬ－イソロイシン及びＬ－トレオニン濃度を測定した。その結果を表１７に示す。

表１７に示すように、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）は、Ｌ－イソロイシンを生産しないが、ＡＴＣＣ１３０３２ ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）ｉｌｖＡ（Ｔ３８１Ａ，Ｆ３８３Ａ）変異株は、３．９ｇ／Ｌの濃度でＬ－イソロイシンを生産し、親株に比べてＬ－イソロイシン生産性が大幅に向上することが確認された。

これらの結果から、ｉｌｖＡ（Ｔ３８１Ａ，Ｆ３８３Ａ）変異がイソロイシン生産増加に有効な変異であることが確認される。

参考例３：ｌｅｕＡ（Ｐ２４７Ｃ，Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）がロイシン生産に及ぼす効果の確認 参考例３－１．ＣＪＬ－８１００菌株の作製 特許文献１０に開示されているｌｅｕＡ遺伝子変異を含むｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）ベクターをコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２にエレクトロポレーションにより形質転換し、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有する培地から、相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株を選択した。選択した１次菌株は、さらに２次交差（cross-over）を経て、ｌｅｕＡ遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に形質転換した菌株に変異が導入されたか否かは、配列番号５５と配列番号５６のプライマーを用いてＰＣＲ（９４℃で５分間、その後９４℃で３０秒間／５５℃で３０秒間／７２℃で９０秒間を３０サイクル行い、次いで７２℃で５分間）を行い、塩基配列を分析することにより判断し、Ｒ５５８Ｈ、Ｇ５６１Ｄ変異が導入されたことが確認された。ｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）ベクターで形質転換されたＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡ＿（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）菌株を「ＣＪＬ－８１００」と命名した。

以下、参考例３で用いたプライマー配列を表１８に示す。

参考例３－２．ｌｅｕＡ変異を含む挿入ベクターの作製 ＬｅｕＡに２つの変異（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）を導入したＬ－ロイシン生産菌株であるＣＪＬ－８１００にＰ２４７Ｃ変異を導入するためのベクターを作製した。

ＣＪＬ－８１００菌株の染色体を鋳型とし、配列番号５７及び５８のプライマー対、配列番号５９及び６０のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で５分間の変性後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分３０秒間を３０サイクル行い、次いで７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。結果として得られたＰＣＲ産物をＳｍａＩ制限酵素で切断した線状のｐＤＣＭ２ベクターとＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ酵素を用いて、ＤＮＡ断片間の末端１５ ｂａｓｅの相同配列をｆｕｓｉｏｎさせてクローニングし、野生型菌株であるＬｅｕＡアミノ酸配列において５５８番目のアミノ酸であるアルギニンがヒスチジンに置換され、５６１番目のアミノ酸であるグリシンがアスパラギン酸に置換されたＬｅｕＡ変異体をコードするｌｅｕＡ変異を含み、ＬｅｕＡの２４７番目のアミノ酸であるプロリン（Ｐｒｏ）をシステイン（Ｃｙｓ）に置換するベクターｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｐ２４７Ｃ，Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）を作製した。

参考例３－３．ＣＪＬ－８１００菌株へのＬｅｕＡ変異体（Ｐ２４７Ｃ）の導入及び評価 Ｌ－ロイシン生産菌株であるＣＪＬ－８１００を参考例３－２で作製したｐＤＣＭ２－ｌｅｕＡ（Ｐ２４７Ｃ，Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）ベクターで形質転換し、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有する培地から、相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株を選択した。選択した１次菌株は、さらに２次交差（cross-over）を経て、目標遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に形質転換した菌株のｌｅｕＡ遺伝子変異が導入されたか否かは、配列番号５５と配列番号６１のプライマーを用いてＰＣＲ（９４℃で５分間、その後９４℃で３０秒間／５５℃で３０秒間／７２℃で９０秒間を３０サイクル行い、次いで７２℃で５分間）を行い、その後塩基配列を分析することにより判断した。塩基配列を分析したところ、菌株の染色体中のｌｅｕＡ遺伝子の１６７３番目のヌクレオチドであるＧがＡに置換され、１６８２番目、１６８３番目のヌクレオチドであるＧＣがＡＴに置換され、７３９番目、７４０番目のヌクレオチドであるＣＣがＴＧに置換され、ＬｅｕＡタンパク質の５５８番目のアミノ酸であるアルギニンがヒスチジンに置換され、５６１番目のアミノ酸であるグリシンがアスパラギン酸に置換され、２４７番目のアミノ酸であるプロリン（Ｐｒｏ）がシステイン（Ｃｙｓ）に置換されたＬｅｕＡ変異体（Ｐ２４７Ｃ，Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）をコードするｌｅｕＡ変異が菌株に導入されたことが確認された。

作製したＣＪＬ８１００＿ｌｅｕＡ＿Ｐ２４７Ｃを「ＣＡ１３－８１０５」と命名し、ブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM）に２０２０年４月２９日付けで寄託番号ＫＣＣＭ１２７０９Ｐとして寄託した。

前述した全３種の変異を含むＬｅｕＡ変異体（Ｐ２４７Ｃ，Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）のアミノ酸配列及びそれをコードするｌｅｕＡ変異体の塩基配列をそれぞれ配列番号６２及び配列番号６３に示す。

ＡＴＣＣ１３０３２、並びに作製したＣＪＬ－８１００及びＣＡ１３－８１０５菌株のＬ－ロイシンの生産能を評価した。具体的には、実施例２－１と同様にフラスコ培養を行い、培養終了後に、ＨＰＬＣを用いて親株及び変異菌株のＬ－ロイシン生産量を測定した。その結果を表１９に示す。

表１９に示すように、Ｌ－ロイシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪＬ８１００は、親株であるＡＴＣＣ１３０３２に比べて、Ｌ－ロイシン生産能が約１３０％向上した。ＣＪＬ８１００菌株にｌｅｕＡ＿Ｐ２４７Ｃ変異をさらに導入したＣＡ１３－８１０５菌株は、親株であるＣＪＬ８１００に比べて、Ｌ－ロイシン生産能が約１５０％向上した。

これらの結果から、ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ，Ｐ２４７Ｃ）変異がロイシン生産増加に有効な変異であることが確認される。

以上の説明から、本出願の属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。

Claims (13)

1. 配列番号１のアミノ酸配列においてＮ末端から２１７番目、３１０番目、４０３番目及び４６２番目の位置に相当するアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたａｒｏＧアルドラーゼ（Phospho-2-dehydro-3-deoxyheptonate aldolase）変異体。
2. 前記変異体は、配列番号１のアミノ酸配列においてＮ末端から２１７番目の位置に相当するアミノ酸のアルギニン以外のアミノ酸への置換、３１０番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のリシン以外のアミノ酸への置換、４０３番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のアルギニン以外のアミノ酸への置換、及び４６２番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のグルタミン酸以外のアミノ酸への置換の少なくとも１つの置換を含むものである、請求項１に記載のａｒｏＧアルドラーゼ（Phospho-2-dehydro-3-deoxyheptonate aldolase）変異体。
3. 前記他のアミノ酸への置換は、非極性（nonpolar）アミノ酸又はサイズの小さいアミノ酸への置換である、請求項１に記載のａｒｏＧアルドラーゼ変異体。
4. 前記他のアミノ酸はアラニン（Ａｌａ）である、請求項１に記載のａｒｏＧアルドラーゼ変異体。
5. 前記ａｒｏＧアルドラーゼ変異体は、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号２３又は配列番号２５と９９％以上の相同性又は同一性を有するものである、請求項１に記載のａｒｏＧアルドラーゼ変異体。
6. 前記ａｒｏＧアルドラーゼ変異体は、配列番号１のａｒｏＧアルドラーゼ変異体に比べて、弱化された活性を有するものである、請求項１に記載のａｒｏＧアルドラーゼ変異体。
7. 請求項１～６のいずれか一項に記載のａｒｏＧアルドラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド。
8. 請求項７に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
9. 請求項１～６のいずれか一項に記載のａｒｏＧアルドラーゼ変異体、前記ａｒｏＧアルドラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターの少なくとも１つを含むコリネバクテリウム属微生物。
10. 前記微生物はコリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項９に記載の微生物。
11. 請求項９に記載の微生物を培地で培養するステップを含む分枝鎖アミノ酸生産方法。
12. 前記方法は、分枝鎖アミノ酸を微生物又は培地から回収するステップをさらに含む、請求項１１に記載の分枝鎖アミノ酸生産方法。
13. 前記分枝鎖アミノ酸は、Ｌ－ロイシン、Ｌ－イソロイシン及びＬ－バリンから選択される少なくとも１つである、請求項１１に記載の分枝鎖アミノ酸生産方法。