RU2229514C2 - 3-дезокси-d-арабиногептулозонат-7-фосфатсинтаза и фрагмент днк, кодирующий 3-дезокси-d-арабиногептулозонат-7-фосфатсинтазу из methylophilus methylotrophus - Google Patents

3-дезокси-d-арабиногептулозонат-7-фосфатсинтаза и фрагмент днк, кодирующий 3-дезокси-d-арабиногептулозонат-7-фосфатсинтазу из methylophilus methylotrophus Download PDF

Info

Publication number
RU2229514C2
RU2229514C2 RU2000128122/13A RU2000128122A RU2229514C2 RU 2229514 C2 RU2229514 C2 RU 2229514C2 RU 2000128122/13 A RU2000128122/13 A RU 2000128122/13A RU 2000128122 A RU2000128122 A RU 2000128122A RU 2229514 C2 RU2229514 C2 RU 2229514C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
dna
arabinoheptulosonate
deoxy
phosphate synthase
amino acids
Prior art date
Application number
RU2000128122/13A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2000128122A (ru
Inventor
Юргис Антанас Владович Йомантас (RU)
Юргис Антанас Владович ЙОМАНТАС
Е.Г. Абалакина (RU)
Е.Г. Абалакина
Йосихиро УСУДА (JP)
Йосихиро УСУДА
Йосуке НИСИО (JP)
Йосуке НИСИО
Н.В. Горшкова (RU)
Н.В. Горшкова
Original Assignee
Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика"
Аджиномото Ко., Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to RU2000128122/13A priority Critical patent/RU2229514C2/ru
Application filed by Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика", Аджиномото Ко., Инк. filed Critical Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика"
Priority to PCT/JP2001/009926 priority patent/WO2002038777A2/en
Priority to KR1020077026858A priority patent/KR20070116187A/ko
Priority to EP01982771A priority patent/EP1334198A2/en
Priority to US10/416,021 priority patent/US20040091891A1/en
Priority to CNA018217486A priority patent/CN1527881A/zh
Priority to JP2002542092A priority patent/JP2004513636A/ja
Priority to BR0115275-0A priority patent/BR0115275A/pt
Priority to KR1020037006428A priority patent/KR100830860B1/ko
Publication of RU2000128122A publication Critical patent/RU2000128122A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2229514C2 publication Critical patent/RU2229514C2/ru

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90Isomerases (5.)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88Lyases (4.)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12YENZYMES
    • C12Y402/00Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/03Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on phosphates (4.2.3)
    • C12Y402/030043-Dehydroquinate synthase (4.2.3.4)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12YENZYMES
    • C12Y504/00Intramolecular transferases (5.4)
    • C12Y504/99Intramolecular transferases (5.4) transferring other groups (5.4.99)
    • C12Y504/99005Chorismate mutase (5.4.99.5)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к 3-дезокси-D-арабиногептулозонат-7-фосфатсинтазе и фрагменту ДНК, кодирующему этот фермент. 3-дезокси-D-арабиногептулозонат-7-фосфатсинтаза выделена из Methylophilus methylotrophus и может содержать замены, делеции, вставки или добавления одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности и при этом сохранять свою активность. Данный фермент играет ключевую роль в биосинтезе ароматических соединений, таких как L-фениламанил, L-тирозин и L-триптофан. Данное изобретение позволяет улучшить продуктивность L-аминокислот за счет усиления активности ферментов, вовлеченных в пути биосинтеза L-аминокислот. 2 с.п.ф-лы, 2 табл., 2 ил.

Description

Предпосылки создания изобретения
Область применения изобретения
Настоящее изобретение относится к биотехнологии, а именно к 3-дезокси-D-арабиногептулозонат-7-фосфатсинтазе, префенатдегидратазе и генам, кодирующим указанные ферменты. Указанные гены являются полезными для улучшения продуктивности ароматических аминокислот.
Описание предшествующих методов
В промышленном масштабе L-аминокислоты традиционно производились методом ферментации с использованием микроорганизмов, принадлежащих к родам Brevibacterium, Corynebacterium, Bacillus, Escherichia, Streptomyces, Pseudomonas, Arthrobactor, Serratia, Penicillium и Candida. Как сами эти микроорганизмы, так и штаммы, полученные из природных или мутантных микроорганизмов, использовались для улучшения продуктивности. Кроме того, были описаны различные методики получения рекомбинантных ДНК, использовавшихся для улучшения продуктивности L-аминокислот за счет усиления активности ферментов, вовлеченных в пути биосинтеза L-аминокислот.
И хотя продуктивность получения L-аминокислот была улучшена путем выведения вышеуказанных микроорганизмов или улучшения процесса получения, существует потребность в разработке более дешевых и эффективных процессов получения L-аминокислот для того, чтобы удовлетворить предполагаемую в будущем явно возрастающую потребность в L-аминокислотах.
Общеизвестны методы получения аминокислот методом ферментации с использованием метанола в качестве исходного материала, который является недорогим и может быть получен в большом количестве, применяя бактерии, принадлежащие к родам Achromobactor и Pseudomonas (см. выложенную патентную заявку Японии №45-25273). Protaminobactor (см. выложенную патентную заявку Японии №49-125590). Protaminohactor и Metanomonas (см. выложенную патентную заявку Японии №50-25790), Microcyclus (см. выложенную патентную заявку Японии №52-18886), Melhylobacillus (см. выложенную патентную заявку Японии №4-91793) и Bacillus (см. выложенную патентную заявку Японии №3-505284).
Кроме того, есть несколько ферментов, играющих центральную роль в биосинтезе ароматических соединений, таких как L-фениаланин, L-тирозин и L-триптофан. Ключевым ферментом является 3-дезокси-D-арабиногептулозонат-7-фосфатсинтаза (далее использовано сокращение "DS"). В биосинтезе L-фенилаланина префенатдегидратаза (далее использовано сокращение "PD") также является ключевым ферментом.
Однако ни один из генов, кодирующих DS и PD, из бактерии, принадлежащей к роду Methylophilus, известен не был.
Краткое описание изобретения
Объектом настоящего изобретения являются гены, кодирующие DS и PD, из бактерии, принадлежащей к роду Methylophilus.
Для того чтобы выявить вышеуказанные объекты, авторы настоящего изобретения провели тщательное исследование. В результате им удалось выделить из Methylophilus methylotrophus гены, кодирующие DS и PD, используя штамм Escherichia coli, дефицитный по гену хоризматмутаза-префенатдегиратазы (pheA), и тем самым совершить настоящее изобретение.
Таким образом, настоящее изобретение предоставляет:
1. Белок, характеризующийся одним из следующих свойств (А) и (В):
(A) белок, состоящий из аминокислот в последовательности, указанной в SEQ ID NO:2; или
(B) белок, состоящий из аминокислот в последовательности, включающей делеции, замены, вставки или добавления одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:2, и который обладает активностью 3-дезокси-D-арабиногептулозонат-7-фосфатсинтазы.
2. ДНК, кодирующую белок, характеризующийся одним из следующих свойств (А) и (В):
(A) белок, состоящий из аминокислот в последовательности, указанной в SEQ ID NO:2; или
(B) белок, состоящий из аминокислот в последовательности, включающей делеции, замены, вставки или добавления одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:2, и который обладает активностью 3-дезокси-D-арабиногептулозонат-7-фосфатсинтазы.
3. ДНК по п.2, которая является ДНК, характеризующейся одним из следующих свойств(а)и (b):
(a) ДНК, состоящая из нуклеотидов в последовательности, указанной в SEQ ID NO:1; или
(b) ДНК, которая гибридизуется с нуклеотидной последовательностью. указанной в SEQ ID NO:1, или с зондом, приготовленным из указанной последовательности, в жестких условиях и кодирует белок, обладающий активностью 3-дезокси-D-арабиногептулозонат-7-фосфатсинтазы.
4. ДНК по п.3, где жесткие условия являются такими условиями, в которых отмывка происходит при 60°С, а концентрация соли соответствует 1×SSC и 0.1% SDS.
5. Белок, характеризующийся одним из следующих свойств (С) и (D):
(C) белок, состоящий из аминокислот в последовательности, указанной в SEQ ID NO:4; или
(D) белок, состоящий из аминокислот в последовательности, включающей делеции, замены, вставки или добавления одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:4, и который обладает по крайней мере одной из активностей префенатдегидратазы или хоризматмутазы.
6. ДНК, кодирующую белок, характеризующийся одним из следующих свойств (С) и (D):
(C) белок, состоящий из аминокислот в последовательности, указанной в SEQ ID NO:4; или
(D) белок, состоящий из аминокислот в последовательности, включающей делеции, замены, вставки или добавлнения одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:2, и который обладает по крайней мере одной из активностей префенатдегидратазы или хоризматмутазы.
7. ДНК по п.6, которая является ДНК, характеризующейся одним из следующих свойств (с) и (d):
(c) ДНК, состоящая из нуклеотидов в последовательности, указанной в SEQ ID NO:3; или
(d) ДНК, которая гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, указанной в SEQ ID NO:3, или с зондом, приготовленным из указанной последовательности, в жестких условиях и кодирует белок, обладающий по крайней мере одной из активностей префенатдегидратазы или хоризматмутазы.
8. ДНК по п.7, где жесткие условия являются такими условиями, в которых отмывка происходит при 60°С, а концентрация соли соответствует 1×SSC и 0.1% SDS.
В настоящем изобретении термин “активность 3-дезокси-D-арабиногептулозонат-7-фосфатсинтазы” означает активность, которая катализирует реакцию синтеза 3-дезокси-D-арабиногептулозонат-7-фосфата из фосфоенолпирувата и D-эритроза-4-фосфата. Термин “активность префенатдегидратазы” означает активность, которая катализирует реакцию синтеза фенилпировиноградной кислоты из префеновой кислоты, термин “активность хоризматмутазы” означает активность, которая катализирует реакцию синтеза префеновой кислоты из хоризмовой кислоты. Предполагается, что PD, описанная в настоящем изобретении, обладает как активностью хоризматмутазы, так и активностью префенатдегидратазы, подобной другим микроорганизмам, таким как Escherichia coli. В настоящем изобретении термин “по крайней мере одна из активностей префенатдегидратазы или хоризматмутазы” означает одно или оба свойства, которыми обладает PD. Далее в настоящем изобретении термин “по крайней мере одна из активностей префенатдегидратазы или хоризматмутазы” может упоминаться как термин “активность PD”.
Далее настоящее изобретение будет объяснено подробнее.
ДНК согласно настоящему изобретению может быть получена из хромосомной ДНК М. Methylotrophus, как описано ниже.
Сначала приготавливается хромосомная ДНК из M. methylotrophus, например из штамма М. methylotrophus AS-1. Хромосомная ДНК может быть получена из клеточного осадка посредством, например, метода Saito и Miura (Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)) или метода K.S.Kirby (Biochem. J., 64, 405 (1956)).
Затем для выделения генов DS и PD из хромосомной ДНК, полученной таким образом, приготавливается библиотека ДНК. Сначала хромосомная ДНК частично расщепляется с помощью подходящих ферментов рестрикции для получения смеси разнообразных фрагментов. Широкий круг ферментов рестрикции может быть использован, если степень расщепления регулируется временем реакции расщепления или подобным образом. Например, ферментам Suu3AI или BamHI предоставляется возможность проведения реакции с хромосомной ДНК для ее расщепления при температуре не ниже 30°С, предпочтительно при 37°С при концентрации ферментов 1-10 единиц/мл в течение различных промежутков времени (от 1 минуты до 2 часов).
Впоследствии для приготовления рекомбинантной ДНК полученные фрагменты ДНК лигируются в ДНК вектор, автономно реплицирующийся в клетках бактерий, принадлежащих к роду Escherichia. Конкретнее, ферменту рестрикции, который создает концевые нуклеотидные последовательности, комплементарные последовательностям, созданным ферментом рестрикции Sau3AI, использованным для расщепления хромосомной ДНК, например BumHI, предоставляется возможность прореагировать с ДНК вектора для его разрезания в условиях, когда температура поддерживается не ниже 30°С и концентрация фермента 1-100 единиц/мл, предпочтительно в течение 1-3 часов для его полного расщепления. Затем смесь фрагментов хромосомной ДНК, полученная, как описано выше, смешивается с разрезанной ДНК вектора и подвергается действию ДНК лигазы, предпочтительно Т4 ДНК лигазы, в условиях, когда температура поддерживается в интервале 4-16°С при концентрации фермента 1-100 единиц/мл в течение не менее чем 1 час, предпочтительно в течение 4-24 часов для получения рекомбинантной ДНК.
Полученная рекомбинантная ДНК используется для трансформации микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, например, Escherichia coli В-7078 (pheA::Tn10(KmR)). Затем трансформанты помещаются на чашки с агаром, не содержащим фенилаланин, и полученные колонии переносятся в жидкую питательную среду и выращиваются. Для получения фрагмента ДНК, содержащего ген PD, из клеток выделяются плазмиды.
Содержит ли фрагмент ДНК, полученный описанным выше способом, ген PD или нет, подтверждается определением последовательности фрагмента и подтверждением, что полученная последовательность содержит последовательность, указанную в SEQ ID NO:3.
Было доказано, что клонированный фрагмент, содержащий ген PD, также содержит ген DS потому, что указанный фрагмент комплементирует ароматическую ауксотрофность штамма Е. coli AB3257 (aroG365-, aroH367-, aroF363-, thi-1, ilvC7, argE3, his-4, proA2, xyl-5 galK-2, lacYI, mtl-1, strA712, tfr3, tsx-358, supE44, hsdR2, zjj-202::Тn10), являющегося дефицитным по DS штаммом, и путем определения последовательности фрагмента.
В случае, когда для расщепления хромосомной ДНК штамма Methylophilus methylotropus AS-1 используется BamHI, гены DS и PD клонируются как BamHI-фрагмент размером около 10 kb.
Гены DS и PD из другой бактерии, принадлежащей к роду Melhylotropus, могут быть выделены методом, подобным описанному выше. Далее, поскольку нуклеотидная последовательность ДНК согласно настоящему изобретению выяснена, указанная ДНК может быть получена из хромосомной ДНК или геномной библиотеки бактерии, принадлежащей к роду Methylophilus, применяя ПЦР (полимеразную цепную реакцию) с использованием в качестве затравок олигонуклеотидов, синтезированных на основе установленной последовательности, или гибридизацией с использованием описанных выше олигонуклеотидов в качестве зонда.
Могут быть использованы обычные методы, хорошо известные лицу, имеющему опыт в приготовлении геномной ДНК, получении библиотеки геномной ДНК, гибридизации, ПЦР, получении ДНК плазмид, расщеплении и лигировании ДНК, трансформации. Указанные методики описаны в Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis Т. “Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
Нуклеотидная последовательность гена DS, полученного, как описано выше, приведена в SEQ ID NO:1 в Списке последовательностей. Кроме того, аминокислотная последовательность белка, который может кодироваться этой нуклеотидной последовательностью, приведена в SEQ ID NO:2.
Нуклеотидная последовательность гена PD, полученного, как описано выше, приведена в SEQ ID NO:3 в Списке последовательностей. Кроме того, аминокислотная последовательность белка, который может кодироваться этой нуклеотидной последовательностью, приведена в SEQ ID NO:4.
ДНК согласно настоящему изобретению может кодировать DS или PD, включающие замены, делеции, вставки, добавления или инверсии одной или нескольких аминокислот в одном или нескольких положениях при условии, что активность DS или PD, кодированных таким образом, не повреждается. Количество “несколько” в случае аминокислот различается в зависимости от положения или типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре белка. Это объясняется следующими причинами. А именно, некоторые аминокислоты, такие как изолейцин и валин, являются аминокислотами, обладающими высокой гомологией с другими аминокислотами. Различия в таких аминокислотах незначительно влияют на трехмерную структуру белка. Вследствие этого белком, кодируемым ДНК согласно настоящему изобретению, может быть белок, обладающий гомологией, не меньшей чем 35-50%, предпочтительно 50-70%, по отношению к исходным аминокислотным остаткам, составляющим DS или PD, и который обладает активностью DS или PD. Наиболее подходящим числом для “нескольких” аминокислот является от 2 до 30, предпочтительно от 2 до 20, наиболее предпочтительно от 2 до 10.
ДНК, кодирующая по существу такой же белок, как DS или PD, как описано выше, получается, например, такой модификацией нуклеотидной последовательности, к примеру, посредством метода сайт-направленного мутагенеза, что замена, делеция, вставка, добавление или инверсия затрагивают один или несколько аминокислотных остатков в определенном положении. Описанным выше модифицированная ДНК может быть получена известными, традиционными методами обработки с целью получения мутаций. Методы получения мутаций включают в себя метод обработки ДНК, кодирующей DS и PD, in vitro, например, гидроксиламином, и метод обработки микроорганизма, например бактерии, принадлежащей к роду Escherichia и содержащей ДНК, кодирующую DS и PD, УФ-облучением или мутагенным реагентом, таким как N-метил-N’-нитро-N-нитрозогуанидин (NTG) и азотистой кислотой, обычно используемым для обработки с целью получения мутаций.
Замена, делеция, вставка, добавление или инверсия нуклеотида, описанные выше, также включают мутации (мутанты или варианты), которые встречаются в природе, например, в виду индивидуальных различий или родовых и видовых различий микроорганизмов, содержащих DS и PD.
ДНК, кодирующая по существу такой же белок, как и DS и PD, выявляется при экспрессии ДНК, содержащей описанные выше мутации, в подходящей клетке и изучении активности DS и PD в экпрессированном продукте. ДНК, кодирующая по существу такой же белок, как и DS и PD, получается при выделении ДНК, которая гибридизуется с ДНК, имеющей, например, нуклеотидную последовательность, указанную в SEQ ID NO:1 в списке последовательностей, в жестких условиях, и кодирует белок, обладающий активностью DS и PD, среди содержащей мутации ДНК, кодирующей DS и PD, или клеток, содержащих такую ДНК. “Жесткими условиями”, упомянутыми здесь, являются условия, при которых образуется так называемый специфический гибрид, а неспецифический не образуется. Трудно четко указать эти условия с использованием численных значений. Однако, например, жесткими условиями являются условия, при которых ДНК с высокой гомологией, например ДНК с гомологией не менее 50%, гибридизуются друг с другом, а ДНК с гомологией ниже, чем указанная, не гибридизуются. С другой стороны, примером жестких условий являются условия, при которых ДНК гибридизуются друг с другом при концентрации солей, соответствующей обычным условиям отмывки при гибридизации по Саузерну, т.е. 60°С. 1×SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1×SSC, 0.1% SDS.
В число генов, которые гибридизуются в условиях, описанных выше, входят гены, содержащие стоп-кодон, расположенный в кодирующем участке гена, а также гены, кодирующие неактивный белок из-за мутаций в активном центре. Однако такие мутации могут быть легко исключены путем лигирования таких генов в коммерчески доступные экспрессирующие векторы и измерения активности DS и PD в соответствии с методами, описанными выше.
Примерами реципиентов для экспрессии генов DS и PD являются, например, бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, такая как Escherichia coli, коринеформная бактерия, такая как Brevibacterium lactofermentum, бактерия, принадлежащая к роду Methylophilus, такая как Methylophilus methylotropus, другие разнообразные эукариоты, такие как Saccharomyces cerevisiae, клетки животных и растений, предпочтительно прокариоты, в частности Е.coli, коринеформные бактерии и М. methylotropus.
В число векторов, которые используются для введения гена DS или PD в Е. coli, входят, например, pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219 и pMW218. Фаговые ДНК векторы также могут быть использованы.
В число векторов, которые могут быть использованы для введения гена DS или PD в коринеформные бактерии, входят, например, рМА330 (см. выложенную патентную заявку Японии №58-67699), рНМ1519 (см. выложенную патентную заявку Японии №58-77895), pAJ655, pAJ611 и рАJ1844 (см. выложенную патентную заявку Японии №58-192900), pCG1 (см. выложенную патентную заявку Японии №57-134500), pCG2 (см. выложенную патентную заявку Японии №58-35197), pCG4 и pCG11 (см. выложенную патентную заявку Японии №57-183799), рНК4 (см. выложенную патентную заявку Японии №5-7491).
Введение гена DS и PD может быть осуществлено трансформацией реципиента, описанного выше, рекомбинантным вектором, полученным введением гена DS или PD в описанный выше вектор. Ген DS или PD может быть встроен в геном реципиента в соответствии с методом, основанным на использовании трансдукции, транспозонов (Berg, D.E. and Berg, C.M. Bio/Technol., 1, 417 (1983)), фага Мu (выложенная патентная заявка Японии №2-109985) или путем гомологичной рекомбинации (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)).
Белки DS и PD могут быть получены при выращивании клетки, в которую ген DS или PD введен в соответствии с описанным выше методом, продукции и накоплении DS или PD в питательной среде, сборе из среды. Питательная среда для выращивания может быть подобрана в соответствии с использованным здесь реципиентом.
Белки DS и PD, полученные описанным выше методом, если необходимо, могут быть выделены из клеточного экстракта или среды с помощью стандартных методов выделения ферментов, таких как ионообменная хроматография, гель-фильтрация, абсорбционная хроматография, осаждение из раствора и им подобные.
Микроорганизм, обладающий более высокой активностью DS или PD, чем исходный, может быть получен при использовании ДНК согласно настоящему изобретению. Это может быть осуществлено при трансформации микроорганизма вектором, содержащим ген DS или PD в экспрессирующей форме.
В число бактерий, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, входят, например, Methylophilus methylotropus AS1 (NCIMB10515) или подобные. Methylophilus methylotropus AS1 (NCIMB10515) может быть предоставлена из Национальной коллекции промышленных и морских бактерий, NCIMB Lts., Torry Research Station 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom.
Для улучшения продуктивности ароматических аминокислот, особенно L-фенилаланина, предпочтительна амплификация генов, кодирующих ферменты DS и PD.
Краткое описание рисунков.
На фиг.1 приведена схема конструкции плазмид pPD1 и pPD2, содержащих гены DS и PD.
На фиг.2 показан комплементационный анализ плазмид, полученных после удаления фрагмента ДНК из М. methylotropus, содержащего гены DS и PD.
Лучший способ осуществления изобретения
BamHI фрагмент ДНК размером 10 kb, содержащий префенатдегидратазу и DAHP-синтазу из М. methylotropus, был клонирован в малокопийный вектор pMW119 (АрR) в ходе экспериментов по клонированию (shot-gun) по комплементации мутации в реципиенте (фиг.1). В ходе этих экспериментов хромосомная ДНК из М. methylotropus AS-1 была расщеплена с помощью BamHI и полученные фрагменты ДНК были лигированы с использованием Т4 ДНК лигазы с продуктом расщепления рестриктазой BamHI плазмиды pMW119. Продукт лигирования был использован для трансформации штамма Е.coli B-7078 (pheA::Tn10(KmR)). Среди клонов, устойчивых к ампициллину, были отобраны штаммы, в которых исчезла ауксотрофность по фенилаланину, и из этих штаммов были выделены рекомбинантные плазмиды. Одна из полученных плазмид была названа pPD1. Плазмида с обратной ориентацией клонированного в pPD1 фрагмента была названа pPD2.
Плазмиды pPD1 и pPD2 комплементировали к прототрофности не только мутации pheA- в штамме Е.coli В-7078, но и также DS-минус в штамме Е.coli AB3257 (aroG-, аrоH-, aroF-). Таким образом предполагалось, что обе плазмиды pPD1 и pPD2 несли гены, кодирующие PD и DS, в одном и том же клонированном фрагменте ДНК.
Были сконструированы производные плазмид pPD1 и pPD2, содержащие делеции (фиг.2), Делеции производились in vitro расщеплением ДНК плазмиды с помощью различных ферментов рестрикции с последующим лигированием полученных ДНК фрагментов. Смеси после лигирования использовались для трансформации PD-минус штамма Е. coli В-7078 (pheA::Tn10(kan)), чтобы получить Phe+ прототрофность. Выделенные плазмиды были картированы и проверены на способность комплементировать DS-минус в штамме Е. coli AB3257 (aroG-, аrоH-, aroF-), чтобы получить Аrо+ прототрофность. Производные, содержащие делецию, различались по структуре и комплементационной способности. Были найдены производные, несущие только один ген, кодирующий фермент PD. Такие производные, содержащие делецию, теряли способность комплементировать DS-минус в штамме Е.coli AB3257 (aroG-, аrоH-, aroF-), чтобы получить прототрофность.
Таким образом предполагалось, что клонированный в pPD1 и pPD2 ДНК фрагмент из М. methylotropus содержал два различных гена, кодирующих ферменты DS и PD соответственно.
Последовательности нуклеотидов двух генов из M. methylotropus, кодирующих ферменты DS и PD, были определены. Нуклеотидная последовательность гена DS и последовательность аминокислот, кодируемая этой нуклеотидной последовательностью, показаны в SEQ ID NO:1. Нуклеотидная последовательность гена PD и последовательность аминокислот, кодируемая этой нуклеотидной последовательностью, показаны в SEQ ID NO:3.
Нуклеотидные последовательности генов из M. methylotropus, кодирующих DS и PD, были проанализированы и охарактеризованы с помощью компьютерных программ. Последовательности генов DS и PD после трансляции были в значительной степени подобны аминокислотным последовательностям белков с теми же функциями из многих других микроорганизмов (таблицы 1, 2).
Figure 00000002
Figure 00000003
Figure 00000004
Figure 00000005
Figure 00000006
Figure 00000007
Figure 00000008

Claims (2)

1. 3-дезокси-D-арабиногептулозонат-7-фосфатсинтаза из Methylophilus methylotrophus, содержащая последовательность аминокислот: (А) приведенную в последовательности, указанной в SEQ ID NO:2; или (В) включающую делеции, замены, вставки или добавления одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:2, и обладающую активностью 3-дезокси-D-арабиногептулозонат-7-фосфатсинтазы.
2. Фрагмент ДНК, кодирующий 3-дезокси-D-арабиногептулозонат-7-фосфатсинтазу по п.1, содержащий последовательность нуклеотидов, указанную в списке последовательностей под номером SEQ ID NO:1, или гибридизующийся в жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, указанной в списке последовательностей под номером SEQ ID NO:1, или зондом, приготовленным из указанной последовательности, где жесткими являются условия, при которых отмывка происходит при 60°С, а концентрация соли соответствует 1×SSC и 0,1% SDS.
RU2000128122/13A 2000-11-13 2000-11-13 3-дезокси-d-арабиногептулозонат-7-фосфатсинтаза и фрагмент днк, кодирующий 3-дезокси-d-арабиногептулозонат-7-фосфатсинтазу из methylophilus methylotrophus RU2229514C2 (ru)

Priority Applications (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2000128122/13A RU2229514C2 (ru) 2000-11-13 2000-11-13 3-дезокси-d-арабиногептулозонат-7-фосфатсинтаза и фрагмент днк, кодирующий 3-дезокси-d-арабиногептулозонат-7-фосфатсинтазу из methylophilus methylotrophus
KR1020077026858A KR20070116187A (ko) 2000-11-13 2001-11-13 메틸로필루스 메틸로트로푸스로부터 유도된 신규한 효소 및이를 암호화하는 유전자
EP01982771A EP1334198A2 (en) 2000-11-13 2001-11-13 Enzymes and encoding genes from methylophilus methylotrophus
US10/416,021 US20040091891A1 (en) 2000-11-13 2001-11-13 Novel enzymes and genes coding for the same derived from methylophilus methylotrophus
PCT/JP2001/009926 WO2002038777A2 (en) 2000-11-13 2001-11-13 Enzymes and encoding genes from methylophilus methylotrophus
CNA018217486A CN1527881A (zh) 2000-11-13 2001-11-13 来自食甲基嗜甲基菌的新的酶及其编码基因
JP2002542092A JP2004513636A (ja) 2000-11-13 2001-11-13 メチロフィラス・メチロトロファスの新規酵素及び遺伝子
BR0115275-0A BR0115275A (pt) 2000-11-13 2001-11-13 Proteìna e dna
KR1020037006428A KR100830860B1 (ko) 2000-11-13 2001-11-13 메틸로필루스 메틸로트로푸스로부터 유도된 신규한 효소및 이를 암호화하는 유전자

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2000128122/13A RU2229514C2 (ru) 2000-11-13 2000-11-13 3-дезокси-d-арабиногептулозонат-7-фосфатсинтаза и фрагмент днк, кодирующий 3-дезокси-d-арабиногептулозонат-7-фосфатсинтазу из methylophilus methylotrophus

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2000128122A RU2000128122A (ru) 2002-11-10
RU2229514C2 true RU2229514C2 (ru) 2004-05-27

Family

ID=20241938

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2000128122/13A RU2229514C2 (ru) 2000-11-13 2000-11-13 3-дезокси-d-арабиногептулозонат-7-фосфатсинтаза и фрагмент днк, кодирующий 3-дезокси-d-арабиногептулозонат-7-фосфатсинтазу из methylophilus methylotrophus

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20040091891A1 (ru)
EP (1) EP1334198A2 (ru)
JP (1) JP2004513636A (ru)
KR (2) KR20070116187A (ru)
CN (1) CN1527881A (ru)
BR (1) BR0115275A (ru)
RU (1) RU2229514C2 (ru)
WO (1) WO2002038777A2 (ru)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6911332B2 (en) 2002-06-12 2005-06-28 Ajinomoto Co., Inc. Isolated polynucleotides encoding d-arabino-3-hexulose-6-phosphate synthases from Methylophilus methylotrophus
US20060019356A1 (en) * 2003-02-28 2006-01-26 Yoshihiro Usuda Polynucleotides encoding polypeptides involved in intermediates metabolism of the central metabolic pathway in Methylophilus methylotrophus
US7026149B2 (en) 2003-02-28 2006-04-11 Ajinomoto Co., Inc. Polynucleotides encoding polypeptides involved in the stress response to environmental changes in Methylophilus methylotrophus
US7060475B2 (en) * 2003-02-28 2006-06-13 Ajinomoto Co., Inc. Polynucleotides encoding polypeptides involved in intermediates metabolism of central metabolic pathway in methylophilus methylotrophus
US7029893B2 (en) 2003-02-28 2006-04-18 Ajinomoto Co., Inc. Polynucleotides encoding polypeptides involved in amino acid biosynthesis in methylophilus methylotrophus
JP2009089603A (ja) * 2006-02-02 2009-04-30 Ajinomoto Co Inc メタノール資化性細菌を用いたl−リジンの製造法
JP2009153382A (ja) * 2006-03-30 2009-07-16 Ajinomoto Co Inc メタノール資化性細菌を用いたカルボン酸の製造法
JP2020513790A (ja) 2017-02-06 2020-05-21 ザイマージェン インコーポレイテッド 発酵によりチラミンを生成させるための遺伝子操作型生合成経路
KR102495918B1 (ko) * 2021-01-26 2023-02-06 씨제이제일제당 주식회사 aroG 알돌라아제 (Phospho-2-dehydro-3-deoxyheptonate aldolase) 변이체 및 이를 이용한 분지쇄 아미노산 생산 방법

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0077196A3 (en) * 1981-10-09 1984-06-06 Genex Corporation Aromatic amino acid-producing microorganisms
KR940011838B1 (ko) * 1991-09-12 1994-12-26 주식회사 미원 유전자 조작 미생물 발효에 의한 l-페닐알라닌의 제조방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ЩЕЛКУНОВ С.Н. Конструирование гибридных молекул ДНК, Новосибирск, "Наука", 1987, стр.164. *

Also Published As

Publication number Publication date
US20040091891A1 (en) 2004-05-13
WO2002038777A2 (en) 2002-05-16
KR100830860B1 (ko) 2008-05-21
KR20070116187A (ko) 2007-12-06
BR0115275A (pt) 2003-08-12
KR20030048140A (ko) 2003-06-18
EP1334198A2 (en) 2003-08-13
JP2004513636A (ja) 2004-05-13
CN1527881A (zh) 2004-09-08
WO2002038777A3 (en) 2003-03-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100420743B1 (ko) 신규한리신데카복실라제유전자및l-리신의제조방법
CN110869504A (zh) 来自谷氨酸棒状杆菌的启动子及其在调节辅助基因表达中的用途
US20070202571A1 (en) Method for microbial production of amino acids of the spartate and/or glutamate family and agents which can be used in said method
US6461852B1 (en) Dihydrodipicolinate synthase from Bacillus methanolicus
RU2229514C2 (ru) 3-дезокси-d-арабиногептулозонат-7-фосфатсинтаза и фрагмент днк, кодирующий 3-дезокси-d-арабиногептулозонат-7-фосфатсинтазу из methylophilus methylotrophus
CN111411092A (zh) 高产l-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌及其应用
KR20200130567A (ko) L-아미노산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산을 생산하는 방법
US7329523B2 (en) Phosphoserine phosphatase of coryneform bacteria and variants thereof
US20230332116A1 (en) Polypeptide with aspartate kinase activity and use thereof in production of amino acid
JP4495788B2 (ja) 温度感受性dtsR遺伝子
RU2250261C1 (ru) ПРЕФЕНАТДЕГИДРАТАЗА-ХОРИЗМАТМУТАЗА И ФРАГМЕНТ ДНК, КОДИРУЮЩИЙ ПРЕФЕНАТДЕГИДРАТАЗУ-ХОРИЗМАТМУТАЗУ, ИЗ БАКТЕРИИ Methylophilus methylotrophus
KR20100124793A (ko) 재조합 미생물 및 l-리신을 생산하는 방법
KR102233376B1 (ko) 메조 디아미노피멜레이트 디하이드로게네이즈 변이형 폴리펩타이드 및 이를 이용한 l-쓰레오닌 생산방법
CN116888141A (zh) Glxr蛋白变体或使用其生产苏氨酸的方法
EP0984066B1 (en) Activator for methanol dehydrogenase and gene thereof
AU2020426558A1 (en) Novel Modified Polypeptide With Attenuated Activity Of Citrate Synthase And Method For Producing L-Amino Acid Using The Same
RU2821918C1 (ru) Полипептид с аспартаткиназной активностью и его применение для получения аминокислоты
EP1059358B1 (en) Penicillin binding protein gene and process for producing l-glutamic acid
CN114921435B (zh) 鸟氨酸乙酰转移酶突变体、编码基因、质粒、基因工程菌及应用
JP5860287B2 (ja) L−アミノ酸の製造法
JP4655374B2 (ja) コリネ型細菌のホスホセリンホスファターゼ遺伝子
US7732176B2 (en) Nucleotide sequences that encode deregulated phosphoglycerate dehydrogenases of coryneform bacteria and method for producing L-serine
CN115916980A (zh) 生产天冬氨酸和甲硫氨酸的嗜氢菌属细菌的转化体
WO2022049116A1 (en) Microorganism and method for the improved production of alanine
CN115820706A (zh) 半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶突变体及其在制备l-赖氨酸中的应用