CN115916980A

CN115916980A - 生产天冬氨酸和甲硫氨酸的嗜氢菌属细菌的转化体

Info

Publication number: CN115916980A
Application number: CN202180043078.XA
Authority: CN
Inventors: 笠井信幸; 末冈英明; 汤川英明; 大谷直人
Original assignee: Co2 Resource Utilization Research Institute Co ltd; Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Co2 Resource Utilization Research Institute Co ltd; Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 2020-06-17
Filing date: 2021-06-16
Publication date: 2023-04-04
Also published as: EP4170033A1; JPWO2021256511A1; WO2021256511A1

Abstract

本发明提供通过将天冬氨酸脱氢酶基因导入嗜氢菌属细菌中而得到的转化体。

Description

生产天冬氨酸和甲硫氨酸的嗜氢菌属细菌的转化体

技术领域

本专利申请基于日本专利申请2020-104487号（2020年6月17日申请）和日本专利申请2020-169550号（2020年10月7日申请）主张巴黎条约的优先权和利益，在此通过引用将上述申请中记载的全部内容并入本说明书中。

本发明涉及具有生产天冬氨酸和/或甲硫氨酸的能力的嗜氢菌属细菌的转化体、以及使用该转化体的天冬氨酸和/或甲硫氨酸的制造方法。

背景技术

2015年采用的巴黎协定规定了迅速削减世界整体的温室效应气体的排放量。据此，日本目标是直到2030年将二氧化碳和甲烷等温室气体排放量从2013年削减26%。现在，世界范围内化学品制造的大半依赖于石油原料，存在温室效应气体的排放量增大的问题。因此，要求化学品制造的脱石油化，各国都在积极地进行由生物质制造绿色化学品的生物精炼的研究开发。然而，为了将作为微生物发酵原料的生物质转化为糖类，需要复杂的步骤，存在成本高的问题。作为脱石油化研究的一环，二氧化碳、甲烷、一氧化碳等气体作为具有更高可持续性的碳原料受到关注，人们对使用利用这些气体的微生物来制造有价值的化学品和生物燃料的技术寄予了关注。特别是，高度期待固定并有效利用对温室化贡献率高的二氧化碳。

天冬氨酸是作为阿斯巴甜甜味剂、生物降解性聚合物等的原料使用的有用氨基酸，甲硫氨酸是作为医药品、饲料添加物等各种化学产品・化学制品的原料使用的有用氨基酸。使用目前使用的石油原料的工业方法中，天冬氨酸主要使用天冬酶由富马酸生产，该富马酸作为石油的分馏产物通过化学合成生产。甲硫氨酸是改良液化石油气（LPG）等生成二氧化碳而生产的。

另一方面，已经提出了使用基因重组微生物制造天冬氨酸和甲硫氨酸的方法。例如，提出了利用向大肠杆菌等肠杆菌科细菌或酵母中导入外源性天冬氨酸脱氢酶基因而得的转化体来制造天冬氨酸的方法(专利文献1和2)。但是，这些方法与在微生物的增殖・培养中使用二氧化碳的本发明不同，微生物的增殖・培养需要高成本的糖类。进而，这些方法在应对温室化方面的贡献并不充分。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第5846122号

专利文献2：WO 2017/083683。

发明内容

发明要解决的课题

本发明的解决课题是提供能够利用二氧化碳作为唯一的碳源来制造天冬氨酸和/或甲硫氨酸的转化体，并使用该转化体制造天冬氨酸和甲硫氨酸。

用于解决课题的手段

为了应对糖类等的高原料成本和上述温室效应对策等，作为能够以工业规模固定二氧化碳的微生物，本发明人等着眼于嗜氢菌属细菌。该细菌具有催化由草酰乙酸生成天冬氨酸的反应的酶，但是需要谷氨酸作为底物。因此，为了在工业规模上赋予生成天冬氨酸和由其衍生的代谢产物即甲硫氨酸的能力，需要导入由来自无机盐的氨基生成天冬氨酸的反应的酶的基因来替代谷氨酸。另一方面，本发明人等发现，即使使用在嗜氢菌属细菌内发挥功能的载体将异源基因导入嗜氢菌属细菌中，也多是不表达发挥功能的蛋白或者不充分表达的情形。另外，还明确了即使是在嗜氢菌属细菌以外的细菌内表达的基因，在嗜氢菌属细菌内不表达或者不充分表达的情况也多。

在这样的状况下，本发明人等反复深入研究，对预测为各种微生物基因组中存在的天冬氨酸脱氢酶基因的基因（以下，称为天冬氨酸脱氢酶基因）的DNA、用于将这些DNA导入到嗜氢菌属细菌中的载体构建等进行了研究，结果发现，如果将后述来自特定微生物的天冬氨酸脱氢酶基因的DNA导入嗜氢菌属细菌中，则可以有效地生成天冬氨酸和/或甲硫氨酸。此外，还发现导入前述DNA而得的转化体能够使用二氧化碳作为唯一的碳源而有效地生成天冬氨酸和/或甲硫氨酸。

本发明基于上述见解而完成且如下所述。

［1］转化体，其通过将天冬氨酸脱氢酶基因导入嗜氢菌属细菌中而得到。

［2］根据［1］所述的转化体，其中，所述天冬氨酸脱氢酶基因是选自下述（1）～（6）的任一项中的DNA：

（1）由SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ IDNO: 11、或SEQ ID NO: 12的碱基序列组成的DNA、

（2）由与SEQ ID NO: 1～12中的任一者具有90%以上的同一性的碱基序列组成且编码具有天冬氨酸脱氢酶活性的多肽的DNA、

（3）与由和SEQ ID NO: 1～12的任一者互补的碱基序列组成的DNA在严格条件下杂交且编码具有天冬氨酸脱氢酶活性的多肽的DNA、

（4）编码由SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO: 26、或SEQ ID NO: 27的氨基酸序列组成的多肽的DNA、

（5）编码由与SEQ ID NO: 16～27中的任一者具有90%以上的同一性的氨基酸序列组成且具有天冬氨酸脱氢酶活性的多肽的DNA、和

（6）编码由SEQ ID NO: 16～27中任一者的氨基酸序列中缺失、替换或添加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成且具有天冬氨酸脱氢酶活性的多肽的DNA。

［3］根据［1］或［2］所述的转化体，其中，所述天冬氨酸脱氢酶基因是选自下述（1）～（6）的任一者中的DNA：

（1）由SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、或SEQ ID NO: 11的碱基序列的DNA、

（2）由与SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、或SEQ ID NO: 11具有90%以上的同一性的碱基序列组成且编码具有天冬氨酸脱氢酶活性的多肽的DNA、

（3）与由和SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、或SEQ ID NO: 11互补的碱基序列组成的DNA在严格条件下杂交且编码具有天冬氨酸脱氢酶活性的多肽的DNA、

（4）编码由SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、或SEQ ID NO: 26的氨基酸序列组成的多肽的DNA、

（5）编码由与SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、或SEQ ID NO: 26具有90%以上的同一性的氨基酸序列组成且具有天冬氨酸脱氢酶活性的多肽的DNA、和

（6）编码由SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、或SEQ ID NO: 26的氨基酸序列中缺失、替换或添加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成且具有天冬氨酸脱氢酶活性的多肽的DNA。

［4］根据［1］～［3］中任一项所述的转化体，其中，所述嗜氢菌属细菌是热叶绿体嗜氢菌。

［5］根据［4］所述的转化体，其中，所述热叶绿体嗜氢菌是热叶绿体嗜氢菌TH-1C菌株。

［6］天冬氨酸的制造方法，其包括使用二氧化碳作为实质上唯一的碳源来培养［1］～［5］中任一项所述的转化体的步骤。

［7］甲硫氨酸的制造方法，其包括使用二氧化碳作为实质上唯一的碳源来培养［1］～［5］中任一项所述的转化体的步骤。

发明效果

根据本发明，通过将上述天冬氨酸脱氢酶基因导入嗜氢菌属细菌中，可以在嗜氢菌属细菌内发挥功能，生成天冬氨酸和/或由其衍生的代谢产物甲硫氨酸。

具体实施方式

（1）具有生成天冬氨酸和/或甲硫氨酸的能力的转化体

首先，本发明提供通过将天冬氨酸脱氢酶基因导入嗜氢菌属细菌中而得到的转化体。本发明的转化体具有天冬氨酸脱氢酶活性，籍此可利用二氧化碳作为唯一的碳源而有效地生成天冬氨酸和/或由其衍生的代谢产物甲硫氨酸。即，本发明的转化体的特征在于，能够直接固定二氧化碳并以工业规模生成作为各种化学制品的基础的天冬氨酸和/或甲硫氨酸。

本发明中导入的天冬氨酸脱氢酶（以下，本说明书中也称为“AspDH”）基因只要能够在所导入的嗜氢菌属细菌内发挥天冬氨酸脱氢酶活性，则可以是任何来源的天冬氨酸脱氢酶基因。作为本发明中使用的天冬氨酸脱氢酶基因，可以使用自然界存在的菌中分离的天冬氨酸脱氢酶基因的DNA，或者也可以是采用本领域技术人员公知的方法人工合成的DNA。此外，本发明中使用的天冬氨酸脱氢酶基因可以是来自迄今为止已知的各种生物的天冬氨酸脱氢酶基因的DNA，或者也可以是对它们进行了遗传学改变的DNA。本发明中使用的天冬氨酸脱氢酶基因并不一定鉴定为天冬氨酸脱氢酶基因，也可以是编码具有天冬氨酸脱氢酶活性的多肽的氨基酸序列的DNA。这里，天冬氨酸脱氢酶活性是指由草酰乙酸和氨（NH₃）生成天冬氨酸的酶活性。

作为本发明中导入的天冬氨酸脱氢酶基因，可以是由例如来自临时嗜热菌（Candidatus Hydrothermae bacterium）的天冬氨酸脱氢酶基因的碱基序列（SEQ ID NO:1）、来自栖冰菌（Glaciecola sp.）33A的天冬氨酸脱氢酶基因的碱基序列（SEQ ID NO: 2）、来自中间根瘤菌（Mesorhizobium sp.）M7D.F.Ca.US.005.01.1.1的天冬氨酸脱氢酶基因的碱基序列（SEQ ID NO: 3）、来自红螺菌（Rhodospirillaceae bacterium）的天冬氨酸脱氢酶基因的碱基序列（SEQ ID NO: 4）、来自科赫芽胞杆菌（Bacillus kochii）的天冬氨酸脱氢酶基因的碱基序列（SEQ ID NO: 5）、来自玫瑰色新鞘氨醇菌（Novosphingobium rosa）的天冬氨酸脱氢酶基因的碱基序列（SEQ ID NO: 6）、来自闪烁古生球菌（Archaeoglobusfulgidus）的天冬氨酸脱氢酶基因的碱基序列（SEQ ID NO: 7）、来自节杆菌（Arthrobactersp.）161MFSha2.1的天冬氨酸脱氢酶基因的碱基序列（SEQ ID NO: 8）、来自特里恩斯海洋袍菌（Oceanotoga teriensis）的天冬氨酸脱氢酶基因的碱基序列（SEQ ID NO: 9）、来自海袍菌（Marinitoga sp.）1155的天冬氨酸脱氢酶基因的碱基序列（SEQ ID NO: 10）、来自热袍菌（Thermotogales bacterium）46_20的天冬氨酸脱氢酶基因的碱基序列（SEQ ID NO:11）、或来自海栖热袍菌（Thermotoga maritima）的天冬氨酸脱氢酶基因的碱基序列（SEQID NO: 12）组成的DNA等。

本发明中使用的天冬氨酸脱氢酶基因也可以是由与SEQ ID NO: 1～12中的任一者具有20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、或99%以上的同一性的碱基序列组成且编码具有天冬氨酸脱氢酶活性的多肽的DNA。本发明中使用的天冬氨酸脱氢酶基因优选为由与SEQ ID NO: 3、8、9、或11具有90%以上的同一性的碱基序列组成且编码具有天冬氨酸脱氢酶活性的多肽的DNA。本发明中，碱基序列的同一性可以使用本领域技术人员公知的方法进行调查，例如可以使用GENETYX ver.17（株式会社Genetics制）算出。

此外，本发明中使用的天冬氨酸脱氢酶基因还可以是与由和SEQ ID NO: 1～12的任一者互补的碱基序列组成的DNA在严格条件下杂交且编码具有天冬氨酸脱氢酶活性的多肽的DNA。这里，“严格条件”是指例如在6×SSC的盐浓度的杂交溶液中，在50～60℃的温度条件下进行16小时杂交，在0.1×SSC的盐浓度的溶液中进行洗涤的条件。本发明中的“在严格条件下杂交”包括形成特异性的杂交体，例如具有60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、98%以上、或99%以上的同源性的杂交体，且不形成非特异性杂交体，例如具有前述以下的同源性的杂交体。

作为本发明中导入的天冬氨酸脱氢酶基因，从天冬氨酸和/或甲硫氨酸生成效率良好的观点出发，优选为来自临时嗜热菌、栖冰菌33A、中间根瘤菌M7D.F.Ca.US.005.01.1.1、红螺菌、科赫芽胞杆菌、玫瑰色新鞘氨醇菌、闪烁古生球菌、节杆菌161MFSha2.1、特里恩斯海洋袍菌、海袍菌1155、热袍菌 46_20、或海栖热袍菌的天冬氨酸脱氢酶基因，更优选为来自中间根瘤菌M7D.F.Ca.US.005.01.1.1、节杆菌161MFSha2.1、特里恩斯海洋袍菌、或热袍菌 46_20的天冬氨酸脱氢酶基因。来自除海栖热袍菌和闪烁古生球菌的前述各种菌的天冬氨酸脱氢酶基因的碱基序列（SEQ ID NO: 1～6、8～11）是、从前述各种菌的基因组序列预测的相当于编码天冬氨酸脱氢酶的DNA的序列，因为由它们所编码的氨基酸序列（SEQ ID NO: 16～21、23～26）与在其它微生物中确认了活性的天冬氨酸脱氢酶的氨基酸序列的同源性最大为约50%这样的非常低，因此实际上并不能容易地预测本发明的转化体具有天冬氨酸脱氢酶活性。

此外，本发明中使用的天冬氨酸脱氢酶基因还可以是编码由来自临时嗜热菌的天冬氨酸脱氢酶的氨基酸序列（SEQ ID NO: 16）、来自栖冰菌33A的天冬氨酸脱氢酶的氨基酸序列（SEQ ID NO: 17）、来自中间根瘤菌M7D.F.Ca.US.005.01.1.1的天冬氨酸脱氢酶的氨基酸序列（SEQ ID NO: 18）、来自红螺菌的天冬氨酸脱氢酶的氨基酸序列（SEQ ID NO:19）、来自科赫芽胞杆菌的天冬氨酸脱氢酶的氨基酸序列（SEQ ID NO: 20）、来自玫瑰色新鞘氨醇菌的天冬氨酸脱氢酶的氨基酸序列（SEQ ID NO: 21）、来自闪烁古生球菌的天冬氨酸脱氢酶的氨基酸序列（SEQ ID NO: 22）、来自节杆菌161MFSha2.1的天冬氨酸脱氢酶的氨基酸序列（SEQ ID NO: 23）、来自特里恩斯海洋袍菌的天冬氨酸脱氢酶的氨基酸序列（SEQID NO: 24）、来自海袍菌1155的天冬氨酸脱氢酶的氨基酸序列（SEQ ID NO: 25）、来自热袍菌46_20的天冬氨酸脱氢酶的氨基酸序列（SEQ ID NO: 26）、或来自海栖热袍菌的天冬氨酸脱氢酶的氨基酸序列（SEQ ID NO: 27）组成的多肽的DNA。

进一步，本发明中使用的天冬氨酸脱氢酶基因还可以是编码由与SEQ ID NO: 16～27中的任一者具有20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、或99%以上的同一性的氨基酸序列组成且具有天冬氨酸脱氢酶活性的多肽的DNA。本发明中使用的天冬氨酸脱氢酶基因优选为编码由与SEQ ID NO: 18、23、24、或26具有90%以上的同一性的氨基酸序列组成且具有天冬氨酸脱氢酶活性的多肽的DNA。本发明中，氨基酸序列的同一性可以使用本领域技术人员公知的方法进行调查，例如可以使用GENETYX ver.17（株式会社Genetics制）算出。

此外，本发明中使用的天冬氨酸脱氢酶基因可以使用编码由SEQ ID NO: 16～27中任一者的氨基酸序列中缺失、替换或添加1个或多个的氨基酸而成的氨基酸序列组成且具有天冬氨酸脱氢酶活性的多肽的DNA。作为本发明中的多个，可举出例如1～5个、1～4个、1～3个、1～2个、或1个。

作为本发明中导入的天冬氨酸脱氢酶基因，从天冬氨酸和/或甲硫氨酸生成效率良好的观点出发，优选为编码由来自临时嗜热菌、栖冰菌33A、中间根瘤菌M7D.F.Ca.US.005.01.1.1、红螺菌、科赫芽胞杆菌、玫瑰色新鞘氨醇菌、闪烁古生球菌、节杆菌161MFSha2.1、特里恩斯海洋袍菌、海袍菌1155、热袍菌 46_20、或海栖热袍菌的天冬氨酸脱氢酶的氨基酸序列（SEQ ID NO: 16～27）组成的多肽的DNA，更优选为编码由来自中间根瘤菌M7D.F.Ca.US.005.01.1.1、节杆菌161MFSha2.1、特里恩斯海洋袍菌、或热袍菌 46_20的天冬氨酸脱氢酶的氨基酸序列（SEQ ID NO: 18、23、24、或26）组成的多肽的DNA。

本发明中的天冬氨酸脱氢酶活性可以由本领域技术人员使用常规方法测定确定。天冬氨酸脱氢酶活性可以通过例如在NADH存在下使所得的多肽与草酰乙酸反应，检测340nm的吸光度来确认。天冬氨酸脱氢酶由草酰乙酸生成天冬氨酸。由于天冬氨酸脱氢酶由草酰乙酸生成天冬氨酸时消耗NADH，因此也可以以340nm的吸光度减少为指标来检测NADH量的减少。若被检多肽使340nm的吸光度有哪怕一点点减少，则可以确定具有天冬氨酸脱氢酶活性。

（2）转化体的制造方法

接着，对将天冬氨酸脱氢酶基因导入嗜氢菌属细菌中得到转化体的方法进行说明。首先，本发明中导入天冬氨酸脱氢酶基因的嗜氢菌属细菌没有特别限定，可以是从自然界分离得到的细菌，或者也可以是从自然界分离得到的细菌经遗传学改变而能够高度表达导入的天冬氨酸脱氢酶基因的细菌。前述改变可以通过除去嗜氢菌属细菌中的内源性质粒等来实现。本发明中可使用的除去（熟化）内源性质粒的方法可以是本领域公知的方法，例如，可以使用利用化学物质的方法（例如，利用新生霉素、SDS、吖啶黄素和溴化乙啶等的方法）、利用质粒不相容性（Plasmid incompatibility）的方法（例如，导入与内源性质粒具有相同复制起点的质粒来实现不稳定化的方法、破坏质粒稳定分配系统（plasmid partitionsystem）相关因子来实现不稳定化的方法）等，但并不限定于此。

作为本发明中可使用的嗜氢菌属细菌，可举出例如，热叶绿体嗜氢菌（Hydrogenophilus thermoluteolus）、盐杆嗜氢菌（Hydrogenophilus halorhabdus）、脱氮嗜氢菌（Hydrogenophilus denitrificans）、赫氏嗜氢菌（Hydrogenophilus hirschii）、冰岛嗜氢菌（Hydrogenophilus islandicus）、和嗜氢菌属细菌Mar3菌株（Hydrogenophilussp. Mar3），尤其优选作为碳酸固定微生物的具有高生育速度和碳酸固定能力的热叶绿体嗜氢菌，特别优选热叶绿体嗜氢菌TH-1（NBRC 14978）菌株。热叶绿体嗜氢菌TH-1菌株显示作为碳酸固定微生物的最高生育速度（1小时增殖2倍）（Agricultural and BiologicalChemistry, 41, 685-690 (1977)）。热叶绿体嗜氢菌TH-1（NBRC 14978）菌株已在布达佩斯条约下进行国际保藏。进一步，作为本发明中使用的菌株，最优选为热叶绿体嗜氢菌TH-1C菌株，该菌株可以基于本说明书中记载的实施例制备。

用于制造本发明的转化体的天冬氨酸脱氢酶基因向嗜氢菌属细菌中的导入可以使用本领域中用于将外来基因导入细菌中常规方法来进行。本发明中的天冬氨酸脱氢酶基因向嗜氢菌属细菌中的导入也可以通过将天冬氨酸脱氢酶基因直接导入嗜氢菌属细菌中来进行，或者也可以通过整合到用于转化的载体（例如，质粒载体、病毒载体、粘粒、F黏粒(fosmid)、BAC、和YAC等），并将整合的载体导入嗜氢菌属细菌中来进行。本发明的导入中所用的载体只要是包含具有在嗜氢菌属细菌内自主复制的功能的DNA的载体，则可以是通常使用的载体，例如，可以是作为广宿主载体的pRK415（GenBank: EF437940.1）、pBHR1（GenBank: Y14439.1）、pMMB67EH（ATCC 37622）、pCAR1（NCBI参考序列: NC_004444.1）、pC194（NCBI参考序列: NC_002013.1）、pK18mobsacB（GenBank: FJ437239.1）、pUB110（NCBI参考序列: NC_001384.1）、或将这些载体进行遗传学改变而得的载体（例如，pCAMO-4）。本发明的导入中可使用的载体优选为pCAMO-4，本领域技术人员可以依照下述实施例制备该载体。此外，作为本发明中使用的载体所含的启动子，可举出例如，tac启动子、lac启动子、trc启动子和Oxford Genetics公司OXB1、OXB11～OXB20的各种启动子等，作为优选的终止子，可举出大肠杆菌rRNA操纵子的rrnB T1T2终止子、噬菌体λt0转录终止子和T7终止子等。本发明中使用的用于将天冬氨酸脱氢酶基因导入（转化）嗜氢菌属细菌中的方法，可以使用能够导入前述载体以使其能够在嗜氢菌属细菌内自主复制的常规方法，可举出例如，氯化钙法、磷酸钙法、DEAE葡聚糖介导的转染法、和电脉冲法（电穿孔法）等。

（3）天冬氨酸和/或甲硫氨酸的制造方法

在进一步的方式中，本发明提供使用本说明书中记载的转化体的天冬氨酸和/或甲硫氨酸的制造方法。本发明的方法包括使用二氧化碳作为实质上唯一的碳源来培养本说明书中记载的转化体的步骤。本发明的方法中的培养步骤可以包括一边供给含有氢、氧和二氧化碳的混合气体，一边使用无机培养基或有机培养基来培养转化体。所供给的气体优选设为包含氢、氧和二氧化碳的混合气体，但也可以在能够有效生成天冬氨酸和/或甲硫氨酸的范围内混入有异种气体。

本发明的方法中使用的转化体的嗜氢菌属细菌能够以氢为能量源，以二氧化碳为唯一的碳源进行生长，因此，特别是通过实质上仅使用二氧化碳（特别是仅使用二氧化碳）作为碳源来制造上述化合物，可以有效地固定二氧化碳。所以，本发明的方法中，优选使用不含有机物、碳酸盐等碳源的无机培养基，即，实质上仅以二氧化碳为碳源（特别仅以二氧化碳为碳源）来进行培养。本发明中的“使用二氧化碳作为实质上唯一的碳源”包括混入不可避免的量的其它碳源的情况。应予说明，本发明的方法也可以不供给二氧化碳而使用包含糖、有机酸、氨基酸等有机物、碳酸盐的培养基。本发明的方法中使用的培养基的pH优选为6.2～8、更优选为6.4～7.4、进一步更优选为6.6～7。只要是该范围，则菌的生长和混合气体在培养基中的溶解性高，可以高效地制造天冬氨酸和/或甲硫氨酸。本发明的方法中，在采用分批培养的情况中，可以将混合气体封入密闭的培养容器中进行静置培养或振荡培养，在采用连续培养的情况中，可以在将混合气体连续供给至密闭的培养容器的同时进行振荡培养，或者在使用密闭的培养容器并通过鼓泡将混合气体导入培养基内的同时对转化体进行培养。本发明的方法中，从改善混合气体在培养基中的溶解的观点出发，优选振荡培养。本发明的方法中使用的供给气体中的氢、氧、二氧化碳的容量比（氢：氧：二氧化碳）优选为1.75～7.5：1：0.25～3、更优选为5～7.5：1：1～2、进一步更优选为6.25～7.5：1：1.5。只要是该范围，则菌的生长良好，可以有效地制造目标化合物。本发明的方法中可使用的混合气体或原料气体的供给速度，相对于每1L培养基为10.5～60L/小时，优选为10.5～40L/小时，更优选为10.5～21L/小时。只要是该范围，则转化体的生长良好，可以有效地制造目标化合物，同时可抑制混合气体的浪费。本发明的方法中使用的培养温度优选为35～55℃，更优选为37～52℃，进一步更优选为50～52℃。只要是该范围，则转化体的生长良好，可以有效地制造天冬氨酸和/或甲硫氨酸。

本发明的方法中，通过如上所述地进行培养，在培养液中生成天冬氨酸和/或甲硫氨酸。通过回收培养液，可以回收天冬氨酸和/或甲硫氨酸，进一步地，天冬氨酸和/或甲硫氨酸还可以通过公知方法从培养液中分离。作为这样的公知方法，可举出沉淀法、蒸馏法、色谱法和电透析法等。

实施例

接着，参照实施例进一步说明本发明。本发明的技术范围并不受以下实施例限定。

质粒载体(pCAMO-4)的构建

以下说明AspDH基因的导入中使用的质粒载体(pCAMO-4)的构建方法。

(1) tac启动子的DNA片段的

为了以New England Biolabs公司制质粒pMAL-c5X为模板扩增tac启动子的DNA片段，合成并使用了下述的一对引物。PCR使用Life Technologies公司制的“DNA Thermalcycler”，使用KOD FX Neo(东洋纺株式会社制)作为反应试剂，通过常法进行。

tac启动子扩增用引物

另外，引物(a-1)中如下划线所示添加有SmaI限制酶切位点。

将上述生成的反应液中的2 μL用1% 琼脂糖凝胶进行电泳，检测出相当于tac启动子的约0.3 kbp的DNA片段。

(2) 多克隆区的DNA片段的制备

为了制备多克隆区的DNA片段，分别合成下述的一对引物并用于PCR，以制作其前半部分和后半部分。PCR使用Life Technologies公司制的“DNA Thermal cycler”，使用KODFX Neo(东洋纺株式会社制)作为反应试剂，通过常法进行。实际上，是在不包含模板DNA的情形下各对引物的3’侧彼此退火延伸，形成双链DNA的反应。

用于制备多克隆区前半部分的引物

引物(a-2)和(b-2)的3’侧的碱基序列相互互补。

用于制备多克隆区后半部分的引物

引物(a-3)和(b-3)的3’侧的碱基序列相互互补。

将上述生成的反应液20 μL用1% 琼脂糖凝胶进行电泳，检测出相当于多克隆区前半和后半部分的各自约0.1 kbp的DNA片段。由琼脂糖凝胶切出各DNA片段，通过将凝胶冷冻・解冻，从凝胶中回收DNA。以回收的相当于多克隆区前半和后半部分的DNA片段为模板，进行重叠延伸PCR。另外，扩增该模板DNA片段时使用的引物(b-2)和(a-3)的5’侧的碱基序列相互互补。在进行重叠延伸PCR时，为了制作多克隆区的DNA，使用上述(a-2)与(b-3)的引物的组合。PCR使用Life Technologies公司制的“DNA Thermal cycler”，使用KOD FX Neo(东洋纺株式会社制)作为反应试剂，通过常法进行。

将上述生成的反应液中的2 μL用1% 琼脂糖凝胶进行电泳，检测出相当于多克隆区的约0.2 kbp的DNA片段。

(3) rrnB终止子和pUC19的复制起始区连接而成的DNA片段的制备

为了以New England Biolabs公司制质粒pMAL-c5X为模板扩增rrnB终止子的DNA片段，合成并使用了下述的一对引物。

rrnB终止子扩增用引物

为了以质粒pUC19为模板扩增DNA复制起始区的DNA片段，合成并使用了下述的一对引物。

pUC19的DNA复制起始区扩增用引物

PCR使用Life Technologies公司制的“DNA Thermal cycler”，使用KOD FX Neo(东洋纺株式会社制)作为反应试剂，通过常法进行。将生成的各反应液20 μL用1% 琼脂糖凝胶进行电泳，在rrnB终止子的情况中检测出约0.3 kbp的DNA片段，在pUC19的DNA复制起始区的情况中检测出约0.8 kbp的DNA片段。由琼脂糖凝胶切出各DNA片段，通过将凝胶冷冻・解冻，从凝胶中回收DNA。以回收的相当于rrnB终止子、pUC19的DNA复制起始区的DNA片段为模板，进行重叠延伸PCR。另外，扩增该模板DNA片段时使用的引物(b-4)和(a-5)的5’侧的碱基序列相互互补。在进行重叠延伸PCR时，为了制作rrnB终止子和pUC19的复制起始区连接而成的DNA片段，使用了上述(a-4)与(b-5)的引物的组合。PCR使用Life Technologies公司制的“DNA Thermal cycler”，使用KOD FX Neo(东洋纺株式会社制)作为反应试剂，通过常法进行。

将上述生成的反应液2 μL用1%琼脂糖凝胶进行电泳，检测出相当于rrnB终止子和pUC19的复制起始区连接而成的DNA的约1.0 kbp的DNA片段。

(4) 新霉素/卡那霉素抗性基因的DNA片段的制备

为了以pK18mobsacB [GenBank: FJ437239.1; Gene, 145, 69-73 (1994)]为模板扩增新霉素/卡那霉素耐性基因（以下，有时称为“nptII基因”）的DNA片段，合成并使用了下述的一对引物。PCR使用Life Technologies公司制的“DNA Thermal cycler”，使用KODFX Neo(东洋纺株式会社制)作为反应试剂，通过常法进行。

nptII基因扩增用引物

另外，引物(b-6)中如下划线所示添加有SmaI限制酶切位点。

将上述生成的反应液中的2 μL用1% 琼脂糖凝胶进行电泳，检测出相当于nptII基因的约1.0 kbp的DNA片段。

(5) 连接(1)至(4)的DNA片段而成的环状质粒的构建

上述(1)至(4)中制备的DNA片段中，(1)的DNA片段的末端与(4)和(2)的DNA片段的末端，(2)的DNA片段的末端与(1)和(3)的DNA片段的末端，(3)的DNA片段的末端与(2)和(4)的DNA片段的末端，(4)的DNA片段的末端与(3)和(1)的DNA片段的末端具有16 bp的同源序列。因此，通过Gibson Assembly可以将(1)、(2)、(3)、(4)的DNA片段连接成环状DNA的状态。为了将(1)至(4)中制备的DNA片段连接形成环状DNA，使用New England Biolabs公司制Master Mix，进行Gibson Assembly。使用所得反应液，通过氯化钙法转化大肠杆菌JM109，涂布于包含卡那霉素50 μg/mL的LB琼脂培养基上。将培养基上的生长株用常法进行液体培养，从培养液提取质粒DNA，将该质粒用限制酶SmaI切断并进行确认。结果，观察到相当于(1)至(4)中制备的DNA片段连接而形成一条DNA的大小的约2.3 kbp的DNA片段。

将在大肠杆菌中复制的该环状质粒DNA命名为pCAMO-1。

(6) 质粒载体(pCAMO-4)的构建

将热叶绿体嗜氢菌(Hydrogenophilus thermoluteolus) TH-1菌株(NBRC 14978)用铂环接种到加入有A液体培养基〔将(NH₄)₂SO₄ 3.0 g、KH₂PO₄ 1.0 g、K₂HPO₄ 2.0 g、NaCl0.25 g、FeSO₄・7H₂O 0.014 g、MgSO₄・7H₂O 0.5 g、CaCl₂ 0.03 g、MoO₃ 4.0 mg、ZnSO₄・7H₂O28 mg、CuSO₄・5H₂O 2.0 mg、H₃BO₃ 4.0 mg、MnSO₄・5H₂O 4.0 mg、CoCl₂・6H₂O 4.0 mg溶解于蒸馏水1 L(pH 7.0)中〕5 mL的试管中，在试管中封入H₂:O₂:CO₂＝7.5:1:1.5的混合气体，在50℃下振荡培养，通过作为常法的碱SDS法，由培养液制备内源性质粒pTH1 [MicrobiolResour Announc. 2018 Aug 16;7(6)]。

将制备的约66 kbp的pTH1用限制酶ScaI和PvuII切断，将上述制作的质粒pCAMO-1用限制酶SmaI切断，使用T4 DNA连接酶 (TAKARA BIO株式会社制)使其相互结合。

用所得的连接液，通过电脉冲法（电穿孔法）转化热叶绿体嗜氢菌 TH-1菌株，涂布于含有卡那霉素50 μg/mL的A固体培养基〔将(NH₄)₂SO₄ 3.0 g、KH₂PO₄ 1.0 g、K₂HPO₄ 2.0g、NaCl 0.25 g、FeSO₄・7H₂O 0.014 g、MgSO₄・7H₂O 0.5 g、CaCl₂ 0.03 g、MoO₃ 4.0 mg、ZnSO₄・7H₂O 28 mg、CuSO₄・5H₂O 2.0 mg、H₃BO₃ 4.0 mg、MnSO₄・5H₂O 4.0 mg、CoCl₂・6H₂O 4.0mg、琼脂 15 g溶解于蒸馏水1 L(pH 7.0)中〕上，在封入有H₂:O₂:CO₂＝7.5:1:1.5的混合气体的腔室内在50℃下进行60小时培养。将A固体培养基上生长的7株使用铂环接种到加入有包含卡那霉素50 μg/mL的A液体培养基 5 mL的试管中，在试管中封入H₂:O₂:CO₂＝7.5:1:1.5的混合气体，在50℃下振荡培养，从培养液中提取质粒DNA，用1% 琼脂糖凝胶进行电泳。结果，确认到所有7株均为相同的约5.5 kbp的质粒DNA。

为了以提取的质粒为模板扩增在pCAMO-1的SmaI限制酶切位点插入的内源性质粒pTH1的DNA片段，合成并使用了相当于pCAMO-1的SmaI限制酶切位点两侧的下述的一对引物。PCR使用Life Technologies公司制的“DNA Thermal cycler”，使用KOD FX Neo(东洋纺株式会社制)作为反应试剂，通过常法进行。

插入的pTH1的DNA片段扩增用引物

将上述生成的反应液中的2 μL用1% 琼脂糖凝胶进行电泳，检测出约3.2 kbp的DNA片段。即，所得质粒中，pCAMO-1质粒的SmaI限制酶切位点插入了作为pTH1的一部分的约3.2 kbp的DNA片段。由于该约3.2 kbp的DNA片段中包含在热叶绿体嗜氢菌细胞内发挥功能的复制起始区，因此所得的质粒在热叶绿体嗜氢菌细胞内复制。

将构建的质粒命名为pCAMO-4，作为用于向热叶绿体嗜氢菌中导入基因的质粒载体来使用。

具有生成天冬氨酸和甲硫氨酸的能力的转化体

天冬氨酸脱氢酶基因的克隆

委托Eurofin Genomics株式会社合成了由来自如下所述选择的各菌的天冬氨酸脱氢酶基因的碱基序列组成的DNA（临时嗜热菌（SEQ ID NO: 1）、栖冰菌33A（SEQ ID NO:2）、中间根瘤菌 M7D.F.Ca.US.005.01.1.1（SEQ ID NO: 3）、红螺菌（SEQ ID NO: 4）、临时埃氏古菌(Candidatus Altiarchaeales archaeon)IMC4（SEQ ID NO: 13）、科赫芽胞杆菌（SEQ ID NO: 5）、玫瑰色新鞘氨醇菌（SEQ ID NO: 6）、黄尖木米亚菌（Mumia flava）（SEQID NO: 14）、闪烁古生球菌（SEQ ID NO: 7）、节杆菌161MFSha2.1（SEQ ID NO: 8）、特里恩斯海洋袍菌（SEQ ID NO: 9）、海袍菌1155（SEQ ID NO: 10）、热袍菌（SEQ ID NO: 11）、海栖热袍菌（SEQ ID NO: 12）、和热黄拟无枝酸菌(Amycolatopsis thermoflava)（SEQ ID NO:15））。

以海栖热袍菌的AspDH基因的氨基酸序列（SEQ ID NO: 27）为询问进行blast检索（数据库：NCBI），选择被推定为来自14种菌的AspDH基因的序列。对迄今为止非专利文献中报道的AspDH的氨基酸序列、和专利文献中记载的氨基酸序列（数据库：dgene）进行blast检索，求出与收集的氨基酸序列的同源性。结果，这些氨基酸序列除了闪烁古生球菌之外仅确认到约50%左右的非常低的同源性。因此，具有来自临时嗜热菌（SEQ ID NO: 16）、栖冰菌33A（SEQ ID NO: 17）、中间根瘤菌 M7D.F.Ca.US.005.01.1.1（SEQ ID NO: 18）、红螺菌（SEQ ID NO: 19）、科赫芽胞杆菌（SEQ ID NO: 20）、玫瑰色新鞘氨醇菌（SEQ ID NO: 21）、节杆菌161MFSha2.1（SEQ ID NO: 23）、特里恩斯海洋袍菌（SEQ ID NO: 24）、海袍菌1155（SEQ ID NO: 25）和热袍菌（SEQ ID NO: 26）的氨基酸序列的多肽具有AspDH活性是并不清楚的。

AspDH基因的表达质粒的构建

将克隆有AspDH的合成基因的质粒用限制酶NdeI和NotI切断后，用1% 琼脂糖凝胶进行电泳。从琼脂糖凝胶切出相当于AspDH合成基因的DNA片段，通过将凝胶冷冻・解冻，从凝胶中回收AspDH合成基因的DNA片段。

将质粒载体pCAMO-4用限制酶NdeI和NotI切断，使用T4 DNA连接酶(TAKARA BIO株式会社制)使其与上述合成的AspDH合成基因的DNA片段相互结合。将热叶绿体嗜氢菌 TH-1菌株用常法除去内源性质粒，得到熟化株（TH-1C菌株）。

用所得连接液，通过电脉冲法（电穿孔法）转化热叶绿体嗜氢菌TH-1C菌株，涂布于包含卡那霉素 50 μg/mL的A固体培养基上，在封入有H₂:O₂:CO₂＝7.5:1:1.5的混合气体的腔室内在50℃下进行60小时培养。

将A固体培养基上的各生长菌株使用铂环接种到加入有包含卡那霉素 50 μg/mL的A液体培养基 5 mL的试管中，在试管中封入H₂:O₂:CO₂＝7.5:1:1.5的混合气体，在50℃下振荡培养，从培养液中提取质粒DNA。将各质粒用限制酶NdeI和NotI切断，确认插入片段。结果，除了质粒pCAMO-4的约5.5 kbp的DNA片段之外，确认到相当于AspDH基因的长度约0.8kbp的插入片段。包含来自各种菌的AspDH基因的质粒和转化了该质粒的热叶绿体嗜氢菌TH-1C菌株如下述表1所示命名。

天冬氨酸和甲硫氨酸生成

使用铂环将如上所述制备的热叶绿体嗜氢菌的天冬氨酸脱氢酶基因导入菌株接种于包含卡那霉素 50 μg/mL的A液体培养基中，在培养过程中供给H₂:O₂:CO₂=7.5:1:1.5的混合气体，在50℃下振荡培养72～96小时。培养后，对通过离心分离（4℃、15,000 rpm、1分钟）得到的培养上清的天冬氨酸和甲硫氨酸进行定量，结果如表1所示那样在培养基上清中生成了天冬氨酸和甲硫氨酸。

[表1]

如表1所示，热叶绿体嗜氢菌的来自各种菌的本发明的天冬氨酸脱氢酶基因导入菌株中，培养的结果，天冬氨酸的浓度为0.9～137.8 μM，甲硫氨酸的浓度为0.9～10.3 μM，与对照菌株（不含来自本发明的种菌之外的菌（AspDH005、008、015）和AspDH基因的菌株（pCAMO-4/TH-1C））相比，显示具有极高的天冬氨酸和甲硫氨酸生成能力。

此外，本说明书中记载的所有菌株（包括ATCC菌株和NBRC菌株）均是在布达佩斯条约下进行了国际保藏的，或是由任何人均可无条件地获得分享的机关所拥有，或是有市售，或是本领域技术人员可基于本说明书制备，且是公众可利用的。

产业实用性

本发明的转化体能够以二氧化碳为唯一的碳源而高效地生成天冬氨酸和/或甲硫氨酸，因此可以解决二氧化碳的增加所致的地球温室化，同时能够在工业上高效地制造化学制品。即，本发明中所用的嗜氢菌属细菌在具有二氧化碳固定能力的生物中由于具有特别优异的二氧化碳固定能力，因此如果使用本发明的转化体，则能够以工业规模固定二氧化碳而制造天冬氨酸和/或甲硫氨酸。进一步，由于天冬氨酸和/或甲硫氨酸成为阿斯巴甜甜味剂、生物降解性聚合物、饲料添加物、和医药品等各种化学产品・化学制品的原料，根据本发明，能够不使用高成本的糖类、成为温室化问题的石油原料等而仅利用二氧化碳作为碳源，在工业上生产以它们为原料的制品。

序列表

<110> 住友化学株式会社（SUMITOMO CHEMICAL COMPANY, LIMITED）

株式会社CO2资源化研究所（Utilization of Carbon Dioxide InstituteCo., Ltd）

<120> 生产天冬氨酸和甲硫氨酸的嗜氢菌属细菌的转化体

<130> S44264WO01

<150> JP2020-104487

<151> 2020-06-17

<150> JP2020-169550

<151> 2020-10-07

<160> 44

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 783

<212> DNA

<213> 临时嗜热菌（Candidatus Hydrothermae bacterium）

<400> 1

atgagagcag ggattattgg atgtggagcc atcggatcat tccttgccag agaaatcgac 60

agaggcaatg tggctcacat gaaacttgtt gcactgtttg atatagattt aaataaggta 120

tataaacttg tggagtcttt agaacataag cctcaaatag ctgatagttt tgagaaattt 180

ttaaaattac ccgtggattt tgtaatagag gcagcctccc agcaggcagt ttttcagtat 240

gcagaaaaaa tcttaaagca aaaaaaaccg cttcttctta tgagtgcagg tgctcttgca 300

gatgatagat taagagaaaa attatttcgg gtggctcggg aaaataatac caaaatttat 360

attccctctg gtgccattgc ggggcttgac ggcctcaagg caatgagcaa tgtgagactt 420

caccgtgcaa gactcactac acgaaaatcc ccctctgcat tgggggttaa aacggagaag 480

cctgttgtgg ttttctcagg gaatgcccat gaagcagcca aaagatatcc ccaaaatatt 540

aatgttgcga ttgcatttgg tctggctgct catgccatag atatcctcca ggtagagatt 600

gtagctgacc caggagtttc aaggaatata cacacaatag aagtagaggg ggaggctgga 660

aaactggaaa ttacactgga aaattttccc ttcccggaca atccaaaaac aagttttctc 720

gcagcacttt ctgctcttca ggtgttaaaa aatatagcat ccaatgtagt aattggaggt 780

taa 783

<210> 2

<211> 792

<212> DNA

<213> 栖冰菌（Glaciecola sp.） 33A

<400> 2

atgattaaaa ttggcctaat aggctttggt gcaatcggtc ggtgtgtgat cgaaacactc 60

cccaaagcgt taactgaaga atatgaagtt atcggtatcc taactagaaa agctgctgac 120

aattgggtga ataatattcc ctcttatagc gatatagacc agttacttgc aaaacaaccc 180

gacattattg tcgaatgtgc gggtcatcat gcggttaaag aatatggttg taaaatatta 240

gaagccaata tatcactcgt tatatcatcc attggtgcct tagctgatag tgttttatat 300

caacaactta aagattcatc tacggctagt aaggcaaaaa tatatctgcc ggctggcgcc 360

attggtggta ttgatgccct tgttgccgca aaacttggcg ggattcacga tgtcacttat 420

accatgcgaa agcctcccaa ggcttggcaa ggttcggttg ctgagacggt ggttgacttg 480

aatagtctta agcaggcaac cgttattttt tctggctctg ccggtgaagc agcaacactt 540

taccctaaaa acaccaatgt aactgcaacc attgcgttag cgggattagg ttttgatgag 600

acaaaagtag aattaattgc agatcccaac attattgaca atatacacga aatatcggta 660

tccggtgaaa cagggtattt taccattgta ttaaaaggaa aaccctctgt gtataaccca 720

aaaacttcag cattaacggc ttttagtgtc actaagtgcg ttgctgattt tggctcatcg 780

atcattattt aa 792

<210> 3

<211> 777

<212> DNA

<213> 中间根瘤菌（Mesorhizobium sp.） M7D.F.Ca.US.005.01.1.1

<400> 3

atggtcacgc tcggcctcat cgggttcggc acgatctcgc gcgcgatcgt ctccgctttc 60

ccaccggact cgtgtcgctg ggtggcgctg atgcgcgaag gcgcccgccc cgcactgccg 120

gcgaacgtca gcactgtcac gcagcttgac gcgctgatca gtgcgcgtcc aagcacggtg 180

gtcgaggcgg caagtcagga agcagtggcc gcctacgtgc ccgcgcttct cgacgccggc 240

atcccgacca tcatcgcttc gatcggtgcg ttctccgatc cgatacttgc cgcccggtta 300

accgatgctt cgcgcaacag cggcgcgcgc ttggtcctgc cgtcaggcgc gttgggcggc 360

ctcgactatc tcagggcgat agcggcactt cccgatgcac gggtgcgcta tacctcgcgc 420

aagccgccgg cagcctggaa agccgagctt gccactcttg gcctatccgc cgagcacgat 480

gcggtatcgc tcttcgaggg cacgcccgcg caagcggcaa aactctatcc gaaaaacctc 540

aacgccgcct tcgccgtggc gctcgcggca ggcatcgaca aagtcaccgt gagcgtggtt 600

gccgatccga aaactaccgg caacacgcac gagatcgagg tcgagagcac cgccggcacc 660

gcctccttcc gcctcgtcaa cgcgccctcg cccagcaatc cgaagacctc gatgctcacg 720

gcgctcagcc tcgtcgcggc gcttagcgag ttgctcgaca gggagggctg tcactga 777

<210> 4

<211> 801

<212> DNA

<213> 红螺菌（Rhodospirillaceae bacterium）

<400> 4

atgttgaata taggattatt aggattagga gcaattggtt cagatgtttt aaatatggtg 60

cgagaagaat tttccaacca aatccagata ccagccgttt tagtcaaacg cccccgcaaa 120

gaaaaactta tgggccattc attaatcacc aatgattttg aggagttttt tagtaaagaa 180

caagacattg ttctagaagt agctggccac tcgactgtgc ggcattatgg agaacgcata 240

ttgaaatctg gagttgacct tatggtaacg tccgttggag ctttcactga tgatactcta 300

tataaaagat gcatcaaagc agccacaaca tctggttcac gtctaattat cccatctgca 360

ggaatcggct ctctggatac tttgtcagcc gccgcagtag gcggtttaga ttccgtgcac 420

atgatagtca gaaaagatcc aacagcttgg tacggaacac atgctgaaaa tttatttgat 480

cttgctgcac taaaaaaacc caccataatt tttgagggta gcccgaggga aggagccgct 540

ctgtatccac aaaacgttaa tatttcagcc gctgtatctc tagcaggtat gggcctcgat 600

aaaacaagat taacgattat cgctgataca gaaattgaca ctcacgtctg tgagattcac 660

gccaatggcg ccttcggaag ttataccttt agagaagatt taacagtcgc cgaaactaac 720

cgaaaaactg gtaaaatcgt tgccatggct gttatgaaaa caatacgcca aatggttagc 780

ccagtgttaa taggcgtttg a 801

<210> 5

<211> 783

<212> DNA

<213> 科赫芽胞杆菌（Bacillus kochii）

<400> 5

atgaagctgg gattaatagg tggaggaaat atcggaaaat ttttgctaca atctatcaat 60

agcgataaat tggtagatgg cgcacaattc gttggattgt atacaagaaa tcaagagaaa 120

gcaaatgagc tggctgaaga gtatgatttg cgaagctacc aatcaatcga tgaactgatt 180

gcttcagata tagatgtgat agttgaagca gctactgtag acgttgttcg agcccatgcc 240

acatcggttc tcacacatgg taaagatctt gttgtgagca gtgttggcgc attttctgat 300

aacgactatt ttctccaatt agaaacgatt tgtaaagaac aagggacaac gattcattta 360

ccttcaggtg cagtaggagg cttggatata ttaaaagctg ctaaggctat tggtgcttta 420

caagaagtat cgttaacaac aacgaagcca ccgcatgcct taaacggtgt tactctcgag 480

aataaaacag tcttatttga aggtaatgcc tatgaagcga ttaaacagtt tcctaagaat 540

attaacgtat caattattct atcattagct ggacttggtt caaaagagac aaaagtgaag 600

attattgctg atccaaaagc aacgaaaaat agtcatgaga ttacagctaa aggggcgttt 660

ggaaaagtga aactagtggt tgaaaatgat ccgatgccaa acaacccaaa gacaagttac 720

ttagcagctt taagtgttct ctcaacattg aaacataagg atcaatctat caaagtgggg 780

taa 783

<210> 6

<211> 774

<212> DNA

<213> 玫瑰色新鞘氨醇菌（Novosphingobium rosa）

<400> 6

atgctgcgca tcggatttat cggcaatggt tccatcgccc gcgcggcctg cgcagcgctg 60

ggcccggatg tgacgctctg cggccatctg gcccgtccgg ggcgtagcga tggcgatctg 120

gcggtcgagc ggctggccga tctgctggac cgtcagcccg atgtggtggt ggaatgcgcc 180

ggccatgagg ccgtgcgcga gcatggcgcg gcggtgctgg aggcgggcgt ggcactgatg 240

gtggtgtcca tcggcgcgct ggccgatccg gcattggaaa gcgccttgaa cgatgccgcg 300

acccgcagcg gcgcgcgcct gatccttccc gcaggcgcgg tgggcggcat cgatgctctg 360

acggcggcca agctgggcgg cctgtccagc gtgacctatc gcgcgcgcaa accggccatg 420

gcctgggcgg gcagcccggc cgagaaggtc gtggatctcg cttcccttgg cgaggccacg 480

accttctttc gcggcaccgc gcgcgaggcc gccatcgctt ttcccaagaa ctccaatgtc 540

gcggccacgg tagcgctggc tggcgtcggt ttcgatgcca cgcaggtcga gctggtcgcc 600

gatccacatt cctcgcgcaa cctgcacgag atctgcttcg agggggccga tggcgccttc 660

cgcttcgaga tcgagggccg tccctcgccc gacaatccca agacctcgct gctgaccgcg 720

catagcgtgg cgcgcgaatt gctcaccttc gccgcccaga gaaaggcccg ctga 774

<210> 7

<211> 711

<212> DNA

<213> 闪烁古生球菌（Archaeoglobus fulgidus）

<400> 7

atgttagtcg gcttaattgg atacggggca attggaaaat ttctggctga gtggcttgaa 60

aggaacggat ttgagattgc tgccattctg gatgtaaggg gagagcacga gaagatggtt 120

agaggcattg acgagttcct ccagagggag atggatgtgg ccgttgaggc tgcatcgcag 180

caagctgtta aggactatgc ggagaaaatt cttaaggctg gcatagacct aattgttctg 240

agcaccgggg ccttcgctga cagggatttt ctcagcagag tcagggaagt ctgcaggaaa 300

acgggcagga gagtttacat agcatctggg gcaatcggtg gattggatgc cattttttca 360

gcatcagagt tgatagagga aatcgttctg acaacaagga agaattggag gcagtttggc 420

agaaaaggtg taatattcga aggctctgca tctgaggcag ctcagaaatt cccgaaaaac 480

ttgaacgttg cagcgacgct cagcattgcc tcaggaaaag acgtgaaggt caggcttgta 540

gctgacgagg ttgaggagaa catccacgaa attctggtga ggggagagtt tggggagatg 600

gaaatcagag ttaggaacag gccaatgagg gaaaatccga agacgagcta tcttgctgcc 660

ctttctgtaa cgagaatttt gagaaatctt aaggagggat tggtggtttg a 711

<210> 8

<211> 810

<212> DNA

<213> 节杆菌（Arthrobacter sp.）161MFSha2.1

<400> 8

atgacgtccc accgcatagg aatcattggc tacggagcca tcggcgcgcg cgtcgccgag 60

gacatctccc tgggcaaggt ggtgggcgca gaactggccg gcatcatcag ccgcaccgac 120

aacggaaccg ggcgtcccgc cgtcgaacgc cccttccctt cgctgacctt ggaagcggcc 180

ctggagtgct gcgagctgat cgtggagtgc gcggggcagt ccgccgtgac tgaatacgct 240

gaaaagatcc tgggcgcggg cgtagatttc ctgatcacct ccatcggcgc ccttgccgac 300

caggacctgg cagcacgctt gaacgcgtgc ggtccaggga gattgttcat gacgtcgggc 360

gcagtgggcg ggctcgacct ccttgaagcc ggcgcaaggg aagccgccta cgattccgtg 420

gtggtttcca ccaccaaact tcctgaaacg ctggtccaac cttggatgga acaggagcaa 480

gccgatggga tccgagcgac cacagaaccg ctggaggtct tcctcggctc agcccaggaa 540

gcggcacggc tgtttccgcg ctcactcaac gtcgcagcgg ccgtggctga ggccgtcggg 600

gattgggacg gcgtgcaggt gcggctgacg gccgacccga aggcctcact gaccagccac 660

gtcattgaag cctcgggccc ctccggcgaa taccgcttcg agatccgcaa caaccccagt 720

ccgcagaacc cgaggaccag cgggatagtc ccctttgccg tcctccggtc cttggaagcg 780

gcgatcggcg aacgcggagg gctggtctag 810

<210> 9

<211> 762

<212> DNA

<213> 特里恩斯海洋袍菌（Oceanotoga teriensis）

<400> 9

atgtttttat tgaatatttt ttttattggg gcaggaaatt gtactgaaat aattcttgaa 60

aaaatgcaga attgtataaa aaaagcttat ttattagatt atgatgttga aaaaattaat 120

tttttaaaag aaaaatttca tttttgtatt gaatccgatt tttttatttc tgatgatatt 180

gatttttatg tggaatgtgc gagtgttgaa gctgtgaaaa aatatactga aaacataatt 240

aggaataata agaatattat tattttatca agtggcgctt tttcagattt tgattttcga 300

aacaatgttg aaaatatttt aaaaaattca aggtctcaaa tatttattcc atctggagct 360

attggtggaa ttgatattat taattctttg aaagatgaaa ttaattctat tactatagaa 420

actcgtaaac ccccattaag ttttaatatg ataaatacaa aagaagaact tattttttat 480

ggaactgccg aagaagctat taaaaattat cctaaaaata ttaatgttgc tatcactctt 540

tcaatggccg ttgaaagttt tgataaagtt aaagtaaaaa ttatttctga tccaaaaata 600

attaaaaata ttcataaaat atttatagat tcaaaagcag gtaaatatga aataaaaatt 660

gaaaataatc cttctaataa tccaaaaaca agtttaatgg caccattatc tgtagttgga 720

tttctaaaaa aatttaataa tagtattaag gttggtgttt aa 762

<210> 10

<211> 756

<212> DNA

<213> 海袍菌（Marinitoga sp.）1155

<400> 10

atgttgaaag tatttctttt aggagcggga aattctgcaa aaattattct ggatgaattg 60

aatttcgaaa aggtttatgt atatgataaa aatttcaagc aatttgaaaa actaaaagaa 120

atacataatg aaatcgaata tttagatatt aaaaacttag aaactactga tgttgattat 180

attatagaag tagcatctgt tgaagcatta aagaattatg gactaaaact ccttgatatg 240

aataaaaatt taattgtctt aagtacaggc gcttttgcag ataaaatttt tagatataat 300

tttgtgaaaa aattaaataa caaaaatatt aatgtttatg ttgtatctgg agcaatcggt 360

ggaattgatc taataagaac cataagcgat aaaataaata caatcacatt aataacacga 420

aaaacaccaa aaagtcttgg gattgatatt aaaaaagaaa aaataatttt tgaaggtaat 480

tcaatagaag ctattgaaag attccctaaa aatataaatg ttgctgttac gctggcattg 540

gcaataaaaa attttgaaaa ggtaaaagtt aaaattatag cagatccttt tattgaaaga 600

aatgtacatt caatagaaat aaaatcaaag gttggaaatt atacatttaa atttgaaaat 660

tatccatcaa aaaatccaaa aaccagttat ctggcaccat tatctatagt tggattattg 720

aaaaacattc actcaaaatt caaaatagga ggataa 756

<210> 11

<211> 747

<212> DNA

<213> 热袍菌（Thermotogales bacterium）46_20

<400> 11

atggacaaaa taagcgtact gctgatcggt ggaggcaaca tcgctcatat cctgctcaat 60

gaacttggac acagaatcag aaaatcctac taccatgatc tcagaaagac agatctggag 120

gccacctttc tggaatcctt tttaatcccc gaagttacag atatcgttgt tgagtgtgcg 180

ggaataaatg cagtcaagca acacgggatc gaagccatca aggcaggaaa agatctctac 240

ataatcagtt cgggagcgtt ttcagatccc aagtttccta ctgagctcct taaccatctt 300

aagagcagca cttccaaagt tttcgtgcca tcaggtgcta tcggaggcct tgatataatc 360

agggcagtga ggacccgaat atcctctgtt agactcataa tgacgaagcc accttcttca 420

ctcggctata aggagcgttt ctcagagcca caagtagtat tcgagggacg cgttgaaaaa 480

gcaattgaga gattccctca gaatgtcaat gttgcagtta ccctgctgct cgcagtggga 540

gaaagtgcca aggttacagt taaggtcgtg gttgatccga caatagatag aaatacgcat 600

gaggtagaag tgaagtcttc tgttggtgat tataaaatcg ttcatgaaaa caaaccgtcg 660

ccaaatctaa agacaagtta tctggcagcg ctctcgttgg cttcgtgcat aaacagaaga 720

ttcgacaggt tagtagtagg gggttga 747

<210> 12

<211> 978

<212> DNA

<213> 海栖热袍菌（Thermotoga maritima）

<400> 12

atgaaagtag gagttgttgg tgccacggga gaagttggaa gaacgatggt aaaagtactc 60

gaagaattca acgttcccgt cacggagctc aggctcttcg cttcggaaag atctgtgggt 120

aaagaaattg aattcaaagg tgagaaattc aaggtcgagc ttctcacgga agaatcgatg 180

aaatggaagt gtgactactt cctgttttcc gcgggtgcca gtgtttccag aaagttcgct 240

cctatcgcag ccgaaaacgg agtgaccgtg atagataact cttctgcttt cagaatggag 300

aaggaaatac cccttgtggt tccggaggtg aacgcttacc ttctcaaggg atacacagga 360

ataatagcaa atccgaactg ttcaacgatt cagatgatcc tttccatcta caaacttcac 420

gaagtttacg gaatagaaga gatctttgtg tcgacgtatc agtccgtctc cggcgctggt 480

cataagggga tagaagaact ccttgctcaa gaaagaggag aaaacgtgat gaaagtcttc 540

ccaaaaccca ttcacagaaa cgtcattcct ctcataggtg atatccagga aaatcttttc 600

tctcaggaag agatgaagat ggtgaatgaa acaagaaaaa ttctgaacga ctactcgata 660

agggtgtatc caacaacggt gagggtgccc gttctgtacg gacactctga agcgatcatg 720

gtgaggctca agaaacccta cgagtctctc gaaaaggtga gagaagtcat agcttctgga 780

gaagacgtgg tggtgacgga cgatctcata acaccggtgg atgtcgcagg aaagaacgaa 840

acttatgttt gccgactcag agcgaccgat gaaagatcca ttcttttctg gaacgtggcg 900

gacaacatcc gtgtaggggc tgcgaccaac gccgtcagaa ttctcctgaa gcacgctgag 960

atgaacggaa aggtgtga 978

<210> 13

<211> 783

<212> DNA

<213> 临时埃氏古菌（Candidatus Altiarchaeales archaeon）IMC4

<400> 13

atgatgaaga ttggtataat cggctgcggt aatatcggca gggtggtcat ccgggctgtt 60

tttgaggggg ttgttgattg tgaggttgtg tgtgtttttg atgccgatcg cagggggttt 120

gagaagcttc cgaaggaagt tatatcatgt cttttgttta cggataagtt tgattttttt 180

ataatgcagg atatggacat tgtcgtggag gcggcatcgc aggaggcggt tcgcgaattt 240

tcggcgtttg ttttgggggg gggtaaggat atgatgataa tgagcgtcgg ggccttggta 300

gatgccgggt ttcgcgggca gttggttggg ttggcgaaag agaagaaggt taagatatat 360

attccctcag gtgcaatcgc cggcatcgat ggtcttaagt ccgctatgtc tgcgggggtt 420

gggggggttg tgctgacgac aagtaagccc ccgtcaagcc ttggcgtgga tacaaaaaca 480

aaaagaatta tttatgatgg atatgctgaa gaggcggtta ggttatttcc aaaaaacgtt 540

aatgtttcgg ccaccctcgc gctagcgggc gttggttttg aaaagacgag ggttaaaata 600

attgcagacc ctaatttaaa ggaaaatgtt catgaggttg ttgtgcgtgg cgacttcgga 660

acttttagcg tgcgagtgga aaacgtgccg agcccggata acccaaagac tagttacctt 720

gccgcgcttt ccgcaatagc aaccctcaaa aaaattactt cccccttaca aatcggtaca 780

tag 783

<210> 14

<211> 786

<212> DNA

<213> 黄尖木米亚菌（Mumia flava）

<400> 14

atgaccacgt cgagtcccac ccgtgaggtc gccgtgctcg gcttcggctc gatcggctcc 60

gtcgtcgccg acgagctcgc cgcaggacgc gtccccggcg cacgcctgag ctgcgtggtc 120

ggcgatcggg cccgcggccg ggtcgacgtc ccggtcgtcg acgtcgacga ggcgaccgcc 180

cgtgccgacg tcctgatcga gtgcgccggg cacgccgccc tgctcgcgca cggggcgcgg 240

atcctcgact ccgggacgga tctggtgatc tcgtcggtcg gcgccctcgt cgaccgcgac 300

ctccgggccc gcctggatgc ggccgggccg ggccgtacct tcctcacaac gggcgcgctc 360

ggcgggctcg acctgctggt ggcaggcgcc tccgccgctc ccttcgggcg ggtccggctg 420

acgacgacga agacgccctc cgcactcgtg caggactgga tggacgaccc gcagcgtgac 480

gcgctgctcg gcaccgacgc gcccgtcgtc gtcttccgcg gcacggcaga gcaggcggcg 540

ccgctgttcc ccaggtccct caacgtcgcc gcgaccctgg cgctcatgct ccccgagagc 600

gaggtcgagg tggagctggt cgccgatccg gccgccaccc tggtgtcgca cgtggtggag 660

gcggacgggc cggtcgggac gtaccggttc gaggttcgca accgcccgtc gccgaccaac 720

ccgcggacca gccaggtcgt cccgtacgcg gtgctgcgga ccctccgcca ggccctcgcc 780

gtctga 786

<210> 15

<211> 765

<212> DNA

<213> 热黄拟无枝酸菌（Amycolatopsis thermoflava）

<400> 15

atgatcggcg cgggctcgat cggcggcgtg gtcgcccgcg ccctgcgcga cggatcagtg 60

ccgggtgcga cgctctccgg cgtcgtggac ccggccggtg cggcggatct gccgctggtg 120

tcgctggacg aacttctgtc cacttcggac ctggtagtcg aggcggccgg gcagcgggcg 180

ctggcggagg tcggaccgca ggtgctggcc gccgggcggg acctgctggt cgtgtcggtc 240

ggcgcgctgg ccgacgacgc cctgctggac aagctgctgt gcgcgggccc cggtgagctg 300

cacctgtcga ccggggcgat cggcggcctg gacctgctgc gggcggcggc ccggatggcg 360

ccgctgaccc gagtgacgat cgagaccacg aaactggccg cgaacctggt tcaggcatgg 420

atgtccgacg aggaggccgc gcggctgcgg accaccgccg agccggtcga gctgatgcgc 480

ggcccggcac gcgaggtgac cgcggcgttc ccgaagtcgg cgaacgtggc tgcctcggtg 540

gcgctggccg tgggcgactg ggacgtggtg gaggcggcgg tgatcgccga cccggccgcc 600

gagctgacct cgcacgtcat caccgccgac gggccggccg ggtcgtaccg gttcgagatc 660

cgcaaccggc cctcgccgcg gacgccgacg agcagtgagg tcgtgccgca cgcggtgctc 720

gccgcgatcg ccgcgctggc ggagccgcgg gtggtgttcc ggtga 765

<210> 16

<211> 260

<212> PRT

<213> 临时嗜热菌（Candidatus Hydrothermae bacterium）

<400> 16

Met Arg Ala Gly Ile Ile Gly Cys Gly Ala Ile Gly Ser Phe Leu Ala

1 5 10 15

Arg Glu Ile Asp Arg Gly Asn Val Ala His Met Lys Leu Val Ala Leu

20 25 30

Phe Asp Ile Asp Leu Asn Lys Val Tyr Lys Leu Val Glu Ser Leu Glu

35 40 45

His Lys Pro Gln Ile Ala Asp Ser Phe Glu Lys Phe Leu Lys Leu Pro

50 55 60

Val Asp Phe Val Ile Glu Ala Ala Ser Gln Gln Ala Val Phe Gln Tyr

65 70 75 80

Ala Glu Lys Ile Leu Lys Gln Lys Lys Pro Leu Leu Leu Met Ser Ala

85 90 95

Gly Ala Leu Ala Asp Asp Arg Leu Arg Glu Lys Leu Phe Arg Val Ala

100 105 110

Arg Glu Asn Asn Thr Lys Ile Tyr Ile Pro Ser Gly Ala Ile Ala Gly

115 120 125

Leu Asp Gly Leu Lys Ala Met Ser Asn Val Arg Leu His Arg Ala Arg

130 135 140

Leu Thr Thr Arg Lys Ser Pro Ser Ala Leu Gly Val Lys Thr Glu Lys

145 150 155 160

Pro Val Val Val Phe Ser Gly Asn Ala His Glu Ala Ala Lys Arg Tyr

165 170 175

Pro Gln Asn Ile Asn Val Ala Ile Ala Phe Gly Leu Ala Ala His Ala

180 185 190

Ile Asp Ile Leu Gln Val Glu Ile Val Ala Asp Pro Gly Val Ser Arg

195 200 205

Asn Ile His Thr Ile Glu Val Glu Gly Glu Ala Gly Lys Leu Glu Ile

210 215 220

Thr Leu Glu Asn Phe Pro Phe Pro Asp Asn Pro Lys Thr Ser Phe Leu

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ser Ala Leu Gln Val Leu Lys Asn Ile Ala Ser Asn Val

245 250 255

Val Ile Gly Gly

260

<210> 17

<211> 263

<212> PRT

<213> 栖冰菌（Glaciecola sp.）33A

<400> 17

Met Ile Lys Ile Gly Leu Ile Gly Phe Gly Ala Ile Gly Arg Cys Val

1 5 10 15

Ile Glu Thr Leu Pro Lys Ala Leu Thr Glu Glu Tyr Glu Val Ile Gly

20 25 30

Ile Leu Thr Arg Lys Ala Ala Asp Asn Trp Val Asn Asn Ile Pro Ser

35 40 45

Tyr Ser Asp Ile Asp Gln Leu Leu Ala Lys Gln Pro Asp Ile Ile Val

50 55 60

Glu Cys Ala Gly His His Ala Val Lys Glu Tyr Gly Cys Lys Ile Leu

65 70 75 80

Glu Ala Asn Ile Ser Leu Val Ile Ser Ser Ile Gly Ala Leu Ala Asp

85 90 95

Ser Val Leu Tyr Gln Gln Leu Lys Asp Ser Ser Thr Ala Ser Lys Ala

100 105 110

Lys Ile Tyr Leu Pro Ala Gly Ala Ile Gly Gly Ile Asp Ala Leu Val

115 120 125

Ala Ala Lys Leu Gly Gly Ile His Asp Val Thr Tyr Thr Met Arg Lys

130 135 140

Pro Pro Lys Ala Trp Gln Gly Ser Val Ala Glu Thr Val Val Asp Leu

145 150 155 160

Asn Ser Leu Lys Gln Ala Thr Val Ile Phe Ser Gly Ser Ala Gly Glu

165 170 175

Ala Ala Thr Leu Tyr Pro Lys Asn Thr Asn Val Thr Ala Thr Ile Ala

180 185 190

Leu Ala Gly Leu Gly Phe Asp Glu Thr Lys Val Glu Leu Ile Ala Asp

195 200 205

Pro Asn Ile Ile Asp Asn Ile His Glu Ile Ser Val Ser Gly Glu Thr

210 215 220

Gly Tyr Phe Thr Ile Val Leu Lys Gly Lys Pro Ser Val Tyr Asn Pro

225 230 235 240

Lys Thr Ser Ala Leu Thr Ala Phe Ser Val Thr Lys Cys Val Ala Asp

245 250 255

Phe Gly Ser Ser Ile Ile Ile

260

<210> 18

<211> 258

<212> PRT

<213> 中间根瘤菌（Mesorhizobium sp.）M7D.F.Ca.US.005.01.1.1

<400> 18

Met Val Thr Leu Gly Leu Ile Gly Phe Gly Thr Ile Ser Arg Ala Ile

1 5 10 15

Val Ser Ala Phe Pro Pro Asp Ser Cys Arg Trp Val Ala Leu Met Arg

20 25 30

Glu Gly Ala Arg Pro Ala Leu Pro Ala Asn Val Ser Thr Val Thr Gln

35 40 45

Leu Asp Ala Leu Ile Ser Ala Arg Pro Ser Thr Val Val Glu Ala Ala

50 55 60

Ser Gln Glu Ala Val Ala Ala Tyr Val Pro Ala Leu Leu Asp Ala Gly

65 70 75 80

Ile Pro Thr Ile Ile Ala Ser Ile Gly Ala Phe Ser Asp Pro Ile Leu

85 90 95

Ala Ala Arg Leu Thr Asp Ala Ser Arg Asn Ser Gly Ala Arg Leu Val

100 105 110

Leu Pro Ser Gly Ala Leu Gly Gly Leu Asp Tyr Leu Arg Ala Ile Ala

115 120 125

Ala Leu Pro Asp Ala Arg Val Arg Tyr Thr Ser Arg Lys Pro Pro Ala

130 135 140

Ala Trp Lys Ala Glu Leu Ala Thr Leu Gly Leu Ser Ala Glu His Asp

145 150 155 160

Ala Val Ser Leu Phe Glu Gly Thr Pro Ala Gln Ala Ala Lys Leu Tyr

165 170 175

Pro Lys Asn Leu Asn Ala Ala Phe Ala Val Ala Leu Ala Ala Gly Ile

180 185 190

Asp Lys Val Thr Val Ser Val Val Ala Asp Pro Lys Thr Thr Gly Asn

195 200 205

Thr His Glu Ile Glu Val Glu Ser Thr Ala Gly Thr Ala Ser Phe Arg

210 215 220

Leu Val Asn Ala Pro Ser Pro Ser Asn Pro Lys Thr Ser Met Leu Thr

225 230 235 240

Ala Leu Ser Leu Val Ala Ala Leu Ser Glu Leu Leu Asp Arg Glu Gly

245 250 255

Cys His

<210> 19

<211> 266

<212> PRT

<213> 红螺菌（Rhodospirillaceae bacterium）

<400> 19

Met Leu Asn Ile Gly Leu Leu Gly Leu Gly Ala Ile Gly Ser Asp Val

1 5 10 15

Leu Asn Met Val Arg Glu Glu Phe Ser Asn Gln Ile Gln Ile Pro Ala

20 25 30

Val Leu Val Lys Arg Pro Arg Lys Glu Lys Leu Met Gly His Ser Leu

35 40 45

Ile Thr Asn Asp Phe Glu Glu Phe Phe Ser Lys Glu Gln Asp Ile Val

50 55 60

Leu Glu Val Ala Gly His Ser Thr Val Arg His Tyr Gly Glu Arg Ile

65 70 75 80

Leu Lys Ser Gly Val Asp Leu Met Val Thr Ser Val Gly Ala Phe Thr

85 90 95

Asp Asp Thr Leu Tyr Lys Arg Cys Ile Lys Ala Ala Thr Thr Ser Gly

100 105 110

Ser Arg Leu Ile Ile Pro Ser Ala Gly Ile Gly Ser Leu Asp Thr Leu

115 120 125

Ser Ala Ala Ala Val Gly Gly Leu Asp Ser Val His Met Ile Val Arg

130 135 140

Lys Asp Pro Thr Ala Trp Tyr Gly Thr His Ala Glu Asn Leu Phe Asp

145 150 155 160

Leu Ala Ala Leu Lys Lys Pro Thr Ile Ile Phe Glu Gly Ser Pro Arg

165 170 175

Glu Gly Ala Ala Leu Tyr Pro Gln Asn Val Asn Ile Ser Ala Ala Val

180 185 190

Ser Leu Ala Gly Met Gly Leu Asp Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ile Ala

195 200 205

Asp Thr Glu Ile Asp Thr His Val Cys Glu Ile His Ala Asn Gly Ala

210 215 220

Phe Gly Ser Tyr Thr Phe Arg Glu Asp Leu Thr Val Ala Glu Thr Asn

225 230 235 240

Arg Lys Thr Gly Lys Ile Val Ala Met Ala Val Met Lys Thr Ile Arg

245 250 255

Gln Met Val Ser Pro Val Leu Ile Gly Val

260 265

<210> 20

<211> 260

<212> PRT

<213> 科赫芽胞杆菌（Bacillus kochii）

<400> 20

Met Lys Leu Gly Leu Ile Gly Gly Gly Asn Ile Gly Lys Phe Leu Leu

1 5 10 15

Gln Ser Ile Asn Ser Asp Lys Leu Val Asp Gly Ala Gln Phe Val Gly

20 25 30

Leu Tyr Thr Arg Asn Gln Glu Lys Ala Asn Glu Leu Ala Glu Glu Tyr

35 40 45

Asp Leu Arg Ser Tyr Gln Ser Ile Asp Glu Leu Ile Ala Ser Asp Ile

50 55 60

Asp Val Ile Val Glu Ala Ala Thr Val Asp Val Val Arg Ala His Ala

65 70 75 80

Thr Ser Val Leu Thr His Gly Lys Asp Leu Val Val Ser Ser Val Gly

85 90 95

Ala Phe Ser Asp Asn Asp Tyr Phe Leu Gln Leu Glu Thr Ile Cys Lys

100 105 110

Glu Gln Gly Thr Thr Ile His Leu Pro Ser Gly Ala Val Gly Gly Leu

115 120 125

Asp Ile Leu Lys Ala Ala Lys Ala Ile Gly Ala Leu Gln Glu Val Ser

130 135 140

Leu Thr Thr Thr Lys Pro Pro His Ala Leu Asn Gly Val Thr Leu Glu

145 150 155 160

Asn Lys Thr Val Leu Phe Glu Gly Asn Ala Tyr Glu Ala Ile Lys Gln

165 170 175

Phe Pro Lys Asn Ile Asn Val Ser Ile Ile Leu Ser Leu Ala Gly Leu

180 185 190

Gly Ser Lys Glu Thr Lys Val Lys Ile Ile Ala Asp Pro Lys Ala Thr

195 200 205

Lys Asn Ser His Glu Ile Thr Ala Lys Gly Ala Phe Gly Lys Val Lys

210 215 220

Leu Val Val Glu Asn Asp Pro Met Pro Asn Asn Pro Lys Thr Ser Tyr

225 230 235 240

Leu Ala Ala Leu Ser Val Leu Ser Thr Leu Lys His Lys Asp Gln Ser

245 250 255

Ile Lys Val Gly

260

<210> 21

<211> 257

<212> PRT

<213> 来自玫瑰色新鞘氨醇菌（Novosphingobium rosa）

<400> 21

Met Leu Arg Ile Gly Phe Ile Gly Asn Gly Ser Ile Ala Arg Ala Ala

1 5 10 15

Cys Ala Ala Leu Gly Pro Asp Val Thr Leu Cys Gly His Leu Ala Arg

20 25 30

Pro Gly Arg Ser Asp Gly Asp Leu Ala Val Glu Arg Leu Ala Asp Leu

35 40 45

Leu Asp Arg Gln Pro Asp Val Val Val Glu Cys Ala Gly His Glu Ala

50 55 60

Val Arg Glu His Gly Ala Ala Val Leu Glu Ala Gly Val Ala Leu Met

65 70 75 80

Val Val Ser Ile Gly Ala Leu Ala Asp Pro Ala Leu Glu Ser Ala Leu

85 90 95

Asn Asp Ala Ala Thr Arg Ser Gly Ala Arg Leu Ile Leu Pro Ala Gly

100 105 110

Ala Val Gly Gly Ile Asp Ala Leu Thr Ala Ala Lys Leu Gly Gly Leu

115 120 125

Ser Ser Val Thr Tyr Arg Ala Arg Lys Pro Ala Met Ala Trp Ala Gly

130 135 140

Ser Pro Ala Glu Lys Val Val Asp Leu Ala Ser Leu Gly Glu Ala Thr

145 150 155 160

Thr Phe Phe Arg Gly Thr Ala Arg Glu Ala Ala Ile Ala Phe Pro Lys

165 170 175

Asn Ser Asn Val Ala Ala Thr Val Ala Leu Ala Gly Val Gly Phe Asp

180 185 190

Ala Thr Gln Val Glu Leu Val Ala Asp Pro His Ser Ser Arg Asn Leu

195 200 205

His Glu Ile Cys Phe Glu Gly Ala Asp Gly Ala Phe Arg Phe Glu Ile

210 215 220

Glu Gly Arg Pro Ser Pro Asp Asn Pro Lys Thr Ser Leu Leu Thr Ala

225 230 235 240

His Ser Val Ala Arg Glu Leu Leu Thr Phe Ala Ala Gln Arg Lys Ala

245 250 255

Arg

<210> 22

<211> 236

<212> PRT

<213> 闪烁古生球菌（Archaeoglobus fulgidus）

<400> 22

Met Leu Val Gly Leu Ile Gly Tyr Gly Ala Ile Gly Lys Phe Leu Ala

1 5 10 15

Glu Trp Leu Glu Arg Asn Gly Phe Glu Ile Ala Ala Ile Leu Asp Val

20 25 30

Arg Gly Glu His Glu Lys Met Val Arg Gly Ile Asp Glu Phe Leu Gln

35 40 45

Arg Glu Met Asp Val Ala Val Glu Ala Ala Ser Gln Gln Ala Val Lys

50 55 60

Asp Tyr Ala Glu Lys Ile Leu Lys Ala Gly Ile Asp Leu Ile Val Leu

65 70 75 80

Ser Thr Gly Ala Phe Ala Asp Arg Asp Phe Leu Ser Arg Val Arg Glu

85 90 95

Val Cys Arg Lys Thr Gly Arg Arg Val Tyr Ile Ala Ser Gly Ala Ile

100 105 110

Gly Gly Leu Asp Ala Ile Phe Ser Ala Ser Glu Leu Ile Glu Glu Ile

115 120 125

Val Leu Thr Thr Arg Lys Asn Trp Arg Gln Phe Gly Arg Lys Gly Val

130 135 140

Ile Phe Glu Gly Ser Ala Ser Glu Ala Ala Gln Lys Phe Pro Lys Asn

145 150 155 160

Leu Asn Val Ala Ala Thr Leu Ser Ile Ala Ser Gly Lys Asp Val Lys

165 170 175

Val Arg Leu Val Ala Asp Glu Val Glu Glu Asn Ile His Glu Ile Leu

180 185 190

Val Arg Gly Glu Phe Gly Glu Met Glu Ile Arg Val Arg Asn Arg Pro

195 200 205

Met Arg Glu Asn Pro Lys Thr Ser Tyr Leu Ala Ala Leu Ser Val Thr

210 215 220

Arg Ile Leu Arg Asn Leu Lys Glu Gly Leu Val Val

225 230 235

<210> 23

<211> 269

<212> PRT

<213> 节杆菌（Arthrobacter sp.）161MFSha2.1

<400> 23

Met Thr Ser His Arg Ile Gly Ile Ile Gly Tyr Gly Ala Ile Gly Ala

1 5 10 15

Arg Val Ala Glu Asp Ile Ser Leu Gly Lys Val Val Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Ala Gly Ile Ile Ser Arg Thr Asp Asn Gly Thr Gly Arg Pro Ala Val

35 40 45

Glu Arg Pro Phe Pro Ser Leu Thr Leu Glu Ala Ala Leu Glu Cys Cys

50 55 60

Glu Leu Ile Val Glu Cys Ala Gly Gln Ser Ala Val Thr Glu Tyr Ala

65 70 75 80

Glu Lys Ile Leu Gly Ala Gly Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Ile Gly

85 90 95

Ala Leu Ala Asp Gln Asp Leu Ala Ala Arg Leu Asn Ala Cys Gly Pro

100 105 110

Gly Arg Leu Phe Met Thr Ser Gly Ala Val Gly Gly Leu Asp Leu Leu

115 120 125

Glu Ala Gly Ala Arg Glu Ala Ala Tyr Asp Ser Val Val Val Ser Thr

130 135 140

Thr Lys Leu Pro Glu Thr Leu Val Gln Pro Trp Met Glu Gln Glu Gln

145 150 155 160

Ala Asp Gly Ile Arg Ala Thr Thr Glu Pro Leu Glu Val Phe Leu Gly

165 170 175

Ser Ala Gln Glu Ala Ala Arg Leu Phe Pro Arg Ser Leu Asn Val Ala

180 185 190

Ala Ala Val Ala Glu Ala Val Gly Asp Trp Asp Gly Val Gln Val Arg

195 200 205

Leu Thr Ala Asp Pro Lys Ala Ser Leu Thr Ser His Val Ile Glu Ala

210 215 220

Ser Gly Pro Ser Gly Glu Tyr Arg Phe Glu Ile Arg Asn Asn Pro Ser

225 230 235 240

Pro Gln Asn Pro Arg Thr Ser Gly Ile Val Pro Phe Ala Val Leu Arg

245 250 255

Ser Leu Glu Ala Ala Ile Gly Glu Arg Gly Gly Leu Val

260 265

<210> 24

<211> 253

<212> PRT

<213> 特里恩斯海洋袍菌（Oceanotoga teriensis）

<400> 24

Met Phe Leu Leu Asn Ile Phe Phe Ile Gly Ala Gly Asn Cys Thr Glu

1 5 10 15

Ile Ile Leu Glu Lys Met Gln Asn Cys Ile Lys Lys Ala Tyr Leu Leu

20 25 30

Asp Tyr Asp Val Glu Lys Ile Asn Phe Leu Lys Glu Lys Phe His Phe

35 40 45

Cys Ile Glu Ser Asp Phe Phe Ile Ser Asp Asp Ile Asp Phe Tyr Val

50 55 60

Glu Cys Ala Ser Val Glu Ala Val Lys Lys Tyr Thr Glu Asn Ile Ile

65 70 75 80

Arg Asn Asn Lys Asn Ile Ile Ile Leu Ser Ser Gly Ala Phe Ser Asp

85 90 95

Phe Asp Phe Arg Asn Asn Val Glu Asn Ile Leu Lys Asn Ser Arg Ser

100 105 110

Gln Ile Phe Ile Pro Ser Gly Ala Ile Gly Gly Ile Asp Ile Ile Asn

115 120 125

Ser Leu Lys Asp Glu Ile Asn Ser Ile Thr Ile Glu Thr Arg Lys Pro

130 135 140

Pro Leu Ser Phe Asn Met Ile Asn Thr Lys Glu Glu Leu Ile Phe Tyr

145 150 155 160

Gly Thr Ala Glu Glu Ala Ile Lys Asn Tyr Pro Lys Asn Ile Asn Val

165 170 175

Ala Ile Thr Leu Ser Met Ala Val Glu Ser Phe Asp Lys Val Lys Val

180 185 190

Lys Ile Ile Ser Asp Pro Lys Ile Ile Lys Asn Ile His Lys Ile Phe

195 200 205

Ile Asp Ser Lys Ala Gly Lys Tyr Glu Ile Lys Ile Glu Asn Asn Pro

210 215 220

Ser Asn Asn Pro Lys Thr Ser Leu Met Ala Pro Leu Ser Val Val Gly

225 230 235 240

Phe Leu Lys Lys Phe Asn Asn Ser Ile Lys Val Gly Val

245 250

<210> 25

<211> 251

<212> PRT

<213> 海袍菌（Marinitoga sp.）1155

<400> 25

Met Leu Lys Val Phe Leu Leu Gly Ala Gly Asn Ser Ala Lys Ile Ile

1 5 10 15

Leu Asp Glu Leu Asn Phe Glu Lys Val Tyr Val Tyr Asp Lys Asn Phe

20 25 30

Lys Gln Phe Glu Lys Leu Lys Glu Ile His Asn Glu Ile Glu Tyr Leu

35 40 45

Asp Ile Lys Asn Leu Glu Thr Thr Asp Val Asp Tyr Ile Ile Glu Val

50 55 60

Ala Ser Val Glu Ala Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Lys Leu Leu Asp Met

65 70 75 80

Asn Lys Asn Leu Ile Val Leu Ser Thr Gly Ala Phe Ala Asp Lys Ile

85 90 95

Phe Arg Tyr Asn Phe Val Lys Lys Leu Asn Asn Lys Asn Ile Asn Val

100 105 110

Tyr Val Val Ser Gly Ala Ile Gly Gly Ile Asp Leu Ile Arg Thr Ile

115 120 125

Ser Asp Lys Ile Asn Thr Ile Thr Leu Ile Thr Arg Lys Thr Pro Lys

130 135 140

Ser Leu Gly Ile Asp Ile Lys Lys Glu Lys Ile Ile Phe Glu Gly Asn

145 150 155 160

Ser Ile Glu Ala Ile Glu Arg Phe Pro Lys Asn Ile Asn Val Ala Val

165 170 175

Thr Leu Ala Leu Ala Ile Lys Asn Phe Glu Lys Val Lys Val Lys Ile

180 185 190

Ile Ala Asp Pro Phe Ile Glu Arg Asn Val His Ser Ile Glu Ile Lys

195 200 205

Ser Lys Val Gly Asn Tyr Thr Phe Lys Phe Glu Asn Tyr Pro Ser Lys

210 215 220

Asn Pro Lys Thr Ser Tyr Leu Ala Pro Leu Ser Ile Val Gly Leu Leu

225 230 235 240

Lys Asn Ile His Ser Lys Phe Lys Ile Gly Gly

245 250

<210> 26

<211> 248

<212> PRT

<213> 热袍菌（Thermotogales bacterium）46_20

<400> 26

Met Asp Lys Ile Ser Val Leu Leu Ile Gly Gly Gly Asn Ile Ala His

1 5 10 15

Ile Leu Leu Asn Glu Leu Gly His Arg Ile Arg Lys Ser Tyr Tyr His

20 25 30

Asp Leu Arg Lys Thr Asp Leu Glu Ala Thr Phe Leu Glu Ser Phe Leu

35 40 45

Ile Pro Glu Val Thr Asp Ile Val Val Glu Cys Ala Gly Ile Asn Ala

50 55 60

Val Lys Gln His Gly Ile Glu Ala Ile Lys Ala Gly Lys Asp Leu Tyr

65 70 75 80

Ile Ile Ser Ser Gly Ala Phe Ser Asp Pro Lys Phe Pro Thr Glu Leu

85 90 95

Leu Asn His Leu Lys Ser Ser Thr Ser Lys Val Phe Val Pro Ser Gly

100 105 110

Ala Ile Gly Gly Leu Asp Ile Ile Arg Ala Val Arg Thr Arg Ile Ser

115 120 125

Ser Val Arg Leu Ile Met Thr Lys Pro Pro Ser Ser Leu Gly Tyr Lys

130 135 140

Glu Arg Phe Ser Glu Pro Gln Val Val Phe Glu Gly Arg Val Glu Lys

145 150 155 160

Ala Ile Glu Arg Phe Pro Gln Asn Val Asn Val Ala Val Thr Leu Leu

165 170 175

Leu Ala Val Gly Glu Ser Ala Lys Val Thr Val Lys Val Val Val Asp

180 185 190

Pro Thr Ile Asp Arg Asn Thr His Glu Val Glu Val Lys Ser Ser Val

195 200 205

Gly Asp Tyr Lys Ile Val His Glu Asn Lys Pro Ser Pro Asn Leu Lys

210 215 220

Thr Ser Tyr Leu Ala Ala Leu Ser Leu Ala Ser Cys Ile Asn Arg Arg

225 230 235 240

Phe Asp Arg Leu Val Val Gly Gly

245

<210> 27

<211> 325

<212> PRT

<213> 海栖热袍菌（Thermotoga maritima）

<400> 27

Met Lys Val Gly Val Val Gly Ala Thr Gly Glu Val Gly Arg Thr Met

1 5 10 15

Val Lys Val Leu Glu Glu Phe Asn Val Pro Val Thr Glu Leu Arg Leu

20 25 30

Phe Ala Ser Glu Arg Ser Val Gly Lys Glu Ile Glu Phe Lys Gly Glu

35 40 45

Lys Phe Lys Val Glu Leu Leu Thr Glu Glu Ser Met Lys Trp Lys Cys

50 55 60

Asp Tyr Phe Leu Phe Ser Ala Gly Ala Ser Val Ser Arg Lys Phe Ala

65 70 75 80

Pro Ile Ala Ala Glu Asn Gly Val Thr Val Ile Asp Asn Ser Ser Ala

85 90 95

Phe Arg Met Glu Lys Glu Ile Pro Leu Val Val Pro Glu Val Asn Ala

100 105 110

Tyr Leu Leu Lys Gly Tyr Thr Gly Ile Ile Ala Asn Pro Asn Cys Ser

115 120 125

Thr Ile Gln Met Ile Leu Ser Ile Tyr Lys Leu His Glu Val Tyr Gly

130 135 140

Ile Glu Glu Ile Phe Val Ser Thr Tyr Gln Ser Val Ser Gly Ala Gly

145 150 155 160

His Lys Gly Ile Glu Glu Leu Leu Ala Gln Glu Arg Gly Glu Asn Val

165 170 175

Met Lys Val Phe Pro Lys Pro Ile His Arg Asn Val Ile Pro Leu Ile

180 185 190

Gly Asp Ile Gln Glu Asn Leu Phe Ser Gln Glu Glu Met Lys Met Val

195 200 205

Asn Glu Thr Arg Lys Ile Leu Asn Asp Tyr Ser Ile Arg Val Tyr Pro

210 215 220

Thr Thr Val Arg Val Pro Val Leu Tyr Gly His Ser Glu Ala Ile Met

225 230 235 240

Val Arg Leu Lys Lys Pro Tyr Glu Ser Leu Glu Lys Val Arg Glu Val

245 250 255

Ile Ala Ser Gly Glu Asp Val Val Val Thr Asp Asp Leu Ile Thr Pro

260 265 270

Val Asp Val Ala Gly Lys Asn Glu Thr Tyr Val Cys Arg Leu Arg Ala

275 280 285

Thr Asp Glu Arg Ser Ile Leu Phe Trp Asn Val Ala Asp Asn Ile Arg

290 295 300

Val Gly Ala Ala Thr Asn Ala Val Arg Ile Leu Leu Lys His Ala Glu

305 310 315 320

Met Asn Gly Lys Val

325

<210> 28

<211> 260

<212> PRT

<213> 临时埃氏古菌（Candidatus Altiarchaeales archaeon）IMC4

<400> 28

Met Met Lys Ile Gly Ile Ile Gly Cys Gly Asn Ile Gly Arg Val Val

1 5 10 15

Ile Arg Ala Val Phe Glu Gly Val Val Asp Cys Glu Val Val Cys Val

20 25 30

Phe Asp Ala Asp Arg Arg Gly Phe Glu Lys Leu Pro Lys Glu Val Ile

35 40 45

Ser Cys Leu Leu Phe Thr Asp Lys Phe Asp Phe Phe Ile Met Gln Asp

50 55 60

Met Asp Ile Val Val Glu Ala Ala Ser Gln Glu Ala Val Arg Glu Phe

65 70 75 80

Ser Ala Phe Val Leu Gly Gly Gly Lys Asp Met Met Ile Met Ser Val

85 90 95

Gly Ala Leu Val Asp Ala Gly Phe Arg Gly Gln Leu Val Gly Leu Ala

100 105 110

Lys Glu Lys Lys Val Lys Ile Tyr Ile Pro Ser Gly Ala Ile Ala Gly

115 120 125

Ile Asp Gly Leu Lys Ser Ala Met Ser Ala Gly Val Gly Gly Val Val

130 135 140

Leu Thr Thr Ser Lys Pro Pro Ser Ser Leu Gly Val Asp Thr Lys Thr

145 150 155 160

Lys Arg Ile Ile Tyr Asp Gly Tyr Ala Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe

165 170 175

Pro Lys Asn Val Asn Val Ser Ala Thr Leu Ala Leu Ala Gly Val Gly

180 185 190

Phe Glu Lys Thr Arg Val Lys Ile Ile Ala Asp Pro Asn Leu Lys Glu

195 200 205

Asn Val His Glu Val Val Val Arg Gly Asp Phe Gly Thr Phe Ser Val

210 215 220

Arg Val Glu Asn Val Pro Ser Pro Asp Asn Pro Lys Thr Ser Tyr Leu

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ser Ala Ile Ala Thr Leu Lys Lys Ile Thr Ser Pro Leu

245 250 255

Gln Ile Gly Thr

260

<210> 29

<211> 261

<212> PRT

<213> 黄尖木米亚菌（Mumia flava）

<400> 29

Met Thr Thr Ser Ser Pro Thr Arg Glu Val Ala Val Leu Gly Phe Gly

1 5 10 15

Ser Ile Gly Ser Val Val Ala Asp Glu Leu Ala Ala Gly Arg Val Pro

20 25 30

Gly Ala Arg Leu Ser Cys Val Val Gly Asp Arg Ala Arg Gly Arg Val

35 40 45

Asp Val Pro Val Val Asp Val Asp Glu Ala Thr Ala Arg Ala Asp Val

50 55 60

Leu Ile Glu Cys Ala Gly His Ala Ala Leu Leu Ala His Gly Ala Arg

65 70 75 80

Ile Leu Asp Ser Gly Thr Asp Leu Val Ile Ser Ser Val Gly Ala Leu

85 90 95

Val Asp Arg Asp Leu Arg Ala Arg Leu Asp Ala Ala Gly Pro Gly Arg

100 105 110

Thr Phe Leu Thr Thr Gly Ala Leu Gly Gly Leu Asp Leu Leu Val Ala

115 120 125

Gly Ala Ser Ala Ala Pro Phe Gly Arg Val Arg Leu Thr Thr Thr Lys

130 135 140

Thr Pro Ser Ala Leu Val Gln Asp Trp Met Asp Asp Pro Gln Arg Asp

145 150 155 160

Ala Leu Leu Gly Thr Asp Ala Pro Val Val Val Phe Arg Gly Thr Ala

165 170 175

Glu Gln Ala Ala Pro Leu Phe Pro Arg Ser Leu Asn Val Ala Ala Thr

180 185 190

Leu Ala Leu Met Leu Pro Glu Ser Glu Val Glu Val Glu Leu Val Ala

195 200 205

Asp Pro Ala Ala Thr Leu Val Ser His Val Val Glu Ala Asp Gly Pro

210 215 220

Val Gly Thr Tyr Arg Phe Glu Val Arg Asn Arg Pro Ser Pro Thr Asn

225 230 235 240

Pro Arg Thr Ser Gln Val Val Pro Tyr Ala Val Leu Arg Thr Leu Arg

245 250 255

Gln Ala Leu Ala Val

260

<210> 30

<211> 254

<212> PRT

<213> 热黄拟无枝酸菌（Amycolatopsis thermoflava）

<400> 30

Met Ile Gly Ala Gly Ser Ile Gly Gly Val Val Ala Arg Ala Leu Arg

1 5 10 15

Asp Gly Ser Val Pro Gly Ala Thr Leu Ser Gly Val Val Asp Pro Ala

20 25 30

Gly Ala Ala Asp Leu Pro Leu Val Ser Leu Asp Glu Leu Leu Ser Thr

35 40 45

Ser Asp Leu Val Val Glu Ala Ala Gly Gln Arg Ala Leu Ala Glu Val

50 55 60

Gly Pro Gln Val Leu Ala Ala Gly Arg Asp Leu Leu Val Val Ser Val

65 70 75 80

Gly Ala Leu Ala Asp Asp Ala Leu Leu Asp Lys Leu Leu Cys Ala Gly

85 90 95

Pro Gly Glu Leu His Leu Ser Thr Gly Ala Ile Gly Gly Leu Asp Leu

100 105 110

Leu Arg Ala Ala Ala Arg Met Ala Pro Leu Thr Arg Val Thr Ile Glu

115 120 125

Thr Thr Lys Leu Ala Ala Asn Leu Val Gln Ala Trp Met Ser Asp Glu

130 135 140

Glu Ala Ala Arg Leu Arg Thr Thr Ala Glu Pro Val Glu Leu Met Arg

145 150 155 160

Gly Pro Ala Arg Glu Val Thr Ala Ala Phe Pro Lys Ser Ala Asn Val

165 170 175

Ala Ala Ser Val Ala Leu Ala Val Gly Asp Trp Asp Val Val Glu Ala

180 185 190

Ala Val Ile Ala Asp Pro Ala Ala Glu Leu Thr Ser His Val Ile Thr

195 200 205

Ala Asp Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Phe Glu Ile Arg Asn Arg Pro

210 215 220

Ser Pro Arg Thr Pro Thr Ser Ser Glu Val Val Pro His Ala Val Leu

225 230 235 240

Ala Ala Ile Ala Ala Leu Ala Glu Pro Arg Val Val Phe Arg

245 250

<210> 31

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> tac启动子扩增用引物 (a-1)

<400> 31

ttttataacc cgggccatcg actgcacggt gcacc 35

<210> 32

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> tac启动子扩增用引物 (b-1)

<400> 32

tgctagcact gtttcctgtg tgaaattgtt atccg 35

<210> 33

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于制备多克隆区的引物 (a-2)

<400> 33

ggaaacagtg ctagcagatc tggaggagaa acgcatat 38

<210> 34

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于制备多克隆区的引物 (b-2)

<400> 34

cagtgcggcc gcaagcttgt cgacggagct cgaattcgga tccgatatca gcatatgcgt 60

ttctcctcca ga 72

<210> 35

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于制备多克隆区的引物 (a-3)

<400> 35

acaagcttgc ggccgcactg cagcaccatc accaccatca ttgataagat ccggctgcta 60

acaaagcccg aaaggaagct 80

<210> 36

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于制备多克隆区的引物 (b-3)

<400> 36

tatttgaatc gagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 60

tgt 63

<210> 37

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rrnB终止子扩增用引物 (a-4)

<400> 37

taactcgatt caaataaaac gaaaggctca gtcga 35

<210> 38

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rrnB终止子扩增用引物 (b-4)

<400> 38

cctagatccg cggagtttgt agaaacgcaa aaagg 35

<210> 39

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pUC19的DNA复制起始区扩增用引物 (a-5)

<400> 39

acaaactccg cggatctagg tgaagatcct ttttg 35

<210> 40

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pUC19的DNA复制起始区扩增用引物 (b-5)

<400> 40

cgtccgcggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaa 35

<210> 41

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> nptII基因扩增用引物 (a-6)

<400> 41

ttgctggccg cggacgtaga aagccagtcc gcaga 35

<210> 42

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> nptII基因扩增用引物 (b-6)

<400> 42

ggcccgggtt ataaaagcca gtcattaggc ctatc 35

<210> 43

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 插入的pTH1的DNA片段扩增用引物 (a-7)

<400> 43

aattgtcaga taggcctaat gactggcttt tataa 35

<210> 44

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 插入的pTH1的DNA片段扩增用引物 (b-7)

<400> 44

tgacgccaga agcattggtg caccgtgcag tcgat 35

Claims

1.转化体，其通过将天冬氨酸脱氢酶基因导入嗜氢菌属细菌中而得到。

2.根据权利要求1所述的转化体，其中，所述天冬氨酸脱氢酶基因是选自下述（1）～（6）的任一项中的DNA：

（1）由SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、或SEQ ID NO: 12的碱基序列组成的DNA、

（4）编码由SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ IDNO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、或SEQ ID NO: 27的氨基酸序列组成的多肽的DNA、

3.根据权利要求1或2所述的转化体，其中，所述天冬氨酸脱氢酶基因是选自下述（1）～（6）的任一者中的DNA：

（1）由SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、或SEQ ID NO: 11的碱基序列组成的DNA、

4.根据权利要求1～3中任一项所述的转化体，其中，所述嗜氢菌属细菌是热叶绿体嗜氢菌。

5.根据权利要求4所述的转化体，其中，所述热叶绿体嗜氢菌是热叶绿体嗜氢菌TH-1C菌株。

6.天冬氨酸的制造方法，其包括使用二氧化碳作为实质上唯一的碳源来培养权利要求1～5中任一项所述的转化体的步骤。

7.甲硫氨酸的制造方法，其包括使用二氧化碳作为实质上唯一的碳源来培养权利要求1～5中任一项所述的转化体的步骤。