CN114423855A

CN114423855A - 产乳酸的转基因嗜氢菌属细菌

Info

Publication number: CN114423855A
Application number: CN201980098975.3A
Authority: CN
Inventors: 汤川英明; 大谷直人
Original assignee: Co2 Resource Utilization Research Institute Co ltd
Current assignee: Co2 Resource Utilization Research Institute Co ltd
Priority date: 2019-08-09
Filing date: 2019-08-09
Publication date: 2022-04-29
Also published as: CA3148422A1; US20220290109A1; EP4012020A4; JP6675574B1; EP4012020A1; JPWO2021028993A1; WO2021028993A1

Abstract

在嗜氢菌属(Hydrogenophilus)细菌中，当将所述嗜氢菌属细菌基因组上的三个乳酸利用酶基因中的一者或多者破坏并将乳酸脱氢酶基因和/或苹果酸/乳酸脱氢酶基因引入到其中时，乳酸生产能力被显著提高。本发明的发明人已鉴定了所述嗜氢菌属细菌的三个乳酸利用酶基因。另外通过将乳酸透性酶基因引入到该转基因细菌中，乳酸生产能力被进一步提高。本发明的转基因细菌利用二氧化碳作为唯一碳源高效地产生乳酸。也就是说，该转基因细菌能够高效生产可生物降解塑料的原料，同时解决由二氧化碳增加导致的全球变暖问题。

Description

产乳酸的转基因嗜氢菌属细菌

技术领域

本发明涉及具有产乳酸能力的重组嗜氢菌属(Hydrogenophilus)细菌以及使用所述细菌生产乳酸的方法。

背景技术

2015年通过的《巴黎协定》(The Paris Agreement)规定，应迅速减少全球温室气体排放。根据所述协定，日本设定了到2030年将其温室气体例如二氧化碳和甲烷的排放量与2013年的水平相比减少26％的目标。

在世界范围内，大部分化学品的生产依赖于石油资源，加剧了温室气体排放增加的问题。因此，摆脱对石油的依赖是化学品生产的理想策略，并且各国正在认真开展从生物质生产绿色化学品的生物炼制的研究和开发。然而，用作微生物发酵的原材料的生物质的糖化除了成本高之外还需要复杂的工艺。

作为试图摆脱对石油的依赖的研究的一部分，诸如二氧化碳、甲烷和一氧化碳等的气体作为更加可持续的碳源备受关注，并且使用利用这些气体的微生物生产有价值的化学品和生物燃料的技术成为让人有浓厚兴趣的主题。尤其是作为气候变暖的重要贡献者的二氧化碳的碳固定和二氧化碳的高效利用，备受期待。

鉴于海洋被塑料垃圾污染等问题，最终被自然界中的微生物分解成水和二氧化碳的可生物降解塑料已引起关注。可生物降解塑料根据制造方法分为细菌产物系列、天然产物系列和化学合成系列。在所有可生物降解塑料中研究和实际实现进展最快的聚乳酸(乳酸树脂)被认为是介于细菌产物系列与化学合成系列之间的一种可生物降解塑料中间体，因为它的原材料是乳酸，是糖酵解系统这种活体内代谢途径的产物。也就是说，聚乳酸通过纯化由微生物发酵产生的乳酸并进行化学缩聚来生产。目前的聚乳酸生产使用生物质作为原材料，如前所述将生物质转化成糖需要复杂的步骤，因此目前的聚乳酸生产具有成本高的问题。

因此，需要一种能够以更简单的步骤生产乳酸的实用方法，特别是能够通过二氧化碳固定生产乳酸的实用方法。

乳酸从丙酮酸这种重要的活体内代谢产物产生。也就是说，乳酸通过乳酸脱氢酶的催化活性从丙酮酸产生。

作为使用重组微生物制造乳酸的技术，专利文献1描述了一种使用通过将瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)或巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的乳酸脱氢酶基因(ldh基因)引入到酵母菌株中而获得的转化体来生产乳酸的方法。

专利文献2描述了一种使用通过将戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)LDH基因作为乳酸脱氢酶基因引入到粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中而获得的转化体来生产乳酸的方法。

专利文献3描述了一种使用通过将Thermoanaerobacter pseudethanolicus ldh基因作为乳酸脱氢酶基因引入到热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)中而获得的转化体来生产乳酸的方法。

专利文献4描述了一种使用通过将德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)hdhD基因或ldhA基因作为乳酸脱氢酶基因引入到热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillusthermoglucosidans)中而获得的转化体来生产乳酸的方法。

非专利文献1描述了一种使用通过将干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的乳酸脱氢酶基因引入到大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)中而获得的转化体来生产乳酸的方法。

然而，所有这些方法都是使用糖作为碳源生产乳酸的方法，而不是使用二氧化碳作为碳源生产乳酸的方法。

非专利文献2描述了一种使用通过将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的乳酸脱氢酶基因引入到集胞藻属(Synechocystis sp.)菌株PCC6803中而获得的转化体来生产乳酸的方法。这种方法使用蓝细菌这种光合细菌作为宿主并使用碳酸氢钠作为碳源来生产乳酸。

蓝细菌与植物相比具有更高的二氧化碳固碳能力。然而，由于蓝细菌的二氧化碳固定能力不足，使用蓝细菌作为宿主的方法尚未作为生产乳酸的工业化方法投入实用。

专利文献5描述了一种使用通过将嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)ldh基因作为乳酸脱氢酶基因引入到嗜热氢杆菌(Hydrogenobacter thermophilus)中而获得的转化体来生产乳酸的方法。

嗜热氢杆菌是一种氢氧化细菌，其在1.5小时内生长两倍。然而，为了生产足够量的乳酸需要施加电流，因此使用嗜热氢杆菌作为宿主的方法尚未作为生产乳酸的工业化方法投入实用。

引文列表

专利文献

[专利文献1]JP2005-528106A

[专利文献2]JP2014/030655A1

[专利文献3]JP2015-023854A

[专利文献4]JP2017-523778A

[专利文献5]JP2017-093465A

非专利文献

[非专利文献1]在代谢工程改造的大肠埃希氏杆菌RR1中同型发酵生产D或L-乳酸(Homofermentative production of D-or L-lactate in metabolically engineeredEscherichia coli RR1)，Chang DE,Jung HC,Rhee JS,Pan JG.Appl.Environ.Microbiol.(1999)65:1384-1389

[非专利文献2]工程化改造蓝细菌细胞工厂以生产乳酸(Engineering acyanobacterial cell factory for production of lactic acid)，Angermayr SA,Paszota M,Hellingwerf KJ.Appl.Environ.Microbiol.(2012)78:7098-7106

发明内容

技术问题

本发明的目的是提供一种能够利用二氧化碳作为唯一碳源高效生产乳酸的重组嗜氢菌属细菌，以及使用这种重组体高效生产乳酸的方法。

技术解决方案

嗜氢菌属细菌是氢氧化细菌，其通过利用氢能从二氧化碳产生有机物质来生长。氢氧化细菌的生长速率通常极为缓慢，但嗜氢菌属细菌的生长速率快，并且它们的二氧化碳固碳能力明显高于植物和光合细菌。

然而，嗜氢菌属细菌不具有在工业规模上生产乳酸的能力。嗜氢菌属细菌不具有已知编码催化从丙酮酸产生乳酸的反应的酶的乳酸脱氢酶基因和苹果酸/乳酸脱氢酶基因。为了向所述细菌提供在工业规模上生产乳酸的能力，需要引入催化产生乳酸的反应的酶的基因。

然而，本发明的发明人的研究显示，当使用在嗜氢菌属细菌中有功能的载体将异源基因引入到嗜氢菌属细菌中时，有功能的蛋白质通常不会产生或不会足量产生。在嗜氢菌属之外的细菌中引起活性的基因在嗜氢菌属细菌中通常不引起或不足量地引起活性。

面对这种情况，本发明的发明人发现，当将乳酸脱氢酶基因和/或苹果酸/乳酸脱氢酶基因引入到嗜氢菌属细菌中时，所述基因在嗜氢菌属细菌中发挥作用并引起高活性。

此外，本发明的发明人发现，作为乳酸脱氢酶基因的热葡萄糖苷酶副地芽孢杆菌(Parageobacillus thermoglucosidasius)、嗜热地芽孢杆菌(Geobacilluskaustophilus)或嗜热栖热菌的ldh基因和作为苹果酸/乳酸脱氢酶基因的嗜热栖热菌的mldh基因和红色亚栖热菌(Meiothermus ruber)的mldh-1和mldh-2基因引起更高的酶活性表达，特别是在嗜氢菌属细菌中。

已知嗜氢菌属细菌利用乳酸(Agric.Biol.Chem.(1978)42(7):1305-1308；Orlygsson J.,Kristjansson J.K.(2014)嗜氢菌科(The FamilyHydrogenophilaceae)，Rosenberg E.,DeLong E.F.,Lory S.,Stackebrandt E.,Thompson F.主编，《原核生物》(The Prokaryotes)，Springer,Berlin,Heidelberg)。

本发明的发明人推测，并排出现在Hydrogenophilus thermoluteolus的基因组上的HPTL_1694、HPTL_1695和HPTL_1696基因起到乳酸利用酶基因的作用。

可以想象，当乳酸利用酶基因发挥作用时，在嗜氢菌属细菌的细胞内产生的乳酸被利用，因此分泌到培养基上清液中的乳酸的量减少。

本发明的发明人已经观察到，在其中引入有乳酸脱氢酶基因和/或苹果酸/乳酸脱氢酶基因的Hydrogenophilus thermoluteolus转化体中，当基因组上的HPTL_1694、HPTL_1695和HPTL_1696中的一个或多个基因被破坏时，分泌到培养基中的乳酸的量显著增加。有鉴于此，本发明人推断HPTL_1694、HPTL_1695和HPTL_1696基因是乳酸利用酶基因。

HPTL_1694、HPTL_1695和HPTL_1696基因中的任一者或多者的破坏增强得到的细胞的乳酸生产能力，因此可以设想这三个基因形成操纵子，并且由这些基因编码的三个蛋白质形成复合体，表现出利用乳酸的功能。

本发明的发明人还观察到上述乳酸利用酶基因被破坏的菌株极为高效地通过使用二氧化碳作为唯一碳源生产乳酸。

本发明的发明人还观察到，当将编码促进乳酸分泌到细胞外的乳酸透性酶的基因引入到其中引入有乳酸脱氢酶基因和/或苹果酸/乳酸脱氢酶基因的嗜氢菌属细菌的乳酸利用酶基因被破坏的菌株中时，分泌到培养基中的乳酸的量进一步增加。

本发明在上述观察的基础上得以完成，并提供了下述条目[1]至[8]。

[1]一种重组嗜氢菌属细菌，其具有引入到其中的乳酸脱氢酶基因和/或苹果酸/乳酸脱氢酶基因，并且其中基因组上的三个乳酸利用酶基因中的一者或多者被破坏。

[2]根据条目[1]所述的重组嗜氢菌属细菌，其中所述三个乳酸利用酶基因分别由下述(a1)至(a6)中的任一者的DNA、下述(b1)至(b6)中的任一者的DNA和下述(c1)至(c6)中的任一者的DNA形成：

(a1)由SEQ ID NO：1中阐述的碱基序列形成的DNA；

(a2)由与SEQ ID NO：1中阐述的碱基序列具有90％或更高同一性的碱基序列形成，并编码具有乳酸利用酶活性的多肽的DNA；

(a3)在严紧条件下与由SEQ ID NO：1的互补碱基序列形成的DNA杂交，并编码具有乳酸利用酶活性的多肽的DNA；

(a4)编码由SEQ ID NO：2中阐述的氨基酸序列形成的多肽的DNA；

(a5)编码由与SEQ ID NO：2具有90％或更高同一性的氨基酸序列形成并具有乳酸利用酶活性的多肽的DNA；和

(a6)编码由在SEQ ID NO：2中阐述的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸缺失、替换或添加的氨基酸序列形成并具有乳酸利用酶活性的多肽的DNA；

(b1)由SEQ ID NO：3中阐述的碱基序列形成的DNA；

(b2)由与SEQ ID NO：3中阐述的碱基序列具有90％或更高同一性的碱基序列形成，并编码具有乳酸利用酶活性的多肽的DNA；

(b3)在严紧条件下与由SEQ ID NO：3的互补碱基序列形成的DNA杂交，并编码具有乳酸利用酶活性的多肽的DNA；

(b4)编码由SEQ ID NO：4中阐述的氨基酸序列形成的多肽的DNA；

(b5)编码由与SEQ ID NO：4具有90％或更高同一性的氨基酸序列形成并具有乳酸利用酶活性的多肽的DNA；和

(b6)编码由在SEQ ID NO：4中阐述的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸缺失、替换或添加的氨基酸序列形成并具有乳酸利用酶活性的多肽的DNA；和

(c1)由SEQ ID NO：5中阐述的碱基序列形成的DNA；

(c2)由与SEQ ID NO：5中阐述的碱基序列具有90％或更高同一性的碱基序列形成，并编码具有乳酸利用酶活性的多肽的DNA；

(c3)在严紧条件下与由SEQ ID NO：5的互补碱基序列形成的DNA杂交，并编码具有乳酸利用酶活性的多肽的DNA；

(c4)编码由SEQ ID NO：6中阐述的氨基酸序列形成的多肽的DNA；

(c5)编码由与SEQ ID NO：6具有90％或更高同一性的氨基酸序列形成并具有乳酸利用酶活性的多肽的DNA；和

(c6)编码由在SEQ ID NO：6中阐述的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸缺失、替换或添加的氨基酸序列形成并具有乳酸利用酶活性的多肽的DNA。

[3]根据条目[1]或[2]所述的重组嗜氢菌属细菌，其中所述三个乳酸利用酶基因中的一者或多者通过在所述三个乳酸利用酶基因中的一者或多者中引入一个或多个核苷酸的缺失、添加、替换或其组合而被破坏。

[4]根据条目[1]至[3]中的任一者所述的重组嗜氢菌属细菌，其中所述乳酸脱氢酶基因由下述(d1)至(d6)中的任一者的DNA形成：

(d1)由SEQ ID NO：9、10或11中阐述的碱基序列形成的DNA；

(d2)由与SEQ ID NO：9、10或11中阐述的碱基序列形成的DNA具有90％或更高同一性的碱基序列形成，并编码具有乳酸脱氢酶活性的多肽的DNA；

(d3)在严紧条件下与由SEQ ID NO：9、10或11的互补碱基序列形成的DNA杂交，并编码具有乳酸脱氢酶活性的多肽的DNA；

(d4)编码由SEQ ID NO：12、13或14中阐述的氨基酸序列形成的多肽的DNA；

(d5)编码由与SEQ ID NO：12、13或14具有90％或更高同一性的氨基酸序列形成并具有乳酸脱氢酶活性的多肽的DNA；和

(d6)编码由在SEQ ID NO：12、13或14中阐述的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸缺失、替换或添加的氨基酸序列形成并具有乳酸脱氢酶活性的多肽的DNA。

[5]根据条目[1]至[4]中的任一者所述的重组嗜氢菌属细菌，其中所述苹果酸/乳酸脱氢酶基因由下述(e1)至(e6)中的任一者的DNA形成：

(e1)由SEQ ID NO：15、16或17中阐述的碱基序列形成的DNA；

(e2)由与SEQ ID NO：15、16或17中阐述的碱基序列形成的DNA具有90％或更高同一性的碱基序列形成，并编码具有乳酸脱氢酶活性的多肽的DNA；

(e3)在严紧条件下与由SEQ ID NO：15、16或17的互补碱基序列形成的DNA杂交，并编码具有乳酸脱氢酶活性的多肽的DNA；

(e4)编码由SEQ ID NO：18、19或20中阐述的氨基酸序列形成的多肽的DNA；

(e5)编码由与SEQ ID NO：18、19或20具有90％或更高同一性的氨基酸序列形成并具有乳酸脱氢酶活性的多肽的DNA；和

(e6)编码由在SEQ ID NO：18、19或20中阐述的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸缺失、替换或添加的氨基酸序列形成并具有乳酸脱氢酶活性的多肽的DNA。

[6]根据条目[1]至[5]中的任一者所述的重组嗜氢菌属细菌，其中所述重组嗜氢菌属细菌还具有引入到其中的乳酸透性酶基因。

[7]根据条目[6]所述的重组嗜氢菌属细菌，其中所述乳酸透性酶基因由下述(f1)至(f6)中的任一者的DNA形成：

(f1)由SEQ ID NO：21中阐述的碱基序列形成的DNA；

(f2)由与SEQ ID NO：21中阐述的碱基序列形成的DNA具有90％或更高同一性的碱基序列形成，并编码具有乳酸透性酶活性的多肽的DNA；

(f3)在严紧条件下与由SEQ ID NO：21的互补碱基序列形成的DNA杂交，并编码具有乳酸透性酶活性的多肽的DNA；

(f4)编码由SEQ ID NO：22中阐述的氨基酸序列形成的多肽的DNA；

(f5)编码由与SEQ ID NO：22具有90％或更高同一性的氨基酸序列形成并具有乳酸透性酶活性的多肽的DNA；和

(f6)编码由在SEQ ID NO：22中阐述的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸缺失、替换或添加的氨基酸序列形成并具有乳酸透性酶活性的多肽的DNA。

[8]一种生产乳酸的方法，所述方法包括利用二氧化碳作为基本上唯一的碳源培养条目[1]至[7]中的任一者所述的重组嗜氢菌属细菌的步骤。

有利效果

应对大气中二氧化碳增加的措施需要减少二氧化碳排放并固定排放出的二氧化碳。为了减少二氧化碳排放，利用太阳能、风能、地热能和类似能源来代替化石能源。然而，此类能源的利用广度尚不足以抑制大气中二氧化碳的积累。因此，有必要加强大气碳固定或排放的二氧化碳的循环利用。

二氧化碳的碳固定可以通过物理或化学方式进行，但利用活细胞的固定产生有机物质，因此可用作食品、饲料和燃料。这样一来，二氧化碳本身变成了一种可以被直接转化成有价值的化学产品的资源。因此，由大气中的二氧化碳增加造成的全球变暖和食品、饲料和燃料短缺的双重问题可以得到解决。此外，在抑制因二氧化碳排放增加引起的全球变暖的同时，还可以生产非常需要的化学产品。

化学产品中的可生物降解塑料由于其环境益处而受到关注。通过二氧化碳固定产生的可生物降解塑料被环境中的微生物分解成水和二氧化碳。也就是说，可生物降解塑料是碳中和的，能够同时解决由二氧化碳排放增加引起的全球变暖、获得生活必需的塑料产品的困难和环境问题例如海洋污染。

氢氧化细菌可以通过利用由氢气与氧气的反应产生的化学能并使用二氧化碳作为唯一碳源来生长。由于氢氧化细菌可以从氧气、氢气和二氧化碳的混合物作为原材料生产化学产品，因此所述细胞可以高效地从二氧化碳同化碳并在简单培养基中培养。典型的氢氧化细菌通常生长缓慢，但嗜氢菌属细菌的生产速率格外高。三菱综合研究所杂志(TheJournal of Mitsubishi Research Institute)第34期1999将嗜氢菌属细菌描述如下：“它们的增殖能力如此之高，使得它们对二氧化碳的碳固定能力无法与植物相比，这真正说明了微生物的高二氧化碳固定能力。”

当使用在嗜氢菌属细菌中起作用的载体将异源基因引入到嗜氢菌属细菌中时，通常不产生有功能的蛋白质。在这种情况下，通过将乳酸脱氢酶基因和/或苹果酸/乳酸脱氢酶基因引入到嗜氢菌属细菌中，所述基因在嗜氢菌属细菌中起作用，并且可以高效生产乳酸。

当将上述嗜氢菌属细菌的转化体的基因组上的三个乳酸利用酶基因中的一者或多者破坏时，可以显著提高培养基中产生的乳酸的量。

当进一步将乳酸透性酶基因引入到所述其中引入有乳酸脱氢酶基因和/或苹果酸/乳酸脱氢酶基因的嗜氢菌属细菌的乳酸利用酶基因被破坏的菌株中时，所述乳酸透性酶基因在所述重组菌株中起作用，提高了分泌到培养基中的乳酸的量。通过破坏充当宿主的嗜氢菌属细菌的乳酸利用酶基因，引入乳酸透性酶基因的乳酸分泌量提高效果被显著增强。

如上所述，在具有二氧化碳固定能力的微生物中，嗜氢菌属细菌具有特别出色的二氧化碳固定能力。因此，使用本发明的重组体能够通过固定二氧化碳进行乳酸的工业生产。乳酸充当生产聚乳酸这种典型的可生物降解塑料的原材料，因此本发明为利用二氧化碳高效工业生产聚乳酸铺平了道路。

附图说明

图1是示意图，说明了产生乳酸利用酶基因被破坏的菌株的实例的方法。

具体实施方式

下面详细描述本发明。

本发明的重组嗜氢菌属细菌是其中引入有乳酸脱氢酶基因和/或苹果酸/乳酸脱氢酶基因，并且其中基因组上的三个乳酸利用酶基因中的一者或多者被破坏的重组嗜氢菌属细菌。

(1)嗜氢菌属细菌

嗜氢菌属细菌的实例包括Hydrogenophilus thermoluteolus、Hydrogenophilushalorhabdus、反硝化嗜氢菌(Hydrogenophilus denitrificans)、Hydrogenophilushirschii、Hydrogenophilus islandicus、嗜氢菌属菌株Mar3(Hydrogenophilus sp.Mar3)和嗜氢菌属菌株Z1038(Hydrogenophilus sp.Z1038)。具体来说，Hydrogenophilusthermoluteolus是优选的，因为它的优越生长速率使其从二氧化碳固定碳的能力在固定二氧化碳的微生物中处于顶级水平。

已从遍及地球的多种多样的区域容易地分离到嗜氢菌属细菌。优选的Hydrogenophilus thermoluteolus菌株是菌株TH-1(NBRC 14978)。Hydrogenophilusthermoluteolus菌株TH-1(NBRC 14978)在固定二氧化碳的微生物中表现出顶级水平的生长速率(Agricultural and Biological Chemistry,41,685-690(1977))。Hydrogenophilus thermoluteolus菌株NBRC 14978根据布达佩斯公约(Budapest Treaty)被国际保藏，因此可供公众使用。

(2)乳酸利用酶基因

(2-1)野生型乳酸利用酶基因

野生型嗜氢菌属细菌在基因组上具有三个乳酸利用酶基因，并且由这些基因编码的多肽形成乳酸利用酶复合体(被认为是一种乳酸氧化酶复合体)。野生型嗜氢菌属细菌产生具有活性的乳酸利用酶复合体，因此具有乳酸利用能力。

所述三个野生型乳酸利用酶基因分别由下述(a1)至(a6)中的任一者的DNA、下述(b1)至(b6)中的任一者的DNA和下述(c1)至(c6)中的任一者的DNA形成：

(a1)由SEQ ID NO：1中阐述的碱基序列形成的DNA；

(a4)编码由SEQ ID NO：2中阐述的氨基酸序列形成的多肽的DNA；

(a6)编码由在SEQ ID NO：2中阐述的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸缺失、替换或添加的氨基酸序列形成并具有乳酸利用酶活性的多肽的DNA。

SEQ ID NO：1阐述了Hydrogenophilus thermoluteolus野生型菌株的HPTL_1694基因的碱基序列，并且SEQ ID NO：2阐述了由Hydrogenophilus thermoluteolus野生型菌株的HPTL_1694基因编码的多肽的氨基酸序列。

(b1)由SEQ ID NO：3中阐述的碱基序列形成的DNA；

(b4)编码由SEQ ID NO：4中阐述的氨基酸序列形成的多肽的DNA；

(b6)编码由在SEQ ID NO：4中阐述的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸缺失、替换或添加的氨基酸序列形成并具有乳酸利用酶活性的多肽的DNA。

SEQ ID NO：3阐述了Hydrogenophilus thermoluteolus野生型菌株的HPTL_1695基因的碱基序列，并且SEQ ID NO：4阐述了由Hydrogenophilus thermoluteolus野生型菌株的HPTL_1695基因编码的多肽的氨基酸序列。

(c1)由SEQ ID NO：5中阐述的碱基序列形成的DNA；

(c4)编码由SEQ ID NO：6中阐述的氨基酸序列形成的多肽的DNA；

SEQ ID NO：5阐述了Hydrogenophilus thermoluteolus野生型菌株的HPTL_1696基因的碱基序列，并且SEQ ID NO：6阐述了由Hydrogenophilus thermoluteolus野生型菌株的HPTL_1696基因编码的多肽的氨基酸序列。

在本发明中，每个碱基序列和氨基酸序列的同一性是使用GENETYX第17版(由Genetyx Corporation制造)计算的值。

在本发明中，术语“严紧条件”是指下述条件：杂交在具有6×SSC的盐浓度的杂交溶液中，在50℃至60℃的温度下进行16小时，然后在具有0.1×SSC的盐浓度的溶液中进行清洗。

所述(a2)、(b2)或(c2)的DNA优选地分别由与SEQ ID NO：1、3或5中阐述的碱基序列具有95％或更高、特别是98％或更高、特别是99％或更高同一性的碱基序列形成。

所述(a5)、(b5)或(c5)的DNA优选地分别编码由与SEQ ID NO：2、4或6中阐述的氨基酸序列具有95％或更高、特别是98％或更高、特别是99％或更高同一性的氨基酸序列形成的多肽。

在本发明中，数目“一个或多个氨基酸”是例如1至5个，特别是1至3个，特别是1或2个，特别是1个。所述多个包含几个。

待测试的多肽具有乳酸利用酶活性这一事实，通过将所述待测试的多肽和其他两个野生型乳酸利用酶与5mM乳酸在120μg/mL的吩嗪硫酸甲酯(PMS)和60μg/mL的3-(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)存在下进行反应，并检测570nm处的吸光度增加来核实。与其中乳酸被氧化成丙酮酸的乳酸氧化酶反应一起，MTT在PMS存在下被还原成甲瓒，因此570nm处的吸光度增加。当所述待测试的多肽显示出即使是轻微的570nm处的吸光度的增加时，判断形成的乳酸利用酶复合体显示出乳酸氧化酶活性，并因此判断所述待测试的多肽具有乳酸利用酶活性。

例如，当所述待测试的多肽是由与SEQ ID NO：1相似的碱基序列编码的多肽时，将所述待测试的多肽、由SEQ ID NO：2编码的多肽和由SEQ ID NO：3编码的多肽与乳酸在PMS和MTT存在下进行反应。

(2-2)乳酸利用酶基因的破坏

在本发明的重组嗜氢菌属细菌中，基因组上的上述三个乳酸利用酶基因中的一者或多者被破坏。结果，具有活性的乳酸利用酶复合体不会形成，或者活性低于野生型乳酸利用酶复合体的活性。

在本发明中，所述重组嗜氢菌属细菌不形成具有活性的乳酸利用酶复合体或形成与野生型乳酸利用酶复合体相比具有更低活性的乳酸利用酶复合体这一事实，可以通过所述重组嗜氢菌属细菌不能在含有乳酸作为唯一碳源的培养基中生长或具有比野生菌株更低的生长速率这一事实来核实。

为了破坏乳酸利用酶基因，缺失所述乳酸利用酶基因的全部或一部分通常是适合的。乳酸利用酶基因可以通过在基因中插入一些核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸来破坏。当基因破坏通过晚些时候描述的同源重组进行时，将正选择标志物基因插入到所述乳酸利用酶基因中是适合的。可以将所述乳酸利用酶基因的全部或一部分用其他核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸替换。

如上所述，通过一个或多个核苷酸的缺失、添加(包括插入)、替换或其组合(在后文中有时被称为“突变”)来破坏所述乳酸利用酶基因是适合的。当引入多个核苷酸的缺失、添加(包括插入)或替换时，所述突变可以被引入到所述基因中的一个位点处，或者可以被分散地引入到其中的多个位点处。

优选地，待缺失、添加(包括插入)或替换的核苷酸的数量为3个或更多，特别是5个或更多，特别是10个或更多，特别是20个或更多，特别是50个或更多。优选地，被缺失、添加(包括插入)或替换的核苷酸的数量对应于所述基因的全长的1％或更多，特别是5％或更多，特别是10％或更多，特别是50％或更多。这确保了所述乳酸利用酶基因的破坏。所述乳酸利用酶基因的全长(即所述乳酸利用酶基因的组成核苷酸数量的100％)可以被缺失或替换。在添加(包括插入)的情况下，可以添加多达100,000个核苷酸。可以添加多达1,000个或多达100个核苷酸。

除了缺失整个所述乳酸利用酶基因的情况之外，理想情况下上述突变被引入到编码所述乳酸利用酶的C-端附近的区域之外的位点处。这有助于所述乳酸利用酶基因功能的丧失或降低。例如，理想情况下，上述突变被引入到编码从所述乳酸利用酶的N-端起对应于全长的95％或更小、特别是90％或更小、特别是80％或更小的区域中。当编码所述乳酸利用酶的N-端附近的区域被突变时，在许多情况下所述多肽不表达或所述多肽不具有正常的高级结构，因此可以将上述突变引入到编码所述乳酸利用酶的N-端附近的区域中。

例如，通过经PCR等产生被破坏的乳酸利用酶基因，并将所述被破坏的基因引入到母体菌株中以引起所述被破坏的基因与基因组上的基因之间的同源重组，可以将染色体上的乳酸利用酶基因用所述被破坏的基因替换。

基于同源重组的基因破坏方法本身是公知的，但在嗜氢菌属细菌中利用同源重组来修饰基因组上的基因是前所未有的。本发明的发明人鉴定到一种在嗜氢菌属细菌中起作用并且可以用作正选择标志物的潮霉素抗性基因，并且鉴定到一种在嗜氢菌属细菌中(特别是在链霉素抗性菌株中)起作用并且可以用作反选择标志物的链霉素敏感基因。因此，通过使用这些基因，可以通过同源重组破坏嗜氢菌属细菌的乳酸利用酶基因。

在这种方法中，可以例如使用由SEQ ID NO：7中阐述的碱基序列形成的链霉素敏感基因作为反选择标志物。在这种方法中，可以例如使用由SEQ ID NO：8中阐述的碱基序列形成的潮霉素抗性基因作为在嗜氢菌属细菌中起作用的正选择标志物基因。

下面以涉及缺失乳酸利用酶基因内的部分区域的方法为例描述破坏乳酸利用酶基因的方法。图1是这种方法的图示说明。

在适合情况下，使用嗜氢菌属细菌的基因组DNA作为模板，通过进行PCR分别扩增由嗜氢菌属细菌的乳酸利用酶基因形成的DNA片段的待缺失区域的5’上游DNA区域和同一待缺失区域的3’DNA下游区域，并将通过所述5’上游区域与3’下游区域彼此相连而获得的DNA连接到可以在宿主例如大肠埃希氏杆菌中使用的载体。所述通过将待缺失区域的5’上游区域与3’下游区域彼此相连而获得的DNA，是其中乳酸利用酶基因的内部已被缺失的DNA。

为了提高同源重组效率，优选地所述5’上游DNA区域和3’下游DNA区域由10或更多个核苷酸、优选为50或更多个核苷酸、更优选为100或更多个核苷酸组成。或者，所述待彼此连接的DNA不必分别由与所述待缺失区域的5’上游区域和所述待缺失区域的3’下游区域完全相同的碱基序列形成，并且随着用于同源重组的区域的长度增加，同源重组可以利用与所述待缺失区域的5’上游区域或3’下游区域更低的同一性来引起。

然后，产生待插入到在载体上彼此相连的所述待缺失区域的5’上游区域与3’下游区域之间的标志物盒。在这里，所述标志物盒使得在嗜氢菌属细菌中起作用的链霉素敏感基因和在嗜氢菌属细菌中起作用的潮霉素抗性基因彼此相邻连接，或在其间插入有约10,000个碱基对或更小的DNA。

然后，在适合情况下，将所述标志物盒插入到载体上的待缺失区域的5’上游区域与3’下游区域之间，在所述载体中已插入有其中所述乳酸利用酶基因的内部已被缺失的DNA片段。此外，在适合情况下，按照常规方法，用得到的载体转化宿主，并从转化体提取所述载体。

然后，在适合情况下，通过用限制性酶切割所述载体的部分或所述载体与5’上游区域或3’下游区域之间的边界，将所述载体线性化，由此提供标记DNA片段。所述切割的进行使所述标志物盒处于被插入到所述待缺失区域的5’上游区域与3’下游区域之间的状态下。因此得到其中插入有所述标志物盒的标记DNA片段，在所述标志物盒中含有链霉素敏感基因的DNA片段和含有潮霉素抗性基因的DNA片段彼此相连。

在适合情况下，进行将所述标记DNA片段引入到嗜氢菌属细菌的链霉素抗性菌株中的操作，并通过使用潮霉素抗性的存在作为指标，选择其中所述链霉素抗性菌株的乳酸利用酶基因已被所述标记DNA片段替换的每个转化体。

DNA在嗜氢菌属细菌细胞中的引入可以通过已知方法来进行，例如氯化钙法、磷酸钙法、DEAE-葡聚糖介导的转染法或电脉冲法。

然后，为了消除所述插入到内部区段已被缺失的乳酸利用酶基因中的标志物盒，使用先前产生的其中乳酸利用酶基因内的区段已被缺失的DNA片段进行同源重组。

通过以不分开所述缺失的乳酸利用酶基因的方式进行切割，将所述其中插入有内部区段已被缺失的乳酸利用酶基因的载体线性化。在适合情况下，进行将所述线性DNA片段引入到链霉素敏感菌株(其中乳酸利用酶基因已被所述标记DNA片段替换的每个重组体)中的操作，并选择已变成链霉素抗性的菌株。选择具有链霉素抗性并且已失去潮霉素抗性的菌株也是优选的。因此获得了插入到乳酸利用酶基因中的标志物盒已被消除的重组体，也就是说在所述乳酸利用酶基因内具有缺失的重组体。

在适合情况下，确定得到的重组体的乳酸利用酶基因的碱基序列，以核实所述基因内部的缺失。

由于所述乳酸利用酶基因内部的区段缺失，所述重组体与嗜氢菌属细菌的母体菌株相比在使用乳酸作为唯一碳源的培养基中生长速率降低，或在其中不生长。

(3)乳酸利用酶基因被破坏的菌株的转化体

(3-1)乳酸脱氢酶基因·苹果酸/乳酸脱氢酶基因

本发明的重组体是作为上述嗜氢菌属细菌的乳酸利用酶基因被破坏的菌株并在其中引入有乳酸脱氢酶基因和/或苹果酸/乳酸脱氢酶基因的重组体。换句话说，这种重组体在基因组上具有被破坏的乳酸利用酶基因，并具有外源乳酸脱氢酶基因和/或苹果酸/乳酸脱氢酶基因。所述苹果酸/乳酸脱氢酶是具有乳酸脱氢酶活性的酶。可以引入两种或更多种乳酸脱氢酶基因，并且可以引入两种或更多种苹果酸/乳酸脱氢酶基因。

野生型嗜氢菌属细菌的基因组上的乳酸利用酶基因可以在引入所述乳酸脱氢酶基因和/或苹果酸/乳酸脱氢酶基因之前被破坏，或者所述乳酸脱氢酶基因和/或苹果酸/乳酸脱氢酶基因可以在基因组上的乳酸利用酶基因被破坏之前引入到野生型嗜氢菌属细菌中。

从良好的乳酸生产效率的观点来看，所述乳酸脱氢酶基因优选为(d1)热葡萄糖苷酶副地芽孢杆菌的ldh基因、嗜热地芽孢杆菌的ldh基因或嗜热栖热菌的ldh基因。

热葡萄糖苷酶副地芽孢杆菌的ldh基因的碱基序列阐述在SEQ ID NO：9中，嗜热地芽孢杆菌的ldh基因的碱基序列阐述在SEQ ID NO：10中，并且嗜热栖热菌的ldh基因的碱基序列阐述在SEQ ID NO：11中。

也可以优选地使用(d2)由与SEQ ID NO：9、10或11中阐述的碱基序列形成的DNA具有90％或更高、特别是95％或更高、特别是98％或更高、特别是99％或更高同一性的碱基序列形成，并编码具有乳酸脱氢酶活性的多肽的DNA。

也可以优选地使用(d3)在严紧条件下与由SEQ ID NO：9、10或11的互补碱基序列形成的DNA杂交，并编码具有乳酸脱氢酶活性的多肽的DNA。

也可以优选地使用(d4)编码由SEQ ID NO：12、13或14中阐述的氨基酸序列形成的多肽的DNA。SEQ ID NO：12阐述了热葡萄糖苷酶副地芽孢杆菌的乳酸脱氢酶的氨基酸序列，SEQ ID NO：13阐述了嗜热地芽孢杆菌的乳酸脱氢酶的氨基酸序列，并且SEQ ID NO：14阐述了嗜热栖热菌的乳酸脱氢酶的氨基酸序列。

也可以优选地使用(d5)编码由与SEQ ID NO：12、13或14具有90％或更高、特别是95％或更高、特别是98％或更高、特别是99％或更高同一性的氨基酸序列形成并具有乳酸脱氢酶活性的多肽的DNA。

也可以优选地使用(d6)编码由在SEQ ID NO：12、13或14中阐述的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸缺失、替换或添加的氨基酸序列形成并具有乳酸脱氢酶活性的多肽的DNA。

从良好的乳酸生产效率的观点来看，所述苹果酸/乳酸脱氢酶基因优选为(e1)嗜热栖热菌的mldh基因和红色亚栖热菌的mldh-1和mldh-2基因中的任一者。

嗜热栖热菌的mldh基因的碱基序列阐述在SEQ ID NO：15中，红色亚栖热菌的mldh-1基因的碱基序列阐述在SEQ ID NO：16中，并且红色亚栖热菌的mldh-2基因的碱基序列阐述在SEQ ID NO：17中。

也可以优选地使用(e2)由与SEQ ID NO：15、16或17中阐述的碱基序列形成的DNA具有90％或更高、特别是95％或更高、特别是98％或更高、特别是99％或更高同一性的碱基序列形成，并编码具有乳酸脱氢酶活性的多肽的DNA；或(e3)在严紧条件下与由SEQ ID NO：15、16或17的互补碱基序列形成的DNA杂交，并编码具有乳酸脱氢酶活性的多肽的DNA。

所述苹果酸/乳酸脱氢酶具有苹果酸脱氢酶活性和乳酸脱氢酶活性两者，但在本发明中，所述苹果酸/乳酸脱氢酶通过乳酸脱氢酶活性的存在来鉴定。

也可以优选地使用(e4)编码由SEQ ID NO：18、19或20中阐述的氨基酸序列形成的多肽的DNA。SEQ ID NO：18阐述了由嗜热栖热菌的苹果酸/乳酸脱氢酶(Mldh)基因编码的氨基酸序列，SEQ ID NO：19阐述了由红色亚栖热菌的苹果酸/乳酸脱氢酶(Mldh-1)基因编码的氨基酸序列，并且SEQ ID NO：20阐述了由红色亚栖热菌的苹果酸/乳酸脱氢酶(Mldh-2)基因编码的氨基酸序列。

也可以优选地使用(e5)编码由与SEQ ID NO：18、19或20具有90％或更高、特别是95％或更高、特别是98％或更高、特别是99％或更高同一性的氨基酸序列形成并具有乳酸脱氢酶活性的多肽的DNA DNA；或(e6)编码由在SEQ ID NO：18、19或20中阐述的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸缺失、替换或添加的氨基酸序列形成并具有乳酸脱氢酶活性的多肽的DNA。

在本发明中，多肽具有乳酸脱氢酶活性这一事实，通过将待测试的多肽与丙酮酸在NADH存在下进行反应，并检测340nm处的吸光度的降低来核实。乳酸脱氢酶从丙酮酸产生乳酸。在从丙酮酸生产乳酸中乳酸脱氢酶消耗NADH，因此使用340nm处的吸光度的降低作为指标来检测NADH量的减少。具体来说，执行在“实施例”章节中描述的方法。当所述待测试的多肽即使是轻微降低340nm处的吸光度时，也判断所述多肽具有乳酸脱氢酶活性。

(3-2)乳酸透性酶基因

本发明涵盖了作为上述嗜氢菌属细菌的乳酸利用酶基因被破坏的菌株，并在其中引入有乳酸脱氢酶基因和/或苹果酸/乳酸脱氢酶基因以及乳酸透性酶基因的重组体。换句话说，所述重组体在基因组上具有被破坏的乳酸利用酶基因，并具有外源或非本源的乳酸脱氢酶基因和/或苹果酸/乳酸脱氢酶基因以及外源或非本源的乳酸透性酶基因。

可以引入一种或两种或更多种的乳酸脱氢酶基因、苹果酸/乳酸脱氢酶基因和乳酸透性酶基因中的每一者。

所述野生型嗜氢菌属细菌的基因组上的乳酸利用酶基因可以在引入所述乳酸脱氢酶基因和/或苹果酸/乳酸脱氢酶基因以及乳酸透性酶基因之前被破坏，或者所述乳酸脱氢酶基因和/或苹果酸/乳酸脱氢酶基因以及乳酸透性酶基因可以在基因组上的乳酸利用酶基因被破坏之前引入到所述野生型嗜氢菌属细菌中。所述乳酸脱氢酶基因和/或苹果酸/乳酸脱氢酶基因可以在基因组上的乳酸利用酶基因被破坏之前引入到所述野生型嗜氢菌属细菌中，然后引入所述乳酸透性酶基因，或者所述乳酸透性酶基因可以在基因组上的乳酸利用酶基因被破坏之前引入到所述野生型嗜氢菌属细菌中，然后引入所述乳酸脱氢酶基因和/或苹果酸/乳酸脱氢酶基因。

从嗜氢菌属细菌的乳酸利用酶基因被破坏的菌株的良好的乳酸分泌效率的观点来看，所述乳酸透性酶基因优选为(f1)嗜热地芽孢杆菌的lutP基因。

嗜热地芽孢杆菌的lutP基因的碱基序列阐述在SEQ ID NO：21中。

也可以优选地使用(f2)由与SEQ ID NO：21中阐述的碱基序列形成的DNA具有90％或更高、特别是95％或更高、特别是98％或更高、特别是99％或更高同一性的碱基序列形成，并编码具有乳酸透性酶活性的多肽的DNA。

也可以优选地使用(f3)在严紧条件下与由SEQ ID NO：21的互补碱基序列形成的DNA杂交，并编码具有乳酸透性酶活性的多肽的DNA。

也可以优选地使用(f4)编码由SEQ ID NO：22中阐述的氨基酸序列形成的多肽的DNA。SEQ ID NO：22阐述了嗜热地芽孢杆菌的乳酸透性酶(LutP)的氨基酸序列。

也可以优选地使用(f5)编码由与SEQ ID NO：22具有90％或更高、特别是95％或更高、特别是98％或更高、特别是99％或更高同一性的氨基酸序列形成并具有乳酸透性酶活性的多肽的DNA。

也可以优选地使用(f6)编码由在SEQ ID NO：22中阐述的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸缺失、替换或添加的氨基酸序列形成并具有乳酸透性酶活性的多肽的DNA。

在本发明中，待测试的多肽具有乳酸透性酶活性这一事实，通过当将编码所述待测试的多肽的DNA引入到大肠埃希氏杆菌中然后培养时，与引入之前的宿主相比培养上清液中乳酸的生产量提高这一事实来核实。大肠埃希氏杆菌被用作宿主是因为大肠埃希氏杆菌具有乳酸脱氢酶基因并产生乳酸。

(3-3)产生转化体的方法

对获得转化体的方法进行了描述，所述方法包括将乳酸脱氢酶基因和/或苹果酸/乳酸脱氢酶基因以及乳酸透性酶基因引入到充当宿主的嗜氢菌属细菌的野生菌株或乳酸利用酶基因被破坏的菌株中。

用于将上述DNA引入到宿主中的质粒载体应该含有控制嗜氢菌属细菌内的自主复制功能的DNA，实例包括广宿主范围载体pRK415(GenBank：EF437940.1)、pBHR1(GenBank：Y14439.1)、pMMB67EH(ATCC 37622)、pCAR1(NCBI参考序列：NC_004444.1)、pC194(NCBI参考序列：NC_002013.1)、pK18mobsacB(GenBank：FJ437239.1)、pUB110(NCBI参考序列：NC_001384.1)等。

优选的启动子的实例包括tac启动子、lac启动子、trc启动子或来自于OxfordGenetics Ltd的启动子OXB1和OXB11至OXB20中的每一者。优选的终止子的实例包括大肠埃希氏杆菌rRNA操纵子rrnB的T1T2终止子、λ噬菌体的t0转录终止子、T7终止子等。

转化可以通过公知的方法来进行，例如氯化钙法、磷酸钙法、DEAE-葡聚糖转染法和电脉冲法。

嗜氢菌属细菌在自养条件下生长。然而，由于它们也可以在异养条件下生长，因此用于培养嗜氢菌属细菌、嗜氢菌属细菌的乳酸利用酶基因被破坏的菌株或嗜氢菌属细菌转化体的培养基可以是无机培养基或有机培养基。可以使用包含糖、有机酸、氨基酸等的有机培养基。然而，乳酸利用酶基因被破坏的菌株不具有乳酸利用能力或具有降低的乳酸利用能力，因此理想情况下不将含有乳酸作为唯一碳源的培养基用于培养所述菌株。培养基的pH可以被调整到大约6.2至8。

在任何情况下，培养可以在供应含有氢气、氧气和二氧化碳的气体混合物、优选为由氢气、氧气和二氧化碳组成的气体混合物的同时进行。当使用有机培养基时，可以将含有氢气、氧气和二氧化碳的气体混合物例如空气用于通气。当不供应二氧化碳气体时，可以使用含有碳酸盐作为碳源的培养基。混合气体可以被捕获在气密培养容器内或连续供应到气密培养容器中，并且可以利用振摇培养溶解在培养基中。可选地，所述培养容器可以是气密或开放式的，并且可以通过鼓泡将混合气体溶解在培养基中。

所述供应气体中氢气、氧气和二氧化碳的体积比(氢气：氧气：二氧化碳)优选为1.75至7.5:1:0.25至3，更优选为5至7.5:1:1至2，更优选为6.25至7.5:1:1.5。嗜氢菌属细菌是嗜热细菌，因此培养温度优选为35至55℃，更优选为37至52℃，甚至更优选为50至52℃。

当所述乳酸脱氢酶基因和/或苹果酸/乳酸脱氢酶基因以及所述乳酸透性酶基因两者均被引入到所述乳酸利用酶基因被破坏的菌株中时，所述乳酸透性酶基因可以通过将所述乳酸脱氢酶基因和/或苹果酸/乳酸脱氢酶基因以及所述乳酸透性酶基因克隆到同一质粒载体中来引入，或者可以通过克隆到不同质粒载体中来引入。

所述乳酸脱氢酶基因、苹果酸/乳酸脱氢酶基因和乳酸透性酶基因可以各自通过同源重组等并入到所述嗜氢菌属细菌的乳酸利用酶基因被破坏的菌株的基因组上。

(4)生产乳酸的方法

当使用上述嗜氢菌属细菌的转化体生产乳酸时，所述转化体可以使用无机或有机培养基培养，同时供应含有氢气、氧气和二氧化碳的气体混合物。

所述供应的气体优选为由氢气、氧气和二氧化碳组成的气体混合物。然而，可以在其中混合不同种类的气体，只要可以高效生产乳酸即可。

嗜氢菌属细菌可以使用氢气作为能源并使用二氧化碳作为唯一碳源生长，因此，通过基本上仅使用二氧化碳(特别是通过仅使用二氧化碳)作为碳源生产上述化合物，二氧化碳可以被特别高效地固定。因此，使用不含诸如有机物质和碳酸盐的碳源的无机培养基，即基本上仅使用二氧化碳(特别是仅使用二氧化碳)作为碳源进行培养是优选的。“基本上仅使用二氧化碳作为碳源”涵盖了其中混合有不可避免的量的其他碳源的情况。此外，也可以使用含有有机物质例如糖、有机酸和氨基酸以及碳酸盐的培养基，而不供应二氧化碳。

所述培养基的pH优选为6.2至8，更优选为6.4至7.4，更优选为6.6至7。当pH在该范围内时，细菌生长良好且混合气体在培养基中溶解良好，并且可以高效生产乳酸。

当使用分批培养时，混合气体可以被捕获在气密培养容器内，并且可以进行静置培养或振摇培养。当使用连续培养时，混合气体可以被连续供应到气密培养容器中并且可以进行振摇培养，或者可以使用气密培养容器培养重组体，同时通过鼓泡将混合气体引入到培养基中。振摇培养是优选的，因为可以实现混合气体在培养基中的更好溶解。

所述供应气体混合物中氢气、氧气和二氧化碳的体积比(氢气：氧气：二氧化碳)优选为1.75至7.5:1:0.25至3，更优选为5至7.5:1:1至2，甚至更优选为6.25至7.5:1:1.5。当体积比在这个范围内时，细菌生长良好，并且可以高效生产目标化合物。

混合气体或原料气体的供应速率可以是每1L培养基10.5至60L/小时，特别是10.5至40L/小时，特别是10.5至21L/小时。当供应速率在这个范围内时，转化体生长良好，可以高效生产目标化合物，并且可以减少废混合气体的量。

培养温度优选为35至55℃，更优选为37至52℃，甚至更优选为50至52℃。当温度在这个范围内时，转化体生长良好，并且可以高效生产乳酸。

通过以上述方式进行培养，在反应溶液中产生目标化合物乳酸。收集所述反应溶液能够回收乳酸，然而，也可以通过遵照公知方法从所述反应溶液进一步分离乳酸。此类公知方法包括沉淀法、分馏和电渗析。

实施例

接下来将参考实施例进一步详细描述本发明，但本发明不限于这些实施例。

(1)链霉素抗性菌株的获取

使用铂环将Hydrogenophilus thermoluteolus TH-1菌株(NBRC14978)(在后文中有时被称为“TH-1菌株”)接种在其中放置有5mL A液体培养基[在1L蒸馏水中溶解有3.0g(NH₄)₂SO₄、1.0g KH₂PO₄、2.0g K₂HPO₄、0.25g NaCl、0.014g FeSO₄·7H₂O、0.5g MgSO₄·7H₂O、0.03g CaCl₂、4.0mg MoO₃、28mg ZnSO₄·7H₂O、2.0mg CuSO₄·5H₂O、4.0mg H₃BO₃、4.0mgMnSO₄·5H₂O和4.0mg CoCl₂·6H₂O(pH 7.0)]的试管中，所述试管充有H₂:O₂:CO₂＝7.5:1:1.5的混合气体，并在50℃进行振摇培养。24小时后，将培养液施加到含有500μg/mL链霉素的A固体培养基[在1L蒸馏水中溶解有3.0g(NH₄)₂SO₄、1.0g KH₂PO₄、2.0g K₂HPO₄、0.25gNaCl、0.014g FeSO₄·7H₂O、0.5g MgSO₄·7H₂O、0.03g CaCl₂、4.0mg MoO₃、28mg ZnSO₄·7H₂O、2.0mg CuSO₄·5H₂O、4.0mg H₃BO₃、4.0mg MnSO₄·5H₂O、4.0mg CoCl₂·6H₂O和15g琼脂(pH 7.0)]上，并在充有H₂:O₂:CO₂＝7.5:1:1.5的混合气体的培养箱中在50℃培养60小时。

结果，在含有500μg/mL链霉素的A固体培养基上能够识别出三个菌落的形成。这些生长的菌株是TH-1菌株的链霉素抗性菌株，并且所述菌株之一被命名为NOC269菌株。

(2)标志物盒的构建

(2-1)反选择标志物的制备

按照常规方法从TH-1菌株的野生菌株(链霉素敏感菌株)提取基因组DNA。使用所述提取的基因组DNA作为模板，通过PCR方法扩增含有rpsL基因的DNA片段，所述基因是编码核糖体蛋白S12的链霉素敏感基因。将下述引物用于所述PCR。PCR使用由LifeTechnologies Corporation制造的“DNA热循环仪”并使用KOD FX Neo(由Toyobo Co.,Ltd.制造)作为反应试剂，通过常规方法来进行。

用于扩增TH-1菌株的野生型rpsL基因的引物：

(a-1)5’-ATACGCGTCCTCCGATGCGTCGTAAGGGAAACGTC-3’(SEQ ID NO：23)

(b-1)5’-ATAGTCGACTTATTTCTTGCCCGCAGCGGCGCCCG-3’(SEQ ID NO：24)

引物(a-1)添加有MluI限制性酶位点，引物(b-1)添加有SalI限制性酶位点。

(2-2)正选择标志物的制备

使用含有潮霉素抗性基因(在后文中有时被称为“hph”)序列的质粒pJR225(GenBank：K01193)[Gene,25,179-188(1983)]的DNA作为模板，通过PCR方法扩增含有所述hph基因的DNA片段。将下述引物用于所述PCR。PCR使用由Life Technologies Corporation制造的“DNA热循环仪”并使用KOD FX Neo(由Toyobo Co.,Ltd.制造)作为反应试剂，通过常规方法来进行。

用于扩增hph基因的引物：

(a-2)5’-ATACTCGAGGAGATGACGTTGGAGGGGCAAGGTCG-3’(SEQ ID NO：25)

(b-2)5’-ATACGCGTCTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTGCT-3’(SEQ ID NO：26)

引物(a-2)添加有XhoI限制性酶位点，引物(b-2)添加有MluI限制性酶位点。

使用1％琼脂糖凝胶对通过上述每个PCR产生的反应液进行电泳。结果，当使用TH-1菌株的基因组DNA作为模板时，检测到对应于rpsL基因的约0.5-kbp DNA片段，而当使用pJR225质粒DNA作为模板时，检测到对应于hph基因的约1.0-kbp DNA片段。

将由此制备的含有rpsL基因的DNA片段和含有hph基因的DNA片段分别用限制性酶SalI和限制性酶XhoI切割，并与已用限制性酶SmaI切割的大肠埃希氏杆菌质粒载体pUC19(GenBank：M77789.2)混合，然后使用T4 DNA连接酶(由Takara Bio Inc.制造)彼此连接。

通过氯化钙法用得到的连接溶液转化大肠埃希氏杆菌JM109，并将转化体施加到含有50μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL潮霉素的LB琼脂培养基上。通过常规方法对在所述培养基上生长的菌株进行液体培养，从培养液提取质粒DNA，并将质粒用限制性酶MluI切割。由此鉴定插入的片段。结果，除了pUC19载体的约2.7-kbp DNA片段之外，还发现了对应于彼此相连的rpsL基因和hph基因的序列的约1.5-kbp DNA片段。

所构建的含有其中rpsL基因和hph基因彼此相连的标志物盒的质粒被命名为pUC-Sm^s·Hm^r。

(3)宿主的乳酸利用酶基因的破坏

(3-1)用于破坏HPTL_1695基因的DNA的构建

使用TH-1菌株的野生菌株的基因组DNA作为模板，通过PCR方法扩增对应于HPTL_1695基因的待缺失区域的5’-上游和3’-下游区域的DNA片段。将下述引物用于所述PCR。PCR使用由Life Technologies Corporation制造的“DNA热循环仪”并使用KOD FX Neo(由Toyobo Co.,Ltd.制造)作为反应试剂，通过常规方法来进行。

用于扩增HPTL_1695基因的待缺失区域的5’-上游区域的引物

(a-3)5’-CGCGAATTCATGGCTACCCAACCCCGCGTCGGTCT-3’(SEQ ID NO：27)

(b-3)5’-CGCACGCGTTGGAGTGCGGCTGGTCATCGGGTGAC-3’(SEQ ID NO：28)

引物(a-3)添加有EcoRI限制性酶位点，引物(b-3)添加有MluI限制性酶位点。

用于扩增HPTL_1695基因的待缺失区域的3’-下游区域的引物

(a-4)5’-GCACGCGTCTGCAGAACGGAGGCGAGCGATGAACG-3’(SEQ ID NO：29)

(b-4)5’-CGCGCATGCTCAGGGGATCAAGAAGACGTGCACCC-3’(SEQ ID NO：30)

引物(a-4)添加有MluI限制性酶位点，引物(b-4)添加有SphI限制性酶位点。

使用1％琼脂糖凝胶对每个上述PCR反应混合物进行电泳。结果，分别检测到对应于HPTL_1695基因的上游区域和下游区域的大约0.8-kbp DNA片段。

将由此制备的HPTL_1695基因的上游区域的DNA片段用限制性酶EcoRI和MluI切割，并将由此制备的HPTL_1695基因的下游区域的DNA片段用限制性酶MluI和SphI切割。将切割产物与已用限制性酶EcoRI和SphI切割的pUC19载体混合，然后使用T4 DNA连接酶(由Takara Bio Inc.制造)彼此连接。

通过氯化钙法用得到的连接溶液转化大肠埃希氏杆菌JM109，并将转化体施加到含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养基上。通过常规方法对在所述培养基上生长的菌株进行液体培养，从培养液提取质粒DNA，并将质粒用限制性酶EcoRI和SphI切割。然后确定所述上游和下游区域是否已被成功克隆。结果，在成功克隆的情况下鉴定到预期的2.7-kbp和1.6-kbp DNA片段。

在这个质粒中，HPTL_1695基因的5’-上游区域和3’-下游区域彼此相连，并且克隆到处于其中HPTL_1695基因内的区段已被缺失的状态下的DNA片段。所构建的含有处于其中HPTL_1695基因已被缺失的状态下的DNA片段的质粒被命名为pΔHPTL_1695。

(3-2)用于标记HPTL_1695基因的DNA的构建

将在上述(2)中制备的pUC-Sm^s·Hm^r用限制性酶MluI切割，并使用1％琼脂糖凝胶进行电泳。然后从凝胶上切下其中rpsL基因和hph基因彼此相连的标志物盒的大约1.5-kbpDNA片段，将凝胶冷冻并融化。然后从所述凝胶回收DNA。

将回收的标志物盒的DNA片段与已用限制性酶MluI切割的在(3-1)中产生的pΔHPTL_1695混合，然后使用T4 DNA连接酶(由Takara Bio Inc.制造)彼此连接。

通过氯化钙法用得到的连接溶液转化大肠埃希氏杆菌JM109，并将转化体转移到含有50μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL潮霉素的LB琼脂培养基上。通过常规方法对在所述培养基上生长的菌株进行液体培养，从培养液提取质粒DNA，并将质粒用限制性酶MluI切割。由此鉴定插入的片段。结果，除了pΔHPTL_1695质粒的大约4.3-kbp DNA片段之外，还鉴定到对应于所述标志物盒的序列的大约1.5-kbp DNA片段。

所构建的用于标记HPTL_1695基因的质粒被命名为ΔHPTL_1695-Sm^s·Hm^r。

(3-3)链霉素抗性菌株的HPTL_1695基因的标记(正选择)

通过用限制性酶EcoRI和SphI切割将在(3-2)中制备的环状质粒pΔHPTL_1695-Sm^s·Hm^r线性化。使用得到的线性pΔHPTL_1695-Sm^s·Hm^r，通过电脉冲法(电穿孔法)转化作为TH-1菌株的链霉素抗性菌株的NOC269菌株。将转化体转移到含有100μg/mL潮霉素的A固体培养基上，并在充有H₂:O₂:CO₂＝7.5:1:1.5的混合气体的培养箱中在50℃培养60小时。

将每个在所述A固体培养基上生长的菌株在含有100μg/mL潮霉素或500μg/mL链霉素的A固体培养基上重新划线，并在充有H₂:O₂:CO₂＝7.5:1:1.5的混合气体的培养箱中在50℃培养60小时。

使用作为上述步骤的结果获得的潮霉素抗性和链霉素敏感菌株作为模板，通过菌落PCR方法扩增含有HPTL_1695基因的DNA区域。将下述引物用于所述PCR。引物(a-5)和(b-5)的组合是在(3-1)中使用的引物(a-3)和(b-4)的组合，并使用野生型TH-1菌株的基因组DNA作为模板，通过PCR扩增含有HPTL_1695基因的大约2.9-kbp DNA区域。PCR使用由LifeTechnologies Corporation制造的“DNA热循环仪”并使用TaKaRa Ex Taq(由Takara BioInc.制造)作为反应试剂，通过常规方法来进行。

用于扩增含有HPTL_1695基因的区域的引物

(a-5)5’-CGCGAATTCATGGCTACCCAACCCCGCGTCGGTCT-3’(SEQ ID NO：31)

(b-5)5’-CGCGCATGCTCAGGGGATCAAGAAGACGTGCACCC-3’(SEQ ID NO：32)

使用1％琼脂糖凝胶对得到的反应混合物进行电泳。结果，检测到对应于在HPTL_1695基因中插入有标志物盒的序列的大约3.1-kbp DNA片段。在这个菌株中，标志物盒被插入到HPTL_1695基因中。也就是说，得到了其中HPTL_1695基因用标志物标记的菌株。

(3-4)HPTL_1695基因的破坏(反选择)

通过用限制性酶EcoRI和SphI切割将在(3-1)中制备的环状质粒pΔHPTL_1695线性化。通过电脉冲法(电穿孔法)用得到的线性pΔHPTL_1695转化在(3-3)中得到的HPTL_1695基因被标记的菌株。将转化体转移到含有500μg/mL链霉素的A固体培养基上，并在充有H₂:O₂:CO₂＝7.5:1:1.5的混合气体的培养箱中在50℃培养60小时。

使用作为上述步骤的结果获得的潮霉素敏感和链霉素抗性菌株作为模板，通过菌落PCR方法扩增含有HPTL_1695基因的DNA区域。所述菌落PCR通过与(3-3)中相同的方法来进行。

使用1％琼脂糖凝胶对得到的反应混合物进行电泳。结果，检测到在HPTL_1695基因被(3-1)的处于其中HPTL_1695基因内的区段已被缺失的状态下的DNA片段替换的情况下会扩增的大约1.6-kbp DNA片段。也就是说，HPTL_1695基因内的区段已被缺失，因此HPTL_1695基因已被破坏。其中HPTL_1695基因被破坏的菌株被命名为NOC373菌株。

在所述NOC373菌株中，TH-1菌株的HPTL_1695基因的碱基序列(SEQ ID NO：3)的第19至1410号碱基的区域被ACGCGTCTGCAG(SEQ ID NO：33)替换。这对应于TH-1菌株的由HPTL_1695基因编码的多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)的第7至470号氨基酸的区域被TRLQ(SEQ ID NO：34)替换。

(3-5)NOC373菌株的乳酸利用性能的确定

在所述NOC373菌株中，HPTL_1695基因被破坏。其中HPTL_1695基因被破坏的NOC373菌株是否已丧失乳酸利用性能如下所述来确定。

将NOC373菌株和充当NOC373菌株的母体菌株的NOC269菌株各自在含有30mM乳酸钠作为唯一碳源的A固体培养基上划线，并在50℃培养60小时。结果发现，充当母体菌株的NOC269菌株在含有30mM乳酸钠的A固体培养基上生长，但其中HPTL_1695基因被破坏的NOC373菌株完全不生长。也就是说，通过破坏HPTL_1695基因，NOC373菌株失去了其原始的乳酸利用能力。因此确认了HPTL_1695基因确实是乳酸利用酶基因。

(4)乳酸脱氢酶基因·苹果酸/乳酸脱氢酶基因的引入

(4-1)质粒载体的构建

下面描述常用于引入提供乳酸生产能力的基因的质粒载体的构建方法。

首先，使用广宿主范围载体pRK415(GenBank：EF437940.1)(Gene,70,191-197(1998))作为模板并进行PCR。为了扩增不包括四环素基因区域的质粒区域的DNA片段，合成并使用了下述引物对。PCR使用由Life Technologies Corporation制造的“DNA热循环仪”并使用KOD FX Neo(由Toyobo Co.,Ltd.制造)作为反应试剂，通过常规方法来进行。

用于扩增pRK415质粒序列的引物

(a-6)5’-CGTGGCCAACTAGGCCCAGCCAGATACTCCCGATC-3’(SEQ ID NO：35)

(b-6)5’-TGAGGCCTCATTGGCCGGAGCGCAACCCACTCACT-3’(SEQ ID NO：36)

SfiI限制性位点已被添加到引物(a-6)和(b-6)。

使用含有新霉素/卡那霉素抗性基因(在后文中，所述基因可以被称为“nptII”)的质粒pK18mobsacB(GenBank：FJ437239.1)(Gene,145,69-73(1994))作为模板并按照常规方法进行PCR。在所述PCR中合成并使用了下述引物对以扩增含有nptII基因序列的DNA片段。PCR使用由Life Technologies Corporation制造的“DNA热循环仪”并使用KOD FX Neo(由Toyobo Co.,Ltd.制造)作为反应试剂，通过常规方法来进行。

用于扩增nptII基因序列的引物

(a-7)5’-ctgGGCCTAGTTGGCCacgtagaaagccagtccgc-3’(SEQ ID NO：37)

(b-7)5’-tccGGCCAATGAGGCCtcagaagaactcgtcaaga-3’(SEQ ID NO：38)

SfiI限制性位点已被添加到引物(a-7)和(b-7)。

使用1％琼脂糖凝胶对通过每个上述PCR产生的反应溶液进行电泳，结果，当使用pRK415质粒作为模板时检测到大约8.7-kb的DNA片段，并在使用nptII基因作为模板时检测到大约1.1-kb的DNA片段。

将由此制备的DNA片段各自用限制性酶SfiI切割，并与T4 DNA连接酶(由TakaraBio Inc.制造)反应，以获得连接溶液。通过氯化钙法(Journal of Molecular Biology,53,159-162(1970))用得到的连接溶液转化大肠埃希氏杆菌JM109，并将转化体施加到含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂培养基上。将可以在所述培养基上存活的菌株通过常规方法在液体培养基中培养，并从得到的培养液提取质粒DNA。将该质粒DNA用限制性酶SfiI切割，并确认插入的片段。结果，除了源自于pRK415质粒的大约2.0-kb、3.0-kb和3.7-kb的DNA片段之外，还观察到大约1.1-kb的nptII基因序列的DNA片段。

所构建的质粒被命名为pCYK01。

(4-2)用于基因表达的克隆载体的构建

(4-2-1)λt0终止子序列的DNA片段的制备

合成了下述引物对并用于PCR中，以便制备具有λt0终止子序列的DNA。PCR使用由Life Technologies Corporation制造的“DNA热循环仪”并使用KOD FX Neo(由ToyoboCo.,Ltd.制造)作为反应试剂来进行。没有包含模板DNA，因为延伸使用每个引物作为另一个引物的模板来进行。

用于制备λt0终止子序列的引物

(a-8)5’-GCATTAATccttggactcctgttgatagatccagtaatgacctcagaactccatctggatttgttcagaacgctcggttgccg-3’(SEQ ID NO：39)

(b-8)5’-caccgtgcagtcgatgGATctggattctcaccaataaaaaacgcccggcggcaaccgagcgttctgaacaaatccagatggag-3’(SEQ ID NO：40)

引物(a-8)和(b-8)的3’末端的碱基序列彼此互补。

使用1％琼脂糖凝胶对产生的反应溶液进行电泳，结果，检测到对应于λt0终止子序列的大约0.13-kb的DNA片段。

(4-2-2)tac启动子序列的DNA片段的制备

PCR使用含有tac启动子的质粒pMAL-c5X(由New England Biolabs Inc.制造)作为模板来进行。在所述PCR中，合成并使用了下述引物对以便扩增tac启动子序列。PCR使用由Life Technologies Corporation制造的“DNA热循环仪”并使用KOD FX Neo(由ToyoboCo.,Ltd.制造)作为反应试剂，按照常规方法来进行。

用于扩增tac启动子序列的引物

(a-9)5’-TTATTGGTGAGAATCCAGATCCATCGACTGCACGGTGCACCAATGCTTCT-3’(SEQ IDNO：41)

(b-9)5’-gcaagcttggagtgatcatcgtATGCATATGCGTTTCTCCTCCAGATCCctgtttcctgtgtgaaattgt-3’(SEQ ID NO：42)

使用1％琼脂糖凝胶对产生的反应溶液进行电泳，结果，检测到对应于tac启动子序列的大约0.3-kb的DNA片段。

(4-2-3)λt0终止子和tac启动子序列的引入

从琼脂糖凝胶上切下在上述(4-2-1)和(4-2-2)中制备的DNA片段，并通过冷冻和融化凝胶从所述凝胶回收DNA。将回收的对应于λt0终止子序列和tac启动子序列的DNA片段混合并用作模板，进行重叠延伸PCR。在所述重叠延伸PCR中使用上述引物(a-8)和(b-9)的组合，以便制备其中tac启动子被连接到λt0终止子下游的DNA。被用于扩增模板DNA片段的引物(b-8)和(a-9)的5’末端的碱基序列彼此互补。PshBI和HindIII限制性位点已被分别添加到引物(a-8)和(b-9)。

使用1％琼脂糖凝胶对产生的反应溶液进行电泳，结果，检测到大约0.4-kb的DNA片段，其对应于其中tac启动子被连接到λt0终止子下游的DNA。

将所述通过PCR扩增的其中tac启动子被连接到λt0终止子下游的大约0.4-kb DNA片段和上述克隆载体pCYK01的大约9.8-kb DNA片段用限制性酶PshBI和HindIII切割。使用T4 DNA连接酶(由Takara Bio Inc.制造)将所述切割的DNA片段彼此连接。

通过氯化钙法用得到的连接溶液转化大肠埃希氏杆菌JM109，并将转化体施加到含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂培养基上。将在所述培养基上存活的菌株通过常规方法在液体培养基中培养，并从得到的培养液提取质粒DNA。将该质粒DNA用限制性酶PshBI和HindIII切割并确认插入的片段。结果，除了来自于质粒pCYK01的大约9.6-kb的DNA片段之外，还观察到其中tac启动子被连接到λt0终止子下游的大约0.4-kb的DNA片段。

(4-2-4)rrnB T1T2双向终止子(在后文中可以被称为“rrnB终止子”)的引入

使用含有rrnB终止子序列的质粒pMAL-c5X(由New England Biolabs Inc.制造)作为模板进行PCR。在所述PCR中，合成并使用了下述引物对以便扩增rrnB终止子序列。PCR使用由Life Technologies Corporation制造的“DNA热循环仪”并使用KOD FX Neo(由Toyobo Co.,Ltd.制造)作为反应试剂，按照常规方法来进行。

用于扩增rrnB终止子序列的引物

(a-10)5’-ctcgaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtg-3’(SEQ ID NO：43)

(b-10)5’-CGCAATTGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGGCCATC-3’(SEQ ID NO：44)

EcoRI和MunI限制性位点已被分别添加到引物(a-10)和(b-10)。

使用1％琼脂糖凝胶对产生的反应溶液进行电泳，结果，检测到对应于rrnB终止子序列的大约0.6-kb的DNA片段。

将通过上述PCR扩增的包含rrnB终止子序列的大约0.6-kb DNA片段用限制性酶EcoRI和MunI切割，并将在上述(4-2-3)中构建的质粒的大约10.0-kb DNA片段用限制性酶EcoRI切割。使用T4 DNA连接酶(由Takara Bio Inc.制造)将所述切割的DNA片段彼此连接。

通过氯化钙法用得到的连接溶液转化大肠埃希氏杆菌JM109，并将得到的转化体施加到含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂培养基上。将在所述培养基上存活的菌株通过常规方法在液体培养基中培养，并从得到的培养液提取质粒DNA。将该质粒用限制性酶EcoRI和MunI切割，并确认插入的片段。结果，除了来自于上述(4-2-3)的质粒的大约10.0-kb的DNA片段之外，还观察到对应于rrnB终止子序列的大约0.6-kb的DNA片段。

所构建的用于基因表达的克隆载体被命名为pCYK21。

(4-3)乳酸脱氢酶基因·苹果酸/乳酸脱氢酶基因的引入

(4-3-1)乳酸脱氢酶基因的克隆

按照常规方法从热葡萄糖苷酶副地芽孢杆菌NBRC 107763、嗜热地芽孢杆菌NBRC102445和红色亚栖热菌NBRC 106122提取基因组DNA。嗜热栖热菌HB8菌株(ATCC 27634)的基因组DNA购自Takara Bio Inc。

将上述四种基因组DNA各自用作模板，通过PCR方法分别扩增含有热葡萄糖苷酶副地芽孢杆菌、嗜热地芽孢杆菌和嗜热栖热菌中的每一者的乳酸脱氢酶ldh基因的DNA片段和含有嗜热栖热菌和红色亚栖热菌中的每一者的苹果酸/乳酸脱氢酶mldh基因的DNA片段。将下述引物用于PCR。PCR使用由Life Technologies Corporation制造的“DNA热循环仪”并使用KOD FX Neo(由Toyobo Co.,Ltd.制造)作为反应试剂，按照常规方法来进行。

用于扩增热葡萄糖苷酶副地芽孢杆菌ldh基因的引物

(a-11)5’-TTACATATGAAACAACAAGGCATGAATCGAGTAGC-3’(SEQ ID NO：45)

(b-11)5’-TTAGAATTCTTATTTTACATCATCAAAATAACGGG-3’(SEQ ID NO：46)

NdeI限制性位点已被添加到引物(a-11)，EcoRI限制性位点已被添加到引物(b-11)。

用于扩增嗜热地芽孢杆菌ldh基因的引物

(a-12)5’-TTACATATGAAAAACGGGAGAGGAAATCGGGTAGC-3’(SEQ ID NO：47)

(b-12)5’-TTAGAATTCTTACTGAGCAAAATAGCGCGCCAATA-3’(SEQ ID NO：48)

NdeI限制性位点已被添加到引物(a-12)，EcoRI限制性位点已被添加到引物(b-12)。

用于扩增嗜热栖热菌ldh基因的引物

(a-13)5’-TTACATATGAAGGTCGGCATCGTGGGAAGCGGCAT-3’(SEQ ID NO：49)

(b-13)5’-TTAGAATTCCTAAAACCCCAGGGCGAAGGCCGCCT-3’(SEQ ID NO：50)

NdeI限制性位点已被添加到引物(a-13)，EcoRI限制性位点已被添加到引物(b-13)。

用于扩增嗜热栖热菌mldh基因的引物

(a-14)5’-TTACATATGAGGTGGCGGGCGGACTTCCTCTCGGC-3’(SEQ ID NO：51)

(b-14)5’-TTAGAATTCTCAAGCATCGTCCCTCCAAGGCACGC-3’(SEQ ID NO：52)

NdeI限制性位点已被添加到引物(a-14)，EcoRI限制性位点已被添加到引物(b-14)。

用于扩增红色亚栖热菌mldh-1基因的引物

(a-15)5’-TTACATATGCAAGGCATTCCTGTGCAACAACTGCG-3’(SEQ ID NO：53)

(b-15)5’-TTAGAATTCTTAAAGGCCCACCGCTTTAGCGGCCT-3’(SEQ ID NO：54)

NdeI限制性位点已被添加到引物(a-15)，EcoRI限制性位点已被添加到引物(b-15)。

用于扩增红色亚栖热菌mldh-2基因的引物

(a-18)5’-TTACATATGAGGGTTCCTTATCCCGTACTCAAGCA-3’(SEQ ID NO：55)

(b-18)5’-TTTGAATTCTCATCTTGTCCCTCCTCCTTGTAGAT-3’(SEQ ID NO：56)

NdeI限制性位点已被添加到引物(a-18)，EcoRI限制性位点已被添加到引物(b-18)。

使用1％琼脂糖凝胶对产生的反应溶液进行电泳，并且对于热葡萄糖苷酶副地芽孢杆菌ldh基因、嗜热地芽孢杆菌ldh基因、嗜热栖热菌ldh基因、嗜热栖热菌mldh基因和红色亚栖热菌mldh-1基因和mldh-2基因中的每一者来说，检测到大约1.0-kb的DNA片段。

将通过上述PCR扩增的含有热葡萄糖苷酶副地芽孢杆菌ldh基因、嗜热地芽孢杆菌ldh基因、嗜热栖热菌ldh基因、嗜热栖热菌mldh基因和红色亚栖热菌mldh-1基因和mldh-2基因中的每一者的大约1.0-kb DNA片段用限制性酶NdeI和EcoRI切割。将上述克隆载体pCYK21的大约10.6-kb DNA片段也用限制性酶NdeI和EcoRI切割。使用T4DNA连接酶(由Takara Bio Inc.制造)将每个所述切割的1.0-kb DNA片段和10.6-kb DNA片段彼此连接。

通过电脉冲法用得到的连接溶液转化Hydrogenophilus thermoluteolus菌株TH-1(NBRC 14978)，并将得到的转化体施加到含有50μg/ml卡那霉素的A固体培养基上，并在充有H₂:O₂:CO₂＝7.5:1:1.5的混合气体的培养箱中在50℃培养60小时。

使用铂环将在所述A固体培养基上存活的每个菌株接种到含有5ml含有50μg/ml卡那霉素的A液体培养基的试管中。向所述试管填充H₂:O₂:CO₂＝7.5:1:1.5的混合气体，在50℃进行振摇培养，并从培养液提取质粒DNA。将分别包含热葡萄糖苷酶副地芽孢杆菌ldh基因、嗜热地芽孢杆菌ldh基因、嗜热栖热菌ldh基因、嗜热栖热菌mldh基因和红色亚栖热菌mldh-1基因和mldh-2基因的质粒用限制性酶NdeI和EcoRI切割，并确认插入的片段。结果，除了质粒pCYK21的大约10.6-kb DNA片段之外还观察到长度为大约1.0-kb的片段，它们各自是热葡萄糖苷酶副地芽孢杆菌ldh基因、嗜热地芽孢杆菌ldh基因、嗜热栖热菌ldh基因、嗜热栖热菌mldh基因和红色亚栖热菌mldh-1基因和mldh-2基因的插入片段。

含有热葡萄糖苷酶副地芽孢杆菌ldh基因的质粒被命名为pC-Pth-ldh，含有嗜热地芽孢杆菌ldh基因的质粒被命名为pC-Gka-ldh，含有嗜热栖热菌ldh基因的质粒被命名为pC-Tth-ldh，含有嗜热栖热菌mldh基因的质粒被命名为pC-Tth-mldh，含有红色亚栖热菌mldh-1基因的质粒被命名为pC-Mru-mldh-1，并且含有红色亚栖热菌mldh-2基因的质粒被命名为pC-Mru-mldh-2。

(4-3-2)乳酸脱氢酶基因·乳酸/苹果酸脱氢酶基因在Hydrogenophilus thermoluteolus菌株中的表达的确认

使用铂环将如上所述获得的每个引入有乳酸脱氢酶基因或苹果酸/乳酸脱氢酶基因的菌株接种到含有5ml含有50μg/ml卡那霉素的A液体培养基的试管中。向所述试管填充H₂:O₂:CO₂＝7.5:1:1.5的混合气体，并在50℃振摇培养20小时。

通过离心(4℃，15,000rpm，1分钟)收集由此培养和增殖的细菌细胞。通过超声处理破坏所述细菌细胞，随后离心(4℃，15,000rpm，5分钟)以获得细胞破坏上清液。将所述细胞破坏上清液用作粗酶液，以通过下述方法测量乳酸脱氢酶活性。将粗酶液、50mM乙酸钠(pH5.0)、0.5mM NADH、0.2mM果糖1,6-二磷酸和5mM丙酮酸钠混合，在50℃反应，跟踪来自于NADH的340nm处的吸光度的降低，并分析初始反应速率。从所述初始反应速率和蛋白质浓度计算比活性。每分钟产生1μmol乳酸的酶水平被定义为1U(单位)。

结果，在其中引入有热葡萄糖苷酶副地芽孢杆菌ldh基因的菌株LDH03、其中引入有嗜热地芽孢杆菌ldh基因的菌株LDH04、其中引入有嗜热栖热菌ldh基因的菌株LDH05、其中引入有嗜热栖热菌mldh基因的菌株MLDH01、其中引入有红色亚栖热菌mldh-1基因的菌株MLDH02和其中引入有红色亚栖热菌mldh-2基因的菌株MLDH03中的每一者中，检测到乳酸脱氢酶活性。

[表1]

通过引入ldh或mldh基因而获得的Hydrogenophilus thermoluteolus菌株的乳酸脱氢酶活性

表1中的转化体的宿主不是乳酸利用酶基因被破坏的菌株，而是作为野生型菌株的Hydrogenophilus thermoluteolus TH-1菌株。然而，揭示出每个上述ldh基因和mldh基因均在Hydrogenophilus thermoluteolus中起作用，能够表达酶活性。

(4-3-3)乳酸脱氢酶基因·苹果酸/乳酸脱氢酶基因在嗜氢菌属细菌的乳酸利用酶基因被破坏的菌株中的引入

通过常规方法从具有含有嗜热栖热菌的乳酸脱氢酶基因(ldh)的pC-Tth-ldh质粒的Hydrogenophilus thermoluteolus LDH05(具有野生型HPTL_1695)和具有含有红色亚栖热菌的苹果酸/乳酸脱氢酶基因(mldh-1)的pC-Mru-mldh1质粒的Hydrogenophilusthermoluteolus MLDH02(具有野生型HPTL_1695)提取相应的质粒，并通过电脉冲法(电穿孔法)用每种质粒转化NOC373菌株(HPTL_1695基因被破坏的菌株)。将转化体转移到含有50μg/mL卡那霉素的A固体培养基上，并在充有H₂:O₂:CO₂＝7.5:1:1.5的混合气体的培养箱中在50℃培养60小时。

使用铂环将在所述A固体培养基上生长的每个菌株接种到试管中，所述试管中放置有5mL含有50μg/mL卡那霉素的A液体培养基，将所述试管用H₂:O₂:CO₂＝7.5:1:1.5的混合气体装填，并在50℃进行振摇培养，然后从培养液提取质粒DNA。将分别含有嗜热栖热菌的ldh基因和红色亚栖热菌的mldh-1基因的每个质粒用限制性酶NdeI和EcoRI切割。由此鉴定插入的片段。结果，除了质粒pCYK21的大约10.6-kb DNA片段之外，还鉴定到长度为大约1.0-kb的插入片段，其对应于嗜热栖热菌的ldh基因和红色亚栖热菌的mldh-1基因中的每一者。得到的菌株如表2中所示来命名。

表2

(4-3-4)乳酸生产

使用铂环将表2中的每种细菌菌株接种到含有50μg/ml卡那霉素的A液体培养基中，并在50℃进行24小时的振摇培养，并随着培养供应H₂:O₂:CO₂＝7.5:1:1.5的混合气体。

在培养后，使用F-试剂盒L-乳酸(Roche)对通过离心(4℃，15,000rpm，5分钟)获得的培养上清液中的乳酸进行定量。

如表3中所示，其中HPTL_1695基因被破坏的每个LAC01菌株和LAC02菌株与相应的LDH05菌株和MLDH02菌株相比，分别显示出培养基上清液中乳酸量的显著增加。

表3

LDH05菌株和MLDH02菌株的宿主是Hydrogenophilus thermoluteolus TH-1菌株，而LAC01菌株和LAC02菌株的宿主是通过破坏Hydrogenophilus thermoluteolus TH-1菌株的链霉素抗性菌株NOC269菌株中的HPTL_1695基因而获得的NOC373菌株。

一个转化体的培养基上清液中的乳酸量与LDH05菌株几乎相同，所述转化体通过将嗜热栖热菌的ldh基因引入到作为宿主的NOC373菌株的母体菌株NOC269菌株(链霉素抗性菌株)中而制备。一个转化体的培养基上清液中的乳酸量与MLDH02菌株几乎相同，所述转化体通过将红色亚栖热菌的mldh-1基因引入到作为宿主的NOC373菌株的母体菌株NOC269菌株(链霉素抗性菌株)中而制备。已显示链霉素抗性的性状不影响乳酸生产能力。

(5)乳酸透性酶基因的引入

为了进一步促进细胞中产生的乳酸向培养基上清液的分泌，将乳酸透性酶基因共表达。

(5-1)乳酸透性酶基因的克隆

使用嗜热地芽孢杆菌的基因组DNA作为模板，通过PCR方法扩增嗜热地芽孢杆菌的乳酸透性酶基因。下述引物被用于所述PCR。PCR使用由Life Technologies Corporation制造的“DNA热循环仪”并使用KOD FX Neo(由Toyobo Co.,Ltd.制造)作为反应试剂，通过常规方法来进行。

用于扩增嗜热地芽孢杆菌的乳酸透性酶基因(lutP)的引物

(a-19)5’-CGGCAATTGCGGGCACAAAGGGGAGGAGAAAACC G-3’(SEQ ID NO：57)

(b-19)5’-CGGCAATTGTTATGGAATCATCCACGACAATACCG-3’(SEQ ID NO：58)

引物(a-19)和(b-19)各自添加有MunI限制性酶位点。

使用1％琼脂糖凝胶对来自于所述PCR的反应混合物进行电泳。结果，检测到乳酸透性酶基因的大约1.7-kbp DNA片段。

将通过PCR扩增的含有嗜热地芽孢杆菌的乳酸透性酶基因的大约1.7-kb DNA片段用限制性酶MunI切割，并用限制性酶EcoRI切割。使用T4 DNA连接酶(由Takara Bio Inc.制造)将所述DNA片段连接到在(4-3-1)中描述的每个质粒DNA，即pC-Tth-ldh(含有嗜热栖热菌的乳酸脱氢酶基因(ldh基因))和pC-Mru-mldh1(含有红色亚栖热菌的苹果酸/乳酸脱氢酶基因(mldh基因))。

通过电脉冲法(电穿孔法)用每个得到的连接产物各自转化NOC269菌株和NOC373菌株。将转化体施加到含有50μg/mL卡那霉素的A固体培养基上，并在充有H₂:O₂:CO₂＝7.5:1:1.5的混合气体的培养箱中在50℃培养60小时。

从在所述固体培养基上生长的菌株，通过菌落PCR选择乳酸透性酶基因以与ldh基因或mldh基因相同的方向被克隆到所述质粒中包含的ldh基因或mldh基因的下游的菌株。当所述菌落PCR使用对应于ldh基因或mldh基因的上游序列的引物与上述引物(b-19)的组合来进行时，可以在是否可以扩增到DNA片段的基础上鉴定乳酸透性酶基因以与ldh基因或mldh基因相同的方向被克隆的菌株。所述PCR使用由Life Technologies Corporation制造的“DNA热循环仪”并使用TaKaRa Ex Taq(由Takara Bio Inc.制造)作为反应试剂，通过常规方法来进行。

用于菌落PCR的引物

嗜热地芽孢杆菌的乳酸透性酶基因lutP

(a-20)5’-GGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAAC-3’(SEQ ID NO：59)

(b-20)5’-CGGCAATTGTTATGGAATCATCCACGACAATACCG-3’(SEQ ID NO：60)

结果，在每种转化中，检测到在乳酸透性酶基因以与ldh基因或mldh基因相同的方向被克隆的情况下将被扩增的大约2.7-kb DNA片段。得到的质粒和细菌菌株如表4中所示来命名。

表4

(5-2)乳酸生产

使用铂环将表4中的每个其中引入有乳酸透性酶基因的菌株接种在含有50μg/ml卡那霉素的A液体培养基中，并在50℃进行24小时的振摇培养，并随着培养供应H₂:O₂:CO₂＝7.5:1:1.5的混合气体。

在培养后，使用F-试剂盒L-乳酸(Roche)对通过离心(4℃，15,000rpm，5分钟)获得的培养上清液中的乳酸进行定量。结果确定，如表5中所示，通过将嗜热地芽孢杆菌的乳酸透性酶基因lutP引入到作为HPTL_1695基因被破坏的菌株的NOC373菌株中而获得的LAC06和LAC12菌株，与各自是其中没有引入乳酸透性酶基因的菌株的LAC01和LAC02菌株相比，分别显示出培养基上清液中乳酸量的增加。

当其中乳酸利用酶基因未被破坏的NOC269菌株是宿主时，引入乳酸透性酶基因的效果并不显著。相比之下，当乳酸利用酶基因被破坏时，通过乳酸透性酶基因的引入导致的乳酸生产能力的增强变得显著。也就是说，乳酸利用酶基因的破坏和乳酸透性酶基因的引入协同作用以增强乳酸生产能力。

表5

(7)保藏菌株

Hydrogenophilus thermoluteolus LAC06菌株和Hydrogenophilusthermoluteolus LAC12菌株被保藏在日本国立技术和评估研究所NITE专利微生物保藏中心(NITE Patent Microorganisms Depositary,National Institute of Technology andEvaluation)(2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba,Japan(邮政编码292-0818))。

对于Hydrogenophilus thermoluteolus LAC06菌株来说，登记号是BP-03007，接受日期是2019年7月30日。对于Hydrogenophilus thermoluteolus LAC12菌株来说，登记号是BP-03008，接受日期是2019年7月30日。

此外，Hydrogenophilus thermoluteolus LDH05菌株和Hydrogenophilusthermoluteolus MLDH02菌株也被保藏在日本国立技术和评估研究所NITE专利微生物保藏中心(NITE Patent Microorganisms Depositary,National Institute of Technologyand Evaluation)(2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba,Japan(邮政编码292-0818))。

对于Hydrogenophilus thermoluteolus LDH05菌株来说，登记号是BP-02822，接受日期是2018年11月14日。对于Hydrogenophilus thermoluteolus MLDH02菌株来说，登记号是BP-02828，接受日期是2018年11月21日。

因此，这些菌株可供公众使用。

此外，本说明书中描述的所有菌株(包括ATCC菌株和NBRC菌株)均根据布达佩斯公约(Budapest Treaty)国际保藏，或由不附加任何条款或条件提供所述菌株的组织拥有，或在市场上销售，因此，这些菌株均可供公众使用。

工业实用性

本发明的重组体使用二氧化碳作为唯一碳源有效地生产乳酸，因此，它能够高效生产可生物降解塑料的原料，同时解决了由二氧化碳排放增加导致的全球变暖。

序列表

<110> 株式会社CO2资源化研究所

<120> 产乳酸的转基因嗜氢菌属细菌

<130> FPR0019WO

<160> 60

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 759

<212> DNA

<213> Hydrogenophilus thermoluteolus

<400> 1

atggctaccc aaccccgcgt cggtctcttt gtcacctgcc tggtcaatac catccgtccc 60

aacatcgcga tggcgcttgc acaactcttg gaagccacgg ggcaccgcgt cgaagtcccg 120

ttcgcgcaaa cctgctgcgg gcaacccggc tacaacgcgg gggactggga tgccgcccgt 180

gcgcttgcga agcagaccat cgccgcgttc gaacccttcg attatctcat cgcgccgtcg 240

ggctcgtgcc ttgcgacgat tcgccacgac tatccggagc tgctcaaaga cgatcccgaa 300

tggcgggaac gcgcgcaacg gctcgcagcc aagtcgtggg aagcgctgag ctacttcgcc 360

caacaggttc cattggaaca actcccacgg gtccggttcc cctatcgcgt cacctaccac 420

gactcctgtt ccggcttgcg cagcctgggg atcaagggac aaccgcgcca gctccttgcc 480

cgtgtcgaag ggctgacgct cgtggagatg gcagaggccg aggtgtgttg cgggttcggt 540

ggcaccttct gcgtcaaata tcccgaactc tccgaggcga tggtcgaacg caaggtccaa 600

aacatcctga agagcggcgc gcaagtgctc ttaggcggcg acctgggttg tctgatgaac 660

attgccgggc ggcttgcgcg catccatgcc ccggtccggg tctatcatac cctcgaagtg 720

ctggcggggc tggcaaatgg tcccggtttg aatggctga 759

<210> 2

<211> 252

<212> PRT

<213> Hydrogenophilus thermoluteolus

<400> 2

Met Ala Thr Gln Pro Arg Val Gly Leu Phe Val Thr Cys Leu Val Asn

1 5 10 15

Thr Ile Arg Pro Asn Ile Ala Met Ala Leu Ala Gln Leu Leu Glu Ala

20 25 30

Thr Gly His Arg Val Glu Val Pro Phe Ala Gln Thr Cys Cys Gly Gln

35 40 45

Pro Gly Tyr Asn Ala Gly Asp Trp Asp Ala Ala Arg Ala Leu Ala Lys

50 55 60

Gln Thr Ile Ala Ala Phe Glu Pro Phe Asp Tyr Leu Ile Ala Pro Ser

65 70 75 80

Gly Ser Cys Leu Ala Thr Ile Arg His Asp Tyr Pro Glu Leu Leu Lys

85 90 95

Asp Asp Pro Glu Trp Arg Glu Arg Ala Gln Arg Leu Ala Ala Lys Ser

100 105 110

Trp Glu Ala Leu Ser Tyr Phe Ala Gln Gln Val Pro Leu Glu Gln Leu

115 120 125

Pro Arg Val Arg Phe Pro Tyr Arg Val Thr Tyr His Asp Ser Cys Ser

130 135 140

Gly Leu Arg Ser Leu Gly Ile Lys Gly Gln Pro Arg Gln Leu Leu Ala

145 150 155 160

Arg Val Glu Gly Leu Thr Leu Val Glu Met Ala Glu Ala Glu Val Cys

165 170 175

Cys Gly Phe Gly Gly Thr Phe Cys Val Lys Tyr Pro Glu Leu Ser Glu

180 185 190

Ala Met Val Glu Arg Lys Val Gln Asn Ile Leu Lys Ser Gly Ala Gln

195 200 205

Val Leu Leu Gly Gly Asp Leu Gly Cys Leu Met Asn Ile Ala Gly Arg

210 215 220

Leu Ala Arg Ile His Ala Pro Val Arg Val Tyr His Thr Leu Glu Val

225 230 235 240

Leu Ala Gly Leu Ala Asn Gly Pro Gly Leu Asn Gly

245 250

<210> 3

<211> 1428

<212> DNA

<213> Hydrogenophilus thermoluteolus

<400> 3

atgaccagcc gcactccacg ccgctttcgc gaacaagcgg tcttcgcgct gcacgagccc 60

aatctccagg cggcgctttc ccgtgccgcg gatggcttca tcggcaaacg cgcgaaagcg 120

gttgcgctcg tccccgaatt cgagcagttg cgcgaagcgg gcgcccagcg caaagatgaa 180

atcctggcca acctcgacac ctacctcgcc gcgttcgaag cagaggtcac ccgccacggc 240

ggtgtcgtcc attgggcacc cgatgccgac gcggcgcgcc gcatcattct ggagatctgc 300

gccgcagcga atgcccgcgt gatcaccaag ggcaaatcga tggtctccga ggagatcggg 360

ctcaacgagg cgctggaggc agcggggtac gaaatcgtcg aaaccgacct aggggagtac 420

atcattcagc tggcgggaga agctccttca cacatcatcg cccccgcggt ccacaaaacc 480

aaagagcaga tctccgacct cttcgaagcc gcgcatggca cgccgcggca aacgaccgtc 540

gaagggctgg tcaccgaggc gcggttgcag ctgcgacaaa agtacttcca agcagacgtc 600

ggcatcaccg gcgcgaactt cctcgtagcc gagacgggac agaccctcat cgtcaccaac 660

gaagggaacg gtgacctcac gcagacgctc gcacgggtcc atatcgtcac cgccggaatc 720

gagcgggtgg tcggcaccct cgaggacgtt gcgctctttc tgcgtttgct cgcgcgttcc 780

gcaacggggc aagacagcga aacctacacc acctactccg tcggcccgca ccgcgcaggc 840

gaccaggacg gcccggaagc gtttcacgtc gtgctcgtcg acaacggacg cagccggatg 900

ctcgatggac cgttccgtcc aatgttgcgc tgcatccgct gcggcgcgtg catgaaccat 960

tgcccggtct atggcgcgat cggcgggcat gcgtacggtt gggtctaccc ggggccgatg 1020

ggatcggtct tgactccgct ctttaccgga ctcgacaacg cgctcgatct gcccaacgcc 1080

tgcacgctga acggtcgttg cggtgaagtg tgcccggtga aaatcccatt gccggacctg 1140

ctgcgccgtc ttcgccacga acagcacaaa gcgggccttc gtccggcgct ggaaggacgg 1200

gccctcaccc tctggcgctg gctcgcaacc cgccctgcgc tctaccatgc cgcggaacgg 1260

gtcaaagtca ggctgctcgc cgcgtgggcg cgcgggcgca agacgcttga ctggtttccc 1320

ttcgcccgcg gctggtttgg ggttcgtgac ctgcccacgc ccccgggacg cacctttctc 1380

gaactgtggc acgccaaacg cgaaaaccca aacggaggcg agcgatga 1428

<210> 4

<211> 475

<212> PRT

<213> Hydrogenophilus thermoluteolus

<400> 4

Met Thr Ser Arg Thr Pro Arg Arg Phe Arg Glu Gln Ala Val Phe Ala

1 5 10 15

Leu His Glu Pro Asn Leu Gln Ala Ala Leu Ser Arg Ala Ala Asp Gly

20 25 30

Phe Ile Gly Lys Arg Ala Lys Ala Val Ala Leu Val Pro Glu Phe Glu

35 40 45

Gln Leu Arg Glu Ala Gly Ala Gln Arg Lys Asp Glu Ile Leu Ala Asn

50 55 60

Leu Asp Thr Tyr Leu Ala Ala Phe Glu Ala Glu Val Thr Arg His Gly

65 70 75 80

Gly Val Val His Trp Ala Pro Asp Ala Asp Ala Ala Arg Arg Ile Ile

85 90 95

Leu Glu Ile Cys Ala Ala Ala Asn Ala Arg Val Ile Thr Lys Gly Lys

100 105 110

Ser Met Val Ser Glu Glu Ile Gly Leu Asn Glu Ala Leu Glu Ala Ala

115 120 125

Gly Tyr Glu Ile Val Glu Thr Asp Leu Gly Glu Tyr Ile Ile Gln Leu

130 135 140

Ala Gly Glu Ala Pro Ser His Ile Ile Ala Pro Ala Val His Lys Thr

145 150 155 160

Lys Glu Gln Ile Ser Asp Leu Phe Glu Ala Ala His Gly Thr Pro Arg

165 170 175

Gln Thr Thr Val Glu Gly Leu Val Thr Glu Ala Arg Leu Gln Leu Arg

180 185 190

Gln Lys Tyr Phe Gln Ala Asp Val Gly Ile Thr Gly Ala Asn Phe Leu

195 200 205

Val Ala Glu Thr Gly Gln Thr Leu Ile Val Thr Asn Glu Gly Asn Gly

210 215 220

Asp Leu Thr Gln Thr Leu Ala Arg Val His Ile Val Thr Ala Gly Ile

225 230 235 240

Glu Arg Val Val Gly Thr Leu Glu Asp Val Ala Leu Phe Leu Arg Leu

245 250 255

Leu Ala Arg Ser Ala Thr Gly Gln Asp Ser Glu Thr Tyr Thr Thr Tyr

260 265 270

Ser Val Gly Pro His Arg Ala Gly Asp Gln Asp Gly Pro Glu Ala Phe

275 280 285

His Val Val Leu Val Asp Asn Gly Arg Ser Arg Met Leu Asp Gly Pro

290 295 300

Phe Arg Pro Met Leu Arg Cys Ile Arg Cys Gly Ala Cys Met Asn His

305 310 315 320

Cys Pro Val Tyr Gly Ala Ile Gly Gly His Ala Tyr Gly Trp Val Tyr

325 330 335

Pro Gly Pro Met Gly Ser Val Leu Thr Pro Leu Phe Thr Gly Leu Asp

340 345 350

Asn Ala Leu Asp Leu Pro Asn Ala Cys Thr Leu Asn Gly Arg Cys Gly

355 360 365

Glu Val Cys Pro Val Lys Ile Pro Leu Pro Asp Leu Leu Arg Arg Leu

370 375 380

Arg His Glu Gln His Lys Ala Gly Leu Arg Pro Ala Leu Glu Gly Arg

385 390 395 400

Ala Leu Thr Leu Trp Arg Trp Leu Ala Thr Arg Pro Ala Leu Tyr His

405 410 415

Ala Ala Glu Arg Val Lys Val Arg Leu Leu Ala Ala Trp Ala Arg Gly

420 425 430

Arg Lys Thr Leu Asp Trp Phe Pro Phe Ala Arg Gly Trp Phe Gly Val

435 440 445

Arg Asp Leu Pro Thr Pro Pro Gly Arg Thr Phe Leu Glu Leu Trp His

450 455 460

Ala Lys Arg Glu Asn Pro Asn Gly Gly Glu Arg

465 470 475

<210> 5

<211> 756

<212> DNA

<213> Hydrogenophilus thermoluteolus

<400> 5

atgaacgcaa ccgcaggctt tcccacgtcg caacgacccg aacggctgga ctccgcttcg 60

acaaacgaca gcaccgccac ccggcacgcc gacggtcgtg aacgggtgct cgctgcgatc 120

cgcgctgcgc tgggcaaaaa tggcgcagtt gagcctgccg atcccgctgc gcgtgccgct 180

gcgatcaccc cgcgcgcacc ccacccccgg ctggcgttct ctgaaccagt cgcggcacga 240

tggcaacgac tttggaccgc acgtgccgga acggtgcacg aactcccttc ccgcgacgcc 300

cttcccgaag cggtcgcggc gtggtgtgcc gaagtgggtg ccacaccgcc cacacacgcg 360

agcggcaccc tcctcgacct cccctggcct gctgcgtggc aactgcgctg cgaaccggca 420

accgtcacca cggaaaccgc ggtgagcgaa gcgtacgctg gcatcgccga agtgggaagt 480

cttgtcttcc tctccgcccc cgtgcatccc accacccacc ggttcgtgcc agacaaccac 540

ctcgtgctgc tatcgcagtc ccgcatcgtt tcccatttcg aggagttctg ggcgctgctg 600

cgccgcgaac tgggtgacga cacaaccgat tggcgcgaac atctgccgcg caccatcaac 660

ttcgtcgctg gcccctcacg caccggagac gtcgagcaga cgatccagtt gggcgcccat 720

gggccgcggc gggtgcacgt cttcttgatc ccctga 756

<210> 6

<211> 251

<212> PRT

<213> Hydrogenophilus thermoluteolus

<400> 6

Met Asn Ala Thr Ala Gly Phe Pro Thr Ser Gln Arg Pro Glu Arg Leu

1 5 10 15

Asp Ser Ala Ser Thr Asn Asp Ser Thr Ala Thr Arg His Ala Asp Gly

20 25 30

Arg Glu Arg Val Leu Ala Ala Ile Arg Ala Ala Leu Gly Lys Asn Gly

35 40 45

Ala Val Glu Pro Ala Asp Pro Ala Ala Arg Ala Ala Ala Ile Thr Pro

50 55 60

Arg Ala Pro His Pro Arg Leu Ala Phe Ser Glu Pro Val Ala Ala Arg

65 70 75 80

Trp Gln Arg Leu Trp Thr Ala Arg Ala Gly Thr Val His Glu Leu Pro

85 90 95

Ser Arg Asp Ala Leu Pro Glu Ala Val Ala Ala Trp Cys Ala Glu Val

100 105 110

Gly Ala Thr Pro Pro Thr His Ala Ser Gly Thr Leu Leu Asp Leu Pro

115 120 125

Trp Pro Ala Ala Trp Gln Leu Arg Cys Glu Pro Ala Thr Val Thr Thr

130 135 140

Glu Thr Ala Val Ser Glu Ala Tyr Ala Gly Ile Ala Glu Val Gly Ser

145 150 155 160

Leu Val Phe Leu Ser Ala Pro Val His Pro Thr Thr His Arg Phe Val

165 170 175

Pro Asp Asn His Leu Val Leu Leu Ser Gln Ser Arg Ile Val Ser His

180 185 190

Phe Glu Glu Phe Trp Ala Leu Leu Arg Arg Glu Leu Gly Asp Asp Thr

195 200 205

Thr Asp Trp Arg Glu His Leu Pro Arg Thr Ile Asn Phe Val Ala Gly

210 215 220

Pro Ser Arg Thr Gly Asp Val Glu Gln Thr Ile Gln Leu Gly Ala His

225 230 235 240

Gly Pro Arg Arg Val His Val Phe Leu Ile Pro

245 250

<210> 7

<211> 396

<212> DNA

<213> Hydrogenophilus thermoluteolus

<400> 7

atgccaacca tcaaccagtt ggtgcgtcgt ccgcggaaaa cggcgcccga aaagagcaaa 60

gtgccggcgt tgcagggatg tccgcaaaaa cgaggcgtgt gtacgcgcgt ctataccacg 120

acgccgaaaa agccgaactc ggcccttcgt aaggtcgcga aagtgcgttt gaccaacggt 180

tacgaggtga tttcgtacat cggcggcgaa gggcacaatc tgcaagaaca ctcggtggtg 240

ctgattcgtg gcggccgggt gaaagacctg ccgggtgtgc gttaccacat cgtgcgcggt 300

tcgctcgact tgcaaggggt caaggaccgt aagcaagggc gttccaagta cggggcgaag 360

cgtccgaagc cgggcgccgc tgcgggcaag aaataa 396

<210> 8

<211> 1026

<212> DNA

<213> 大肠埃希氏杆菌（Escherichia coli）

<400> 8

atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacatct gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac 60

agcgtctccg acctgatgca gctctcggag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat 120

gtaggagggc gtggatatgt cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat 180

cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt 240

ggggaattca gcgagagcct gacctattgc atctcccgcc gtgcacaggg tgtcacgttg 300

caagacctgc ctgaaaccga actgcccgct gttctgcagc cggtcgcgga ggccatggat 360

gcgatcgctg cggccgatct tagccagacg agcgggttcg gcccattcgg accgcaagga 420

atcggtcaat acactacatg gcgtgatttc atatgcgcga ttgctgatcc ccatgtgtat 480

cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag 540

ctgatgcttt gggccgagga ctgccccgaa gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc 600

tccaacaatg tcctgacgga caatggccgc ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg 660

atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc aacatcttct tctggaggcc gtggttggct 720

tgtatggagc agcagacgcg ctacttcgag cggaggcatc cggagcttgc aggatcgccg 780

cggctccggg cgtatatgct ccgcattggt cttgaccaac tctatcagag cttggttgac 840

ggcaatttcg atgatgcagc ttgggcgcag ggtcgatgcg acgcaatcgt ccgatccgga 900

gccgggactg tcgggcgtac acaaatcgcc cgcagaagcg cggccgtctg gaccgatggc 960

tgtgtagaag tactcgccga tagtggaaac cgacgcccca gcactcgtcc gagggcaaag 1020

gaatag 1026

<210> 9

<211> 960

<212> DNA

<213> 热葡萄糖苷酶副地芽孢杆菌（Parageobacillus thermoglucosidasius）

<400> 9

atgaaacaac aaggcatgaa tcgagtagca cttataggaa cggggttcgt tggggccagc 60

tatgcatttg cccttatgaa ccaaggaata gcagatgagt tagtattgat tgatgtaaat 120

aagaataagg cagagggcga tgtgatggat ttaaatcacg gaaaagtatt cgcgccgaag 180

ccgatgaata tttggtttgg agattatcaa gattgccaag acgccgattt ggtggtgatt 240

tgtgcagggg ctaaccaaaa gccgggagaa acaagactgg atcttgttga caaaaatatt 300

aatatcttca aaacgattgt cgattctgtg atgaaatccg gatttgatgg cgtttttctt 360

gtggcaacga acccagtgga tattttaacg tatgctactt ggaaatttag cgggttaccg 420

aaagagcggg taatcggctc aggaacgatt cttgatacag caagattccg cttcttgcta 480

agtgaatatt ttcaagtggc tccgaccaat gtacatgcgt atattattgg cgagcatggg 540

gatacagagc tgcctgtttg gagccatgcg gaaattggaa gcattccagt tgagcaaata 600

ttgatgcaaa acgataacta tagaaaagag gatttagaca atatctttgt taatgttcgt 660

gatgcggcat atcaaatcat tgagaaaaaa ggggcaacgt attacggcat tgcaatggga 720

ttagtccgta tcactcgtgc tattttgcac aatgaaaatg ccatcttaac cgtttctgct 780

catttggacg gccaatatgg cgaacgaaat gtttatattg gcgtgcctgc cattatcaac 840

cgaaacggta ttcgtgaagt gatggaattg acgctaaatg aaacagaaca acaacaattc 900

catcatagtg taactgtatt aaaagacatt ctttcccgtt attttgatga tgtaaaataa 960

<210> 10

<211> 954

<212> DNA

<213> 嗜热地芽孢杆菌（Geobacillus kaustophilus）

<400> 10

atgaaaaacg ggagaggaaa tcgggtagcg gtcgtcggca ccgggtttgt cggcgccagt 60

tatgcgtttg ccttaatgaa tcaagggatt gccgatgaga tcgtgctcat cgatgcaaat 120

gaaaacaagg ctgagggcga tgcgatggac ttcaaccatg ggaaagtatt tgcgccgaag 180

ccggctgaca tttggcacgg cgattacgat gattgccgcg atgccgattt ggttgtcatt 240

tgcgccggcg ccaaccaaaa accgggcgag acgcggcttg atcttgtgga caaaaacatt 300

gccattttcc gctcgatcgt tgagtcggtc atggcatccg gatttcaagg actgtttctc 360

gtcgccacca atccggtcga cattttaacg tacgcgacgt ggaaattcag cggcctgccg 420

caagagcgag taatcggatc gggcacgatt ttggacacgg cgcggttccg cttcttgttg 480

ggcgactatt tcgccgtcgc cccgacgaac gtgcacgcct atattatcgg cgaacatggc 540

gacactgaac tcccggtctg gagccaggct gatatcggcg gcgtgccgat ccgcaagctg 600

gtcgagtcta aaggggaaga agcgcaaaaa gagctcgagc gcatttttgt caatgtgcgc 660

gatgccgcct accaaattat tgagaaaaaa ggagcgacgt actacgggat tgctatgggg 720

cttgcccgcg tgacgcgcgc cattttgcat catgaaaatg ccattttgac cgtttccgct 780

tacttggacg gcccatacgg cgaacgcgat gtctacatcg gtgtgcctgc tgtgatcaac 840

cgaaatggca tccgcgaagt gattgaaatt gaacttgacg aggaggagaa aaaatggttc 900

caccgtagtg ctgcgacgtt aaaaggtgta ttggcgcgct attttgctca gtaa 954

<210> 11

<211> 933

<212> DNA

<213> 嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）

<400> 11

atgaaggtcg gcatcgtggg aagcggcatg gtggggagcg ccaccgccta cgccctggcc 60

ctcctcggcg tggcgcggga ggtggtcctc gtggacctgg accggaagct ggcccaggcc 120

cacgccgagg acatcctcca cgccacgccc ttcgcccacc cggtctgggt gcgggcgggg 180

tcgtacgggg acctcgaggg ggcccgggcg gtggtgctcg ccgccggggt ggcccagcgc 240

cccggggaga cccgcctgca gcttctggac cgcaacgccc aggtcttcgc ccaggtggtg 300

ccccgggttt tagaggcggc cccggaggcg gtgctcctcg tggccacgaa cccggtggac 360

gtgatgaccc aggtggccta ccgcctctcc ggcctgcccc cggggcgggt ggtgggctcg 420

gggacgatcc tggacacggc ccgcttccgg gcccttctgg cggagtacct ccgggtggcc 480

ccccagtcgg tccacgccta cgtgctgggg gagcacgggg actcggaggt gctggtctgg 540

tccagcgccc aggtgggcgg ggtgcccctc ctggagttcg ccgaggcccg ggggcgggcc 600

ctttccccgg aggaccgggc ccgcattgac gaaggggtcc gccgggccgc ctaccggatc 660

attgagggga agggggccac ctactacggc atcggggcgg gcctcgcccg gcttgtgcgg 720

gccatcctca ccgacgaaaa gggggtgtac accgtgagcg ccttcacccc cgaggtggag 780

ggggtcttgg aggtgagcct ctccctgccc cgcatcctgg gcgcgggggg cgtggagggg 840

accgtctacc cgagcctgag cccggaggag cgggaggcct tgcggcggag cgccgagatc 900

ctcaaggagg cggccttcgc cctggggttt tag 933

<210> 12

<211> 319

<212> PRT

<400> 12

Met Lys Gln Gln Gly Met Asn Arg Val Ala Leu Ile Gly Thr Gly Phe

1 5 10 15

Val Gly Ala Ser Tyr Ala Phe Ala Leu Met Asn Gln Gly Ile Ala Asp

20 25 30

Glu Leu Val Leu Ile Asp Val Asn Lys Asn Lys Ala Glu Gly Asp Val

35 40 45

Met Asp Leu Asn His Gly Lys Val Phe Ala Pro Lys Pro Met Asn Ile

50 55 60

Trp Phe Gly Asp Tyr Gln Asp Cys Gln Asp Ala Asp Leu Val Val Ile

65 70 75 80

Cys Ala Gly Ala Asn Gln Lys Pro Gly Glu Thr Arg Leu Asp Leu Val

85 90 95

Asp Lys Asn Ile Asn Ile Phe Lys Thr Ile Val Asp Ser Val Met Lys

100 105 110

Ser Gly Phe Asp Gly Val Phe Leu Val Ala Thr Asn Pro Val Asp Ile

115 120 125

Leu Thr Tyr Ala Thr Trp Lys Phe Ser Gly Leu Pro Lys Glu Arg Val

130 135 140

Ile Gly Ser Gly Thr Ile Leu Asp Thr Ala Arg Phe Arg Phe Leu Leu

145 150 155 160

Ser Glu Tyr Phe Gln Val Ala Pro Thr Asn Val His Ala Tyr Ile Ile

165 170 175

Gly Glu His Gly Asp Thr Glu Leu Pro Val Trp Ser His Ala Glu Ile

180 185 190

Gly Ser Ile Pro Val Glu Gln Ile Leu Met Gln Asn Asp Asn Tyr Arg

195 200 205

Lys Glu Asp Leu Asp Asn Ile Phe Val Asn Val Arg Asp Ala Ala Tyr

210 215 220

Gln Ile Ile Glu Lys Lys Gly Ala Thr Tyr Tyr Gly Ile Ala Met Gly

225 230 235 240

Leu Val Arg Ile Thr Arg Ala Ile Leu His Asn Glu Asn Ala Ile Leu

245 250 255

Thr Val Ser Ala His Leu Asp Gly Gln Tyr Gly Glu Arg Asn Val Tyr

260 265 270

Ile Gly Val Pro Ala Ile Ile Asn Arg Asn Gly Ile Arg Glu Val Met

275 280 285

Glu Leu Thr Leu Asn Glu Thr Glu Gln Gln Gln Phe His His Ser Val

290 295 300

Thr Val Leu Lys Asp Ile Leu Ser Arg Tyr Phe Asp Asp Val Lys

305 310 315

<210> 13

<211> 317

<212> PRT

<213> 嗜热地芽孢杆菌（Geobacillus kaustophilus）

<400> 13

Met Lys Asn Gly Arg Gly Asn Arg Val Ala Val Val Gly Thr Gly Phe

1 5 10 15

Val Gly Ala Ser Tyr Ala Phe Ala Leu Met Asn Gln Gly Ile Ala Asp

20 25 30

Glu Ile Val Leu Ile Asp Ala Asn Glu Asn Lys Ala Glu Gly Asp Ala

35 40 45

Met Asp Phe Asn His Gly Lys Val Phe Ala Pro Lys Pro Ala Asp Ile

50 55 60

Trp His Gly Asp Tyr Asp Asp Cys Arg Asp Ala Asp Leu Val Val Ile

65 70 75 80

Cys Ala Gly Ala Asn Gln Lys Pro Gly Glu Thr Arg Leu Asp Leu Val

85 90 95

Asp Lys Asn Ile Ala Ile Phe Arg Ser Ile Val Glu Ser Val Met Ala

100 105 110

Ser Gly Phe Gln Gly Leu Phe Leu Val Ala Thr Asn Pro Val Asp Ile

115 120 125

Leu Thr Tyr Ala Thr Trp Lys Phe Ser Gly Leu Pro Gln Glu Arg Val

130 135 140

Ile Gly Ser Gly Thr Ile Leu Asp Thr Ala Arg Phe Arg Phe Leu Leu

145 150 155 160

Gly Asp Tyr Phe Ala Val Ala Pro Thr Asn Val His Ala Tyr Ile Ile

165 170 175

Gly Glu His Gly Asp Thr Glu Leu Pro Val Trp Ser Gln Ala Asp Ile

180 185 190

Gly Gly Val Pro Ile Arg Lys Leu Val Glu Ser Lys Gly Glu Glu Ala

195 200 205

Gln Lys Glu Leu Glu Arg Ile Phe Val Asn Val Arg Asp Ala Ala Tyr

210 215 220

Gln Ile Ile Glu Lys Lys Gly Ala Thr Tyr Tyr Gly Ile Ala Met Gly

225 230 235 240

Leu Ala Arg Val Thr Arg Ala Ile Leu His His Glu Asn Ala Ile Leu

245 250 255

Thr Val Ser Ala Tyr Leu Asp Gly Pro Tyr Gly Glu Arg Asp Val Tyr

260 265 270

Ile Gly Val Pro Ala Val Ile Asn Arg Asn Gly Ile Arg Glu Val Ile

275 280 285

Glu Ile Glu Leu Asp Glu Glu Glu Lys Lys Trp Phe His Arg Ser Ala

290 295 300

Ala Thr Leu Lys Gly Val Leu Ala Arg Tyr Phe Ala Gln

305 310 315

<210> 14

<211> 310

<212> PRT

<213> 嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）

<400> 14

Met Lys Val Gly Ile Val Gly Ser Gly Met Val Gly Ser Ala Thr Ala

1 5 10 15

Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Gly Val Ala Arg Glu Val Val Leu Val Asp

20 25 30

Leu Asp Arg Lys Leu Ala Gln Ala His Ala Glu Asp Ile Leu His Ala

35 40 45

Thr Pro Phe Ala His Pro Val Trp Val Arg Ala Gly Ser Tyr Gly Asp

50 55 60

Leu Glu Gly Ala Arg Ala Val Val Leu Ala Ala Gly Val Ala Gln Arg

65 70 75 80

Pro Gly Glu Thr Arg Leu Gln Leu Leu Asp Arg Asn Ala Gln Val Phe

85 90 95

Ala Gln Val Val Pro Arg Val Leu Glu Ala Ala Pro Glu Ala Val Leu

100 105 110

Leu Val Ala Thr Asn Pro Val Asp Val Met Thr Gln Val Ala Tyr Arg

115 120 125

Leu Ser Gly Leu Pro Pro Gly Arg Val Val Gly Ser Gly Thr Ile Leu

130 135 140

Asp Thr Ala Arg Phe Arg Ala Leu Leu Ala Glu Tyr Leu Arg Val Ala

145 150 155 160

Pro Gln Ser Val His Ala Tyr Val Leu Gly Glu His Gly Asp Ser Glu

165 170 175

Val Leu Val Trp Ser Ser Ala Gln Val Gly Gly Val Pro Leu Leu Glu

180 185 190

Phe Ala Glu Ala Arg Gly Arg Ala Leu Ser Pro Glu Asp Arg Ala Arg

195 200 205

Ile Asp Glu Gly Val Arg Arg Ala Ala Tyr Arg Ile Ile Glu Gly Lys

210 215 220

Gly Ala Thr Tyr Tyr Gly Ile Gly Ala Gly Leu Ala Arg Leu Val Arg

225 230 235 240

Ala Ile Leu Thr Asp Glu Lys Gly Val Tyr Thr Val Ser Ala Phe Thr

245 250 255

Pro Glu Val Glu Gly Val Leu Glu Val Ser Leu Ser Leu Pro Arg Ile

260 265 270

Leu Gly Ala Gly Gly Val Glu Gly Thr Val Tyr Pro Ser Leu Ser Pro

275 280 285

Glu Glu Arg Glu Ala Leu Arg Arg Ser Ala Glu Ile Leu Lys Glu Ala

290 295 300

Ala Phe Ala Leu Gly Phe

305 310

<210> 15

<211> 1035

<212> DNA

<213> 嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）

<400> 15

atgaggtggc gggcggactt cctctcggcc tgggcggagg ccctcttgcg aaaggcggga 60

gcggacgaac cctccgccaa ggcggtggcc tgggccctgg tggaggcgga cctcaggggg 120

gtgggaagcc acgggctttt gcgccttccc gtttacgtgc gccgcctcga ggcgggcctg 180

gtgaacccca gccccaccct gcccctggag gaacggggcc ccgtggccct cctggacggg 240

gagcacggct tcggaccccg cgtggcccta aaggccgtgg aggcggccca aagcctcgca 300

aggaggcacg gcctcggggc cgtgggggtg cggcggagca cccacttcgg catggcgggc 360

ctctacgcgg agaagctcgc ccgggagggc ttcgtggcct gggtcaccac caacgccgag 420

cccgacgtgg tgcccttcgg ggggcgggag aaggccttgg gcaccaaccc tctggccttc 480

gccgccccgg cccctcaggg gatcctcgtg gccgacctgg ccacctcgga aagcgccatg 540

ggcaaggtct tcctagcccg ggagaagggg gagcggatcc ccccaagctg gggggtggac 600

cgggagggga gccccacgga cgacccccac cgggtctacg ccctgaggcc cctcgggggg 660

cccaaggggt acgccctggc ccttttggtg gaggtgctct cgggggtgct cacgggggcg 720

ggggtggccc acggcatcgg ccgcatgtac gacgagtggg accgccccca ggacgtgggc 780

cacttcctcc tggccctgga cccggggcgc ttcgtgggca aagaggcctt cctggagcgg 840

atgggggccc tttggcaagc cctaaaggcc actcccccgg cgccggggca cgaggaggtc 900

ttcctccccg gggagttgga ggccaggagg cgggagcggg ccctggcgga ggggatggcc 960

cttccggagc gggtggtggc ggagcttaag gccttggggg agcgctacgg cgtgccttgg 1020

agggacgatg cttga 1035

<210> 16

<211> 1011

<212> DNA

<213> 红色亚栖热菌（Meiothermus ruber）

<400> 16

atgcaaggca ttcctgtgca acaactgcgc gagcgggtgg agcagattct aataaaccgg 60

ggctttacgc tggagaatgc tctacccatc gcagaatccc tggtgctggc cgagatgcgg 120

ggggttgcct cgcacggcct gatccgactg cccatctacc tcgagcgcgc ccgactgggt 180

tcggtaaaac cccaggcccg gcccgtgctg ctggcggatt atccagccct ggccctgctg 240

gatgcccagg atggtcacgg catcccctcc ggcttgaaag cgatggagct ggccattgaa 300

aaagcccaga aggtgggcct ggccgctgtg ggggtgcggc gctcgagcca ctttggcctg 360

gcctggtact tcgtgcgcag cgcagtggaa aaggggctgg tcggcgtggc actctccaac 420

gccgatgcgc tggtggcccc ctggggcgcc cgcagccgct ttctgggcac caaccccctg 480

gctgtgggca tcccggccat ggaggaaccc cccatcgccc tggacatggc caccagcgag 540

gccgcccacg gcaaaatttt gctggccaag tccagcggga aaaccatccc cctcaactgg 600

gccctcgatg cggaggggcg gcccaccgac gaccccgacc gggccctggc cggcgccctg 660

ctgccttttg gggggcccaa gggatcggcc atcagcctgc tcattgatgt gctgtgcggc 720

ccactcgtgg gcgctctgat tggccccgag atcgccccgc tctacaccga gcccgaacgg 780

ccccagggcc tgggccattt ttttatggcc ctgaacccgg gtgtttttgg cgacgccgaa 840

cagtttagaa agcaggtcga cgcgtacatt cgcagggttc gcgcgctgcc tcccgccgaa 900

aacgtcgatc gggttctact gccaggcgaa cgcgagtggc gcctcgagca aaaagcgcta 960

caggaggggg tgtctctaag cccagaggcc gctaaagcgg tgggccttta a 1011

<210> 17

<211> 999

<212> DNA

<213> 红色亚栖热菌（Meiothermus ruber）

<400> 17

atgagggttc cttatcccgt actcaagcag gcggtctcga gccacttcca gggcctgggg 60

ctggccccgg atcatgccga ggccttcacc gaggtgatcc tcgaggccga gctcgagggc 120

aacctggggc acggcctgac ccggattgcc cagtacaccg cccagctaca ggccggtggg 180

ctcaaccccc ggccgcagat gcgtttggaa cgaaccaaac ccggggttgc agttctgcat 240

gccgacggcg cacccgggcc ggtggccggg ctttttgcag tgcaggcgct ggccccgatg 300

gccagggagc agggaagcgc cgccctggcc gtgcgcggcg cggggcattc cggggtgctc 360

tcggcgtacg tgggccggct ggcccaagag ggcctggtag ccctggcctt tgccaacacc 420

cccccggcca tcgccccggg gccggtgctg ggcaccaacc ccatcgccct gggcgcgccg 480

gccgagcccc agccggtcat cattgatacc tccatctcgg tggtggcgcg cggcaagatc 540

atcgccgcgg ctaaaaaggg cgagcccatc ccgccgggct gggcgctcga caaggagggt 600

cgcccaacca ccgatgccaa ggctgcgctg gaaggctcac tgctgcccat tggcgagggc 660

aaggggtttg cgctggcagt gctggtggaa attctggccg gggccctggc gggcgacgtg 720

ctctcgcccg agctgcccct gccctggatg cccccagcgc aggccgccaa gccggggctg 780

ctgctgctgg cctttgaccc cgccgccttt ggcccgggct acaggggccg ggtggcccag 840

ctcatcgagg ctcttaaagc ggccggaggc cggattcccg gtgcgcgccg ggccgcttta 900

cgagagaaag ccttggcgga aggtctggag gtcaaccaga cgcttcaggc cgaactcggt 960

acactaggcg tgcatctaca aggaggaggg acaagatga 999

<210> 18

<211> 344

<212> PRT

<213> 嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）

<400> 18

Met Arg Trp Arg Ala Asp Phe Leu Ser Ala Trp Ala Glu Ala Leu Leu

1 5 10 15

Arg Lys Ala Gly Ala Asp Glu Pro Ser Ala Lys Ala Val Ala Trp Ala

20 25 30

Leu Val Glu Ala Asp Leu Arg Gly Val Gly Ser His Gly Leu Leu Arg

35 40 45

Leu Pro Val Tyr Val Arg Arg Leu Glu Ala Gly Leu Val Asn Pro Ser

50 55 60

Pro Thr Leu Pro Leu Glu Glu Arg Gly Pro Val Ala Leu Leu Asp Gly

65 70 75 80

Glu His Gly Phe Gly Pro Arg Val Ala Leu Lys Ala Val Glu Ala Ala

85 90 95

Gln Ser Leu Ala Arg Arg His Gly Leu Gly Ala Val Gly Val Arg Arg

100 105 110

Ser Thr His Phe Gly Met Ala Gly Leu Tyr Ala Glu Lys Leu Ala Arg

115 120 125

Glu Gly Phe Val Ala Trp Val Thr Thr Asn Ala Glu Pro Asp Val Val

130 135 140

Pro Phe Gly Gly Arg Glu Lys Ala Leu Gly Thr Asn Pro Leu Ala Phe

145 150 155 160

Ala Ala Pro Ala Pro Gln Gly Ile Leu Val Ala Asp Leu Ala Thr Ser

165 170 175

Glu Ser Ala Met Gly Lys Val Phe Leu Ala Arg Glu Lys Gly Glu Arg

180 185 190

Ile Pro Pro Ser Trp Gly Val Asp Arg Glu Gly Ser Pro Thr Asp Asp

195 200 205

Pro His Arg Val Tyr Ala Leu Arg Pro Leu Gly Gly Pro Lys Gly Tyr

210 215 220

Ala Leu Ala Leu Leu Val Glu Val Leu Ser Gly Val Leu Thr Gly Ala

225 230 235 240

Gly Val Ala His Gly Ile Gly Arg Met Tyr Asp Glu Trp Asp Arg Pro

245 250 255

Gln Asp Val Gly His Phe Leu Leu Ala Leu Asp Pro Gly Arg Phe Val

260 265 270

Gly Lys Glu Ala Phe Leu Glu Arg Met Gly Ala Leu Trp Gln Ala Leu

275 280 285

Lys Ala Thr Pro Pro Ala Pro Gly His Glu Glu Val Phe Leu Pro Gly

290 295 300

Glu Leu Glu Ala Arg Arg Arg Glu Arg Ala Leu Ala Glu Gly Met Ala

305 310 315 320

Leu Pro Glu Arg Val Val Ala Glu Leu Lys Ala Leu Gly Glu Arg Tyr

325 330 335

Gly Val Pro Trp Arg Asp Asp Ala

340

<210> 19

<211> 336

<212> PRT

<213> 红色亚栖热菌（Meiothermus ruber）

<400> 19

Met Gln Gly Ile Pro Val Gln Gln Leu Arg Glu Arg Val Glu Gln Ile

1 5 10 15

Leu Ile Asn Arg Gly Phe Thr Leu Glu Asn Ala Leu Pro Ile Ala Glu

20 25 30

Ser Leu Val Leu Ala Glu Met Arg Gly Val Ala Ser His Gly Leu Ile

35 40 45

Arg Leu Pro Ile Tyr Leu Glu Arg Ala Arg Leu Gly Ser Val Lys Pro

50 55 60

Gln Ala Arg Pro Val Leu Leu Ala Asp Tyr Pro Ala Leu Ala Leu Leu

65 70 75 80

Asp Ala Gln Asp Gly His Gly Ile Pro Ser Gly Leu Lys Ala Met Glu

85 90 95

Leu Ala Ile Glu Lys Ala Gln Lys Val Gly Leu Ala Ala Val Gly Val

100 105 110

Arg Arg Ser Ser His Phe Gly Leu Ala Trp Tyr Phe Val Arg Ser Ala

115 120 125

Val Glu Lys Gly Leu Val Gly Val Ala Leu Ser Asn Ala Asp Ala Leu

130 135 140

Val Ala Pro Trp Gly Ala Arg Ser Arg Phe Leu Gly Thr Asn Pro Leu

145 150 155 160

Ala Val Gly Ile Pro Ala Met Glu Glu Pro Pro Ile Ala Leu Asp Met

165 170 175

Ala Thr Ser Glu Ala Ala His Gly Lys Ile Leu Leu Ala Lys Ser Ser

180 185 190

Gly Lys Thr Ile Pro Leu Asn Trp Ala Leu Asp Ala Glu Gly Arg Pro

195 200 205

Thr Asp Asp Pro Asp Arg Ala Leu Ala Gly Ala Leu Leu Pro Phe Gly

210 215 220

Gly Pro Lys Gly Ser Ala Ile Ser Leu Leu Ile Asp Val Leu Cys Gly

225 230 235 240

Pro Leu Val Gly Ala Leu Ile Gly Pro Glu Ile Ala Pro Leu Tyr Thr

245 250 255

Glu Pro Glu Arg Pro Gln Gly Leu Gly His Phe Phe Met Ala Leu Asn

260 265 270

Pro Gly Val Phe Gly Asp Ala Glu Gln Phe Arg Lys Gln Val Asp Ala

275 280 285

Tyr Ile Arg Arg Val Arg Ala Leu Pro Pro Ala Glu Asn Val Asp Arg

290 295 300

Val Leu Leu Pro Gly Glu Arg Glu Trp Arg Leu Glu Gln Lys Ala Leu

305 310 315 320

Gln Glu Gly Val Ser Leu Ser Pro Glu Ala Ala Lys Ala Val Gly Leu

325 330 335

<210> 20

<211> 332

<212> PRT

<213> 红色亚栖热菌（Meiothermus ruber）

<400> 20

Met Arg Val Pro Tyr Pro Val Leu Lys Gln Ala Val Ser Ser His Phe

1 5 10 15

Gln Gly Leu Gly Leu Ala Pro Asp His Ala Glu Ala Phe Thr Glu Val

20 25 30

Ile Leu Glu Ala Glu Leu Glu Gly Asn Leu Gly His Gly Leu Thr Arg

35 40 45

Ile Ala Gln Tyr Thr Ala Gln Leu Gln Ala Gly Gly Leu Asn Pro Arg

50 55 60

Pro Gln Met Arg Leu Glu Arg Thr Lys Pro Gly Val Ala Val Leu His

65 70 75 80

Ala Asp Gly Ala Pro Gly Pro Val Ala Gly Leu Phe Ala Val Gln Ala

85 90 95

Leu Ala Pro Met Ala Arg Glu Gln Gly Ser Ala Ala Leu Ala Val Arg

100 105 110

Gly Ala Gly His Ser Gly Val Leu Ser Ala Tyr Val Gly Arg Leu Ala

115 120 125

Gln Glu Gly Leu Val Ala Leu Ala Phe Ala Asn Thr Pro Pro Ala Ile

130 135 140

Ala Pro Gly Pro Val Leu Gly Thr Asn Pro Ile Ala Leu Gly Ala Pro

145 150 155 160

Ala Glu Pro Gln Pro Val Ile Ile Asp Thr Ser Ile Ser Val Val Ala

165 170 175

Arg Gly Lys Ile Ile Ala Ala Ala Lys Lys Gly Glu Pro Ile Pro Pro

180 185 190

Gly Trp Ala Leu Asp Lys Glu Gly Arg Pro Thr Thr Asp Ala Lys Ala

195 200 205

Ala Leu Glu Gly Ser Leu Leu Pro Ile Gly Glu Gly Lys Gly Phe Ala

210 215 220

Leu Ala Val Leu Val Glu Ile Leu Ala Gly Ala Leu Ala Gly Asp Val

225 230 235 240

Leu Ser Pro Glu Leu Pro Leu Pro Trp Met Pro Pro Ala Gln Ala Ala

245 250 255

Lys Pro Gly Leu Leu Leu Leu Ala Phe Asp Pro Ala Ala Phe Gly Pro

260 265 270

Gly Tyr Arg Gly Arg Val Ala Gln Leu Ile Glu Ala Leu Lys Ala Ala

275 280 285

Gly Gly Arg Ile Pro Gly Ala Arg Arg Ala Ala Leu Arg Glu Lys Ala

290 295 300

Leu Ala Glu Gly Leu Glu Val Asn Gln Thr Leu Gln Ala Glu Leu Gly

305 310 315 320

Thr Leu Gly Val His Leu Gln Gly Gly Gly Thr Arg

325 330

<210> 21

<211> 1674

<212> DNA

<213> 嗜热地芽孢杆菌（Geobacillus kaustophilus）

<400> 21

atgtggaagc aagattttac accaatcgcc gaccagcttt ggttatcggc gattgtcgca 60

ctcattccga ttttatattt cttttgggcg ttggccgtca agcggatgaa agggcatgtt 120

gcggggctga cgacgttgct gcttgctgtt gtgttggctg taatcgctta cagaatgccg 180

gctggaaaag cggttatgtc agtgacgcaa ggcgcggtgt acggattgtt gccgatcggc 240

tggatcatca tcacctctgt ctttttatac aagctgacgg tgaaaacagg ccactttgac 300

attatccgca attcggttgt ctcgctcacc gaagaccgcc ggctgcaagc gttgctgatt 360

gccttttcgt ttggcgcctt tttggaaggg gcagctgggt ttggcgcgcc agtggcgatt 420

tcagcggcgc ttcttgcggg gttggggttc aacccgctgt atgccgcggg catttgcttg 480

atcgccaaca cagcgccagt ggcattcggg gcggtcggga ttccaatcat ttcgatggaa 540

ggaccgactg gcgtgccggc gatggaaatc tcaaaaatgg ttgggcggca gttgccgttt 600

ttatcagtgt tcatcccgtt ctatctcgtg ctcattatgg ccgggtggaa aaagacgatg 660

gaagtgttgc cggccattat cgtttccggt gtttcgtttg cgctgacgca atatttcacc 720

tcgaactttt taggaccgga gctgccggac attttgtcct cgctcgtttc gatcgtcgcg 780

ttggctgtct ttttgaaata ttggaagccg aaaagcacat tccgctttgc aacggagtcg 840

gaagtggcgg ccgctgggca agttgctcgc gcgacgcaac gcggcgggga agtattccgc 900

gcttggtcgc cgtttctcgt gctgacggct ttgatctcgc tgtggggcat cccgcaagtg 960

aaggcggcgc tcaccggcca ttatgaaggg acaaacggct tgttgaagtt ggtcaacgct 1020

atcggcgtcc acttgacgtt tatgccgcct gtgccggggc tcaacaacca aattttgaac 1080

ccaagtggcc agccgatcgc tgcggtgtat aagcttgagc tgctcggcgc ggctgggacg 1140

gcgattttgc tggcggcggt cgtcacaaag ttcatcatcg gcatctcgtg gaaagagtgg 1200

gcgcgtacgt ttgtggaaac gcttaacgaa ttgaaattcc cgatcatcac gatcgcttcg 1260

gttgtcggct ttgcctatat cgccaactcg tcaggcatga gcacgacgct tggaatggcg 1320

ttggccaaaa caggcccgtt gttcccgttc ttctcgccga ttttaggatg gctcggcgtg 1380

tttatcaccg gttccgacac gtcgtcgaac ttgttgttcg gcaacctgca aaaagtgacg 1440

gcgacatcga ttggcatgga tccggtgctg gcgttggcgg ccaactcatc aggcggcgtc 1500

gtcgggaaaa tgatttcgcc gcaatcgatc gctgtcgcct gtgcggccgt cggtttgacc 1560

ggcaaagaat ccgacttgtt ccgcttcacg atcaaacata gcgtgttctt aatcatcttg 1620

attggcgttc tcgtttactt gcaatcgacg gtattgtcgt ggatgattcc ataa 1674

<210> 22

<211> 557

<212> PRT

<213> 嗜热地芽孢杆菌（Geobacillus kaustophilus）

<400> 22

Met Trp Lys Gln Asp Phe Thr Pro Ile Ala Asp Gln Leu Trp Leu Ser

1 5 10 15

Ala Ile Val Ala Leu Ile Pro Ile Leu Tyr Phe Phe Trp Ala Leu Ala

20 25 30

Val Lys Arg Met Lys Gly His Val Ala Gly Leu Thr Thr Leu Leu Leu

35 40 45

Ala Val Val Leu Ala Val Ile Ala Tyr Arg Met Pro Ala Gly Lys Ala

50 55 60

Val Met Ser Val Thr Gln Gly Ala Val Tyr Gly Leu Leu Pro Ile Gly

65 70 75 80

Trp Ile Ile Ile Thr Ser Val Phe Leu Tyr Lys Leu Thr Val Lys Thr

85 90 95

Gly His Phe Asp Ile Ile Arg Asn Ser Val Val Ser Leu Thr Glu Asp

100 105 110

Arg Arg Leu Gln Ala Leu Leu Ile Ala Phe Ser Phe Gly Ala Phe Leu

115 120 125

Glu Gly Ala Ala Gly Phe Gly Ala Pro Val Ala Ile Ser Ala Ala Leu

130 135 140

Leu Ala Gly Leu Gly Phe Asn Pro Leu Tyr Ala Ala Gly Ile Cys Leu

145 150 155 160

Ile Ala Asn Thr Ala Pro Val Ala Phe Gly Ala Val Gly Ile Pro Ile

165 170 175

Ile Ser Met Glu Gly Pro Thr Gly Val Pro Ala Met Glu Ile Ser Lys

180 185 190

Met Val Gly Arg Gln Leu Pro Phe Leu Ser Val Phe Ile Pro Phe Tyr

195 200 205

Leu Val Leu Ile Met Ala Gly Trp Lys Lys Thr Met Glu Val Leu Pro

210 215 220

Ala Ile Ile Val Ser Gly Val Ser Phe Ala Leu Thr Gln Tyr Phe Thr

225 230 235 240

Ser Asn Phe Leu Gly Pro Glu Leu Pro Asp Ile Leu Ser Ser Leu Val

245 250 255

Ser Ile Val Ala Leu Ala Val Phe Leu Lys Tyr Trp Lys Pro Lys Ser

260 265 270

Thr Phe Arg Phe Ala Thr Glu Ser Glu Val Ala Ala Ala Gly Gln Val

275 280 285

Ala Arg Ala Thr Gln Arg Gly Gly Glu Val Phe Arg Ala Trp Ser Pro

290 295 300

Phe Leu Val Leu Thr Ala Leu Ile Ser Leu Trp Gly Ile Pro Gln Val

305 310 315 320

Lys Ala Ala Leu Thr Gly His Tyr Glu Gly Thr Asn Gly Leu Leu Lys

325 330 335

Leu Val Asn Ala Ile Gly Val His Leu Thr Phe Met Pro Pro Val Pro

340 345 350

Gly Leu Asn Asn Gln Ile Leu Asn Pro Ser Gly Gln Pro Ile Ala Ala

355 360 365

Val Tyr Lys Leu Glu Leu Leu Gly Ala Ala Gly Thr Ala Ile Leu Leu

370 375 380

Ala Ala Val Val Thr Lys Phe Ile Ile Gly Ile Ser Trp Lys Glu Trp

385 390 395 400

Ala Arg Thr Phe Val Glu Thr Leu Asn Glu Leu Lys Phe Pro Ile Ile

405 410 415

Thr Ile Ala Ser Val Val Gly Phe Ala Tyr Ile Ala Asn Ser Ser Gly

420 425 430

Met Ser Thr Thr Leu Gly Met Ala Leu Ala Lys Thr Gly Pro Leu Phe

435 440 445

Pro Phe Phe Ser Pro Ile Leu Gly Trp Leu Gly Val Phe Ile Thr Gly

450 455 460

Ser Asp Thr Ser Ser Asn Leu Leu Phe Gly Asn Leu Gln Lys Val Thr

465 470 475 480

Ala Thr Ser Ile Gly Met Asp Pro Val Leu Ala Leu Ala Ala Asn Ser

485 490 495

Ser Gly Gly Val Val Gly Lys Met Ile Ser Pro Gln Ser Ile Ala Val

500 505 510

Ala Cys Ala Ala Val Gly Leu Thr Gly Lys Glu Ser Asp Leu Phe Arg

515 520 525

Phe Thr Ile Lys His Ser Val Phe Leu Ile Ile Leu Ile Gly Val Leu

530 535 540

Val Tyr Leu Gln Ser Thr Val Leu Ser Trp Met Ile Pro

545 550 555

<210> 23

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 23

atacgcgtcc tccgatgcgt cgtaagggaa acgtc 35

<210> 24

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 24

atagtcgact tatttcttgc ccgcagcggc gcccg 35

<210> 25

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 25

atactcgagg agatgacgtt ggaggggcaa ggtcg 35

<210> 26

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 26

atacgcgtct attcctttgc cctcggacga gtgct 35

<210> 27

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 27

cgcgaattca tggctaccca accccgcgtc ggtct 35

<210> 28

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 28

cgcacgcgtt ggagtgcggc tggtcatcgg gtgac 35

<210> 29

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 29

gcacgcgtct gcagaacgga ggcgagcgat gaacg 35

<210> 30

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 30

cgcgcatgct caggggatca agaagacgtg caccc 35

<210> 31

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 31

cgcgaattca tggctaccca accccgcgtc ggtct 35

<210> 32

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 32

cgcgcatgct caggggatca agaagacgtg caccc 35

<210> 33

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 代替HPTL_1695基因的内部序列的核苷酸序列

<400> 33

acgcgtctgc ag 12

<210> 34

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 代替HPTL_1695基因编码的多肽的内部序列的氨基酸序列

<400> 34

Thr Arg Leu Gln

1

<210> 35

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 35

cgtggccaac taggcccagc cagatactcc cgatc 35

<210> 36

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 36

tgaggcctca ttggccggag cgcaacccac tcact 35

<210> 37

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 37

ctgggcctag ttggccacgt agaaagccag tccgc 35

<210> 38

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 38

tccggccaat gaggcctcag aagaactcgt caaga 35

<210> 39

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 39

gcattaatcc ttggactcct gttgatagat ccagtaatga cctcagaact ccatctggat 60

ttgttcagaa cgctcggttg ccg 83

<210> 40

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 40

caccgtgcag tcgatggatc tggattctca ccaataaaaa acgcccggcg gcaaccgagc 60

gttctgaaca aatccagatg gag 83

<210> 41

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 41

ttattggtga gaatccagat ccatcgactg cacggtgcac caatgcttct 50

<210> 42

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 42

gcaagcttgg agtgatcatc gtatgcatat gcgtttctcc tccagatccc tgtttcctgt 60

gtgaaattgt 70

<210> 43

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 43

ctcgaattca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtg 35

<210> 44

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 44

cgcaattgag tttgtagaaa cgcaaaaagg ccatc 35

<210> 45

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 45

ttacatatga aacaacaagg catgaatcga gtagc 35

<210> 46

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 46

ttagaattct tattttacat catcaaaata acggg 35

<210> 47

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 47

ttacatatga aaaacgggag aggaaatcgg gtagc 35

<210> 48

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 48

ttagaattct tactgagcaa aatagcgcgc caata 35

<210> 49

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 49

ttacatatga aggtcggcat cgtgggaagc ggcat 35

<210> 50

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR pimer

<400> 50

ttagaattcc taaaacccca gggcgaaggc cgcct 35

<210> 51

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 51

ttacatatga ggtggcgggc ggacttcctc tcggc 35

<210> 52

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 52

ttagaattct caagcatcgt ccctccaagg cacgc 35

<210> 53

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 53

ttacatatgc aaggcattcc tgtgcaacaa ctgcg 35

<210> 54

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 54

ttagaattct taaaggccca ccgctttagc ggcct 35

<210> 55

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 55

ttacatatga gggttcctta tcccgtactc aagca 35

<210> 56

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 56

tttgaattct catcttgtcc ctcctccttg tagat 35

<210> 57

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 57

cggcaattgc gggcacaaag gggaggagaa aaccg 35

<210> 58

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 58

cggcaattgt tatggaatca tccacgacaa taccg 35

<210> 59

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 59

ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataac 35

<210> 60

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 60

cggcaattgt tatggaatca tccacgacaa taccg 35

Claims

1.一种重组嗜氢菌属(Hydrogenophilus)细菌，其具有引入到其中的乳酸脱氢酶基因和/或苹果酸/乳酸脱氢酶基因，并且其中基因组上的三个乳酸利用酶基因中的一者或多者被破坏。

2.根据权利要求1所述的重组嗜氢菌属细菌，其中所述三个乳酸利用酶基因分别由下述(a1)至(a6)中的任一者的DNA、下述(b1)至(b6)中的任一者的DNA和下述(c1)至(c6)中的任一者的DNA构成：

(a1)由SEQ ID NO：1中阐述的碱基序列构成的DNA；

(a2)由与SEQ ID NO：1中阐述的碱基序列具有90％或更高同一性的碱基序列构成，并编码具有乳酸利用酶活性的多肽的DNA；

(a3)在严紧条件下与由SEQ ID NO：1的互补碱基序列构成的DNA杂交，并编码具有乳酸利用酶活性的多肽的DNA；

(a4)编码由SEQ ID NO：2中阐述的氨基酸序列构成的多肽的DNA；

(a5)编码由与SEQ ID NO：2具有90％或更高同一性的氨基酸序列构成并具有乳酸利用酶活性的多肽的DNA；和

(a6)编码由在SEQ ID NO：2中阐述的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸缺失、替换或添加的氨基酸序列构成并具有乳酸利用酶活性的多肽的DNA；

(b1)由SEQ ID NO：3中阐述的碱基序列构成的DNA；

(b2)由与SEQ ID NO：3中阐述的碱基序列具有90％或更高同一性的碱基序列构成，并编码具有乳酸利用酶活性的多肽的DNA；

(b3)在严紧条件下与由SEQ ID NO：3的互补碱基序列构成的DNA杂交，并编码具有乳酸利用酶活性的多肽的DNA；

(b4)编码由SEQ ID NO：4中阐述的氨基酸序列构成的多肽的DNA；

(b5)编码由与SEQ ID NO：4具有90％或更高同一性的氨基酸序列构成并具有乳酸利用酶活性的多肽的DNA；和

(b6)编码由在SEQ ID NO：4中阐述的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸缺失、替换或添加的氨基酸序列构成并具有乳酸利用酶活性的多肽的DNA；和

(c1)由SEQ ID NO：5中阐述的碱基序列构成的DNA；

(c2)由与SEQ ID NO：5中阐述的碱基序列具有90％或更高同一性的碱基序列构成，并编码具有乳酸利用酶活性的多肽的DNA；

(c3)在严紧条件下与由SEQ ID NO：5的互补碱基序列构成的DNA杂交，并编码具有乳酸利用酶活性的多肽的DNA；

(c4)编码由SEQ ID NO：6中阐述的氨基酸序列构成的多肽的DNA；

(c5)编码由与SEQ ID NO：6具有90％或更高同一性的氨基酸序列构成并具有乳酸利用酶活性的多肽的DNA；和

(c6)编码由在SEQ ID NO：6中阐述的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸缺失、替换或添加的氨基酸序列构成并具有乳酸利用酶活性的多肽的DNA。

3.根据权利要求1或2所述的重组嗜氢菌属细菌，其中所述三个乳酸利用酶基因中的一者或多者通过在所述三个乳酸利用酶基因中的一者或多者中引入一个或多个核苷酸的缺失、添加、替换或其组合而被破坏。

4.根据权利要求1至3中的任一项所述的重组嗜氢菌属细菌，其中所述乳酸脱氢酶基因由下述(d1)至(d6)中的任一者的DNA构成：

(d1)由SEQ ID NO：9、10或11中阐述的碱基序列构成的DNA；

(d2)由与SEQ ID NO：9、10或11中阐述的碱基序列构成的DNA具有90％或更高同一性的碱基序列构成，并编码具有乳酸脱氢酶活性的多肽的DNA；

(d3)在严紧条件下与由SEQ ID NO：9、10或11的互补碱基序列构成的DNA杂交，并编码具有乳酸脱氢酶活性的多肽的DNA；

(d4)编码由SEQ ID NO：12、13或14中阐述的氨基酸序列构成的多肽的DNA；

(d5)编码由与SEQ ID NO：12、13或14具有90％或更高同一性的氨基酸序列构成并具有乳酸脱氢酶活性的多肽的DNA；和

(d6)编码由在SEQ ID NO：12、13或14中阐述的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸缺失、替换或添加的氨基酸序列构成并具有乳酸脱氢酶活性的多肽的DNA。

5.根据权利要求1至4中的任一项所述的重组嗜氢菌属细菌，其中所述苹果酸/乳酸脱氢酶基因由下述(e1)至(e6)中的任一者的DNA构成：

(e1)由SEQ ID NO：15、16或17中阐述的碱基序列构成的DNA；

(e2)由与SEQ ID NO：15、16或17中阐述的碱基序列形成的DNA具有90％或更高同一性的碱基序列构成，并编码具有乳酸脱氢酶活性的多肽的DNA；

(e3)在严紧条件下与由SEQ ID NO：15、16或17的互补碱基序列构成的DNA杂交，并编码具有乳酸脱氢酶活性的多肽的DNA；

(e4)编码由SEQ ID NO：18、19或20中阐述的氨基酸序列构成的多肽的DNA；

(e5)编码由与SEQ ID NO：18、19或20具有90％或更高同一性的氨基酸序列构成并具有乳酸脱氢酶活性的多肽的DNA；和

(e6)编码由在SEQ ID NO：18、19或20中阐述的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸缺失、替换或添加的氨基酸序列构成并具有乳酸脱氢酶活性的多肽的DNA。

6.根据权利要求1至5中的任一项所述的重组嗜氢菌属细菌，其中所述重组嗜氢菌属细菌还具有引入到其中的乳酸透性酶基因。

7.根据权利要求6所述的重组嗜氢菌属细菌，其中所述乳酸透性酶基因由下述(f1)至(f6)中的任一者的DNA构成：

(f1)由SEQ ID NO：21中阐述的碱基序列构成的DNA；

(f2)由与SEQ ID NO：21中阐述的碱基序列构成的DNA具有90％或更高同一性的碱基序列构成，并编码具有乳酸透性酶活性的多肽的DNA；

(f3)在严紧条件下与由SEQ ID NO：21的互补碱基序列构成的DNA杂交，并编码具有乳酸透性酶活性的多肽的DNA；

(f4)编码由SEQ ID NO：22中阐述的氨基酸序列构成的多肽的DNA；

(f5)编码由与SEQ ID NO：22具有90％或更高同一性的氨基酸序列构成并具有乳酸透性酶活性的多肽的DNA；和

(f6)编码由在SEQ ID NO：22中阐述的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸缺失、替换或添加的氨基酸序列构成并具有乳酸透性酶活性的多肽的DNA。

8.一种生产乳酸的方法，所述方法包括利用二氧化碳作为基本上唯一的碳源培养根据权利要求1至7中的任一项所述的重组嗜氢菌属细菌的步骤。