WO2021256511A1 - アスパラギン酸およびメチオニンを生産するヒドロゲノフィラス属細菌の形質転換体 - Google Patents

アスパラギン酸およびメチオニンを生産するヒドロゲノフィラス属細菌の形質転換体 Download PDF

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amino acid
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信幸 笠井
英明 末岡
英明 湯川
直人 大谷
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住友化学株式会社
株式会社Ｃｏ２資源化研究所
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    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y104/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12Y104/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.4.1)
    • C12Y104/01021—Aspartate dehydrogenase (1.4.1.21)

Definitions

  • the present invention relates to a transformant of a bacterium belonging to the genus Hydrogenophilus capable of producing aspartic acid and / or methionine, and a method for producing aspartic acid and / or methionine using this transformant.
  • gases such as carbon dioxide, methane, and carbon monoxide are attracting attention as carbon raw materials with higher sustainability, and valuable chemicals and biotechnology using microorganisms that use these gases are attracting attention.
  • gases such as carbon dioxide, methane, and carbon monoxide are attracting attention as carbon raw materials with higher sustainability, and valuable chemicals and biotechnology using microorganisms that use these gases are attracting attention.
  • there are high expectations for the effective use of carbon dioxide which has a high contribution to global warming, by fixing it.
  • Aspartic acid is a useful amino acid used as a raw material for aspartame sweeteners and biodegradable polymers
  • methionine is a useful amino acid used as a raw material for various chemicals and chemicals such as pharmaceuticals and feed additives.
  • aspartic acid is mainly produced from fumaric acid using aspartase, and this fumaric acid is produced by chemical synthesis as a fractionated product of petroleum.
  • Methionine is produced by improving liquefied petroleum gas (LPG) and the like to generate carbon dioxide.
  • LPG liquefied petroleum gas
  • a method for producing aspartic acid and methionine using genetically modified microorganisms has been proposed.
  • a method for producing aspartic acid using a transformant in which an extrinsic aspartate dehydrogenase gene has been introduced into an Enterobacteriaceae bacterium such as Escherichia coli or yeast has been proposed (Patent Documents 1 and 2).
  • Patent Documents 1 and 2 unlike the present invention in which carbon dioxide is used for the growth and culture of microorganisms, these methods require high-cost saccharides for the growth and culture of microorganisms. Furthermore, these methods do not contribute sufficiently to global warming countermeasures.
  • a solution of the present invention is to provide a transformant capable of producing aspartic acid and / or methionine using carbon dioxide as the sole carbon source, and using this transformant to produce aspartic acid and methionine. It is to be.
  • the present inventors focused on hydrogenophilus bacteria as a microorganism capable of immobilizing carbon dioxide on an industrial scale in order to cope with the high cost of raw materials such as sugars and the above-mentioned measures against global warming.
  • This bacterium has an enzyme that catalyzes the reaction that produces aspartic acid from oxaloacetate, but requires glutamic acid as a substrate. Therefore, in order to impart the ability to produce aspartic acid and methionine, which is a metabolite derived from it, on an industrial scale, instead of glutamic acid, an enzyme that catalyzes the reaction of producing aspartic acid from an amino group derived from an inorganic salt It is necessary to introduce the gene.
  • aspartate dehydrogenase genes genes predicted to be aspartate dehydrogenase genes (hereinafter referred to as aspartate dehydrogenase genes) present in various types of microbial genomes, and these.
  • the DNA of the aspartate dehydrogenase gene derived from a specific microorganism described later was introduced into the bacterium of the genus Hydrogenophilus, the aspartate dehydrogenate was examined. And / or found that methionine can be produced efficiently. It was also found that the transformant obtained by introducing the DNA can efficiently produce aspartic acid and / or methionine using carbon dioxide as the sole carbon source.
  • the present invention has been completed based on the above findings and is as follows.
  • [1] A transformant obtained by introducing the aspartate dehydrogenase gene into a bacterium belonging to the genus Hydrogenophilus.
  • the aspartate dehydrogenase gene is a DNA selected from any of the following (1) to (6): (1) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: DNA consisting of 12 base sequences, (2) A DNA consisting of a base sequence having 90% or more identity with any one of SEQ ID NOs: 1 to 12 and encoding a polypeptide having aspartate dehydrogenase activity.
  • the aspartate dehydrogenase gene is a DNA selected from any of the following (1) to (6): (1) DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, or SEQ ID NO: 11 (2) A DNA consisting of a base sequence having 90% or more identity with SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, or SEQ ID NO: 11 and encoding a polypeptide having aspartate dehydrogenase activity.
  • DNA consisting of a base sequence complementary to SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, or SEQ ID NO: 11 and has aspartate dehydrogenase activity.
  • DNA (4) A DNA encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, or SEQ ID NO: 26.
  • a DNA comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, or SEQ ID NO: 26 and encoding a polypeptide having aspartate dehydrogenase activity.
  • a method for producing aspartic acid which comprises a step of culturing the transformant according to any one of [1] to [5] using carbon dioxide as substantially the sole carbon source.
  • a method for producing methionine which comprises a step of culturing the transformant according to any one of [1] to [5] using carbon dioxide as substantially the sole carbon source.
  • the aspartate dehydrogenase gene by introducing the aspartate dehydrogenase gene into a bacterium belonging to the genus Hydrogenophilus, it functions in the bacterium belonging to the genus Hydrogenophilus to produce methionine, which is a metabolite derived from aspartate and / or derived from it. can do.
  • the present invention provides a transformant obtained by introducing an aspartate dehydrogenase gene into a bacterium belonging to the genus Hydrogenophilus.
  • the transformants of the present invention have aspartate dehydrogenase activity, thereby utilizing carbon dioxide as the sole carbon source to efficiently produce aspartic acid and / or the metabolite methionine derived from it. can. That is, the transformant of the present invention is characterized in that it can directly immobilize carbon dioxide and produce aspartic acid and / or methionine, which are the basis of various chemical products, on an industrial scale.
  • the aspartate dehydrogenase gene (hereinafter, also referred to as "AspDH" in the present specification) introduced in the present invention is long as long as it can exert aspartate dehydrogenase activity in the introduced hydrogenophilus bacterium. It may be derived from any of them.
  • As the aspartate dehydrogenase gene used in the present invention DNA of an aspartate dehydrogenase gene isolated from a naturally occurring bacterium can be used, or DNA artificially synthesized by a method known to those skilled in the art. May be.
  • the aspartate dehydrogenase gene used in the present invention may be the DNA of the aspartate dehydrogenase gene derived from various organisms known so far, or is a DNA obtained by genetically modifying these. May be good.
  • the aspartate dehydrogenase gene used in the present invention does not necessarily have to be identified as an aspartate dehydrogenase gene, and may be DNA encoding the amino acid sequence of a polypeptide having aspartate dehydrogenase activity.
  • the aspartate dehydrogenase activity refers to an enzymatic activity that produces aspartic acid from oxaloacetate and ammonia (NH 3).
  • Examples of the aspartate dehydrogenase gene introduced in the present invention include the base sequence of the aspartate dehydrogenase gene derived from Candidatus Hydroothermae bacterium (SEQ ID NO: 1) and the base sequence of the aspartate dehydrogenase gene derived from Glaciecola sp. 33A (SEQ ID NO: 2). ), Mesorhizobium sp.
  • M7D.F.Ca.US.005.01.1.1-derived aspartate dehydrogenase gene base sequence SEQ ID NO: 3
  • Rhodospirillaceae bacterium-derived aspartate dehydrogenase gene base sequence SEQ ID NO: 4
  • Bacillus kochii Nucleotide sequence of aspartate dehydrogenase gene derived from SEQ ID NO: 5
  • nucleotide sequence of aspartate dehydrogenase gene derived from Novosphingobium rosa SEQ ID NO: 6
  • nucleotide sequence of aspartate dehydrogenase gene derived from Archaeoglobus fulgidus SEQ ID NO: 7
  • Arthrobacter Nucleotide sequence of aspartate dehydrogenase gene derived from sp.161MFSha2.1 SEQ ID NO: 8
  • base sequence of aspartate dehydrogenase gene derived from Oceanotoga teriensis SEQ ID NO: 9
  • DNA consisting of the base sequence of the aspartate dehydrogenase gene derived from Thermotogales bacterium 46_20 (SEQ ID NO: 11), or the base sequence of the aspartate dehydrogenase gene derived from Thermotoga maritima (SEQ ID NO: 12) may be used. ..
  • the aspartate dehydrogenase gene used in the present invention is 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more with any of SEQ ID NOs: 1 to 12. , 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more DNA having a base sequence and encoding a polypeptide having aspartate dehydrogenase activity. May be good.
  • the aspartate dehydrogenase gene used in the present invention is preferably a DNA consisting of a base sequence having 90% or more identity with SEQ ID NO: 3, 8, 9, or 11, and is a polypeptide having aspartate dehydrogenase activity. Is the DNA that encodes.
  • the identity of the base sequence can be examined by using a method known to those skilled in the art, for example, GENETYX ver. It can be calculated using 17 (manufactured by Genetics Co., Ltd.).
  • the aspartate dehydrogenase gene used in the present invention encodes a polypeptide having aspartate dehydrogenase activity that hybridizes with DNA having a base sequence complementary to any of SEQ ID NOs: 1 to 12 under stringent conditions. It may be DNA to be used.
  • the "stringent condition" is, for example, hybridization is performed in a hybridization solution having a salt concentration of 6 ⁇ SSC under a temperature condition of 50 to 60 ° C. for 16 hours to obtain a salt concentration of 0.1 ⁇ SSC. The condition for washing in a solution.
  • hybridize under stringent conditions means a specific hybrid, for example, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more, 98% or more, or 99%. Hybrids having the above homology are formed, and non-specific hybrids, for example, hybrids having the following homology are not formed.
  • Candidatus Hydroothermae bacterium Glacicola sp. 33A, Mesorhizobium sp. M7D.F.Ca.US.005.01.1.1, Rhodospirillaceae bacterium, Bacillus kochii, Novosphingobium rosa, Archaeoglobus fulgidus, Arthrobacter sp. 161MFSha2.1, Oceanotoga teriensis, Marinitoga sp.
  • the aspartate dehydrogenase gene derived from Ca.US.005.01.1.1, Arthrobacter sp.
  • Thermotogales bacterium 46_20 is more preferred.
  • the base sequences of the aspartate dehydrogenase genes (SEQ ID NOs: 1 to 6, 8 to 11) derived from the various bacteria except Thermotoga maritima and Archaeoglobus fulgidus are predicted to correspond to the DNA encoding aspartate dehydrogenase from the genomic sequences of the various bacteria.
  • the amino acid sequences encoded by these (SEQ ID NOs: 16-21, 23-26) have a maximum homology of about 50% with the amino acid sequences of aspartate dehydrogenase whose activity has been confirmed in other microorganisms. It was not easy to predict that the transformant of the present invention actually had aspartate dehydrogenase activity.
  • the aspartate dehydrogenase gene used in the present invention also includes an amino acid sequence of aspartate dehydrogenase derived from Candidatus Hydroothermae bacterium (SEQ ID NO: 16), an amino acid sequence of aspartate dehydrogenase derived from Glaciecola sp. 33A (SEQ ID NO: 17), Mesorhizobium sp.
  • Amino acid sequence of aspartate dehydrogenase derived from M7D.F.Ca.US.005.01.1.1 (SEQ ID NO: 18), amino acid sequence of aspartate dehydrogenase derived from Rhodospirillaceae bacterium (SEQ ID NO: 19), amino acid of aspartate dehydrogenase derived from Bacillus kochii Sequence (SEQ ID NO: 20), amino acid sequence of aspartate dehydrogenase derived from Novosphingobium rosa (SEQ ID NO: 21), amino acid sequence of aspartate dehydrogenase derived from Archaeoglobus fulgidus (SEQ ID NO: 22), aspartate dehydrogenase derived from Arthrobacter sp.
  • the aspartate dehydrogenase gene used in the present invention is 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more with any of SEQ ID NOs: 16 to 27.
  • a DNA consisting of an amino acid sequence having an identity of% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more and encoding a polypeptide having aspartate dehydrogenase activity. May be.
  • the aspartate dehydrogenase gene used in the present invention is preferably a polypeptide consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with SEQ ID NO: 18, 23, 24, or 26, and is a poly having aspartate dehydrogenase activity.
  • the identity of the amino acid sequence can be examined using a method known to those skilled in the art, for example, GENETYX ver. It can be calculated using 17 (manufactured by Genetics Co., Ltd.).
  • the aspartate dehydrogenase gene used in the present invention comprises an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added in any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 16 to 27, and aspartate.
  • DNA encoding a polypeptide having acid dehydrogenase activity can be used. Examples of the plurality of pieces in the present invention include 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2, or 1 piece.
  • Candidatus Hydroothermae bacterium Glacicola sp. 33A, Mesorhizobium sp. M7D.F.Ca.US.005.01.1.1, Rhodospirillaceae bacterium, Bacillus kochii, Novosphingobium rosa, Archaeoglobus fulgidus, Arthrobacter sp. 161MFSha2.1, Oceanotoga teriensis, Marinitoga sp.
  • DNA encoding the polypeptide is preferred, and the amino acid sequence of aspartate dehydrogenase from Mesorhizobium sp.
  • the aspartate dehydrogenase activity in the present invention can be measured and determined by those skilled in the art using a general method. Aspartate dehydrogenase activity can be confirmed, for example, by reacting the obtained polypeptide with oxaloacetate in the presence of NADH and detecting the absorbance at 340 nm. Aspartate dehydrogenase produces aspartic acid from oxaloacetate. Since aspartate dehydrogenase consumes NADH in producing aspartic acid from oxaloacetate, a decrease in the amount of NADH may be detected using a decrease in absorbance at 340 nm as an index. It can be determined that the test polypeptide has aspartate dehydrogenase activity if the absorbance at 340 nm is reduced by any amount.
  • the bacterium belonging to the genus Hydrogenophilus into which the aspartate dehydrogenase gene is introduced is not particularly limited, and may be isolated from the natural world, or a bacterium isolated from the natural world may be introduced. It may be genetically modified so that the aspartate dehydrogenase gene can be highly expressed. The modification can be achieved by removing the endogenous plasmid in the bacterium belonging to the genus Hydrogenophilus.
  • the method for removing (curing) the endogenous plasmid that can be used in the present invention may be a method known in the art, for example, a method using a chemical substance (for example, novobiocin, SDS, acryflavin). , And a method using Etidium bromide, etc.), a method using plasmid incompatibility (for example, a method of introducing a plasmid having the same replication origin as the endogenous plasmid to destabilize it, a plasmid.
  • a method of destroying factors related to a stable partition system to achieve destabilization can be used, but the method is not limited thereto.
  • Examples of the bacterium belonging to the genus Hydrogenophilus that can be used in the present invention include Hydrogenophilus thermoluteolus, Hydrogenophilus halorhabdus, and Hydrogenophilus denitrificans. , Hydrogenophilus hirschii, Hydrogenophilus islandicus, and Hydrogenophilus bacterium Mar3 strain (Hydrogenophilus sp. Mar3), among others, high growth as carbonic acid fixing microorganisms. Hydrogenophilus thermotheoras having velocity and carbon dioxide fixing ability is preferable, and hydrogenophilus thermotheoras TH-1 (NBRC 14978) strain is particularly preferable.
  • Hydrogenophilus thermotheoras TH-1 strain shows the highest growth rate as a carbon dioxide-fixing microorganism (double growth in 1 hour) (Agricultural and Biological Chemistry, 41, 685-690 (1977)).
  • the Hydrogenophilus Thermolteoras TH-1 (NBRC 14978) strain has been deposited internationally under the Budapest Treaty. Further, the strain used in the present invention is most preferably the hydrogenophilus thermotheoras TH-1C strain, which can be prepared based on the examples described herein.
  • the introduction of the aspartate dehydrogenase gene for producing the transformant of the present invention into a bacterium belonging to the genus Hydrogenophilus shall be carried out using a general method for introducing a foreign gene into the bacterium in the art. Can be done.
  • the introduction of the aspartate dehydrogenase gene into the bacterium of the genus Hydrogenophilus in the present invention may be carried out by directly introducing the aspartate dehydrogenase gene into the bacterium of the genus Hydrogenophilus, or a vector for transformation (for example, it may be carried out by incorporating into a plasmid vector, virus vector, cosmid, phosmid, BAC, YAC, etc.) and introducing the incorporated vector into a bacterium belonging to the genus Hydrogenophilus.
  • the vector used for introduction in the present invention may be a commonly used vector as long as it contains DNA having a function of autonomously replicating in a bacterium belonging to the genus Hydrogenophilus, and may be, for example, a broad host.
  • Region vectors pRK415 (GenBank: EF437940.1), pBHR1 (GenBank: Y14439.1), pMMB67EH (ATCC37622), pCAR1 (NCBIReferenceSequence: NC_004444.1), pC194 (NCBIReferenceSequence: NC_002013.1), It may be pK18mobsacB (GenBank: FJ437239.1), pUB110 (NCBIReferenceSequence: NC_001384.1), or a genetically modified version of these vectors (eg, pCAMO-4).
  • the vector that can be used for the introduction in the present invention is preferably pCAMO-4, which can be prepared by one of ordinary skill in the art according to the following examples.
  • Examples of the promoter contained in the vector used in the present invention include a tac promoter, a lac promoter, a trc promoter, and Oxford Genetics OXB1 and OXB11 to OXB20 promoters.
  • Preferred terminators include Escherichia coli. Examples include the rRNAB T1T2 terminator of the rRNA operon, the bacterial promoter ⁇ t0 transcription terminator, and the T7 terminator.
  • the method for introducing (transforming) the aspartate dehydrogenase gene used in the present invention into a bacterium belonging to the genus Hydrogenophilus is generally capable of introducing the vector so that it can autonomously replicate in the bacterium belonging to the genus Hydrogenophilus.
  • Methods can be used, and examples thereof include a calcium chloride method, a calcium phosphate method, a DEAE dextran-mediated transfection method, and an electric pulse method (electroporation method).
  • the present invention provides a method for producing aspartic acid and / or methionine using the transformant described in the present specification.
  • the method of the invention comprises the step of culturing the transformants described herein using carbon dioxide as substantially the sole carbon source.
  • the culturing step in the method of the present invention may include culturing the transformant in an inorganic or organic medium while supplying a mixed gas containing hydrogen, oxygen, and carbon dioxide.
  • the gas to be supplied is preferably a mixed gas composed of hydrogen, oxygen, and carbon dioxide, but a heterogeneous gas may be mixed as long as aspartic acid and / or methionine can be efficiently produced.
  • the transformant Hydrogenophilus bacterium used in the method of the present invention can grow using hydrogen as an energy source and carbon dioxide as the sole carbon source, in particular, substantially only carbon dioxide is used as the carbon source.
  • substantially only carbon dioxide is used as the carbon source.
  • an inorganic medium containing no carbon source such as organic matter or carbonate is used, that is, the culture is carried out using substantially only carbon dioxide as a carbon source (particularly, using only carbon dioxide as a carbon source). Is preferable.
  • "Using carbon dioxide as substantially the only carbon source” in the present invention also includes the case where an unavoidable amount of other carbon sources is contaminated.
  • a medium containing organic substances such as sugars, organic acids and amino acids and carbonates without supplying carbon dioxide can also be used.
  • the pH of the medium used in the method of the present invention is preferably 6.2 to 8, more preferably 6.4 to 7.4, and even more preferably 6.6 to 7. Within this range, the growth of the fungus and the solubility of the mixed gas in the medium are high, and aspartic acid and / or methionine can be produced with high efficiency.
  • the mixed gas when batch culture is used, the mixed gas can be enclosed in a closed culture container for static culture or shaking culture, and when continuous culture is used, the mixed gas can be continuously placed in a closed culture container.
  • the transformant may be cultured by shaking while supplying, or by introducing the mixed gas into the medium by bubbling using a closed culture vessel.
  • shaking culture is preferable in that the dissolution of the mixed gas in the medium is improved.
  • the volume ratio of hydrogen, oxygen, and carbon dioxide (hydrogen: oxygen: carbon dioxide) in the supply gas used in the method of the present invention is preferably 1.75 to 7.5: 1: 0.25 to 3, and 5 to 5. 7.5: 1: 1 to 2 is more preferable, and 6.25 to 7.5: 1: 1.5 is even more preferable. Within this range, the growth of the fungus is good and the target compound can be efficiently produced.
  • the supply rate of the mixed gas or the raw material gas that can be used in the method of the present invention is 10.5 to 60 L / hour, preferably 10.5 to 40 L / hour, and more preferably 10.5 to 1 L per 1 L of the medium. 21 L / hour. Within this range, the transformant grows well, the target compound can be efficiently produced, and waste of the mixed gas can be suppressed.
  • the culture temperature used in the method of the present invention is preferably 35 to 55 ° C, more preferably 37 to 52 ° C, and even more preferably 50 to 52 ° C. Within this range, the transformant grows well and aspartic acid and / or methionine can be efficiently produced.
  • aspartic acid and / or methionine is produced in the culture broth by culturing as described above.
  • Aspartic acid and / or methionine can be recovered by recovering the culture broth, but further, aspartic acid and / or methionine can also be separated from the culture broth by a known method.
  • Such known methods include precipitation, distillation, chromatography, electrodialysis and the like.
  • plasmid vector (pCAMO-4) The method for constructing the plasmid vector (pCAMO-4) used for the introduction of the AspDH gene will be described below.
  • (1) Preparation of DNA fragment of tac promoter Using the plasmid pMAL-c5X manufactured by New England Biolabs as a template, the following pair of primers was synthesized and used to amplify the DNA fragment of tac promoter. PCR was carried out by a conventional method using "DNA thermal cycler" manufactured by Life Technologies, Inc. and KOD FX Neo (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) as a reaction reagent.
  • Primer for tac promoter amplification (a-1) 5'-TTTTATAA CCCGGG CCATCGACTGCACGGTGCACC -3'(SEQ ID NO: 31) (b-1) 5'-TGCTAGCACTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCG -3'(SEQ ID NO: 32)
  • a SmaI restriction enzyme site is added to the primer (a-1) as shown by the underline.
  • 2 ⁇ L was electrophoresed on a 1% agarose gel, and a DNA fragment of about 0.3 kbp corresponding to the tac promoter was detected.
  • Primer for preparing the first half of the multi-cloning region (a-2) 5'-GGAACAGTGCTAGCAGATCTGGAGGAGAAACGCATAT -3'(SEQ ID NO: 33) (b-2) 5'-CAGTGCGGCCGCAAGCTTGTCGACGGAGCTCGAATTCGGATCCGATATCAGCATATGCGTTTCTCCTCCAGA -3'(SEQ ID NO: 34)
  • the base sequences on the 3'side of the primers (a-2) and (b-2) are complementary to each other.
  • Primer for preparing the second half of the multi-cloning region (a-3) 5'-ACAAGCTTGCGGCCGCACTGCAGCACCATCACCACCATCATTGATAAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCT -3'(SEQ ID NO: 35) (b-3) 5'- TATTTGAATCGAGTTATTGCTCAGCGGTGGCAGCAGCCAACTCAGCTTCCTTTCGGGCTTTGT -3'(SEQ ID NO: 36)
  • the base sequences on the 3'side of the primers (a-3) and (b-3) are complementary to each other.
  • PCR was carried out by a conventional method using "DNA thermal cycler” manufactured by Life Technologies, Inc. and KOD FX Neo (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) as a reaction reagent.
  • "DNA thermal cycler” manufactured by Life Technologies, Inc.
  • KOD FX Neo manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • 2 ⁇ L was electrophoresed on a 1% agarose gel, and a DNA fragment of about 0.2 kbp corresponding to the multicloning region was detected.
  • rrnB terminator amplification primer (a-4) 5'-TAACTCGATTCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGA -3'(SEQ ID NO: 37) (b-4) 5'-CCTAGATCCGCGGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG -3' (SEQ ID NO: 38)
  • a-4 5'-TAACTCGATTCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGA -3'(SEQ ID NO: 37)
  • b-4 5'-CCTAGATCCGCGGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG -3' (SEQ ID NO: 38)
  • Primer for amplifying DNA replication initiation region of pUC19 (a-5) 5'-ACAAACTCCGCGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTG -3' (SEQ ID NO: 39) (b-5) 5'-CGTCCGCGGCCAGCAAAAGCCAGGAACCGTAAAA -3'(SEQ ID NO: 40) PCR was carried out by a conventional method using "DNA thermal cycler” manufactured by Life Technologies, Inc. and KOD FX Neo (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) as a reaction reagent.
  • PCR was carried out by a conventional method using "DNA thermal cycler” manufactured by Life Technologies, Inc. and KOD FX Neo (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) as a reaction reagent. 2 ⁇ L of the reaction solution produced above was electrophoresed on a 1% agarose gel, and a DNA fragment of about 1.0 kbp corresponding to the DNA to which the rrnB terminator and the replication initiation region of pUC19 were linked was detected.
  • neomycin / kanamycin resistance gene (hereinafter referred to as "nptII gene")
  • nptII gene neomycin / kanamycin resistance gene
  • PCR was carried out by a conventional method using "DNA thermal cycler” manufactured by Life Technologies, Inc. and KOD FX Neo (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) as a reaction reagent.
  • Primer for nptII gene amplification (a-6) 5'-TTGCTGGCCGCGGACGTAGAAAGCCAGTCCGCAGA -3'(SEQ ID NO: 41) (b-6) 5'-GG CCCGGG TTATAAAAGCCAGTCATTAGGCCTATC -3'(SEQ ID NO: 42) A SmaI restriction enzyme site is added to the primer (b-6) as shown by the underline.
  • a-6 5'-TTGCTGGCCGCGGACGTAGAAAGCCAGTCCGCAGA -3'(SEQ ID NO: 41)
  • b-6) 5'-GG CCCGGG TTATAAAAGCCAGTCATTAGGCCTATC -3'(SEQ ID NO: 42)
  • a SmaI restriction enzyme site is added to the primer (b-6) as shown by the underline.
  • 2 ⁇ L was electrophoresed on a 1% agarose gel, and a DNA fragment of about 1.0 kbp corresponding to the np
  • the DNA fragments prepared in (1) to (4) above have the ends of the DNA fragments of (1) at (4) and (2).
  • the end of the DNA fragment of), the end of the DNA fragment of (2) is the end of the DNA fragment of (1) and (3)
  • the end of the DNA fragment of (3) is the end of the DNA fragment of (2) and (4).
  • the end of the DNA fragment of (4) and the end of the DNA fragment of (4) have a homologous sequence of 16 bp with the ends of the DNA fragments of (3) and (1). Therefore, the Gibson Assembly can ligate the DNA fragments of (1), (2), (3), and (4) into the state of circular DNA.
  • An endogenous plasmid pTH1 [Microbiol Resour Announc. 2018 Aug 16; 7 (6)] was prepared by an alkaline SDS method.
  • the prepared pTH1 of about 66 kbp was cleaved with restriction enzymes ScaI and PvuII, and the plasmid pCAMO-1 prepared above was cleaved with restriction enzymes SmaI, and bound to each other using T4 DNA ligase (manufactured by Takara Bio Co., Ltd.).
  • thermotheoras TH-1 strain was transformed with the obtained ligation solution by an electric pulse method (electroporation method), and A solid medium containing 50 ⁇ g / mL of canamycin [(NH 4 ) 2 SO 4 ).
  • PCR was carried out by a conventional method using "DNA thermal cycler" manufactured by Life Technologies, Inc. and KOD FX Neo (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) as a reaction reagent.
  • Primer for amplifying the inserted pTH1 DNA fragment (a-7) 5'-AATTGTCAGATAGGCCTAATGACTGGCTTTTATAA -3'(SEQ ID NO: 43) (b-7) 5'-TGACGCCAGAAGCATTGGTGCACCGTGCAGTCGAT -3'(SEQ ID NO: 44)
  • 2 ⁇ L was electrophoresed on a 1% agarose gel, and a DNA fragment of about 3.2 kbp was detected. That is, in the obtained plasmid, a DNA fragment of about 3.2 kbp, which is a part of pTH1, is inserted into the SmaI restriction enzyme site of the pCAMO-1 plasmid.
  • the constructed plasmid was named pCAMO-4 and used as a plasmid vector for introducing the gene into the hydrogenophilus thermotheoras.
  • Transformants capable of producing aspartic acid and methionine Cloning of aspartate dehydrogenase gene DNA consisting of the base sequence of aspartate dehydrogenase gene derived from each bacterium selected as follows (Candidatus Hydrothermae bacterium (SEQ ID NO: 1), Glacicola sp. 33A (SEQ ID NO: 2), Mesorhizobium sp.
  • a blast search (database: NCBI) was performed using the amino acid sequence (SEQ ID NO: 27) of the AspDH gene of Thermotoga maritima as a query, and a sequence presumed to be the AspDH gene derived from 14 types of bacteria was selected.
  • a blast search was performed on the amino acid sequence of AspDH reported in the non-patent documents and the amino acid sequence (database: dgene) described in the patent documents, and the homology was obtained for the collected amino acid sequences. As a result, these amino acid sequences, except for Archaeoglobus fulgidus, showed very low homology of about 50%. Therefore, Candidatus Hydroothermae bacterium (SEQ ID NO: 16), Glacicola sp.
  • the plasmid vector pCAMO-4 was cleaved with restriction enzymes NdeI and NotI, and bound to each other with the DNA fragment of the AspDH synthesis gene synthesized above using T4 DNA ligase (manufactured by Takara Bio Co., Ltd.).
  • the endogenous plasmid was removed from the hydrogenophilus thermotheoras TH-1 strain by a conventional method to obtain a curing strain (TH-1C strain).
  • the obtained ligation solution was used to transform the hydrogenophilus thermotheoras TH-1C strain by an electric pulse method (electroporation method), and the mixture was applied to A solid medium containing 50 ⁇ g / mL of kanamycin, and H 2 : O.
  • a mixed gas of 1: 1.5 was sealed, and the cells were cultured with shaking at 50 ° C., and the plasmid DNA was extracted from the culture medium.
  • Each plasmid was cleaved with restriction enzymes NdeI and NotI, and the inserted fragment was confirmed.
  • aspartate dehydrogenase concentration was 0.9 to 137.8 ⁇ M and methionine concentration was 0.9 as a result of culturing. It is ⁇ 10.3 ⁇ M, which is extremely high aspartic acid as compared with the control strain (bacteria other than those derived from the inoculum of the present invention (AspDH005, 008, 015) and the strain not containing the AspDH gene (pCAMO-4 / TH-1C)). And it was shown to have the ability to produce methionine.
  • the transformant of the present invention can produce aspartic acid and / or methionine with high efficiency using carbon dioxide as the sole carbon source, it can industrially produce chemical products while solving global warming caused by an increase in carbon dioxide. It can be manufactured with high efficiency. That is, since the bacterium belonging to the genus Hydrogenophilus used in the present invention has a particularly excellent carbon dioxide-fixing ability among the organisms having a carbon dioxide-fixing ability, if the transformant of the present invention is used, carbon dioxide is distilled off on an industrial scale. Carbon can be fixed to produce aspartic acid and / or methionine.
  • aspartame and / or methionine are raw materials for various chemicals and chemicals such as aspartame sweeteners, biodegradable polymers, feed additives, and pharmaceuticals, and thus, according to the present invention, are high cost as a carbon source. It is possible to industrially produce products using only carbon dioxide as raw materials without using sugars and petroleum raw materials that cause warming problems.

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Abstract

本発明は、ヒドロゲノフィラス属細菌にアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することにより得られる形質転換体を提供する。

Description

アスパラギン酸およびメチオニンを生産するヒドロゲノフィラス属細菌の形質転換体
　本特許出願は、日本国特許出願２０２０－１０４４８７号（２０２０年６月１７日出願）および日本国特許出願２０２０－１６９５５０号（２０２０年１０月７日出願）に基づくパリ条約上の優先権および利益を主張するものであり、ここに引用することによって、上記出願に記載された内容の全体が、本明細書中に組み込まれるものとする。
　本発明は、アスパラギン酸および／またはメチオニン生成能を有するヒドロゲノフィラス属細菌の形質転換体、およびこの形質転換体を用いるアスパラギン酸および／またはメチオニンの製造方法に関する。
　２０１５年採択のパリ協定は、世界全体の温室効果ガスの排出量を迅速に削減することを定めている。これに従い、日本は、２０３０年までに二酸化炭素やメタンなどの温室効果ガス排出量を２０１３年から２６％削減することを目標としている。現在、世界的に化学品製造の大半は石油原料に依存しており、温室効果ガスの排出量増大といった問題を抱えている。従って、化学品製造の脱石油化が求められており、バイオマスからグリーン化学品を製造するバイオリファイナリーの研究開発が各国で精力的に行われている。しかしながら、微生物発酵の原料とするためのバイオマスの糖類への変換には複雑な工程が必要であり、高コストとなる課題がある。脱石油化の研究の一環として、より高度のサステナビリティを有する炭素原料として二酸化炭素、メタン、一酸化炭素などのガスが注目されており、これらのガスを利用する微生物を用いた有価化学品やバイオ燃料を製造する技術に関心が寄せられている。とりわけ、温暖化への寄与率が高い二酸化炭素を固定して有効に利用することへの期待が高い。
　アスパラギン酸はアスパルテーム甘味料や生分解性ポリマーなどの原料として、メチオニンは医薬品や飼料添加物などの様々な化成品・化学品の原料として用いられる有用なアミノ酸である。現在使用されている石油原料を用いる工業プロセスでは、アスパラギン酸は、主に、アスパルターゼを用いてフマル酸から生産され、このフマル酸は石油の分留産物として化学合成により生産されている。メチオニンは、液化石油ガス（ＬＰＧ）などを改良して二酸化炭素を生成して生産されている。
　一方、遺伝子組み換え微生物を用いてアスパラギン酸やメチオニンを製造する方法が提案されている。例えば、大腸菌などの腸内細菌科細菌や酵母に、外因性アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入した形質転換体を利用したアスパラギン酸の製造方法が提案されている（特許文献１および２）。しかしながら、これらの方法では、微生物の増殖・培養に二酸化炭素を用いる本発明とは異なり、微生物の増殖・培養にコストの高い糖類を必要とする。さらに、これらの方法では温暖化対策への寄与が不十分である。
特許第5846122号 WO 2017/083683
　本発明の解決課題は、二酸化炭素を唯一の炭素源として利用してアスパラギン酸および／またはメチオニンを製造することができる形質転換体を提供し、この形質転換体を用いてアスパラギン酸およびメチオニンを製造することである。
　本発明者らは、糖類などの高い原料コストと上記温暖化対策などに対処するために、工業規模で二酸化炭素を固定できる微生物として、ヒドロゲノフィラス属細菌に着目した。この細菌は、オキサロ酢酸からアスパラギン酸を生成する反応を触媒する酵素を有するが、基質としてグルタミン酸を必要とする。そのため、アスパラギン酸およびこれから誘導される代謝産物であるメチオニンの生成能を工業規模で付与するためには、グルタミン酸の代わりに、無機塩由来のアミノ基からアスパラギン酸を生成する反応を触媒する酵素の遺伝子を導入する必要がある。一方で、本発明者らは、ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能するベクターを用いて異種遺伝子をヒドロゲノフィラス属細菌に導入しても、機能するタンパク質を発現しないか、または十分に発現しないことが多いことを知見していた。また、ヒドロゲノフィラス属細菌以外の細菌内では発現する遺伝子であっても、ヒドロゲノフィラス属細菌内では発現しないか、または十分に発現しない場合も多いことも明らかになっていた。
　このような状況の下において、本発明者らは、鋭意研究を重ね、様々な種類の微生物ゲノムに存在するアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子と予測される遺伝子（以下、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子という）のＤＮＡやこれらのＤＮＡのヒドロゲノフィラス属細菌への導入のためのベクター構築などについて検討したところ、後述する特定の微生物に由来するアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のＤＮＡをヒドロゲノフィラス属細菌に導入すると、アスパラギン酸および／またはメチオニンを効率的に生成できることを見出した。また、前記ＤＮＡを導入して得られた形質転換体は、二酸化炭素を唯一の炭素源として用いてアスパラギン酸および／またはメチオニンを効率的に生成できることも見出した。
　本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、以下のとおりである。
［１］
　ヒドロゲノフィラス属細菌に、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することにより得られる、形質転換体。
［２］
　前記アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が、下記（１）～（６）のいずれかから選択されるＤＮＡである、［１］に記載の形質転換体：
（１）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２の塩基配列からなるＤＮＡ、
（２）配列番号１～１２のいずれか１つと９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡであって、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（３）配列番号１～１２のいずれか１つと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（４）配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、または配列番号２７のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（５）配列番号１６～２７のいずれか１つと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、および
（６）配列番号１６～２７のいずれか１つのアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が、欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
［３］
　前記アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が、下記（１）～（６）のいずれかから選択されるＤＮＡである、［１］または［２］に記載の形質転換体：
（１）配列番号３、配列番号８、配列番号９、または配列番号１１の塩基配列からなるＤＮＡ、
（２）配列番号３、配列番号８、配列番号９、または配列番号１１と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡであって、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（３）配列番号３、配列番号８、配列番号９、または配列番号１１と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（４）配列番号１８、配列番号２３、配列番号２４、または配列番号２６のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（５）配列番号１８、配列番号２３、配列番号２４、または配列番号２６と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、および
（６）配列番号１８、配列番号２３、配列番号２４、または配列番号２６のアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が、欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
［４］
　前記ヒドロゲノフィラス属細菌が、ヒドロゲノフィラス サーモルテオラスである、［１］～［３］のいずれか１つに記載の形質転換体。
［５］
　前記ヒドロゲノフィラス サーモルテオラスが、ヒドロゲノフィラス サーモルテオラスTH-1C株である、［４］に記載の形質転換体。
［６］
　［１］～［５］のいずれか１つに記載の形質転換体を、二酸化炭素を実質的に唯一の炭素源として用いて培養する工程を含む、アスパラギン酸の製造方法。
［７］
　［１］～［５］のいずれか１つに記載の形質転換体を、二酸化炭素を実質的に唯一の炭素源として用いて培養する工程を含む、メチオニンの製造方法。
　本発明によれば、上記アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をヒドロゲノフィラス属細菌に導入することにより、ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能し、アスパラギン酸および／またはこれから誘導される代謝産物のメチオニンを生成することができる。
（１）アスパラギン酸および／またはメチオニン生成能を有する形質転換体
　まず、本発明は、ヒドロゲノフィラス属細菌に、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することにより得られる形質転換体を提供する。本発明の形質転換体は、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性を有し、それにより二酸化炭素を唯一の炭素源として利用してアスパラギン酸および／またはこれから誘導される代謝産物のメチオニンを効率的に生成させることができる。すなわち、本発明の形質転換体は、二酸化炭素を直接固定し、様々な化学製品の基となるアスパラギン酸および／またはメチオニンを工業規模で生成することができることを特徴とする。
　本発明で導入されるアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ（以下、本明細書では「ＡｓｐＤＨ」とも称される）遺伝子は、導入されるヒドロゲノフィラス属細菌内でアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性を発揮できるものであれば、いずれに由来するものであってもよい。本発明で用いられるアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子として、自然界に存在する菌から単離されたアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のＤＮＡを用いることができ、あるいは当業者に公知の手法を用いて人工的に合成されたＤＮＡであってもよい。また、本発明で用いられるアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、これまでに知られている各種生物に由来するアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のＤＮＡであってもよく、またはこれらを遺伝学的に改変したＤＮＡであってもよい。本発明で用いられるアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、必ずしもアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子として同定されている必要はなく、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡでありうる。ここで、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性とは、オキサロ酢酸とアンモニア（ＮＨ３）からアスパラギン酸を生成する酵素活性をいう。
　本発明において導入されるアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子としては、例えば、Candidatus Hydrothermae bacterium由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列（配列番号１）、Glaciecola sp. 33A由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列（配列番号２）、Mesorhizobium sp. M7D.F.Ca.US.005.01.1.1由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列（配列番号３）、Rhodospirillaceae bacterium由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列（配列番号４）、Bacillus kochii由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列（配列番号５）、Novosphingobium rosa由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列（配列番号６）、Archaeoglobus fulgidus由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列（配列番号７）、Arthrobacter sp. 161MFSha2.1由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列（配列番号８）、Oceanotoga teriensis由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列（配列番号９）、Marinitoga sp. 1155由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列（配列番号１０）、Thermotogales bacterium 46_20由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列（配列番号１１）、またはThermotoga maritima由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列（配列番号１２）からなるＤＮＡなどであってもよい。
　本発明で用いられるアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、配列番号１～１２のいずれかと２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡであって、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであってもよい。本発明で用いられるアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、好ましくは、配列番号３、８、９、または１１と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡであって、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである。本発明において、塩基配列の同一性は、当業者で公知の手法を用いて調べることができ、例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ ｖｅｒ．１７（株式会社ゼネティックス製）を用いて算出することができる。
　また、本発明で用いられるアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、配列番号１～１２のいずれかと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」は、例えば、６×ＳＳＣの塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、５０～６０℃の温度条件下、１６時間ハイブリダイゼーションを行い、０．１×ＳＳＣの塩濃度の溶液中で洗浄を行う条件をいう。本発明における「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、特異的なハイブリッド、例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上の相同性を有するハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッド、例えば、前記以下の相同性を有するハイブリッドが形成されないものが含まれる。
　本発明において導入されるアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子としては、アスパラギン酸および／またはメチオニン生成効率が良い点で、Candidatus Hydrothermae bacterium、Glaciecola sp. 33A、Mesorhizobium sp. M7D.F.Ca.US.005.01.1.1、Rhodospirillaceae bacterium、Bacillus kochii、Novosphingobium rosa、Archaeoglobus fulgidus、Arthrobacter sp. 161MFSha2.1、Oceanotoga teriensis、Marinitoga sp. 1155、Thermotogales bacterium 46_20、またはThermotoga maritima由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が好ましく、Mesorhizobium sp. M7D.F.Ca.US.005.01.1.1、Arthrobacter sp. 161MFSha2.1、 Oceanotoga teriensis、またはThermotogales bacterium 46_20由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子がより好ましい。Thermotoga maritimaおよびArchaeoglobus fulgidusを除く前記各種菌由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列（配列番号１～６、８～１１）は、前記各種菌のゲノム配列からアスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡに相当すると予測されたものであり、これらにコードされるアミノ酸配列（配列番号１６～２１、２３～２６）が他の微生物において活性が確認されているアスパラギン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列と相同性が最大で約５０％と非常に低いため、実際に本発明の形質転換体がアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性を有することは容易に予測できるものではなかった。
　本発明で用いられるアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子はまた、Candidatus Hydrothermae bacterium由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列（配列番号１６）、Glaciecola sp. 33A由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列（配列番号１７）、Mesorhizobium sp. M7D.F.Ca.US.005.01.1.1由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列（配列番号１８）、Rhodospirillaceae bacterium由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列（配列番号１９）、Bacillus kochii由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列（配列番号２０）、Novosphingobium rosa由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列（配列番号２１）、Archaeoglobus fulgidus由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列（配列番号２２）、Arthrobacter sp. 161MFSha2.1由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列（配列番号２３）、Oceanotoga teriensis由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列（配列番号２４）、Marinitoga sp. 1155由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列（配列番号２５）、Thermotogales bacterium 46_20由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列（配列番号２６）、またはThermotoga maritima由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列（配列番号２７）からなるポリペプチドをコードするＤＮＡであってもよい。
　さらに、本発明で用いられるアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、配列番号１６～２７のいずれかと２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであってもよい。本発明で用いられるアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、好ましくは、配列番号１８、２３、２４、または２６と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである。本発明において、アミノ酸配列の同一性は、当業者で公知の手法を用いて調べることができ、例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ ｖｅｒ．１７（株式会社ゼネティックス製）を用いて算出することができる。
　また、本発明で用いられるアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、配列番号１６～２７のいずれかのアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用いることができる。本発明における複数個としては、例えば、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、または１個が挙げられる。
　本発明において導入されるアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子としては、アスパラギン酸および／またはメチオニン生成効率が良い点で、Candidatus Hydrothermae bacterium、Glaciecola sp. 33A、Mesorhizobium sp. M7D.F.Ca.US.005.01.1.1、Rhodospirillaceae bacterium、Bacillus kochii、Novosphingobium rosa、Archaeoglobus fulgidus、Arthrobacter sp. 161MFSha2.1、Oceanotoga teriensis、Marinitoga sp. 1155、Thermotogales bacterium 46_20、またはThermotoga maritima由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列（配列番号１６～２７）からなるポリペプチドをコードするＤＮＡが好ましく、Mesorhizobium sp. M7D.F.Ca.US.005.01.1.1、Arthrobacter sp. 161MFSha2.1、Oceanotoga teriensis、またはThermotogales bacterium 46_20由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列（配列番号１８、２３、２４、または２６）からなるポリペプチドをコードするＤＮＡがより好ましい。
　本発明におけるアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性は、当業者が一般的な手法を用いて測定し、決定することができる。アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性は、例えば、得られたポリペプチドをＮＡＤＨ存在下でオキサロ酢酸と反応させ、３４０ｎｍの吸光度を検出することにより確認することができる。アスパラギン酸デヒドロゲナーゼは、オキサロ酢酸からアスパラギン酸を生成する。アスパラギン酸デヒドロゲナーゼがオキサロ酢酸からアスパラギン酸を生成する際にＮＡＤＨを消費するため、ＮＡＤＨ量の減少を３４０ｎｍの吸光度減少を指標に検出してもよい。被験ポリペプチドが少しでも３４０ｎｍの吸光度を減少させればアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性を有すると決定することができる。
（２）形質転換体の製造方法
　続いて、ヒドロゲノフィラス属細菌にアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入して形質転換体を得る方法について説明する。まず、本発明においてアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入されるヒドロゲノフィラス属細菌は特に限定されず、自然界から単離されたものであってもよく、あるいは自然界から単離された菌を、導入するアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を高度に発現できるように遺伝学的に改変されたものであってもよい。前記改変は、ヒドロゲノフィラス属細菌中の内在性プラスミドを除去することなどにより達成することができる。本発明で用いることができる内在性プラスミドを除去（キュアリング）する手法は、当該技術分野で公知の方法であってもよく、例えば、化学物質を利用する方法（例えば、ノボビオシン、ＳＤＳ、アクリフラビン、および臭化エチジウムなどを利用する方法）、プラスミド不和合性（Plasmid incompatibility）を利用する方法（例えば、内在性プラスミドと同一の複製開始点を持つプラスミドを導入し不安定化を図る方法、プラスミド安定分配システム（plasmid partition system）に関わる因子を破壊し不安定化を図る方法）などを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
　本発明で用いることができるヒドロゲノフィラス属細菌としては、例えば、ヒドロゲノフィラス サーモルテオラス（Hydrogenophilus thermoluteolus）、ヒドロゲノフィラス ハロラブダス（Hydrogenophilus halorhabdus）、ヒドロゲノフィラス デニトリフィカンス（Hydrogenophilus denitrificans）、ヒドロゲノフィラス ハルシ（Hydrogenophilus hirschii）、ヒドロゲノフィラス アイランディカス（Hydrogenophilus islandicus）、およびヒドロゲノフィラス属細菌Mar3株（Hydrogenophilus sp. Mar3）が挙げられ、とりわけ、炭酸固定微生物として高い生育速度と炭酸固定能力を有するヒドロゲノフィラス サーモルテオラスが好ましく、特に、ヒドロゲノフィラス サーモルテオラスTH-1（NBRC 14978）株が好ましい。ヒドロゲノフィラス サーモルテオラスTH-1株は、炭酸固定微生物として最も高い生育速度を示す（１時間で２倍に増殖）（Agricultural and Biological Chemistry, 41, 685-690 (1977)）。ヒドロゲノフィラス サーモルテオラスTH-1（NBRC 14978）株は、ブダペスト条約の下で国際寄託されている。さらに、本発明で用いられる菌株として最も好ましくは、ヒドロゲノフィラス サーモルテオラスTH-1C株であり、この株は、本明細書に記載の実施例に基づいて調製することができる。
　本発明の形質転換体を製造するためのアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のヒドロゲノフィラス属細菌への導入は、当該技術分野において、外来遺伝子を細菌に導入するための一般的な方法を用いて行うことができる。本発明におけるアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のヒドロゲノフィラス属細菌への導入は、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をヒドロゲノフィラス属細菌に直接導入することによって行われてもよく、あるいは形質転換のためのベクター（例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミド、フォスミド、ＢＡＣ、およびＹＡＣなど）に組み込み、組み込んだベクターをヒドロゲノフィラス属細菌に導入することにより行われてもよい。本発明における導入に用いられるベクターは、ヒドロゲノフィラス属細菌内で自律的に複製する機能を有するＤＮＡを含むものであれば、一般的に用いられるベクターであってもよく、例えば、広宿主域ベクターであるpRK415（GenBank: EF437940.1）、pBHR1（GenBank: Y14439.1）、pMMB67EH（ATCC 37622）、pCAR1（NCBI Reference Sequence: NC_004444.1）、pC194（NCBI Reference Sequence: NC_002013.1）、pK18mobsacB（GenBank: FJ437239.1）、pUB110（NCBI Reference Sequence: NC_001384.1）、またはこれらのベクターを遺伝学的に改変したもの（例えば、pCAMO-4）であってもよい。本発明における導入に用いることができるベクターは、好ましくは、pCAMO-4であり、このベクターは、下記実施例に従って当業者が調製することができる。また、本発明で用いられるベクターに含有されるプロモーターとしては、例えば、tacプロモーター、lacプロモーター、trcプロモーター、およびOxford Genetics社OXB1、OXB11～OXB20の各プロモーターなどが挙げられ、好ましいターミネーターとしては、大腸菌rRNAオペロンのrrnB T1T2ターミネーター、バクテリオファージλt0転写ターミネーター、およびT7ターミネーターなどが挙げられる。本発明で用いられるアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のヒドロゲノフィラス属細菌への導入（形質転換）のための手法は、前記ベクターがヒドロゲノフィラス属細菌内で自律的に複製できるように導入できる一般的な手法を用いることができ、例えば、塩化カルシウム法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン介在トランスフェクション法、および電気パルス法（エレクトロポレーション法）などが挙げられる。
（３）アスパラギン酸および／またはメチオニンの製造方法
　本発明は、さらなる態様において、本明細書に記載の形質転換体を用いるアスパラギン酸および／またはメチオニンの製造方法を提供する。本発明の方法には、本明細書に記載の形質転換体を、二酸化炭素を実質的に唯一の炭素源として用いて培養する工程が含まれる。本発明の方法における培養工程は、水素、酸素、および二酸化炭素を含む混合ガスを供給しながら、無機培地または有機培地を用いて形質転換体を培養することが含まれうる。供給されるガスは、水素、酸素、および二酸化炭素からなる混合ガスとすることが好ましいが、アスパラギン酸および／またはメチオニンを効率的に生成できる範囲で異種ガスが混入していてもよい。
　本発明の方法で用いられる形質転換体のヒドロゲノフィラス属細菌は、水素をエネルギー源として、二酸化炭素を唯一の炭素源として生育できるため、特に、炭素源として実質的に二酸化炭素のみを用いて（特に、二酸化炭素のみを用いて）上記化合物を製造することにより、二酸化炭素を効率的に固定できる。よって、本発明の方法において、有機物や炭酸塩などの炭素源を含まない無機培地を用いること、すなわち、実質的に二酸化炭素のみを炭素源として（特に、二酸化炭素のみを炭素源として）培養することが好ましい。本発明における「二酸化炭素を実質的に唯一の炭素源として用いる」ことは、不可避の量の他の炭素源が混入する場合も包含する。なお、本発明の方法は、二酸化炭素を供給せず、糖、有機酸、アミノ酸などの有機物や炭酸塩を含む培地を用いることもできる。本発明の方法で用いられる培地のｐＨは、６．２～８が好ましく、６．４～７．４がより好ましく、６．６～７がさらにより好ましい。この範囲であれば、菌の生育および混合ガスの培地中への溶解性が高く、アスパラギン酸および／またはメチオニンを高い効率で製造できる。本発明の方法において、バッチ培養を用いる場合、混合ガスを密閉された培養容器に封入して静置培養または振盪培養することができ、連続培養を用いる場合、混合ガスを密閉した培養容器に連続供給しながら振盪培養するか、あるいは密閉した培養容器を用いてバブリングにより混合ガスを培地内に導入しながら形質転換体を培養すればよい。本発明の方法では、混合ガスの培地中への溶解が向上する点で振盪培養が好ましい。本発明の方法で用いられる供給ガス中の水素、酸素、二酸化炭素の容量比（水素：酸素：二酸化炭素）は、１．７５～７．５：１：０．２５～３が好ましく、５～７．５：１：１～２がより好ましく、６．２５～７．５：１：１．５がさらにより好ましい。この範囲であれば、菌の生育が良好であり、目的化合物を効率的に製造できる。本発明の方法で用いることができる混合ガスまたは原料ガスの供給速度は、培地１Ｌ当たり、１０．５～６０Ｌ／時間、好ましくは、１０．５～４０Ｌ／時間、より好ましくは、１０．５～２１Ｌ／時間である。この範囲であれば、形質転換体の生育が良好であり、目的化合物を効率的に製造できると共に、混合ガスの無駄が抑えられる。本発明の方法で用いられる培養温度は、３５～５５℃が好ましく、３７～５２℃がより好ましく、５０～５２℃がさらにより好ましい。この範囲であれば、形質転換体の生育が良好であり、アスパラギン酸および／またはメチオニンを効率的に製造できる。
　本発明の方法において、上記のように培養することにより、培養液中にアスパラギン酸および／またはメチオニンが生成される。培養液を回収することによりアスパラギン酸および／またはメチオニンを回収できるが、さらに、アスパラギン酸および／またはメチオニンは、公知の方法で培養液から分離することもできる。そのような公知の方法として、沈殿法、蒸留法、クロマトグラフィー、および電気透析法などが挙げられる。
　次に、本発明を、実施例を参照することにより説明する。本発明の技術的範囲は、以下の実施例によって限定されない。
プラスミドベクター(pCAMO-4)の構築
　AspDH遺伝子の導入に用いたプラスミドベクター(pCAMO-4)の構築方法を、以下に説明する。
(1) tacプロモーターのDNA断片の調製
　ニュー・イングランド・バイオラボ社製プラスミドpMAL-c5Xを鋳型として、tacプロモーターのDNA断片を増幅するべく、下記の一対のプライマーを合成し、使用した。PCRは、ライフテクノロジーズ社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試薬としてKOD FX Neo(東洋紡株式会社製)を用いて、常法により行った。

tacプロモーター増幅用プライマー
(a-1) 5’- TTTTATAACCCGGGCCATCGACTGCACGGTGCACC -3’（配列番号３１）
(b-1) 5’- TGCTAGCACTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCG -3’（配列番号３２）
尚、プライマー(a-1)には、下線で示すようにSmaI制限酵素部位が付加されている。

　上記で生成した反応液のうち2 μLを1% アガロースゲルにより電気泳動を行い、tacプロモーターに相当する約0.3 kbpのDNA断片を検出した。
(2) マルチクローニング領域のDNA断片の調製
　マルチクローニング領域のDNA断片を調製するため、その前半部分及び後半部分を作成するべく、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、PCRに使用した。PCRは、ライフテクノロジーズ社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試薬としてKOD FX Neo(東洋紡株式会社製)を用いて、常法により行った。実際には、鋳型DNAを含まず、各一対のプライマーの3’側同士がアニーリングして伸長し、二本鎖DNAを形成する反応である。

マルチクローニング領域前半部分調製用プライマー
(a-2) 5’- GGAAACAGTGCTAGCAGATCTGGAGGAGAAACGCATAT -3’（配列番号３３）
(b-2) 5’- CAGTGCGGCCGCAAGCTTGTCGACGGAGCTCGAATTCGGATCCGATATCAGCATATGCGTTTCTCCTCCAGA -3’（配列番号３４）
プライマー(a-2)及び(b-2)の3’側の塩基配列は互いに相補的になっている。

マルチクローニング領域後半部分調製用プライマー
(a-3) 5’- ACAAGCTTGCGGCCGCACTGCAGCACCATCACCACCATCATTGATAAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCT -3’（配列番号３５）
(b-3) 5’- TATTTGAATCGAGTTATTGCTCAGCGGTGGCAGCAGCCAACTCAGCTTCCTTTCGGGCTTTGT -3’（配列番号３６）
プライマー(a-3) 及び(b-3)の3’側の塩基配列は互いに相補的になっている。

　上記で生成した反応液20 μLを1% アガロースゲルにより電気泳動を行い、マルチクローニング領域前半及び後半部分に相当する、それぞれ約0.1 kbpずつのDNA断片を検出した。各DNA断片をアガロースゲルから切り出し、ゲルを凍結・融解することで、ゲルからDNAを回収した。回収したマルチクローニング領域前半及び後半部分に相当するDNA断片を鋳型として、オーバーラップエクステンションPCRを行った。尚、この鋳型DNA断片を増幅する際に用いたプライマー(b-2)及び(a-3)の5’側の塩基配列は互いに相補的になっている。オーバーラップエクステンションPCRに際しては、マルチクローニング領域のDNAを作成するべく、上記の(a-2)と(b-3)のプライマーの組み合わせを使用した。PCRは、ライフテクノロジーズ社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試薬としてKOD FX Neo(東洋紡株式会社製)を用いて、常法により行った。
　上記で生成した反応液のうち2 μLを1% アガロースゲルにより電気泳動を行い、マルチクローニング領域に相当する、約0.2 kbpのDNA断片を検出した。
(3) rrnBターミネーター及びpUC19の複製開始領域が連結したDNA断片の調製
　ニュー・イングランド・バイオラボ社製プラスミドpMAL-c5Xを鋳型として、rrnBターミネーターのDNA断片を増幅するべく、下記の一対のプライマーを合成し、使用した。

rrnBターミネーター増幅用プライマー
(a-4) 5’- TAACTCGATTCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGA -3’（配列番号３７）
(b-4) 5’- CCTAGATCCGCGGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG -3’（配列番号３８）

　プラスミドpUC19を鋳型として、DNA複製開始領域のDNA断片を増幅するべく、下記の一対のプライマーを合成し、使用した。

pUC19のDNA複製開始領域増幅用プライマー
(a-5) 5’- ACAAACTCCGCGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTG -3’（配列番号３９）
(b-5) 5’- CGTCCGCGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAA -3’（配列番号４０）

　PCRは、ライフテクノロジーズ社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試薬としてKOD FX Neo(東洋紡株式会社製)を用いて、常法により行った。生成した各反応液20 μLを1% アガロースゲルにより電気泳動を行い、rrnBターミネーターの場合は約0.3 kbp、pUC19のDNA複製開始領域の場合は約0.8 kbpのDNA断片を検出した。各DNA断片をアガロースゲルから切り出し、ゲルを凍結・融解することで、ゲルからDNAを回収した。回収したrrnBターミネーター、pUC19のDNA複製開始領域に相当するDNA断片を鋳型として、オーバーラップエクステンションPCRを行った。尚、この鋳型DNA断片を増幅する際に用いたプライマー、(b-4)及び(a-5)の5’側の塩基配列は互いに相補的になっている。オーバーラップエクステンションPCRに際しては、rrnBターミネーター及びpUC19の複製開始領域が連結したDNA断片を作成するべく、上記の(a-4)と(b-5)のプライマーの組み合わせを使用した。PCRは、ライフテクノロジーズ社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試薬としてKOD FX Neo(東洋紡株式会社製)を用いて、常法により行った。
　上記で生成した反応液2 μLを1%アガロースゲルにより電気泳動を行い、rrnBターミネーター及びpUC19の複製開始領域が連結したDNAに相当する、約1.0 kbpのDNA断片を検出した。
(4) ネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子のDNA断片の調製
　pK18mobsacB [GenBank: FJ437239.1; Gene, 145, 69-73 (1994)]を鋳型として、ネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子（以下、「nptII遺伝子」と言うことがある）のDNA断片を増幅するべく、下記の一対のプライマーを合成し、使用した。PCRは、ライフテクノロジーズ社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試薬としてKOD FX Neo(東洋紡株式会社製)を用いて、常法により行った。

nptII遺伝子増幅用プライマー
(a-6) 5’- TTGCTGGCCGCGGACGTAGAAAGCCAGTCCGCAGA -3’（配列番号４１）
(b-6) 5’- GGCCCGGGTTATAAAAGCCAGTCATTAGGCCTATC -3’（配列番号４２）
尚、プライマー(b-6)には、下線で示すようにSmaI制限酵素部位が付加されている。

　上記で生成した反応液のうち2 μLを1% アガロースゲルにより電気泳動を行い、nptII遺伝子に相当する、約1.0 kbpのDNA断片を検出した。
(5) (1)から(4)のDNA断片を連結した環状プラスミドの構築
　上記(1)から(4)で調製したDNA断片は、(1)のDNA断片の末端は(4)及び(2)のDNA断片の末端と、(2)のDNA断片の末端は(1)及び(3)のDNA断片の末端と、(3)のDNA断片の末端は(2)及び(4)のDNA断片の末端と、(4)のDNA断片の末端は(3)及び(1)のDNA断片の末端と16 bpの相同配列を有している。従って、Gibson Assemblyにより、(1)、(2)、(3)、(4)のDNA断片を環状DNAの状態に連結することができる。(1)から(4)で調製したDNA断片を連結して環状DNAとするため、ニュー・イングランド・バイオラボ社製Gibson Assemblyマスターミックスを用いて、Gibson Assemblyを行った。得られた反応液を用いて、塩化カルシウム法により大腸菌JM109を形質転換し、カナマイシン50 μg/mLを含むLB寒天培地に塗布した。培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出し、このプラスミドを制限酵素SmaIで切断して確認した。この結果、(1)から(4)で調製したDNA断片が連結して一本のDNAとなったサイズに相当する、約2.3 kbpのDNA断片が認められた。
　大腸菌で複製する、この環状プラスミドDNAをpCAMO-1と命名した。
(6) プラスミドベクター(pCAMO-4)の構築
　ヒドロゲノフィラス　サーモルテオラス(Hydrogenophilus thermoluteolus) TH-1株(NBRC 14978)を A液体培地〔(NH4)2SO4 3.0 g、KH2PO4　1.0 g、K2HPO4　2.0 g、NaCl　0.25 g、FeSO4・7H2O　0.014 g、MgSO4・7H2O　0.5 g、CaCl2　0.03 g、MoO3　4.0 mg、ZnSO4・7H2O　28 mg、CuSO4・5H2O　2.0 mg、H3BO3　4.0 mg、MnSO4・5H2O　4.0 mg、CoCl2・6H2O　4.0 mgを蒸留水1 Lに溶解(pH 7.0)〕5 mLの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、試験管にH2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入して、50℃で振盪培養し、培養液から、常法であるアルカリSDS法により、内在性プラスミドpTH1 [Microbiol Resour Announc. 2018 Aug 16;7(6)]を調製した。
　調製した約66 kbpのpTH1を制限酵素ScaI及びPvuII、上記で作成したプラスミドpCAMO-1を制限酵素SmaIで切断し、T4 DNAリガーゼ (タカラバイオ株式会社製)を用いて互いに結合させた。
　得られたライゲーション液で、電気パルス法（エレクトロポレーション法）により、ヒドロゲノフィラス　サーモルテオラス TH-1株を形質転換し、カナマイシン50 μg/mLを含むA固体培地〔(NH4)2SO4 3.0 g、KH2PO4　1.0 g、K2HPO4　2.0 g、NaCl　0.25 g、FeSO4・7H2O　0.014 g、MgSO4・7H2O　0.5 g、CaCl2　0.03 g、MoO3　4.0 mg、ZnSO4・7H2O　28 mg、CuSO4・5H2O　2.0 mg、H3BO3　4.0 mg、MnSO4・5H2O　4.0 mg、CoCl2・6H2O　4.0 mg、寒天 15 gを蒸留水1 Lに溶解(pH 7.0)〕に塗布し、H2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入したチャンバー内で、50℃にて60時間培養した。A固体培地上で生育した７株をカナマイシン50 μg/mLを含むA液体培地 5 mLの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、試験管にH2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入して、50℃で振盪培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出し、1% アガロースゲルにより電気泳動を行った。この結果、７株のいずれもが同じ約5.5 kbpのプラスミドDNAであることが認められた。
　抽出したプラスミドを鋳型として、pCAMO-1のSmaI制限酵素部位に挿入された内在性プラスミドpTH1のDNA断片を増幅するべく、pCAMO-1のSmaI制限酵素部位の両側に相当する下記の一対のプライマーを合成し、使用した。PCRは、ライフテクノロジーズ社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試薬としてKOD FX Neo(東洋紡株式会社製)を用いて、常法により行った。

挿入されたpTH1のDNA断片増幅用プライマー
(a-7) 5’- AATTGTCAGATAGGCCTAATGACTGGCTTTTATAA -3’（配列番号４３）
(b-7) 5’- TGACGCCAGAAGCATTGGTGCACCGTGCAGTCGAT -3’（配列番号４４）

　上記で生成した反応液のうち2 μLを1% アガロースゲルにより電気泳動を行い、約3.2 kbpのDNA断片を検出した。即ち、得られたプラスミドは、pCAMO-1プラスミドのSmaI制限酵素部位にpTH1の一部である約3.2 kbpのDNA断片が挿入されている。この約3.2 kbpのDNA断片にヒドロゲノフィラス　サーモルテオラス細胞内で機能する複製開始領域が含まれているため、得られたプラスミドはヒドロゲノフィラス　サーモルテオラス細胞内で複製する。
　構築されたプラスミドをpCAMO-4と命名し、ヒドロゲノフィラス　サーモルテオラスに遺伝子を導入するためのプラスミドベクターとして用いた。
アスパラギン酸およびメチオニン生成能を有する形質転換体
アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング
　下記のように選択した各菌由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列からなるＤＮＡ（Candidatus Hydrothermae bacterium（配列番号１）、Glaciecola sp. 33A（配列番号２）、Mesorhizobium sp. M7D.F.Ca.US.005.01.1.1（配列番号３）、Rhodospirillaceae bacterium（配列番号４）、Candidatus Altiarchaeales archaeon IMC4（配列番号１３）、Bacillus kochii（配列番号５）、Novosphingobium rosa（配列番号６）、Mumia flava（配列番号１４）、Archaeoglobus fulgidus（配列番号７）、Arthrobacter sp. 161MFSha2.1（配列番号８）、Oceanotoga teriensis（配列番号９）、Marinitoga sp. 1155（配列番号１０）、Thermotogales bacterium（配列番号１１）、Thermotoga maritima（配列番号１２）、およびAmycolatopsis thermoflava（配列番号１５））をユーロフィンジェノミクス株式会社に委託し合成した。
　Thermotoga maritimaのAspDH遺伝子のアミノ酸配列（配列番号２７）をクエリとしてblast検索（データベース：NCBI）を行い、１４種類の菌由来のAspDH遺伝子と推定される配列を選択した。これまでに非特許文献に報告のあったAspDHのアミノ酸配列、および特許文献に記載のアミノ酸配列（データベース：dgene）に対してblast検索を行い収集したアミノ酸配列に対して相同性を求めた。その結果、これらのアミノ酸配列は、Archaeoglobus fulgidusを除いて、約５０％程度と非常に低い相同性しか認められなかった。したがって、Candidatus Hydrothermae bacterium（配列番号１６）、Glaciecola sp. 33A（配列番号１７）、Mesorhizobium sp. M7D.F.Ca.US.005.01.1.1（配列番号１８）、Rhodospirillaceae bacterium（配列番号１９）、Bacillus kochii（配列番号２０）、Novosphingobium rosa（配列番号２１）、Arthrobacter sp. 161MFSha2.1（配列番号２３）、Oceanotoga teriensis（配列番号２４）、Marinitoga sp. 1155（配列番号２５）、およびThermotogales bacterium（配列番号２６）由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドにAspDH活性があることは明らかではなかった。
AspDH遺伝子の発現プラスミドの構築
　AspDHの合成遺伝子をクローニングしたプラスミドを制限酵素NdeI及びNotIで切断した後、1% アガロースゲルにより電気泳動を行った。AspDH合成遺伝子に相当するDNA断片をアガロースゲルから切り出し、ゲルを凍結・融解することで、ゲルからAspDH合成遺伝子のDNA断片を回収した。
　プラスミドベクターpCAMO-4を制限酵素NdeI及びNotIで切断し、T4 DNAリガーゼ (タカラバイオ株式会社製)を用いて、上記で合成したAspDH合成遺伝子のDNA断片と互いに結合させた。ヒドロゲノフィラス　サーモルテオラス　TH-1株を常法により、内在性プラスミドを除去し、キュアリング株（TH-1C株）を得た。
　得られたライゲーション液で、電気パルス法（エレクトロポレーション法）により、ヒドロゲノフィラス　サーモルテオラス　TH-1C株を形質転換し、カナマイシン 50 μg/mLを含むA固体培地に塗布し、H2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入したチャンバー内で、50℃にて60時間培養した。
　A固体培地上の各生育株をカナマイシン 50 μg/mLを含むA液体培地 5 mLの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、試験管にH2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入して、50℃で振盪培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出した。各プラスミドを制限酵素NdeI及びNotIで切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCAMO-4の約5.5 kbpのDNA断片に加え、AspDH遺伝子に相当する長さ約0.8 kbpの挿入断片が認められた。各種菌由来のAspDH遺伝子を含むプラスミドおよび当該プラスミドを形質転換したヒドロゲノフィラス サーモルテオラスTH-1C株を下記表１のように命名した。
アスパラギン酸およびメチオニン生成
　上記のとおり調製したヒドロゲノフィラス サーモルテオラスのアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子導入株をカナマイシン 50 μg/mLを含むＡ液体培地に白金耳を用いて植菌し、H2:O2:CO2=7.5:1:1.5の混合ガスを培養に伴い供給し、50℃にて72～96時間、振盪培養した。培養後、遠心分離（4℃、15,000 rpm、1分間）により得た培養上清のアスパラギン酸およびメチオニンを定量したところ、表１に示すように、培地上清中にアスパラギン酸およびメチオニンが生成していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　表１に示されるように、ヒドロゲノフィラス サーモルテオラスの各種菌由来の本発明のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子導入株では、培養の結果、アスパラギン酸の濃度が0.9～137.8 μMであり、メチオニンの濃度が0.9～10.3 μMであり、コントロール株（本発明の種菌由来以外の菌（AspDH005、008、015）およびAspDH遺伝子を含有しない株（pCAMO-4/TH-1C））と比較して、極めて高いアスパラギン酸およびメチオニン生成能を有することが示された。
　また、本明細書に記載の全ての菌株（ATCC株、およびNBRC株を含む）は、ブダペスト条約の下で国際寄託されているか、条件なく誰でも分譲を受けることができる機関が保有しているか、市販されているか、または当業者が本明細書に基づいて調製することができ、公に利用可能である。
　本発明の形質転換体は、二酸化炭素を唯一の炭素源として、アスパラギン酸および／またはメチオニンを高い効率で生成できるため、二酸化炭素の増加による地球温暖化を解決しながら、化学製品を工業的に高い効率で製造することができる。すなわち、本発明に用いられるヒドロゲノフィラス属細菌は、二酸化炭素固定能を有する生物の中でも、特に優れた二酸化炭素固定能を有するため、本発明の形質転換体を用いれば、工業規模で二酸化炭素を固定してアスパラギン酸および／またはメチオニンを製造することができる。さらに、アスパラギン酸および／またはメチオニンは、アスパルテーム甘味料、生分解性ポリマー、飼料添加物、および医薬品などの様々な化成品・化学品の原料となるため、本発明により、炭素源として、高いコストの糖類や温暖化問題となる石油原料などを用いることなく、二酸化炭素のみを利用してこれらを原料とする製品を工業的に生産することができる。

Claims (7)

  1. 　ヒドロゲノフィラス属細菌に、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することにより得られる、形質転換体。
  2. 　前記アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が、下記（１）～（６）のいずれかから選択されるＤＮＡである、請求項１に記載の形質転換体：
    （１）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２の塩基配列からなるＤＮＡ、
    （２）配列番号１～１２のいずれか１つと９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡであって、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
    （３）配列番号１～１２のいずれか１つと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
    （４）配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、または配列番号２７のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ、
    （５）配列番号１６～２７のいずれか１つと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、および
    （６）配列番号１６～２７のいずれか１つのアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が、欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
  3. 　前記アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が、下記（１）～（６）のいずれかから選択されるＤＮＡである、請求項１または２に記載の形質転換体：
    （１）配列番号３、配列番号８、配列番号９、または配列番号１１の塩基配列からなるＤＮＡ、
    （２）配列番号３、配列番号８、配列番号９、または配列番号１１と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡであって、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
    （３）配列番号３、配列番号８、配列番号９、または配列番号１１と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
    （４）配列番号１８、配列番号２３、配列番号２４、または配列番号２６のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ、
    （５）配列番号１８、配列番号２３、配列番号２４、または配列番号２６と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、および
    （６）配列番号１８、配列番号２３、配列番号２４、または配列番号２６のアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が、欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
  4. 　前記ヒドロゲノフィラス属細菌が、ヒドロゲノフィラス サーモルテオラスである、請求項１～３のいずれか１項に記載の形質転換体。
  5. 　前記ヒドロゲノフィラス サーモルテオラスが、ヒドロゲノフィラス サーモルテオラスTH-1C株である、請求項４に記載の形質転換体。
  6. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の形質転換体を、二酸化炭素を実質的に唯一の炭素源として用いて培養する工程を含む、アスパラギン酸の製造方法。
  7. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の形質転換体を、二酸化炭素を実質的に唯一の炭素源として用いて培養する工程を含む、メチオニンの製造方法。
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