KR101954530B1

KR101954530B1 - 메탄을 이용하여 숙신산을 생성하는 재조합 미생물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101954530B1
Application number: KR1020170117324A
Authority: KR
Inventors: 이은열; 테이 넉 딥 뉴엔; 황인엽
Original assignee: 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2017-09-13
Filing date: 2017-09-13
Publication date: 2019-05-23

Abstract

본 발명은 메탄을 이용하여 숙신산을 생산하는 재조합 미생물 및 이의 용도에 대한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 기존의 메탄자화균과 비교하여 우수한 숙신산 생산량을 나타내는 재조합형 메틸로모나스 속(Methylomonas sp .) DH-1 및 상기 균주를 이용한 숙신산 제조 방법에 대한 것이다.
본 발명에서 제공하는 미생물은 메탄을 이용하여 많은 양의 숙신산 생성이 가능하므로, 활용성이 낮은 메탄가스를 이용하여 유용한 화합물인 숙신산을 대량생산 하는 용도로 사용할 수 있다.

Description

메탄을 이용하여 숙신산을 생성하는 재조합 미생물 및 이의 용도 {Recombinant microorganism for producing succinic acid from methane and uses thereof}

본 발명은 메탄을 이용하여 숙신산을 생산하는 재조합 미생물 및 이의 용도에 대한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 기존의 메탄자화균과 비교하여 우수한 숙신산 생산량을 나타내는 재조합형 메틸로모나스 속(Methylomonas sp .) DH-1 및 상기 균주를 이용한 숙신산 제조 방법에 대한 것이다.

메탄가스는 천연가스와 셰일가스의 주성분이며 온실효과를 일으키는 원인 물질로 알려져있다. 석유로 대표되는 액체 탄화수소와는 달리 메탄은 그 자체만으로는 기체이기 때문에 고부가가치 사물로의 전환이 어렵고 연료로서의 사용 또한 어렵다고 평가된다. 그에 따라 메탄가스를 유용성을 지닌 화합물로 전환하고자 하는 노력이 계속되어 왔다.

메탄자화균(Methanotrophic bacteria)은 메탄을 유일한 에너지원으로 생육할 수 있는 미생물로, 1906년에 Sohngen에 의해 처음으로 분리되었다. 그 후, 분류학적 연구로 세포의 형태, 정지기의 세포 또는 세포내막구조의 형태에 따라 25종으로 분류되었다. 이러한 메탄산화세균은 메탄 모노옥시게나아제(monooxygenases, MMO)라는 효소를 함유하고 있어 상온, 상압하에서도 용이하게 메탄을 메탄올로 전환할 수 있다. 메탄은 메탄 모노옥시게나아제에 의해 메탄올로 산화되고, 그 다음, 메탄올은 메탄올탈수소효소(methanol dehydrogenase, MDH)에 의해 포름알데히드(formaldehyde) 또는 포름산으로 산화되어 이산화탄소가 된다. 이러한 메탄으로부터 탄소화합물의 생합성은 리불로오스 일인산 회로(ribulose monophosphate cycle; RuMP cycle)와 세린 회로(serine cycle)에 의해 진행되고, 일반적으로 type I의 메탄산화세균은 리불로오스 일인산 회로를, type II의 메탄산화세균은 세린 회로를 이용하여 바이오매스를 합성한다고 알려져 있다(Biocatalytic Conversion of Methane to Methanol as a Key Step for Development of Methane-Based BiorefineriesJ. Microbiol. Biotechnol. In Yeub Hwang et al(2014), 24(12), 1597-605). 이러한 메탄산화세균이 갖는 생리학적 특성으로 인해, 메탄산화세균을 이용하여 메탄을 유기화합물로 전환시켜, 유해한 메탄가스를 절감시키려는 노력과 에너지원으로 활용하려는 노력이 계속되어 왔다.

한편, 탄소화합물 중 높은 유용성을 가진 것으로 알려진 숙신산(succinic acid)은 무색의 주상 또는 관상 결정을 가지는 유기산으로, TCA 회로를 구성하는 주요 유기산 중 하나이며 카르복시산의 일종이다. 숙신산은 식품, 농업, 고분자산업 등 다양한 분야에 사용될 수 있으며, 약 150억 달러의 국제적 시장가치를 지닌 화합물로 판단된다.

이러한 숙신산은 화학적 합성법과 미생물 발효에 의해 생산되는데, 의약품, 식품의 첨가제 및 보존제 등 특수한 용도로 사용되는 소량의 숙신산만 미생물 발효법에 의해서 생산되고 있으며, 산업적으로 사용되는 대부분의 숙신산은 미국, 유럽, 일본 및 중국의 거대 화학회사들에 의하여 원유나 액화천연가스에서 유래한 n-부탄(butane)과 아세틸렌(acetylene)으로부터 합성되고 있는 실정이다. 그러나, 화학적 방법을 이용한 숙신산 합성공정은 제조과정에서 유해성 고형폐기물, 폐용액 및 폐가스(일산화탄소 포함) 등을 다량 배출한다는 문제점이 있어, 생물공정을 이용하여 숙신산을 생산하는 방법이 계속 연구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 메탄가스를 유용한 화합물로 전환하는 방법에 대해 예의 연구 노력한 결과, 재조합 메탄자화균을 통해 메탄을 이용하여 숙신산을 대량생산하는 방법을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은, 숙신산 탈수소효소(succinate dehydrogease) 의 활성이 감소 또는 불활성화되고, 이소시트르산 분해효소(isocitrate lyase) 및 말산 합성효소(malate synthase)의 활성을 가지는, 숙신산을 생산하는 재조합 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은, 메탄을 포함한 배양액에 상기 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 숙신산 제조 방법을 제공하는 것이다.

상기의 과제를 해결하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 숙신산 탈수소효소(succinate dehydrogease)의 활성이 감소 또는 불활성화 되고, 이소시트르산 분해효소(isocitrate lyase) 및 말산 합성효소(malate synthase)의 활성을 가지는, 숙신산을 생산하는 재조합 미생물을 제공한다.

이하, 본 발명에서의 숙신산을 생산하는 재조합 미생물을 구체적으로 설명한다.

본 발명에서의 용어, “숙신산”은 HOOC-CH₂CH₂-COOH의 화학식을 갖는 무색의 주상 또는 관상 결정을 가지는 유기산이다. 숙신산은 TCA 회로를 구성하는 주요 유기산 중 하나로 카르복시산의 일종이다. TCA회로의 경우, 알파케토글루타르산이 탈수소화, 탈카르복시화되어 숙시닐조효소 A(succinyl Co-A)를 형성한 후, 다시 숙신산으로 전환되어 생성되며, 숙신산은 숙신산 탈수소효소에 의해 푸마르산으로 산화된다. 또한, 글리옥실산 회로의 경우, 이소시트르산이 이소시트르산 분해효소에 의해 숙신산 및 글리옥실산으로 전환되는 과정에서 숙신산이 생산되며, 글리옥실산은 글리옥실산 회로에 의해 말산, 옥살로아세트산, 시트르산의 과정을 거쳐 다시 이소시트르산으로 전환된다.

본 발명에서의 용어, “메탄자화균(methanotroph)”은 메탄을 주 탄소원 및 에너지원으로 사용하는 세균을 의미한다. 메탄의 산화경로를 이용하여 메탄을 CO₂까지 완전히 산화함으로써 ATP를 획득한다. 메탄, 메탄올, 메틸아민 등의 탄소수 1개의 화합물을 에너지원으로 사용하는 메틸자화균(methylotroph) 중에서 메탄을 함께 사용할 수 있는 균주 또한 메탄자화균으로 간주한다.

상기 메탄자화균은 메탄을 주 탄소원으로 사용하여 숙신산을 생산하는 균주로서, 특별히 이에 제한되지 않으나, 메틸로모나스 속(Methylomonas), 메틸로박터 속(Methylobacter), 메틸로코커스 속(Methylococcus), 메틸로마이크로븀 속(Methylomicrobium), 메틸로스페라 속(Methylosphaera), 메틸로칼덤 속(Methylocaldum), 메틸로글로버스 속(Methyloglobus), 메틸로사르시나 속(Methylosarcina), 메틸로프로펀더스 속(Methyloprofundus), 메틸로썰머스 속(Methylothermus), 메틸로할로비우스 속(Methylohalobius), 메틸로게아 속(Methylogaea), 메틸로마리넘 속(Methylomarinum), 메틸로벌럼 속(Methylovulum), 메틸로마리노범 속(Methylomarinovum), 메틸로러브럼 속(Methylorubrum), 메틸로파라코커스 속(Methyloparacoccus), 메틸로시너스 속(Methylosinus), 메틸로시스티스 속(Methylocystis), 메틸로셀라 속(Methylocella), 메틸로캡사 속(Methylocapsa), 메틸로퍼룰라 속(Methylofurula), 메틸아시디필럼 속(Methylacidiphilum), 메틸아시디마이크로븀 속(Methylacidimicrobium) 일 수 있으며, 구체적으로 메틸로모나스 속, 보다 구체적으로 기탁번호 KCTC18400P로 기탁된 메틸로모나스 속(Methylomonas sp .) DH-1일 수 있다.

본 발명에서의 용어, “재조합 메탄자화균”은 상기 메탄자화균의 유전자를 도입 또는 제거하여 형질을 전환시킨 균주를 의미한다.

상기 재조합 메탄자화균은 서열번호 1로 표시되는 숙신산 탈수소효소 유전자를 제거하고, 서열번호 2 및 3으로 표시되는 이소시트르산 분해효소 및 말산 합성효소 유전자를 도입한 메탄자화균을 의미할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

상기 숙신산 탈수소효소(succinate dehydrogease)는 TCA 회로에서 사용되는 효소 중 하나로, 숙신산의 탈수소반응을 촉매하여 숙신산을 푸마르산으로 전환시킬 수 있다.

상기 숙신산 탈수소효소는 서열번호 1의 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90%이상, 보다 더 구체적으로는 95%이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열로서, 실질적으로 숙신산 탈수소효소 활성을 가진 단백질을 발현 가능한 경우, 제한없이 본 발명의 범주에 포함될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 숙신산 탈수소효소 유전자를 제거한 재조합 메탄자화균을 제조하여 TCA 회로에서 숙신산이 푸마르산으로 전환되는 것을 막아 숙신산의 생산량이 증가하는 것을 확인하였다.

상기 이소시트르산 분해효소(isocitrate lyase)는 글리옥실산 회로에서 사용되는 효소 중 하나로, 이소시트르산의 분해를 촉매하여 숙신산 및 글리옥실산으로 전환시킬 수 있다.

상기 이소시트르산 분해효소는 서열번호 2의 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90%이상, 보다 더 구체적으로는 95%이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열로서, 실질적으로 이소시트르산 분해효소 활성을 가진 단백질을 발현 가능한 경우, 제한없이 본 발명의 범주에 포함될 수 있다.

상기 말산 합성효소(malate synthase)는 글리옥실산 회로에서 사용되는 효소 중 하나로, 글리옥실산을 아세틸 CoA와 축합시켜 말산과 CoA를 생성하는 반응을 촉매한다.

상기 말산 합성효소는 서열번호 3의 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90%이상, 보다 더 구체적으로는 95%이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열로서, 실질적으로 말산 합성효소 활성을 가진 단백질을 발현 가능한 경우, 제한없이 본 발명의 범주에 포함될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 숙신산 탈수소 효소 유전자를 제거하고 이소시트르산 분해효소 및 말산 합성효소 유전자가 도입된 재조합 메탄자화균을 제조하여 글리옥실산 회로를 통해 이소시트르산에서 숙신산과 글리옥실산을 생성하고, 글리옥실산은 말산을 생성하여 TCA 회로를 거치는 방법으로 숙신산의 생산량이 현저히 증가하는 것을 확인하였다.

본 발명에서 용어 "상동성"은 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 갖는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0를 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 당업자에게 잘 알려진 방법으로 결정될 수 있다.

상기 메탄자화균은 유전자를 제거 또는 도입하기 위해 벡터를 사용할 수 있고, 상기 벡터는 이에 한정되지 않으나, 숙신산 탈수소 효소 유전자를 제거할 수 있고, 이소시트르산 분해효소 및 말산 합성효소 유전자를 메탄자화균 유전체에 도입할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용하여 제작될 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 구체적으로는 pCM184-SDH::-ISL-MS일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 재조합 메탄자화균을 제조하기 위해, 숙신산 탈수소효소 유전자가 제거된 상류 및 하류 주변DNA를 벡터에 주입하고, 이소시트르산 분해효소 및 말산 합성효소 유전자를 추가로 벡터에 주입하여 pCM184-SDH::-ISL-MS 벡터를 제작한 뒤, 상기 벡터를 메탄자화균 내에 주입하여 이중 교차 혼성 재조합을 유도함으로써 재조합 메탄자화균을 제조하였다.

본 발명에서의 용어, “효소의 활성이 감소”된다는 것은 해당 효소의 활성이 야생형 또는 변이 전 상태의 내재적 활성에 비해 감소되는 것을 의미한다.

또한 본 발명에서의 용어, “불활성화”는 해당 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 야생 균주에 비하여 낮은 수준으로 감소하거나 전혀 발현이 되지 않는 경우 및 발현이 되더라도 그 활성이 없거나 감소된 것을 의미한다. 상기 효소의 활성의 감소 또는 불활성화는 당업계에 알려진 임의의 방법에 의하여 이루어질 수 있다.

구체적으로 해당 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체의 결실, 상기 뉴클레오티드의 발현이 감소하도록 발현 조절 서열의 변형, 상기 단백질의 활성이 약화되도록 염색체상의 상기 뉴클레오티드 서열의 변형, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 방법에 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

상기에서 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은 세균 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 일부 핵산 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다.

본 발명에서의 용어, “효소의 활성을 가진다”는 것은 유전자 도입으로 인해 기존에 없던 효소를 발현하여 그 활성을 나타내거나, 기존에 불활성화 상태인 효소의 유전자를 활성화 시키는 것을 의미한다. 상기 효소의 활성 증가는 당업계에 알려진 임의의 방법에 의하여 이루어질 수 있다.

본 발명에서의 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다.

본 발명에서의 용어, “배양”은 목적하는 세포 또는 조직 등을 인공적으로 조절한 환경 조건에서 생육하는 것을 의미한다. 인공적으로 조절하는 환경 조건은 대표적으로 영양소, 온도, 삼투압, pH, 기체 조성, 빛 등이 있으나, 직접적인 영향을 주는 것은 배지이며, 크게 액체배지와 고체배지로 나뉜다.

본 발명의 일 실시예에서는, 재조합 메탄자화균의 배양을 위해, 막힌 플라스크(baffled flask)에 NMS(Nitrate mineral salt)와 메탄을 첨가하고 매 24시간마다 기질인 메탄을 추가로 제공하여 재조합 메탄자화균을 배양하였다.

상기 메탄자화균의 배양 온도는 15℃ 내지 45℃, 구체적으로 20℃ 내지 40℃, 보다 구체적으로 25℃ 내지 35℃일 수 있으며, 메탄과 균주의 원활한 접촉을 위해, 150rpm 내지 300rpm, 구체적으로 180rpm 내지 270rpm, 보다 구체적으로 200rpm 내지 250rpm으로 교반할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 메탄자화균은 호기성 조건에서 TCA 회로 및 글리옥실산 회로를 통해 숙신산을 생성하며, 혐기성 조건에서 역방향 TCA 회로를 통해 숙신산을 생성할 수 있다. 따라서, 상기 메탄자화균은 혐기성 및 호기성 조건에서 숙신산을 생성가능한 것일 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 메탄을 포함한 배양액에 상기 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 숙신산 제조 방법을 제공한다.

본 발명에서의 용어, “메탄자화균”, “배양”, “숙신산”은 상기에서 설명한 바와 같다.

상기 단계는 배양액으로부터 숙신산을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 숙신산 회수 단계는 배양 방법에 따라 당업계에 공지된 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 공지된 쓰레오닌 회수 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증발, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 HPLC, 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는, 상기 메탄자화균을 NMS 및 메탄을 첨가한 배양액에 배양하고, 24시간마다 배양액을 회수하여 숙신산 농도를 측정한 결과, 야생형과 비교하여 매우 뛰어난 숙신산 생산량을 확인하였다.

본 발명에서 제공하는 미생물은 메탄을 이용하여 많은 양의 숙신산 생성이 가능하므로, 활용성이 낮은 메탄가스를 이용하여 유용한 화합물인 숙신산을 대량생산 하는 용도로 사용할 수 있다.

도 1은 재조합 플라스미드 pCM184-SDH::-ISL-MS의 구조를 나타낸 도면이다.
도 2는 각 균주의 유전체 PCR 결과를 나타낸 그래프이다; WT: 야생형, A1: 숙신산 탈수소효소 유전자 제거 + 이소시트르산 분해효소 및 말산 합성효소 유전자 도입, B1: 숙산산 탈수소효소 제거, M: 마커.
도 3은 각 균주별 세포성장속도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 각 균주별 숙신산 생산량을 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 재조합 메탄자화균 제작

메탄을 이용하여 숙신산을 생산하는 균주를 제작하기 위해, 균주에 도입할 플라스미드를 제작하였다. pCM184 벡터(Addgene Plasmid #46012)의 다중 복제 부위(multiple cloning site)에 존재하는 제한효소 작용 부위를 EcoRI 및 SacI을 이용하여 절단한 후, 메틸로모나스 속(Methylomonas sp .) DH-1의 유전체에 존재하는 숙신산 탈수소효소(succinaste dehydrogenase) 유전자 카세트의 업스트림(upstream)에 해당하는 666bp의 유전자 조각(flank-1-SDH) 및 다운스트림(downstream)에 해당하는 574bp의 유전자 조각(flank-2-SDH)을 하기 표 1에 기재된 서열번호 4 내지 7의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭시킨 후, Gibson assembly 방법을 이용하여 벡터에 연결하고 클로닝하여 pCM184-SDHdel 벡터를 구축하였다. 또한, 대장균(Escherichia coli) MG1655 균주의 유전체 상에 존재하는 이소시트르산 분해효소(isocitrate lyase) 및 말산 합성효소(malate synthase)를 코딩하는 유전자를 클로닝 한 후, 각각의 효소를 코딩하는 서열의 업스트림에 메틸로모나스 속(Methylomonas sp .) DH-1에서 작동하는 리보솜 결합 부위(ribosome binding site)를 삽입하였고 이소시트르산 분해효소 및 말산 합성효소가 붙어있는 클러스터 앞에 mxaF 프로모터를 삽입하였다. 그 후, 클러스터 프라이머(서열번호 8 및 9)를 사용하여 증폭시킨 클러스터 서열을 kpnI으로 절단한 pCM184-SDHdel 벡터에 Gibson assembly 방법을 이용하여 삽입하고 클로닝하여 pCM184-SDH::-ISL-MS를 구축하였다(도 1). 구축된 플라스미드는 전기천공법을 이용하여 메틸로모나스 속(Methylomonas sp .) DH-1으로 도입하여 이중 교차 혼성 재조합(double crossover homologous recombination)을 유도하였다.

그 결과, 유전체 DNA에 존재하는 숙신산 탈수소효소를 코딩하는 유전자는 pCM184-SDHdel에 의해 카나마이신 항생제 내성 유전자 카세트로 대체되었거나 (균주 B1), pCM184-SDH::-ISL-MS에 의해 이소시트르산 분해효소, 말산 합성효소 및 카나마이신 항생제 내성 유전자 카세트로 대체되었다 (균주 A1).

[표 1]

실시예 2. 재조합 메탄자화균 내 효소 활성 확인

재조합된 메탄자화균의 유전체가 성공적으로 변형되었는지 확인하기 위해, 이소시트르산 분해효소 및 말산 합성효소의 활성을 측정하였다. 이소시트르산 분해효소의 활성은 100mM 인산 칼륨(pH 7.0), 6mM MgCl₂, 4mM 페닐하이드라진 염산, 12mM L-시스테인 염산 및 단백질(50 내지 200μg)으로 구성된 반응 혼합물 A에 8mM의 이소시트르산을 첨가하여 글리옥살산 페닐하이드라존(glyoxylate phenylhydrazone)이 생성됨에 따른 324nm의 흡광도 변화를 측정하였다. 또한, 말산 합성효소의 활성은 90mM 트리스(pH 8.0), 3.4mM MgCl₂, 0.05mM 아세틸-CoA 나트륨염 및 단백질(100μg)으로 구성된 반응 혼합물 B에 글리옥살산(최종 농도 0.5mM)을 첨가하여 아세틸 CoA의 황-에스터 결합이 분해되어 232nm의 흡광도가 변화하는 것을 측정하였다.

그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이, 이소시트르산 분해효소와 말산 합성효소를 발현하기 위한 유전자 카세트가 없는 야생형과 균주 B1에서는 두 효소의 활성이 확인되지 않았으나, 균주 A1은 이소시트르산 분해효소 및 말산 합성효소의 유전자 카세트를 삽입하였기 때문에 각각 7203, 10370nmol/mg protein min의 활성을 확인할 수 있었다.

[표 2]

이는 균주 A1의 유전체가 성공적으로 변형되었다는 것을 나타내고 있으며, 성공적으로 발현되어 숙신산을 효율적으로 생산할 수 있는 대사경로가 확보되었다는 것을 의미한다.

실시예 3. 재조합 메탄자화균 유전체의 변이 확인

균주 유전체의 재조합에 의한 변이를 더욱 확실하게 확인하기 위해, 각 균주 유전체의 숙신산 탈수소효소 유전자 구간을 PCR을 통해 증폭하고 그 차이를 확인하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 야생형과 비교하여, 균주 A1 및 B1은 숙신산 탈수소효소의 유전자가 위치해야할 자리에 각각 다른 크기의 유전자가 존재하는 것을 확인하였다. 이는 이중 교차 혼성 재조합에 의해 다른 유전자가 삽입된 것을 의미하며 재조합이 성공적으로 진행된 것을 의미한다.

실시예 4. 메탄자화균의 성장 수준 분석

재조합을 통해 유전체 DNA가 변이된 메탄자화균의 배양에 따른 성장 수준을 확인하기 위해, 500ml의 막힌 플라스크에 NMS(Nitrate mineral salt)와 메탄을 첨가하고 24시간마다 기질인 메탄을 추가로 제공하면서 야생형(WT), 균주 A1, 균주 B1을 각각 배양하였다. 30℃, 230rpm의 조건에서 배양하였으며, 매 24시간마다 흡광도를 측정하여 균체의 농도를 확인하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 야생형은 최대 2.5의 OD₆₀₀까지 성장하였고, B1은 최대 2.3의 OD₆₀₀까지 성장하였으며, A1은 최대 3.6의 OD₆₀₀까지 성장하였다. A1의 최대균체농도는 야생형 대비 1.44배 증가한 것으로, 이는 숙신산 탈수소효소의 제거 및 이소시트르산 분해효소와 말산 합성효소의 발현이 균체의 성장에 긍정적인 영향을 미치는 것을 의미한다.

실시예 5. 메탄자화균을 이용한 숙신산 생산량 분석

재조합을 통해 숙신산 생산 경로를 개선한 메탄자화균의 숙신산 생성량을 확인하기 위해, 500ml의 막힌 플라스크에 NMS(Nitrate mineral salt)와 메탄을 첨가하고 24시간마다 기질인 메탄을 추가로 제공하면서 야생형(WT), 균주 A1, 균주 B1을 각각 배양하였다. 30℃, 230rpm의 조건에서 배양하였으며, 매 24시간마다 샘플을 수집하여 배양액의 숙신산 농도를 측정하였다. 숙신산의 농도는 HPLC를 사용하여 Aminex HPX-87H 컬럼으로 분석하였으며, 굴절률검출기(RI detector)를 사용하였고 60℃의 컬럼에 5mM H₂SO₄를 0.7mL/min으로 흘려주었다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 야생형은 최대 9.53mg/L의 숙신산을 생산하는 것을 확인하였고, 균주 B1은 최대 26.3mg/L의 숙신산을 생산하였으며, 균주 A1은 최대 134.48mg/L의 숙신산을 생산하는 것을 확인하였다. 균주 A1의 숙신산 생산량은 야생형 대비 최대 14배의 숙신산 생산량을 나타내는 수치로, 재조합을 통한 생산 경로의 변화가 우수한 생산능을 나타내는 것을 확인하였다.

종합하면, 재조합을 통해 숙신산 탈수소효소의 유전자가 제거되고 이소시트르산 분해효소 및 말산 합성효소의 유전자를 도입한 균주 A1은 야생형과 비교하여 최대균체농도도 높으며 숙신산의 생산량은 현저히 높음을 확인할 수 있다. 또한, 표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 균주 A1의 숙신산 생산량은 기존 발명에서 공지된 메탄을 이용하여 숙신산을 생산하는 균주들의 숙신산 생산량보다 우수한 것을 확인할 수 있어, 본 발명의 재조합 메탄자화균이 메탄을 이용한 숙신산의 대량생산에 적합한 것을 확인하였다.

[표 3]

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국생명공학연구원

KCTC18400P

20150827

<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Recombinant microorganism for producing succinic acid from methane and uses thereof <130> KPA170236-KR <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 3338 <212> DNA <213> Methylomonas sp. <400> 1 atgtccgcta atcgaccgct ttccccccat ttgcaggttt accgcttacc gttgaccggc 60 ttggtgtcca tcacgcaccg gatgaccggc gtgtttttgt cgatgggcct ggtattgttc 120 gtatatgtct tgttcgccat cgcggccggc gaatccgcct atctggccat gcaggctttc 180 atggcctatt ggttattcaa gctggtgtat tggggcttta tttatgcgtt gttcttccat 240 ctggtgcacg ggatccggca tttaatctgg gatgtcggta agaccttcgg acgggcgacg 300 ctggataaat ttgctcttta cgaactggtg tgttcggcgt cgttgacact gttgacgttt 360 atcgtttcct gattagggag gatggttatg gattacaaag cctgggtgga aaaagccgcc 420 gattttttct cggtgcacag cggatcgggc catttttggt accagcgggt aaccgcggtt 480 gcgttggtgc ctttatcgat atggttgttg gtgttgctgc acaaagcctt aaatgcgcct 540 tatgcggaca ccgtggcctg gttgtcgtcg ccgttcaata ccttggccat catcgcttgg 600 accatcgccg tggtttacca cgccgctttg ggcgtgcaag tggttatcga ggactacgta 660 tcgacgattc cggtgcggca tttggcgatt cgggccacca atctgacttt tttggttttg 720 ggtatcgctg cgttactcgc gatcgtcatt attcttttgg caaggtaaat catggcctca 780 gcatataaca tcattgaaca ccagcacgac gttgtggtgg ttggcgccgg cggagccggt 840 ttgcgggcaa cttttggaat ggtggagaag gggctgaaaa ccgcttgtat cagcaaggtg 900 tttccgaccc gcagccatac agtggcagcg cagggtggaa ttagcgcggc attgggcaac 960 atgggcgaag acgattggcg gtttcatatg tacgacaccg tcaagggttc cgattggctt 1020 ggcgaccagg atgcgatcga atatatgtgc cgcgaggcga ttccggccat catcgagctg 1080 gagcactacg gcgtgccgtt ttctaggacc gcggaaggca aaatttacca gcgcgcgttc 1140 ggcggcatgt cgactcacta cggtaaagcc caggcgcaac gtacttgcgc ggcggccgac 1200 gtcaccggcc acgccattct gcacactctt taccaacagg ctttaaagca caacgccgag 1260 ttcttcgtcg aatacatcgc gctggatctg atcatggaag acggcgaatg ccgcggcgtg 1320 ttggcctggt gtctggacga cggttccatt catctgttcc gtggccacca gaccgtactg 1380 gcgaccggcg gttacggccg agcgtttttc tcctgcacct cggcgcacac tgtgaccggc 1440 gacggtaacg gtatggtttt gcgggccggt ttaccgttgc aggacatgga gttcgtgcaa 1500 ttccatccga ccggcatcta cggttccggc tgcttgatta cggaaggcgc caggggcgag 1560 ggcggttacc tgaccaattc cgaaggcgaa cgtttcatgc ccaattacgc gcccaacgcg 1620 aaggacttgg cgtcgcgcga cgtggtcagt cgggctatca cgatggaagt taacgccggc 1680 cgcggcgtcg gtccgaaaaa agaccatgcc ttgctgcatt tggaacatct cgatccggcg 1740 atcatccacg aacgcctgcc cggtatcgcc gaaaccgcgc gcatctttgc cggcgtcgac 1800 gttaccaagc agccaatccc ggtgattccg accgtgcact acaacatggg cgggataccg 1860 accaactaca aagccgaagt tgtgaccctg aaggacggcg atcccgacac cgtggtgccg 1920 ggcttgatgg ccatcggcga aaccgcttgc gtttcggtcc acggcgccaa ccggttggga 1980 tccaactcgt tgctcgactt ggtggtattc ggccgggctg ctgctatccg tgccaacgaa 2040 ctgatcaaac cgggcatggc gcataagccg ctggctaagg atgcttgcga taaagccctg 2100 tcccgtttcg ataccatccg ccatgcaagc ggcagccgta agaccgctga aatccgtttg 2160 gatatgcaaa ccacgatgca ggccaaagcg gctgtgttcc gcacagcgga aaccttacaa 2220 gaaggcgtag cacgcatagg cgagattgcc gcgtcgttta gcgatgtcaa cgtcggggat 2280 aaatcgctga tttggaacac cgatttggtc gaaaccctgg 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gctggcggat agccgcgacg 3180 acaacgatca ggagcgcctc gacgaattgg acgagtcgtt caagctgtac cgttgccata 3240 ccatcatgaa ctgtaccgac acttgtccga aaggtttgaa tccggccaaa gcgatcgccg 3300 aaatcaagaa gcgtttggtg gaacgcgacc atttgtga 3338 <210> 2 <211> 1305 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 2 atgaaaaccc gtacacaaca aattgaagaa ttacagaaag agtggactca accgcgttgg 60 gaaggcatta ctcgcccata cagtgcggaa gatgtggtga aattacgcgg ttcagtcaat 120 cctgaatgca cgctggcgca actgggcgca gcgaaaatgt ggcgtctgct gcacggtgag 180 tcgaaaaaag gctacatcaa cagcctcggc gcactgactg gcggtcaggc gctgcaacag 240 gcgaaagcgg gtattgaagc agtctatctg tcgggatggc aggtagcggc ggacgctaac 300 ctggcggcca gcatgtatcc ggatcagtcg ctctatccgg caaactcggt gccagctgtg 360 gtggagcgga tcaacaacac cttccgtcgt gccgatcaga tccaatggtc cgcgggcatt 420 gagccgggcg atccgcgcta tgtcgattac ttcctgccga tcgttgccga tgcggaagcc 480 ggttttggcg gtgtcctgaa tgcctttgaa ctgatgaaag cgatgattga agccggtgca 540 gcggcagttc acttcgaaga tcagctggcg tcagtgaaga aatgcggtca catgggcggc 600 aaagttttag tgccaactca 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Claims

숙신산 탈수소효소(succinate dehydrogease)의 활성이 감소 또는 불활성화 되고, 이소시트르산 분해효소(isocitrate lyase) 및 말산 합성효소(malate synthase)의 활성을 가지는, 숙신산을 생산하는 메틸로모나스 속(Methylomonas sp.) DH-1(기탁번호 KCTC18400P) 재조합 미생물.
제1항에 있어서,
상기 숙신산 탈수소효소 유전자는 서열번호 1로 표시되는 것인, 재조합 미생물.
제1항에 있어서,
상기 이소시트르산 분해효소 유전자는 서열번호 2로 표시되는 것인, 재조합 미생물.
제1항에 있어서,
상기 말산 합성효소 유전자는 서열번호 3으로 표시되는 것인, 재조합 미생물.
제1항에 있어서,
상기 미생물은 기탁번호 KCTC18400P로 기탁된 메틸로모나스 속(Methylomonas sp.) DH-1인 것인, 재조합 미생물.
제1항에 있어서,
상기 미생물은 혐기성 및 호기성 조건에서 숙신산을 생성가능한 것을 특징으로 하는, 재조합 미생물.
메탄을 포함한 배양액에 제1항의 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 숙신산 제조 방법.
제7항에 있어서,
상기 단계는 배양액으로부터 숙신산을 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 숙신산 제조 방법.
제7항에 있어서,
상기 미생물은 기탁번호 KCTC18400P로 기탁된 메틸로모나스 속(Methylomonas sp.) DH-1인 것인, 숙신산 제조 방법.
제7항에 있어서, 숙신산을 생성하는 단계의 온도는 20℃ 내지 40℃인 것인, 숙신산 제조 방법.