MX2015004180A

MX2015004180A - Microorganismos recombinantes para producir acidos organicos organicos.

Info

Publication number: MX2015004180A
Application number: MX2015004180A
Authority: MX
Inventors: Susanne Kleff; Michael Guettler; Robert Hanchar; Sanchin Jadhav
Original assignee: Michigan Biotech Inst
Priority date: 2012-10-02
Filing date: 2013-10-02
Publication date: 2015-07-06
Also published as: US20140093925A1; PH12015500737A1; WO2014055670A1; JP2015530121A; CA2883407A1; KR20140108486A; IN2015DN02873A; KR101521045B1; EP2904104B1; CN104854244A; US20160326554A1; EP2904104A1

Abstract

Los microorganismos recombinantes que co-expresan la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y malato deshidrogenasa enzimáticas que se generan para producir ácidos orgánicos.

Description

MICROORGANISMOS RECOM Bl NANTES PARA PRODUCIR ÁCIDOS ORGÁNICOS Declaración con Respecto al Apoyo del Gobierno de los Estados Unidos de America Los aspectos de esta invención se hicieron con el apoyo del gobierno de los Estados Unidos de América bajo la concesión DE-FC36-02G012001 .

Referencia Cruzada a las Solicitudes Relacionadas e Incorporación Mediante Referencia del Material Presentado Electrónicamente La solicitud reclama la prioridad a la Solicitud de Patente Provisional Estadounidense No. 61 /708,998, presentada el 2 de octubre de 2012, la descripción de la cual se incorpora como referencia en su totalidad.

Esta solicitud contiene, como una parte separada de la descripción, un Listado de Secuencias en forma legible por computadora (nombre del archivo: 40000A_SeqListing .txt, creado el 2 de octubre de 2013, de 20,065 bytes) , el cual se incorpora como referencia en su totalidad.

Campo de la Invención La invención se refiere a microorganismos genéticamente modificados para producir cantidades aumentadas de ácidos orgánicos y métodos de uso.

Antecedentes de la Invención Los ácidos orgánicos tienen potencial para desplazar monómeros petroqu ímicamente derivados en un intervalo de aplicaciones industriales como polímeros, alimentos, farmaceuticos y cosméticos. El uso de ácidos orgánicos de base biológica podría disminuir la dependencia de los combustibles fósiles y beneficiar al medio ambiente en términos de producción reducida de dióxido de carbono.

Breve Descripción de la Invención Se describen microorganismos recombinantes para producir ácidos orgánicos. Los microorganismos recombinantes descritos expresan las enzimas glucosa-6-fosfato-1 -deshidrogenasa y malatos deshidrogenasa, lo cual resulta en el aumento de la producción de ácido orgánico Los siguientes párrafos numerados definen cada uno sucintamente una o más variaciones ejemplares de la invención: 1 . Un microorganismo recombinante que expresa enzimas glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y malato deshidrogenasa. 2. El microorganismo recombinante del párrafo 1 , en donde el organismo recombinante es un microorganismo que produce ácido succínico. 3. El microorganismo recombinante del párrafo 1 , que comprende una secuencia de ARN ribosomal 16S con al menos 90% de identidad con la secuencia de ARN ribosomal 16S de Actinombacillus succinogenes . 4. El microorganismo recombinante del párrafo 1 , el cual es Actinombacillus succinogenes, Bisgaard Taxon 6 y Bisgaard Taxon 10. 5. El microorganismo recombinante de cualquiera de los párrafos 1 - 4, que comprende un polinucleótido heterólogo o 5 sobreexpresado que codifica una enzima glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y un polinucleótido heterólogo o sobreexpresado que codifica una enzima malato deshidrogenasa. 6. El microorganismo recombinante de cualquiera de los párrafos 1 - 5, en donde la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa o ío malato deshidrogenasa son enzimas de A. succinogenes. 7. El microorganismo recombinante de cualquiera de los párrafos 1 - 5, en donde la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y malato deshidrogenasa es una enzima de A. succinogenes. 8. El microorganismo recombinante de cualquiera de los 15 párrafos 1 - 6, en donde la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa o malato deshidrogenasa son enzimas de E. coli. 9. El microorganismo recombinante de cualquiera de los párrafos 1 - 5, en donde la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y malato deshidrogenasa es una enzima de E. coli. 20 10. El microorganismo recombinante de cualquiera de los párrafos 1 - 5, en donde la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 40% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No. : 2. 25 1 1 . El microorganismo recombinante de cualquiera de los párrafos 1 - 5, en donde la malato deshidrogenasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 60% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC I D No. : 4. 12. El microorganismo recombinante de cualquiera de los párrafos 1 - 1 1 , en donde el microorganismo produce una cantidad aumentada de ácido orgánico (por ejemplo, ácido succínico) en comparación con un microorganismo que expresa las enzimas g!ucosa-6-fosfato deshidrogenasa o malato deshidrogenasa solas. 13. El microorganismo recombinante de cualquiera de los párrafos 1 - 12, en donde el microorganismo es capaz de producir ácido succínico a concentraciones de aproximadamente 50 g/l a 150 g/l. 14. Un proceso para la producción de ácido orgánico, el proceso comprende cultivar el microorganismo recombinante de cualquiera de los párrafos 1 - 13, en un medio de fermentación. 15. U n metodo para producir ácido orgánico que comprende la etapa de cultivar un microorganismo recombinante con una fuente de carbono bajo condiciones que favorecen la producción de ácido orgánico, en donde el microorganismo recombinante expresa al menos unas enzimas glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y malato deshidrogenasa. 16. El método del párrafo 15, en donde el microorganismo recombinante expresa tantas enzimas glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y malato deshidrogenase. 17. Un metodo para producir ácido orgánico que comprende cultivar el microorganismo recombinante de cualquiera de los párrafos 1 - 13 con una fuente de carbono bajo condiciones que 5 favorecen la producción de ácido orgánico. 18. El método de cualquiera de los párrafos 15 - 17 , en donde el ácido orgánico es ácido succínico o ácido propiónico. 19. El método del párrafo 18, en donde el ácido orgánico es ácido succínico. ío 20. El método de cualquiera de los párrafos 15 - 19, en donde la fuente de carbono es glucosa o sorbitol.

Breve Descripción de las Figuras Figura 1 representa un mapa esquemático del vector pL88.

Figura 2 representa un mapa esquemático de pISTONSI . 15 Figura 3 representa un mapa esquemático de p830.60.

Figura 4 representa un mapa esquemático de p856.78.

Figura 5 es una comparación de secuencias entre las secuencias de aminoácidos de las enzimas de Zwf de E. coli (“problema”) y A. succinogenes (“base de datos”) . 20 Figura 6 es una comparación de secuencias entre las secuencias de aminoácidos de las enzimas de Mdh de E. coli (“problema”) y A. succinogenes (“base de datos”) .

Figura 7 es una comparación de secuencias entre las secuencias de aminoácidos de la enzima de Mdh de Aspergillus 25 flavus (“problema”) y A. succinogenes (“base de datos”) .

Figura 8 es una secuencia de ácidos nucleicos de Zwf de A. succinogenes en p830.60.

Figura 9 es una secuencia de ácidos nucleicos de mdh de A. succinogenes en pISTONSI .

Descripción Detallada de la Invención En la siguiente descripción detallada, las modalidades se describen con suficiente detalle para permitir a los expertos en la teenica practicarlas, y se entenderá que otras modalidades se pueden usar y que se pueden hacer cambios químicos y de procedimiento sin apartarse del espíritu y alcance del presente tema. La siguiente descripción detallada, por lo tanto, no se debe tomar en un sentido limitativo, y el alcance de las modalidades se define sólo por las reivindicaciones adjuntas.

El término “microorganismo” se refiere a un organismo unicelular como bacterias, hongos o levaduras.

El término “microorganismo recombinante” se refiere a un microorganismo alterado, modificado o diseñado (por ejemplo, genéticamente modificado) de tal manera que exhibe un genotipo o fenotipo alterado, modificado o diferente (por ejemplo, cuando la modificación genética afecta la codificación de secuencias de ácidos nucleicos del microorganismo) en comparación con el microorganismo de origen natural o de inicio a partir del cual se deriva.

La manipulación genética puede incluir, pero no se limitan a, alterar o modificar las secuencias reguladoras o sitios asociados con la expresión de un gen particular (por ejemplo, usando promotores fuertes, promotores inducibles o promotores múltiples); modificar la ubicación cromosómica de un gen particular; alterar las secuencias de ácidos nucleicos adyacentes a un gen particular, como una secuencia en la región promotora que incluye secuencias reguladoras importantes para la actividad del promotor, un sitio de unión al ribosoma, o terminador de transcripción; aumentar el número de copias de un gen particular; modificar las proteínas (por ejemplo, proteínas reguladoras, supresores, mejoradores, activadores transcripcionales, y similares) implicadas en la transcripción o traducción de un producto de gen particular; o cualquier otro medio convencional para aumentar la expresión de un gen particular.

Como se usa en la presente, un “ácido orgánico” incluye un ácido que comprende al menos un grupo carboxílico.

Opcionalmente, el ácido orgánico es un ácido orgánico de 1 a 10 átomos de carbono, tambien opcionalmente el ácido orgánico comprende dos grupos carboxilato. Por ejemplo, “ácido orgánico” incluye el ácido succínico o ácido propiónico. Otros ejemplos de ácidos orgánicos incluyen , pero no se limitan a, ácido láctico, ácido málico, ácido cítrico, ácido oxálico, y ácido tartárico. Como se usa en la presente, los ácidos orgánicos también pueden incluir el anión de ácido orgánico o una sal del mismo. Por ejemplo, “ácido succínico” puede ser referido como “succinato;” ácido propiónico” puede ser referido como “propionato.” “Heterólogo” se refiere a cualquier polinucleótido o polipeptido que no se origina o no es nativo de la célula u organismo particular donde se desea la expresión.

“Sobreexpresión” se refiere a la expresión de un polinucleótido para producir un producto (por ejemplo, un polipéptido o ARN) a un nivel mayor al que el polinucleótido se expresa normalmente en la célula huésped. Un polinucleótido sobreexpresado generalmente es un polinucleótido nativo a la célula huésped, el producto del cual se genera en una cantidad mayor que la normalmente encontrada en la célula huésped. La sobreexpresión se logra, por ejemplo y sin limitación, enlazando operativamente el polinucleótido a un promotor diferente del promotor nativo del polinucleótido o introduciendo copias adicionales del polinucleótido en la célula huésped.

Un polipéptido o polinucleótido “derivado de” un organismo comprende la misma secuencia de aminoácidos o secuencia de ácidos nucleicos como el polipéptido o polinucleótido de referencia del organismo, u opcionalmente contiene una o más modificaciones en la secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos nativa, como se describe adicionalmente a continuación , y opcionalmente exhibe similar, si no mejor, actividad en comparación con la enzima nativa (por ejemplo, al menos 70% , al menos 80% , al menos 90%, al menos 95% , al menos 100% , o al menos 1 10% del nivel de actividad de la enzima nativa). Se apreciará que un polipéptido o polinucleótido “derivado de” un organismo no se limita a polipéptidos o polinucleótidos físicamente removidos de un organismo huésped particular.

También en la presente, las relaciones de intervalos numéricos por criterios de valoración incluyen todos los números subsumidos dentro de este intervalo (por ejemplo, 1 a 5 incluye 1 , 1 .5, 2, 2.75, 3, 3.80, 4, 5, y similares). Además, la descripción de un intervalo incluye la descripción de todos los subintervalos incluidos dentro del intervalo más amplio (por ejemplo, 1 a 5 describe 1 a 4, 1 .5 a 4.5, 4 a 5, y similares) .

La invención proporciona materiales y métodos mejorados para producir ácido orgánico a través de la fermentación. El desempeño de la fermentación se captura típicamente por tres parámetros: título, productividad y rendimiento. El título específico la concentración del producto (por ejemplo, ácido orgánico, como ácido succínico) en el caldo de fermentación al final de la fermentación . La productividad o velocidad de producción representa el tiempo para alcanzar el título del producto. El rendimiento es el cociente de la masa de producto por masa de material de alimentación (por ejemplo, azúcar, como glucosa) . Los tres parámetros afectan a la economía de un proceso de producción fermentativa. Un título alto facilita la recuperación del producto; menos agua se debe evaporar o remover, requiriendo menos energ ía, lo cual reduce los costos de operación del proceso. La productividad está vinculada al título, añadiendo una dimensión de tiempo a la misma. La alta productividad implica un proceso de fermentación rápida, y permite una reducción en el tamaño del recipiente de fermentación, ya que el proceso se puede ejecutar más a menudo. La productividad afecta principalmente el costo de capital de los procesos de producción fermentativa. El rendimiento afecta a los costos operativos del proceso - tanto mayor es el rendimiento, cuanto menos materia prima o material de alimentación se necesita para obtener el producto.

El título, productividad y rendimiento se entrelazan y se afectan mutuamente. Una fermentación que logra un título alto en poco tiempo dará lugar a una alta productividad y viceversa. La acumulación de un producto de fermentación o título mayor pueden retrasar la producción . El rendimiento está inversamente correlacionado con la productividad , porque el material de alimentación se usa en la fermentación para apoyar el crecimiento del organismo, multiplicar las celulas y construir la biomasa, pero también para metabolizar el material de alimentación en el producto deseado. En general, más células producirán más producto y lo producirán más rápido, lo cual dará como resultado en una mayor productividad, pero menor rendimiento. Por lo tanto, la optimización de la fermentación debe equilibrar todos los tres parámetros para lograr el proceso más económico. El objetivo final es lograr un proceso que tenga altos valores de los tres parámetros.

Sorprendentemente, la sobre-producción simultánea de enzimas en la vía de la pentosa fosfato (o vía de Entner-Doudoroff) y el ciclo de ácido tri-carboxílico en un microbio recombinante (por ejemplo, Actinobacillus succinogenes) como se describe en la presente se descubrió que promueve un mayor rendimiento de ácido succínico, que es un factor clave en la determinación de la viabilidad económica del proceso de fermentación. A este respecto, la invención se basa, al menos en parte, en el sorprendente descubrimiento que la producción de una glucosa-6-fosfato deshidrogenase y una malato deshidrogenasa en un microorganismo resulta en el aumento de la producción de ácido orgánico en comparación con el nivel de producción logrado por una microorganismo que expresa una enzima única sola. El ciclo de la pentosa fosfato (o vía de Entner-Doudoroff) usa varias enzimas que incluyen glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (por ejemplo, glucosa-6-fosfato-1 -deshidrogenasa, que tambien es referida como enzima de Zwischenferment o Zwf); 6-fosfogluconolactonasa; 6-fosfogluconato deshidrogenasa, (también llamada Gnd); ribosa-5-fosfato isomerasa A y B; ribulosa fosfato 3-epimerasa; transquetolasa I y I I ; transaldolasa A y B; 6-fosfogluconato deshidratasa (Edd); y 2-ceto-3-desoxifosfogluconato aldolasa (Eda) . El ciclo del ácido tri-carboxílico usado en la producción anaeróbica de ácido succínico usa, por ejemplo, las enzimas fosfoenolpiruvato-carboxicinasa, malato deshidrogenasa, fumarasa, y fumarato reductasa.

En un aspecto, la invención proporciona un microorganismo recombinante que produce tanto una glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (por ejemplo, Zwf) como una malato deshidrogenasa (por ejemplo, Mdh) de tal manera que, en diversas modalidades, el microorganismo recombinante exhibe producción mejorada de ácido orgánico (por ejemplo, ácido succínico o ácido propiónico) en comparación con un microorganismo de origen no modificado. Las actividades de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (EC 1 .1 .1 .49) y malato deshidrogenasa (EC 1 .1 .1 .37) se entienden bien en la téenica. La glucosa-6-fosfato deshidrogenasa cataliza, por ejemplo, la reacción de D-glucosa-6-fosfato + NADP + => 6-fosfo-D-glucono-1 ,5-lactona + NADPH . La malato deshidrogenasa convierte el oxalo-acetato a malato, o ácido oxaloacético a ácido málico, reduciendo el sustrato mediante el uso de co-factores como, pero no limitado a, NADH o NADPH .

La glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y malato deshidrogenasa se encuentran en una amplia variedad de organismos. Una o ambas de las enzimas pueden ser nativas para el microorganismo recombinante, pero múltiples copias de un polinucleótido que codifica la enzima se introducen en la célula huésped para aumentar la producción de la enzima. En algunas modalidades, el microorganismo recombinante expresa una glucosa 6-fosfato deshidrogenasa nativa y/o una malato deshidrogenasa nativa a niveles elevados (por ejemplo, “sobreexpresa” la enzima) con respecto a los niveles presentes en los microorganismos no recombinantes o el microorganismo de partida. Alternativamente, una o ambas de enzimas son no nativas para el microorganismo recombinante. En diversas modalidades, los polinucleótidos se derivan de un organismo que produce de forma natural ácido succínico o ácido málico. Dependiendo de la modalidad de la invención, el polinucleótido se aísla de una fuente natural como bacterias, algas, hongos, plantas o animales; se produce a traves de una ruta semi-sintética (por ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos de un polinucleótido es optimizada por codones para la expresión en una célula huésped particular, como E. coli) o se sintetiza de novo.

Los polinucleótidos que codifican la malato deshidrogenasa (por ejemplo, genes de mdh) se pueden derivar, por ejemplo, de A. succinogenes (por ejemplo, NC_009655) o E. coli (EG 10576 (EcoCyc)) , o de otras fuentes adecuadas que muestran tener la actividad enzimática. Del mismo modo, el polinucleótido que codifica la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa es, en varias modalidades, derivado de E. coli. (Por ejemplo, EG 1 1221 (EcoCyc); número de acceso: ECK1853) o A. succinogenes (por ejemplo, acceso a GenBank No. ABR73607.1 G 1 : 150839636). Opcionalmente, los polinucleótidos son optimizados por codones para facilitar la expresión en un microorganismo particular. En algunas modalidades, el microorganismo recombinante comprende un polinucleótido que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID No. : 1 , que codifica la enzima de Zwf, y/o un polinucleótido que comprende la secuencia de ácidos nucleicos 5 que codifica la SEC I D No. : 3, que codifica una enzima de Mdh.

Tambien contemplados en la presente están los polinucleótidos que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos que es al menos 50%, al menos 55% , al menos 60% , al menos 65% , al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85 % , al ío menos 90%, o al menos 95% (o cualquier intervalo de los porcentajes anteriores) con la SEC I D No. : 1 o SEC I D No. : 3.

En algunas modalidades, el polinucleótido variante codifica un polipéptido que tiene una o más actividades bioquímicas de la enzima de Zwf o Mdh . Un polinucleótido variante puede incluir, 15 por ejemplo, un fragmento del gen zwf o mdh. En algunas modalidades, el microorganismo recombinante puede expresar un gen zwf o mdh expresado por A. succinogenes, E. cotí, Bastía (por ejemplo, Bastía succinicproducens), Mannheimia (por ejemplo, Mannheimia succiniciproducens) , Saccharomyces, 20 Aspergillus o una variante de los mismos.

Los inventores han descubierto que la expresión de ambas enzimas de Zwf y Mdh en un proceso de fermentación única resulta en un aumento de la producción de ácido orgánico como ácido succínico o ácido propiónico. En algunas modalidades, se 25 puede usar un organismo recombinante único que co-expresa Zwf y Mdh. En otras modalidades, los genes que codifican Zwf y Mdh se expresan en diferentes organismos, pero la expresión combinada de estas dos enzimas en un único proceso de fermentación se usa en la producción de ácido orgánico. La invención contempla un microorganismo recombinante que comprende (por ejemplo, un microorganismo que se ha transformado con) un polinucleótido que codifica un polipeptido que tiene una o más actividades bioquímicas de la enzima de Mdh , opcionalmente en combinación con un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una o más actividades bioquímicas de la enzima de Zwf, como la actividad de la glucosa-6-fosfato deshidrogenase y/o actividad de la NADP reductasa. Por ejemplo, un enzima de Zwf o Mdh adecuada es la enzima de Zwf o Mdh de E. coli o una variante de la misma. Dicho de otra manera , en diversas modalidades, la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y/o malato deshidrogenasa son/es enzima(s) de E. coli o A. succinogenes.

Una secuencia de aminoácidos de glucosa 6-fosfato deshidrogenasa representativa se proporciona en la SEC ID No. : 2, que es una secuencia de aminoácidos de Zwf de A. succinogenes. El microorganismo recombinante puede expresar un polipéptido variante que tiene al menos aproximadamente 40% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de una enzima de Zwf (por ejemplo, SEC I D No. : 2), y más deseablemente al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80% , o al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de una enzima de Zwf (por ejemplo, SEC I D No. : 2). En diversas modalidades, el polipeptido variante comprende una o más mutaciones conservadoras con respecto a una secuencia de referencia, es decir, una sustitución de un aminoácido con un aminoácido funcionalmente similar. Dicho de otra manera, una sustitución conservadora implica el remplazo de un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la téenica, e incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, e histidina) , cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico y ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina y cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina , isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina y triptófano), cadenas laterales con ramificación beta (por ejemplo, treonina, valina e isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, e histidina) .

Una secuencia de aminoácidos de malato deshidrogenasa representativa se proporciona en la SEC I D No. : 4, que es una secuencia de aminoácidos de MdH de A. succinogenes. El microorganismo recombinante puede expresar un polipeptido variante que tiene al menos aproximadamente 50% o al menos aproximadamente 60% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de una enzima de Mdh (por ejemplo, 5 SEC ID No.: 4), y más deseablemente al menos aproximadamente 70% u 80% o 90%, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de una enzima de Mdh (por ejemplo, SEC ID No. : 4) .

La variación sustancial en la secuencia de aminoácidos está permitida en el contexto de las enzimas del microorganismo ío recombinante. Las secuencias de aminoácidos de las enzimas de Zwf de E. coli y A. succinogenes, por ejemplo, comparten 44% de identidad , y ambas son enzimas adecuadas en el contexto de la invención . Ver Figura 5. De manera similar, las secuencias de aminoácidos de las enzimas de Mdh de E. coli y A. succinogenes 15 comparten 69% de identidad, y ambas son enzimas adecuadas en el contexto de la invención. Ver Figura 6. La enzima de Mdh generalmente es bien conservada entre diferentes organismos. La secuencia de aminoácidos de la enzima de Mdh de Aspergillus flavus, un hongo filamentoso, demuestra aproximadamente 50% 20 de identidad con la secuencia de enzima de Mdh de A. succinogenes, y conserva la capacidad de convertir el oxalo- acetato a malato. Ver Figura 7.

De manera deseable, el polipéptido variante tiene uno o más actividades bioquímicas de la enzima de Zwf o Mdh , por ejemplo, 25 actividad de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y malato deshidrogenasa . Un polipeptido variante puede incluir un fragmento de la enzima de Zwf o Mdh . Los métodos para evaluar la actividad de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y la actividad del malato deshidrogenasa son conocidos en la téenica y están disponibles comercialmente de, por ejemplo, Abcam, Cambridge, MA, y Sigma Aldrich , St. Louis, MO. Un ensayo ejemplar para determinar la actividad de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa se describe en Rowlcy and Wolf, J. Bacteriology, 173, 968-977 (1991 ) y Wolf et al., J. Bacteriology, 139, 1093-1096 (1979) . Las condiciones ilustrativas para la reacción son como sigue: una mezcla de reacción que contiene Tris-HCI 50 mM (pH 7.8), MgCI2 10 mM , NADP 1 mM, glucosa-6-fosfato 1 mM , y el extracto celular se prepara, y se mide el aumento de la absorbancia a 340 nm. En diversas modalidades, la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa codificada por el polinucleótido exhibe al menos 70% , al menos 75% , al menos 80% , al menos 85%, al menos 90% , al menos 95% , o 100% de la actividad de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa del polipéptido de SEC ID No. : 2. La glucosa-6-fosfato deshidrogenasa codificada por el polinucleótido puede exhibir más de 100% de la actividad de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa del polipéptido de SEC ID No. : 2 (por ejemplo, 1 10% o más, 120% o 130% o más de la actividad). Alternativamente, o además, la malato deshidrogenasa producida por el microorganismo recombinante exhibe al menos 70%, al menos 75% , al menos 80% , al menos 85%, al menos 90% , al menos 95%, o 100% de la actividad de la malato deshidrogenasa del polipeptido de SEC I D No. : 4. La malato deshidrogenasa codificada por el polinucleótido puede exhibir más de 100% de la actividad de la malato deshidrogenasa del polipéptido de SEC I D No. : 4 (por ejemplo, 1 10% o más, 120% o 130% o más de la actividad) . Un ensayo ejemplar para determinar la actividad de la malato deshidrogenasa se describe en Samuelov, J. Bacteriology, 57, 3013 (1991 ) . Las condiciones ilustrativas para la reacción son como sigue: una mezcla de reacción que contiene Tris-HCI 100 mM, pH 8.1 , oxaloacetato 5 mM , NADH 0.3 mM , DTT 2 mM , y el extracto celular se prepara; y se mide la disminución de la absorbancia a 340 nm, que representa la oxidación de NADH .

El microorganismo recombinante se puede derivar de cualquier microorganismo adecuado, como, por ejemplo, células bacterianas y otras células procariotas y células de levadura. Típicamente, el microorganismo es capaz de producir un ácido orgánico a un nivel adecuado para la producción comercial . Los microorganismos adecuados para preparar microorganismos recombinantes como se describe en la presente incluyen microorganismos que producen ácido succínico. Los microorganismos ejemplares incluyen , pero no se limitan a, organismos de la familia Pasteurellaceae. Los ejemplos de miembros de la familia Pasteurellaceae incluyen miembros del género Actinobacillus, incluyendo A. succinogenes, Bisgaard Taxon 6 (depositado en la Colección de Cultivos, Universidad de Goteborg , Suecia (CCUG), bajo el número de acceso 15568) , Bisgaard Taxon 10 (depositado bajo el número de acceso de CCUG 15572) , Mannheimia succiniciproducens , Bastía succinicproducens, E. coli, Anaerobiospirillum succiniciproducens, Ruminobacter amyiophiius, Succinivibrio dextrinosolvens, Prevotella ruminicola, Ralstonia eutropha, y bacterias corineformes (por ejemplo, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentuin, Brevibacterium divaricatum)\ miembros del genero Lactobacillus levadura (por ejemplo, miembros del género Saccharomyces como Saccharomyces cerevisiae) ·, y cualquier subconjunto de los mismos En algunas modalidades, la cepa recombinante puede ser (es) derivada de un microorganismo cuyo rARN 16S tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia) con el rARN 16S de Actinobacillus succinogenes. Por ejemplo, la cepa recombinante se puede derivar de una cepa de Actinobacillus succinogenes , Bisgaard Taxon b, o Bisgaard Taxon 10.

El microorganismo recombinante puede expresar un gen Zwf, un gen mdh o ambos. Los genes zwf o mdh pueden ser nativos para el microorganismo recombinante. En otras modalidades, los genes zwf o mdh pueden ser heterólogos (es decir, no nativos para el microorganismo del cual se deriva el microorganismo recombinante). En algunas modalidades, el polinucleótido que codifica la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y/o el polinucleótido que codifica la malato deshidrogenasa (por ejemplo, el gen zwf o mdh) están optimizados para la expresión en el microorganismo recombinante. Por ejemplo, los genes zwf o mdh pueden estar operativamente enlazados a un promotor que facilita la sobreexpresión de genes en relación a un microorganismo no recombinante. El promotor puede ser endógeno para el microorganismo (por ejemplo, nativo para el microorganismo del cual se deriva el microorganismo recombinante) o heterólogo para el microorganismo. En algunas modalidades, los genes zwf y mdh son de A. succinogenes y son regulados por sus respectivos promotores de zwf y mdh tambien de A. succinogenes.

El polinucleótido que codifica la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y/o el polinucleótido que codifica la malato deshidrogenasa (por ejemplo, genes zwf o mdh) se modifican opcionalmente para facilitar la traducción de los mARN correspondientes. Por ejemplo, un gen zwf o mdh se puede modificar para incluir codones que no están presentes en el gen endógeno o nativo. Estos codones no endógenos se pueden seleccionar para reflejar la frecuencia de uso de codones en el microorganismo recombinante. Las tablas de uso de codones se han desarrollado para muchos microorganismos y son conocidas en la téenica. Por ejemplo, el polinucleótido que codifica la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y/o el polinucleótido que codifica la malato deshidrogenasa (por ejemplo, genes zwf o mdh) se pueden modificar para reflejar la frecuencia de uso de codones para A. succinogenes como se proporciona en la Patente Estadounidense No. 8, 1 19,377, la patente que se incorpora como referencia en su totalidad.

El microorganismo recombinante se puede derivar de una cepa que produce altos niveles de uno o más ácidos orgánicos como ácido succínico o ácido propiónico, o el microorganismo recombinante se puede seleccionar o modificar geneticamente para producir niveles altos o mejorados de uno o más ácidos orgánicos como ácido succínico o ácido propiónico con respecto a un microorganismo no recombinante.

Opcionalmente, el microorganismo recombinante se selecciona o modifica genéticamente (o ambos) para ser resistente a niveles relativamente altos de subproductos indeseables o para producir niveles relativamente bajos de subproductos indeseables. Por ejemplo, después de la introducción de los polinucleótidos que codifican la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y malato deshidrogenasa en la célula (por ejemplo, transformación) , una población de microorganismos recombinantes opcionalmente se cultiva en la presencia de monofluoroacetato de sodio para seleccionar cepas que son resistentes a niveles de acetato relativamente altos o cepas que producen niveles de acetato relativamente bajos. Los subproductos indeseables incluyen , pero no se limitan a, formiato (o ácido fórmico), acetato (o ácido acetico), y/o piruvato (o ácido pirúvico), lactato, 1 ,3-propanodiol, y etanol. Los métodos para seleccionar cepas que producen bajos niveles de acetato se conocen en la téenica. Véase, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 5,521 ,075 y Patente Estadounidense No. 5,573,931 , las cuales incorporan en la presente como referencia, especialmente con respecto a su discusión de la selección de la cepa microbiana . Por ejemplo, las cepas de microorganismos que producen niveles de acetato relativamente bajos se pueden seleccionar cultivando los microorganismos en la presencia de un derivado de acetato tóxico, como monofluoroacetato de sodio a una concentración de aproximadamente 1 .0 a aproximadamente 8.0 g/l. Las cepas seleccionadas pueden producir niveles de acetato relativamente bajos (por ejemplo, menos de aproximadamente 10 g/l, menos de aproximadamente 7 g/l, menos de aproximadamente 5 g/l, o menos de aproximadamente 2.0 g/l) , formiato (por ejemplo, menos de aproximadamente 2.0 g/l) , y/o piruvato (por ejemplo, menos de aproximadamente 3.0 g/l) en una fermentación de glucosa. Una cepa resistente a monofluoroacetato adecuada para producir un microorganismo recombinante o derivado es una cepa de A. succinogenes depositada bajo el número de acceso de ATCC 55618. Véase también la Patente Estadounidense No. 5,573,931 , la cual describe métodos adecuados para preparar cepas microbianas que son resistentes al monofluoroacetato. Otros ejemplos de cepa resistente a monofluoroacetato adecuada incluyen FZ45 y FZ53, también descrito en la Patente Estadounidense No. 5,573,931 .

Un polinucleótido que codifica una glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y un polinucleótido que codifica una malato deshidrogenasa (o un polipéptido con una o más actividades bioqu ímicas de la enzima de Zwf o Mdh) se pueden obtener empleando métodos conocidos en la téenica (por ejemplo, amplificación por PCR con cebadores adecuados y clonación en un vector de ADN adecuado). Se han descrito las secuencias de polinucleótidos de genes zwf adecuados que codifican la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. (Ver, por ejemplo, GenBank). Por ejemplo, la secuencia de polinucleótidos del gen zwf de A. succinogenes se ha publicado en la Patente Estadounidense No. 8 , 1 19,377, la cual se incorpora en la presente como referencia. Ver también Jomt Genome Institute, sitio web del Departamento de Energía, número de acceso de NCBI NC_009655. El gen zwf de E. coli está depositado en GenBank (por ejemplo, bajo el número de acceso de GenBank NC 000913 y número de acceso de GenBank M55005). El gen zwf o variantes del mismo se puede obtener por amplificación por PCR de un ADN genómico del microorganismo con cebadores apropiados.

Las secuencias de mdh se pueden obtener, por ejemplo, de Actinombacillus succinogenes, GenBank NC_009655, o E. coli. EG 10576 (EcoCyc) .

El vector de ADN puede ser cualquier vector adecuado para expresar los polinucleótidos en un microorganismo recombinante. Los vectores adecuados incluyen plásmidos, cromosomas artificiales (por ejemplo, cromosomas artificiales bacterianos), y/o bacteriófagos modificados (por ejemplo, fagemidos). El vector se puede diseñar para existir como un elemento epigenético y/o el vector se puede diseñar para recombinarse con el genoma del microorganismo.

El polinucleótido incluye típicamente un promotor operativamente enlazado a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una glucosa-6-fosfato deshidrogenasa o malato deshidrogenasa (es decir, un polipéptido que tiene actividad de la enzima de Zwf o Mdh). El promotor puede ser endógeno o nativo para el microorganismo del cual se deriva el microorganismo recombinante o heterólogo para el microorganismo (por ejemplo, derivado de una fuente diferente del microorganismo recombinante). Además, el promotor puede ser el promotor nativo para una secuencia codificante de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa o malato deshidrogenasa seleccionada (es decir, gen zwf o mdh) o puede ser un promotor diferente del promotor nativo para una glucosa-6-fosfato deshidrogenasa o malato deshidrogenasa seleccionada (por ejemplo, un promotor no de gen zwf o mdh). En algunas modalidades, el microorganismo recombinante es una cepa de A. succinogenes, y se usa el promotor de zwf o mdh de A. succinogenes. En otras modalidades, el promotor puede ser un promotor de fosfoenolpiruvato ( PckA ) carboxicinasa de A. succinogenes, depositado bajo el número de acceso de GenBank AY308832, incluyendo los nucleótidos 1 -258, o una variante del mismo, como se describe en la Patente Estadounidense No. 8, 1 19,377, la cual se incorpora en la presente como referencia. Se puede usar cualquier promotor adecuado (por ejemplo, inducible, constitutivo, fuerte y similar) que puede dirigir la expresión de la secuencia deseada en el microorganismo deseado. El promotor puede estar operativamente enlazado con el polinucleótido que codifica la glucosa-6-fosfato deshidrogenase o polinucleótido que codifica la malato deshidrogenasa (por ejemplo, gen zwf o mdh) usando metodos de clonación que son conocidos en la téenica. Por ejemplo, el promotor y la secuencia codificante (por ejemplo, gen zwf y mdh) se pueden amplificar por PCR usando cebadores que incluyen sitios de reconocimiento de enzimas de restricción compatibles. El promotor amplificado y la secuencia codificante luego se pueden digerir con la enzima y clonar en un vector apropiado que incluye un sitio de clonación múltiple adecuado.

Además, los polinucleótidos o vector pueden incluir o codificar un marcador seleccionable. El marcador seleccionable puede conferir resistencia a uno o más agentes antibióticos. Por ejemplo, los marcadores seleccionables pueden incluir genes para resistencia a la ampicilina, resistencia a la estreptomicina, resistencia a la canamicina, resistencia a la tetracielina, resistencia a cloranfenicol, resistencia a la sulfonamida, o combinaciones de estos marcadores. Típicamente, el marcador seleccionable está operativamente enlazado a un promotor que facilita la expresión del marcador. Los plásmidos y otros vectores de clonación que incluyen marcadores seleccionables son conocidos en la téenica.

Cualquier célula huésped adecuado se puede usar para almacenar o propagar un vector que comprende los polinucleótidos. La célula huésped expresa opcionalmente una secuencia codificante en la molécula de ADN . Las células huésped adecuadas también pueden incluir células que son capaces de producir (es decir, células que producen) un ácido orgánico en un proceso de fermentación, como ácido succínico o ácido propiónico a una concentración adecuada para la producción comercial (por ejemplo, al menos aproximadamente 20 g/l, más adecuadamente al menos aproximadamente 50 g/l , y más adecuadamente al menos aproximadamente 100 g/l) .

En el contexto de la invención, los métodos para producir un ácido orgánico típicamente incluyen fermentar un medio de nutrientes con un microorganismo recombinante. En algunas modalidades, el microorganismo recombinante en el medio de fermentación expresa un gen zwf y mdh . Por ejemplo, el método puede incluir fermentar un medio de nutrientes con una A. succinogenes recombinante que expresa un gen Zwf y mdh (por ejemplo, un gen zwf o mdh de A. succinogenes nativo). Se puede contemplar que otras combinaciones de genes y organismos se pueden usar para fermentar el medio para producir ácido orgánico. Por ejemplo, un gen zwf heterólogo y gen mdh endógeno pueden ser ambos expresados de un promotor heterólogo en un organismo adecuado o cualquiera otras combinaciones adecuadas.

Por lo tanto, en un aspecto, la invención proporciona un metodo para producir ácido orgánico que comprende cultivar el microorganismo recombinante descrito en la presente con una fuente de carbono bajo condiciones que favorecen la producción de ácido orgánico. El microorganismo recombinante, por ejemplo, comprende un polinucleótido heterólogo o sobreexpresado que codifica una enzima glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y un polinucleótido heterólogo o sobreexpresado que codifica una enzima malato deshidrogenasa, y produce las enzimas para permitir la producción de un ácido orgánico deseado. Los ácidos orgánicos producidos en la fermentación pueden incluir, por ejemplo, ácido succínico o ácido propiónico, o cualquier otro ácido orgánico discutido en la presente.

Un microorganismo recombinante adecuado para los métodos descritos en la presente es una cepa recombinante de A. succinogenes que expresa el gen zwf de E. cotí, depositado bajo el número de acceso de ATCC PTA-6255. Este organismo, en combinación con otro organismo recombinante que expresa el gen mdh, puede ser cultivado en medio de nutrientes de fermentación para producir ácido orgánico. Alternativamente, la cepa depositada bajo el número de acceso de ATCC PTA-6255 se modifica para sobreexpresar mdh o producir mdh heteróloga. Los metodos también pueden incluir fermentar un medio de nutrientes con una cepa recombinante de Bisgaard Taxon 6 o Bisgaard Taxon 10 que expresa una zwf o mdh o ambos genes (por ejemplo, un gen zwf o mdh heterólogo como de E. coli) para producir ácido succínico.

El medio de nutrientes típicamente incluye una fuente de carbono fermentable. La fuente de carbono fermentable se puede proporcionar por una biomasa fermentable. Una biomasa fermentable se puede derivar de una variedad de cultivos y/o materiales de alimentación , incluyendo: cultivos de azúcar (por ejemplo, remolacha azucarera, sorgo dulce, caña de azúcar, remolacha forrajera); cultivos de almidón (por ejemplo, granos como maíz, trigo, sorgo, cebada y tubérculos como papas y papas dulce); cultivos celulósicos (por ejemplo, rastrojo de maíz, fibra de maíz, paja de trigo y forrajes como forraje de pasto de Sudán, y sorgo). La biomasa se puede tratar para facilitar la liberación de la fuente de carbono fermentable (por ejemplo, azúcares). Por ejemplo, la biomasa se puede tratar con enzimas como celulasa y/o xilanasa, para liberar azúcares simples, y/o se puede tratar con calor, vapor, o ácido para facilitar la degradación. La fuente de carbono fermentable puede incluir azúcares simples y alcoholes de azúcar como glucosa, maltosa, mañosa, manitol, sorbitol , galactosa, xilosa, xilitol , arabinosa, arabitol, y mezclas de los mismos. En algunas modalidades, las fuentes de carbono no purificadas mínimamente procesadas o crudas se pueden usar para la producción de ácido orgánico. En una modalidad , la fuente de carbono puede incluir polioles crudos descritos en la Solicitud de Patente Estadounidense Serie No. 60/709,036, titulada “I ntegrated Systems & Methods for Organic Acid Productions” presentada en la misma fecha que la Solicitud de Patente Provisional Estadounidense No. 61 /708998, a la cual la solicitud actual reivindica la prioridad, la solicitud se incorpora como referencia en la presente en su totalidad. Los polioles crudos incluyen , por ejemplo, polioles producidos a traves de, por ejemplo, la fermentación o hidrogenación, los cuales someten de otro modo a un procesamiento mínimo. Por ejemplo, los polioles crudos no se someten a una etapa de filtración para remover los sólidos. Como tal, los polioles crudos son menos puros que los polioles refinados.

Los métodos de la invención resultan en un rendimiento relativamente alto de ácido succínico con respecto a una fuente de carbono de entrada, como azúcar (por ejemplo, glucosa o sorbitol) . Por ejemplo, los métodos opcionalmente tienen un rendimiento de ácido succínico (g) de al menos aproximadamente 70% , al menos aproximadamente 75% , al menos aproximadamente 80% , al menos aproximadamente 85% , al menos aproximadamente 90% , o al menos aproximadamente 95% (o cualquier intervalo de los porcentajes anteriores) con respecto a la entrada de fuente de carbono (g) (por ejemplo, glucosa), o un rendimiento de ácido propiónico (g) de al menos 56% (por ejemplo, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70% , al menos aproximadamente 75% , al menos aproximadamente 80% , al menos aproximadamente 85% , al menos aproximadamente 90% , o al menos aproximadamente 95% , o cualquier intervalo de los porcentajes anteriores) con respecto a la entrada de fuente de carbono (g) (por ejemplo, glucosa). En algunas modalidades, el rendimiento se puede calcular como % de rendimiento de ácido succínico o ácido propiónico (mol)/entrada de fuente de carbono (mol) (por ejemplo, glucosa). Como tal , los metodos pueden tener un rendimiento de ácido succínico o propiónico (mol) de al menos aproximadamente 154% con respecto a la entrada de fuente de carbono (mol) (por ejemplo, glucosa). Deseablemente, los métodos pueden tener un rendimiento de ácido succínico o ácido propiónico (mol) de al menos aproximadamente 130% o al menos aproximadamente 170% con respecto a la entrada de fuente de carbono (mol) (por ejemplo, glucosa).

Los métodos pueden resultar en una concentración de ácido succínico relativamente alta (por ejemplo, con respecto a un método que usa un microorganismo no recombinante en una fermentación). Por ejemplo, una fermentación puede alcanzar una concentración de al menos aproximadamente 50 g/l de ácido succínico (por ejemplo, al menos aproximadamente 60 g/l, al menos aproximadamente 70 g/l, o al menos aproximadamente 80 g/l). Deseablemente, una fermentación puede alcanzar una concentración de al menos aproximadamente 90 g/l de ácido succínico (por ejemplo, al menos aproximadamente 100 g/l de ácido succínico, al menos aproximadamente 1 10 g/l de ácido succínico, o al menos aproximadamente 120 g/l de ácido succínico) o más deseablemente, una concentración de al menos aproximadamente 130 g/l de ácido succínico y aún más deseablemente una concentración de al menos aproximadamente 140 g/l . En algunas modalidades, la fermentación típicamente no produce niveles sustanciales de subproductos no deseables como acetato, formiato, piruvato, y mezclas de los mismos (por ejemplo, no más de aproximadamente 1 1 .0 g/l de acetato, no más de aproximadamente 10.0 g/l de acetato, no más de aproximadamente 9.0 g/l de acetato, no más de aproximadamente 8.0 g/l de acetato, no más de aproximadamente 7.0 g/l de etilo, no más de aproximadamente 6.0 g/l de acetato, no más de aproximadamente 5.0 g/l de acetato, no más de aproximadamente 4.0 g/l de acetato, no más de aproximadamente 3.0 g/l, o no más de aproximadamente 2.0 g/l de acetato (por ejemplo, 1 .5 g/l o menos o 1 .0 g/l o menos); no más de aproximadamente 2.0 g/l de formiato (por ejemplo, 1 .5 g/l o menos o 1 .0 g/l o menos), y/o no más de aproximadamente 3.0 g/l de piruvato (por ejemplo, 2.5 g/l o menos o 2.0 g/l o menos o 1 .5 g/l o menos, o 1 .0 g/l o menos)).

El metodo descrito en la presente opcionalmente resulta en velocidades de producción relativamente altas. En diversas modalidades, el metodo logra una productividad de al menos aproximadamente 1 .0 g/l-h, al menos aproximadamente 1 .5 g/l-h , al menos aproximadamente 2.0 g/l-h, al menos aproximadamente 5 2.5 g/l-h, al menos aproximadamente 3.0 g/l-h, al menos aproximadamente 3.5 g/l-h , o al menos aproximadamente 4.0 g/l- h .

En una modalidad, el microorganismo recombinante es Actinobacillus succinogenes que expresa un gen heterólogo zwf y ío mdh . Los genes heterólogos zwf y mdh pueden ser optimizados para la expresión en Actinombacillus succinogenes. Los genes zwf y medh heterólogos se pueden codificar por E. coli. Por ejemplo, un organismo recombinante es Actinombacillus succinogenes depositado bajo el número de acceso de ATCC 15 PTA-6255 (Colección de Cultivo Tipo Americano, Manassas, VA, EUA), que es opcionalmente modificado para sobreproducir Mdh . U n microorganismo recombinante alternativo es una cepa de A. succinogenes depositada bajo el número de acceso de ATCC PTA-120462 , la cual es una cepa que produce niveles 20 aumentados de Zwf y Mdh en comparación con una cepa de A. succinogenes progenitora (no modificada). La cepa recombinante puede ser capaz de producir ácido succínico o ácido propiónico a concentraciones de aproximadamente 50 g/l a aproximadamente 150 g/l (por ejemplo, en un sistema de fermentación que usa una 25 fuente de carbono adecuada) . La cepa recombinante puede ser resistente a los niveles de monofluoroacetato de sodio de al menos aproximadamente 1 g/l.

En otra modalidad, la cepa recombinante es Actinombacillus succinogenes, que incluye una molécula de ADN (es decir, un polinucleótido) que comprende un promotor de transcripción para Actinombacillus succinogenes operativamente enlazado a un gen heterólogo zwf o mdh (por ejemplo, un promotor de A. succinogenes enlazado a una secuencia codificante de zwf y un promotor de A. succinogenes enlazado a una secuencia codificante de Mdh) . El promotor de transcripción puede incluir el promotor de fosfoenolpiruvato ( PckA ) carboxicinasa de A. succinogenes o una variante del mismo, cuya secuencia se describe en la Patente Estadounidense No. 8, 1 19,377. El gen heterólogo puede codificar la enzima de Zwischenferment de E. coli o una variante de la misma. El gen heterólogo mdh puede codificar la enzima de Mdh de E. coli o una variante de la misma. Opcionalmente, el gen zwf y/o el gen mdh pueden ser optimizados para la expresión en Actinombacillus succinogenes. La molécula de ADN puede ser epigenética (por ejemplo, presente en un plásmido) . La molécula de ADN puede incluir un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a la canamicina, resistencia a la ampicilina, resistencia a la estreptomicina, resistencia a la sulfonamida, resistencia a la tetracielina, resistencia al cloranfenicol, o una combinación de los mismos).

En algunas modalidades, la molécula de ADN (polinucleótido) comprende un promotor de transcripción para un microorganismo que produce ácido succínico operativamente enlazado a un gen zwf heterólogo. El promotor de transcripción puede incluir un promotor de zwf. La molecula de ADN puede estar presente dentro de un plásmido. La molécula de ADN puede estar presente en una célula huésped (por ejemplo, una célula huésped que produce ácido succínico o ácido propiónico a concentraciones de aproximadamente 50 g/l a aproximadamente 150 g/l).

En una modalidad, se proporciona el método para producir ácido succínico. El método comprende fermentar un medio de nutrientes con un microorganismo recombinante que expresa una gen heterólogo zwf para producir una enzima glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, opcionalmente en combinación con un segundo microorganismo recombinante que expresa un gen heterólogo mdh para producir una enzima malato deshidrogenasa. En diversas modalidades, el microorganismo recombinante expresa un gen heterólogo mdh y un gen heterólogo zwf. El microorganismo recombinante puede incluir una cepa recombinante de Actinombacillus succinogenes (por ejemplo, cepa recombinante de A. succinogenes depositada bajo el número de acceso de ATCC PTA-6255). El microorganismo recombinante puede incluir una cepa recombinante de Bisgaard Taxon b, Bisgaard Taxon 10 y similares. El gen heterólogo zwf puede incluir el gen zwf de E. coli. El gen heterólogo mdh puede incluir el gen mdh de E. coli.

Opcionalmente, la cepa recombinante es resistente a niveles de monofluoroacetato de sodio de al menos aproximadamente 1 g/l. Opcionalmente, la cepa recombinante es capaz de producir ácido succínico o ácido propiónico a concentraciones de aproximadamente 50 g/l a aproximadamente 150 g/l. El medio de nutrientes puede incluir un azúcar fermentable (por ejemplo, glucosa). Típicamente, el metodo resulta en un rendimiento de ácido succínico (g) de al menos aproximadamente 100% con respecto a la glucosa (g).

En otra modalidad, el microorganismo recombinante es una cepa recombinante de un microorganismo que produce ácido succínico. El microorganismo recombinante comprende (por ejemplo, se ha transformado con) un gen zwf heterólogo (es decir, un polinucleótido heterólogo que codifica una glucosa-6-fosfato deshidrogenasa). El gen zwf heterólogo puede ser optimizado para la expresión en el microorganismo. En algunas modalidades, el gen zwf heterólogo puede codificar la enzima de zwf de E. coli.

En otra modalidad , el microorganismo recombinante es una cepa recombinante de un microorganismo que produce ácido succínico que se ha transformado con una molécula de ADN (un polinucleótido) que incluye un promotor de transcripción para fosfoenolpiruvato (PckA) carboxicinasa operativamente enlazada al polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de enzima de Zwf. El microorganismo recombinante opcionalmente se ha transformado con una molécula de ADN (un polinucleótido) que incluye un promotor de transcripción para fosfoenolpiruvato (PckA) carboxicinasa operativamente enlazada al polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de enzima de Mdh. El promotor de transcripción puede incluir el promotor de fosfoenolpiruvato (PckA) carboxicinasa de Actinobacillus succinogenes. En otra modalidad , el microorganismo recombinante es una cepa recombinante transformada con una molécula de ADN que es epigenética. La molécula de ADN puede estar presente en un plásmido.

En otra modalidad, el microorganismo recombinante es una cepa recombinante que es capaz de producir ácido succínico o ácido propiónico a concentraciones de aproximadamente 50 g/l a aproximadamente 150 g/l.

La cepa recombinante puede ser resistente a los niveles de monofluoroacetato de sodio de al menos aproximadamente 1 g/l. En algunas modalidades, la cepa recombinante se produce usando Actinombacillus succinogenes recombinante depositada bajo el número de acceso de ATCC PTA-6255, o la cepa recombinante es Actinombacillus succinogenes depositada bajo el número de acceso de ATCC PTA 120462.

En otra modalidad, el microorganismo recombinante se usa para producir ácido succínico o ácido propiónico en un método que incluye fermentar un medio de nutrientes con el microorganismo recombinante. El medio de nutrientes típicamente incluye azúcar fermentable como glucosa o sorbitol. El método puede resultar en un rendimiento de ácido succínico (g) de al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80% , al menos aproximadamente 90%, o al menos aproximadamente 100% con respecto a la glucosa (g). El metodo puede resultar en un ácido propiónico (g) de al menos aproximadamente 62% a aproximadamente 72% con respecto a la glucosa (g), o al menos aproximadamente 60%, o al menos aproximadamente 70% , o al menos aproximadamente 80%, o al menos aproximadamente 90% (o cualquier intervalo dentro de estos porcentajes).

Los métodos para producir un ácido orgánico pueden incluir cultivar microorganismos adecuados en un caldo de fermentación adecuado que contiene una fuente de carbono (por ejemplo, sorbitol crudo). En una modalidad, el caldo de fermentación también contiene una fuente de nitrógeno, sales inorgánicas, vitaminas o factores que promueven el crecimiento, y similares. En algunas modalidades, las sales, fuente de amonio y otros requisitos de los medios de nutrientes se pueden obtener de licor de maceración de maíz (CSL), un subproducto de la industria de molienda húmeda del maíz. Con respecto a las sales, las fuentes de sodio incluyen, pero no se limitan a, Na3P04, Na2HP04, NaH2P04, Na2CO3, NaHC03, NaCI, Na y de sales orgánicas (por ejemplo, glutamato de monosodio, acetato de sodio). La concentración de sodio puede variar entre aproximadamente 1200 mg/l a aproximadamente 6800 mg/l. En algunas modalidades, la concentración de sodio es desde aproximadamente 3000 mg/l a aproximadamente 3500 mg/l. La invención no se limita a sales de sodio; otras sales se contemplan como parte de la invención.

Las fermentaciones se pueden conducir combinando la fuente de carbono y el caldo de fermentación en cualquier fermentador adecuado, e inoculando con un microorganismo adecuado. La fermentación se puede realizar ya sea aeróbica o anaeróbicamente bajo condiciones que conducen al crecimiento del microorganismo y la producción del ácido orgánico adecuado. En una modalidad, la temperatura de fermentación se mantiene dentro del intervalo de al menos aproximadamente 25°C, y menos de aproximadamente 50° C. En algunas modalidades, la temperatura es entre aproximadamente 30°C y aproximadamente 39°C (por ejemplo, aproximadamente 38°C). En algunas modalidades, la temperatura es entre aproximadamente 30°C y aproximadamente 37°C.

El caldo de fermentación tambien puede incluir una betaína o una sal de adición o una mezcla de las mismas. En algunas modalidades, la betaína es betaína-HCI, base libre de betaína o similares.

En otras modalidades, la betaína puede estar presente como un componente de un producto de alimentación que contiene betaína. Las betaínas ejemplares o al menos un producto de alimentación que contiene betaína incluyen betaína, solubles de subproductos de fermentación de aminoácidos, melazas que contienen betaína, subproducto de separador de condensado, solubles de melazas condensadas, vinaza, o cualquier mezcla de los mismos. Otros ejemplos de productos de alimentación que contienen betaína incluyen un producto de fermentación de ácido glutámico extraído condensado, solubles de subproductos de fermentación de aminoácidos de la lisina de producción fermentativa, solubles de subproductos de fermentación de aminoácidos de la treonina de producción fermentativa, o solubles de subproductos de fermentación de aminoácidos del triptófano de producción fermentativa. La concentración de betaína puede variar desde aproximadamente 0.05 g/l a aproximadamente 2 g/l. En algunas modalidades, la concentración de betaína usada puede ser 0.2 g/l a 0.5 g/l.

En una modalidad , el pH del caldo de fermentación al comienzo de la fermentación está dentro del intervalo de aproximadamente pH 6 - 7 o el intervalo de aproximadamente pH 7 a aproximadamente pH 8.0 (por ejemplo, aproximadamente pH 8.0). El pH de la fermentación se puede controlar por la adición de base, por ejemplo, el pH se puede controlar para lograr aproximadamente pH 5 a aproximadamente pH 7, o aproximadamente pH 6 a aproximadamente pH 7 (por ejemplo, aproximadamente pH 6.6), o aproximadamente pH 4.5 a aproximadamente 6, o desde aproximadamente 5 a aproximadamente 5.5, cuando la fermentación progresa. Las bases de magnesio son adecuadas para controlar el pH en el contexto de la invención. En una modalidad , se proporciona MgCO3 para controlar el pH en un atmósfera de CO2 para lograr opcionalmente un pH aproximado de aproximadamente pH 6.0 a aproximadamente pH 7.0 (por ejemplo, aproximadamente pH 6.4 a aproximadamente pH 6.8), de manera preferible aproximadamente pH 6.6. El Mg(OH)2 tambien es apropiado. El NH4OH , NaOH , NH3 gaseoso, Na3P04 o sus formas de carbonato se pueden usar, aunque el método no depende de un agente de control de pH particular Ejemplos Ejemplo 1 Cepas de Microorganismos y Plásmidos Las cepas de A. succinogenes FZ45 y FZ53 son variantes bacterianas estables de Actinobacillus succinogenes 130Z, que es resistente a monofluoroacetato de sodio. Ver Guettler et al. , I NT’L J . SYST. BACT. (1999) 49:207-216; y Patente Estadounidense No. 5,573,931 . Un vector lanzadera de E. coli-A. succinogenes pLS88 (depositado en la Colección de Cultivo Tipo Americano como acceso de ATCC no. 86980) se obtuvo del Dr. Leslie Slancy, Universidad de Manitoba, Canadá. El plásmido pLS88 se describe como que se ha aislado de Haemophilus ducreyi y puede conferir resistencia a las sulfonamidas, estreptomicina, y canamicina.

Manipulaciones Genéticas: Las manipulaciones de ADN recombinante siguieron en general los metodos descritos en la téenica. El ADN del plásmido se preparó por el método de lisis alcalina. Los volúmenes de resuspensión típicos para plásmidos multicopias extraídos de cultivos de 1 .5 mi fueron 50 mI. La preparación de ADN más grande usó el kit Midi y Maxi de Purificación de Plásmido Qiagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las endonucleasas de restricción , estándares de peso molecular y marcadores pre-teñidos se adquirieron de New England Biolabs e Invitrogen y las digestiones se realizaron como se recomienda por los fabricantes, excepto que se usó un exceso de enzima de aproximadamente 5 veces. El ADN se analizó en geles de Tris-acetato-agarosa en la presencia de bromuro de etidio. El ADN se extrajo de geles de agarosa y se purificó usando el kit de extracción de gel Qiagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN se desfosforiló usando fosfatasa alcalina de camarón o ternero (Roche) en combinación con la digestión de restricción . La fosfatasa se inactivó con calor a 70°C, durante 15 min o pasando a través de una columna de purificación Qiagen. Las ligaciones se realizaron usando un exceso molar de 3 a 5 veces de inserción al ADN de vector en un volumen de reacción de 20 mI y 1 mI de T4 ADN ligasa (New England Biolabs) durante 1 hora a 25°C. La transformación de E. coli se realizó usando “células competentes library efficiency” compradas de Invitrogen, siguiendo las instrucciones del fabricante.

Las transformaciones usando mezclas de ligación se colocaron en placas sin diluciones en placas de LB estándares que contienen el antibiótico apropiado. Las amplificaciones de PCR se realizaron usando el manual de Perkin Elmer como una guía. Los diseños de cebadores se basaron en secuencias publicadas (como se proporciona en la base de datos del Centro Nacional de Información Bioteenológica (NCBI)) y obtenidas de Invitrogen Life Sciences. Los cebadores incluyeron sitios de reconocimiento de enzimas de restricción modificadas geneticamente. Los cebadores se analizaron para el dímero y formación de horquilla y temperatura de fusión usando el programa Vector NTI . Todos los cebadores fueron solicitados a la Instalación de Estructura Molecular del Estado de Michigan . Las amplificaciones por PCR se realizaron en un Cielador Maestro de Gradiente Eppendorf, o en un Termociclador Perkin Elmer. Las temperaturas de apareamiento de partida se determinaron usando el programa Vector NTI para cada par de cebadores. Las enzimas de restricción para digerir los productos amplificados se compraron de Invitrogen o New England Biolabs.

Las células competentes de A. succinogenes para la electroporación se prepararon cultivando las células en la presencia de MgCO3 en caldo de soya tríptica, TSB, medio suplementado con glucosa y se recolectaron en fase logarítmica temprana a media. El carbonato no usado se removió por centrifugación a baja velocidad. Las células se centrifugaron, se lavaron dos veces con agua estéril, dos veces con 10% v/v de glicerol , y se resuspendieron en 0.01 x el volumen de cultivo original de 10% glicerol. Las células se suspendieron en pequeñas alícuotas, se congelaron rápidamente y se almacenaron a -80°C. Se usaron 40 mI de células preparadas para la 5 electroporación , usando cubetas de 0.1 cm y un BioRad GenePulser con los ajustes de 400W, 25mF, 1 .8kV. Después de la electroporación , se añadió inmediatamente 1 mi de medio TSB a temperatura ambiente a la cubeta y se incubó a 37°C durante 1 hora. La solución de células se colocó en placas en placas de ío agar con TSB que contienen el antibiótico apropiado, y se incubó durante 3 días a 37°C en una atmósfera de CO2.

Plásmido P830.60 El gen zwf de A. succinogenes y promotor se amplificaron del ADN genómico FZ45 de Actinobacillus succinogenes, usando 15 el cebador TD299 (SEC I D No. 5), y TD300, (SEC I D No. 6), y se insertaron en los sitios BamH 1 y Salí de pJ R762.47, un derivado de pLS88, con un sitio de multiclonación, se insertó en los sitios EcoRI y Sph l de pLS88 y se muestra como Figura 3.

El gen clonado en p830.60 es de 1781 pares de bases (bp), 20 la región codificante comienza en la posición 272 (atg subrayado en negrita en Figura 8) y se detiene en 1757 (taa subrayado en negrita en Figura 8) y su secuencia de se proporciona como SEC ID No. : I. La secuencia del promotor comienza en el inicio y termina antes de la secuencia codificante. 25 Plásmido oISTONSI El gen Mdh de A. succinogenes y promotor se amplificaron de ADN genómico FZ45 de Actinobacillus succinogenes usando los cebadores TD223 (SEC I D No. : 7), y TD218 (SEC ID No. : 8). El ADN amplificado se clonó como un fragmento EcoRI y se insertó en el sitio EcoRI de pLS88 como se muestra en Figura 2.

El gen mdh en pISTONSI es de 1558 bp, con la región codificante comenzando en 303 (atg subrayado en negrita en Figura 9) y terminando en 1239 (taa subrayado en negrita en Figura 9.) y proporcionado como SEC ID No. : 3 y el promotor se muestra desde el comienzo de la secuencia y termina antes de la región codificante.

Plásmido P856. 78 El gen mdh de A. succinogenes se escindió de pISTONSI usando la enzima . de restricción EcoRI , los extremos se rellenaron con polimerasa de Klenow para preparar extremos romos y se ligaron al plásmido p830.60, el cual se ha linealizado con la endonucleasa de restricción BamH I y los extremos se han rellenado con polimerasa de Klenow. Los dos genes se arreglan como inserciones de cabeza a cola.

Ejemplo 2 Producción de Ácido Succínico a partir de Sorbitol por Sobreexpresión de Enzimas de Zwf y Mdh Las cepas de Actinobacillus succinogenes (FZ53, FZ53/pLS88; FZ53/p830.60; FZ53/FZ53 pPISTONSI y/p856.78) se cultivaron en recipientes de fermentación (Bioflo I I I , New Brunswick) que contienen 2 litros de medio de cultivo. El medio de cultivo contuvo 120 g/l de sorbitol, 30 g/l (sólidos) de líquido de maceración de maíz (CSL) (10-12% sólidos de ADM), 1 .6 g/l de Mg(OH)2, 0.2 mg/l de biotina, 0.5 g/l de betaína HCI , 0.2 mg/l de MSG, fosfato de sodio 6.5 mM , 7 g/l de Na2CO3, 0.5 g/l de extracto de levadura (AG900).

El fermentador se inoculó con 6.25% de inoculo de un cultivo de frasco cultivado en el mismo medio que el fermentador (pero omitiendo el Mg(OH)2) y se incubó con agitación constante a 150 rpm a 38°C durante 13 horas.

Los termentadores inoculados se incubaron a 38°C con agitación a 380 rev/min y una aspersión de 0.025 a 0.05 vvm de CO2. El pH del medio de fermentación se mantuvo a pH 6.8 mediante la adición automática de Mg(OH)2 6 M o la adición de MgC03 a 120 g/l Una alimentación de fuente de carbono se implemento entre 12 y 22h durante las cuales se añadieron 15 g de fuente de carbono adicional al recipiente de fermentación.

Azúcar y Determinación de Ácidos Orgánicos: Las muestras se removieron de los termentadores a intervalos y los sólidos se removieron por centrifugación a 10,000 x g durante 4 minutos. El sobrenadante se filtró a traves de un filtro de 0.2 mM antes del análisis. Las concentraciones de azúcar y ácido orgánico en los sobrenadantes de cultivo y filtrados se determinaron por H PLC (Agilent serie 1200). Se usó una columna Aminex HPX-87H (300 mm x 7.8 mm) (Bio-Rad) con una fase móvil que consiste en H2SO4 0.013N con una velocidad de flujo de 1 .4 ml/minutos. Los picos del analito se detectaron y cuantificaron usando un detector de índice de refracción (Waters 5 2414), la identificación de los picos se determinó por referencia a las soluciones estándares de ácido orgánico compradas de Sigma. La Tabla 1 muestra la evaluación de fermentación de múltiples transformantes de A. succinogenes, cultivados en sorbitol. ío Tabla: 1 25 La transformación de A. succinogenes con un vector “vacío” (pLS88) que no contuvo genes que se sobreexpresan por el huésped ni afectan significativamente el rendimiento de la fermentación del ácido succínico cuando el sorbitol fue la fuente de carbono. La sobreexpresión ya sea del gen zwf o el gen mdh como genes únicos (vectores p830.60 y pPISTONSI respectivamente) aumentó el rendimiento de ácido succínico. El rendimiento más alto se obtuvo con la sobreexpresión de la enzima de Mdh , sin embargo, este alto rendimiento llegó a expensas de la productividad, la cual fue menor en este transformante que en la cepa que expresa Zwf, el progenitor no transformado y el transformante con el vector vacío.

La co-expresión de genes zwf y mdh también conduce a un alto rendimiento (equivalente al observado para el transformante de mdh), pero también apoyó un aumento de la productividad (no significativamente diferente del transformante de zwf.

Se demostró que la co-expresión de las enzimas de Zwf y Mdh promueve la formación de ácido succínico con alta productividad , rendimiento y título cuando el sorbitol es la fuente de carbono.

Ejemplo 3 Producción de Ácido Succínico a partir de Glucosa por Sobreexpresión de las Enzimas de Zwf y Mdh Las cepas de Actinobacillus succinogenes (FZ53, FZ53/pLS88; FZ53/p830.60; FZ53/plSTONS1 y FZ53/p856.78) descritas en el Ejemplo 1 se cultivaron en frascos anaeróbicos de 50 mi en el mismo medio como se describe en el Ejemplo 2 con la modificación que las botellas se precargaron con 6 g de MgCO3 para mantener el pH del cultivo. Los frascos se inocularon con 2.5 mi (5% v/v de inoculo) de un frasco para semillas identico. Los frascos se incubaron a 38°C con agitación constante a 150 rev/minutos.

El análisis de los filtrados de cultivo se realizó como se describe en el Ejemplo 2. Un ejemplo de los resultados del análisis son los siguientes (calculado en 46 horas): FZ53 pLS88 logró un título de 80.0 g/l , una productividad de 1 .74 g/l-h , y rendimiento de 0.76 g de ácido succínico/g de azúcar; FZ53 P830.60 (Zwf) logró un título de 100.6 g/l, una productividad de 2.19 g/l-h, y rendimiento de 0.89 g de ácido succínico/g de azúcar; FZ53 pPISTONSI (Mdh) logró un título de 80.2 g/l, una productividad de 1 .87 g/l-h, y rendimiento de 0.77 g de ácido succínico/g de azúcar; y FZ53 p878.56 (Zwf + Mdh) logró un título de 1 10.0 g/l, una productividad de 2.16 g/l-h , y rendimiento de 0.96 g de ácido succínico/g de azúcar. Ver también la Tabla 2, la cual resume los resultados de la evaluación de la fermentación de transformantes de A. succinogenes en glucosa.

Tabla 2 : Mientras que la sobreexpresión de Zwf se confirmó que es beneficiosa, aumentando tanto la productividad como el rendimiento de ácido succínico a partir de glucosa, la sobreexpresión de Mdh sola no mostró algún efecto beneficioso. La co-expresión de Zwf y Mdh proporciona un beneficio sobre la expresión de Zwf sola, aumentando el rendimiento, mientras que no disminuye significativamente la productividad de ácido succínico. Las observaciones adicionales se proporcionan a continuación.

La producción de ácido succínico usando A. succinogenes es un proceso de producción anaeróbico. El organismo es un productor natural de ácido succínico. La producción es estimulada por la suplementación del cultivo, ya sea con H2 o sustratos más reducidos (por ejemplo, sorbitol o manitol) , lo que sugiere que la reducción de energía (NADPH) limita la producción de ácido succínico en A. succinogenes. Con esto en mente, Zwf (una enzima que genera directamente NADPH y desvía la glucosa en la vía de la pentosa fosfato o vía de Entner-Doudoroff) se sobreexpresa en A. succinogenes. Esta intervención aumentó el rendimiento de la fermentación de ácido succínico en terminos de rendimiento. Por lo tanto, la desviación de la glucosa de la vía glucolítica a través de la vía de fosfato de pentosa o vía de Entner-Doudoroff (y el aumento del grupo NADPH intracelular) benefició la producción de ácido succínico.

Los estudios bioquímicos de A. succinogenes y la comparación con E. coli que produce ácido succínico demostró que las enzimas implicadas en la conversión de piruvato de fosfoenol a ácido succínico (fosfoenol piruvato descarboxilasa, malato deshidrogenasa, fumarasa, y fumarato reductasa) son altamente expresadas en A. succinogenes, lo que sugiere un mecanismo detrás de la prodigiosa capacidad de A. succinogenes para acumular ácido succínico. En particular, la actividad de la malato deshidrogenasa se encontró que es muy alta en A. succinogenes - mayor de 10 veces mayor que en E. coli (2, 100 nmoles/minutos/mg de proteína c.f. 160 mmoles/minutos/mg de proteína (Van der Werf, Arch . Microbiol . , 167, 332-342 (1997)). Por lo tanto, no se esperó que la actividad de la malato deshidrogenasa limitará la producción de ácido succínico en A. succinogenes. De hecho, la sobreexpresión de Mdh sola no mejoró significativamente el título, la productividad , o el rendimiento en comparación con un microorganismo de control que carece de un polinucleótido heterólogo que codifica Mdh. Ver la Tabla 2. Esta observación pareció confirmar las conclusiones extraídas despues del estudio bioqu ímico de A. succinogenes, que Mdh no fue una etapa limitante de la velocidad en la producción de ácido succínico en A. succinogenes como resultado 5 de su actividad endógeno naturalmente alta.

Sobre la base de la encuesta bioquímica y los datos reportados en la Tabla 2 para la sobreexpresión de Mdh sola, no habría expectativa de un beneficio de la co-expresión de un polinucleótido que codifica la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa ío (zwf) y un polinucleótido que codifica una malato deshidrogenasa (mdh) en A. succinogenes.

Sin embargo, durante la caracterización de una cepa A. succinogenes que sobreexpresa Zwf de, se observó sorprendentemente un pico en el perfil de subproducto de HPLC 15 que estuvo asociado, y aumentó con, la sobreexpresión de Zwf. El pico se determinó que corresponde a oxalacetato, un compuesto muy lábil que se descarboxila, se dimeriza, y se convierte en malato fácilmente. Esto sugiere que, inesperadamente, cuando Zwf se sobreexpresa en A. succinogenes, la Mdh llega a ser una 20 enzima limitante en la producción de ácido succínico, resultando en una acumulación de su sustrato (oxaloacetato). Sin desear estar ligado por una teoría particular, la acumulación de oxaloacetato como un subproducto desvía el flujo de carbono, disminuyendo el rendimiento de ácido succínico de la 25 fermentación. Por lo tanto, contrario a los estudios bioquímicos in vitro que demostraron que la actividad de Mdh es alta en A. succinogenes, la actividad enzimática in vivo se limitó inesperadamente. La sobreproducción de Mdh en combinación con Zwf superó la limitación , evitando la acumulación de oxaloacetato y aumentando el rendimiento de ácido succínico.

Este ejemplo demuestra que la co-expresión de Zwf y Mdh proporciona un beneficio sobre la expresión de cualquier enzima única cuando la glucosa se usa como una fuente de carbono. La Mdh mostró previamente no ser una actividad limitante en la producción de ácido succínico por A. succinogenes. Se descubrió inesperadamente que la sobreexpresión de Mdh condujo a un rendimiento mejorado en la producción de ácido succínico por A. succinogenes cuando la Zwf tambien se sobreexpresó.

Algunas modalidades adicionales no limitativas se proporcionan a continuación para ejemplificar adicionalmente la presente invención .

En una modalidad , el microorganismo recombinante expresa las enzimas glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y malato deshidrogenasa. En algunas modalidades, una enzima única o ambas enzimas son heterólogas para el organismo. En diversas modalidades, la expresión del polinucleótido heterólogo o sobreexpresión del polinucleótido que codifica la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y/o malato deshidrogenasa resulta en un aumento mayor de dos veces, cinco veces, diez veces, 25 veces, 50 veces, 100 veces o 250 veces, o 500 veces en la actividad enzimática en comparación con la actividad enzimática observada en un microorganismo progenitor (no modificado, comcidente).

El microorganismo de la invención en varios aspectos produce más ácido orgánico (o produce ácido orgánico más rápidamente o más eficientemente) que un microorganismo de otra manera similar que no comprende los polinucleótidos heterólogos o no sobreexpresa los polinucleótidos. En diversas modalidades, el microorganismo produce al menos 2%, al menos 3%, al menos 5% , al menos 6% , al menos 7%, al menos 10% , al menos 12%, al menos 15%, al menos 17 %, al menos 20%, al menos 25%, o al menos 30% más ácido orgánico que un microorganismo de otra manera similar que no comprende los polinucleótidos heterólogos o no sobreexpresa los polinucleótidos en el mismo marco de tiempo. Alternativamente, o además, el microorganismo demuestra un nivel de productividad que es al menos 2% , al menos 3%, al menos 5% , al menos 6%, al menos 7%, al menos 10% , al menos 12%, al menos 15%, al menos 17% , al menos 20% , al menos 25% , o al menos 30% mejor que un microorganismo no modificado (progenitor) . Alternativamente, o además, el microorganismo demuestra un aumento en el rendimiento de al menos 2%, al menos 3% , al menos 5%, al menos 6% , al menos 7%, al menos 10%, al menos 12% , al menos 15% , al menos 17% , al menos 20%, al menos 25% , o al menos 30% en comparación con un microorganismo no modificado (progenitor).

En otras modalidades ambas enzimas se expresan de A succinogenes. En aún otras modalidades ambas enzimas se expresan de E. coli. En todavía otras modalidades, la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa se codifica de E. coli y la malato deshidrogenasa se codifica por A. succinogenes. Las combinaciones de genes se pueden invertir. En otras modalidades, los microorganismos que expresan Zwf y Mdh incluyen miembros de la familia Pasteurellaceae. En todavía otras modalidades, los microorganismos incluyen Actinombacillus succinogenes, Bisgaard Taxon 6 y Bisgaard Taxon 10 o microorganismos que tienen más de 90% de identidad de secuencia de rARN con Actinombacillus succinogenes. La célula huésped que expresa estos genes puede ser A. succinogenes. En todavía otras modalidades, los genes se pueden expresar en organismos separados pero ambos organismos se incluyen en el medio de fermentación para producir ácidos orgánicos. En una modalidad , los ácidos orgánicos son ácido succínico o ácido propiónico.

En algunas modalidades, los polioles crudos se pueden usar como la fuente de carbono. En otras modalidades, el caldo o medio de fermentación para cultivar los microorganismos incluyen licor maceración de maíz, betaína, sodio, iones de magnesio y combinaciones de los mismos.

La descripción de la expresión de enzimas que se usan en la vía de pentosa fosfato (o vía de Entner-Doudoroff) y el cielo reductor de ácido tri-carboxílico resulta en el aumento de la producción de ácido orgánico que una enzima única sola.

Esta solicitud se destina a cubrir cualquiera de las adaptaciones o variaciones del presente tema. Por ejemplo, aunque se describe principalmente como un organismo recombinante único que coexpresa zwf y mdh se puede prever que múltiples organismos que expresan cada uno zwf y mdh se pueden incluir en un proceso de fermentación único para resultar en la producción de ácido orgánico. La invención incluye variantes o progenie de los microorganismos descritos en la presente que conservan las características fenotípicas del microbio recombinante. Tambien se proporciona un monocultivo sustancialmente puro del microorganismo descrito en la presente (es decir, un cultivo que comprende al menos 80% o al menos 90% de un microorganismo deseado).

Claims

REIVINDICACIONES

1 . Un microorganismo recombinante, (i) heterólogo que expresa glucosa-6-fosfato deshidrogenasa o sobreexpresa glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y (ii) heterólogo que expresa malato deshidrogenasa o sobreexpresa, en donde el microorganismo es un ácido succínico natural que produce microorganismo.

2. Un microorganismo recombinante que comprende (i) un no nativo o un polinucleótido sobreexpresado que codifica una glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y (ii) un no nativo o un polinucleótido sobreexpresado que codifica el malato deshidrogenasa

3. El microorganismo recombinante de la reivindicación 1 o reivindicación 2, que comprende una secuencia de ARN ribosomal 16S con al menos 90% de identidad con la secuencia de ARN ribosomal 16S de Actinobacillus succinogenes.

4. El microorganismo recombinante de la reivindicación 1 o reivindicación 2, que es Actinombacillus succinogenes, Bisgaard Taxon 6 o Bisgaard Taxon 10.

5. El microorganismo recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, en donde las enzimas glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y malato deshidrogenasa son A. succinogenes.

6. El microorganismo recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, en donde las enzimas glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y malato deshidrogenasa son A. succinogenes.

7. El microorganismo recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, en donde las enzimas glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y malato deshidrogenasa son E. col¡. 5

8. El microorganismo recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, en donde las enzimas glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y malato deshidrogenasa son E. coli.

9. El microorganismo recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, en donde la glucosa-6-fosfato ío deshidrogenasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 40% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos descrita en la SEC I D No. : 2.

10. El microorganismo recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, en donde el malato deshidrogenasa 15 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 60% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos descrita en la SEC I D No. : 4.

1 1 . El microorganismo recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 -10, en donde el microorganismo demuestra la 20 producción de ácido orgánico mejorada en comparación con un microorganismo que expresa las enzimas glucosa-6-fosfato deshidrogenasa o malato deshidrogenasa solas.

12. El microorganismo recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 1 1 , en donde el microorganismo es capaz de 25 producir ácido succínico a concentraciones de aproximadamente 50 g/l a 150 g/l .

13. Un proceso para la producción de ácido orgánico, que comprende cultivar el microorganismo recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 12 , en un medio de fermentación. 5

14. Un metodo para producir ácido orgánico, que comprende la etapa de: cultivar un microorganismo recombinante que expresa ambas las glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y malato deshidrogenasa con una fuente de carbono bajo condiciones que ío favorecen la producción de ácido orgánico, en donde las enzimas no son nativas al microorganismo o están sobreexpresadas en comparación con un microorganismo de origen no modificado.

15. Un método para producir ácido orgánico que comprende cultivar el microorganismo recombinante de cualquiera 15 de las reivindicaciones 1 - 12, con una fuente de carbono bajo condiciones que favorecen la producción del ácido orgánico.

16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 13 - 15, en donde el ácido orgánico es ácido succínico o ácido propiónico. 20

17. El método de la reivindicación 16, en donde el ácido orgánico es ácido succínico.

18. El método de cualquiera de las reivindicaciones 14 - 1 7, en donde la fuente de carbono es glucosa o poliol. 25